Genética Médica Tema 2. Estructura y organización del genoma humano: genes, familias génicas y polimorfismos del DNA

Genética Médica – Tema 2 Estructura y organización del genoma humano: genes, familias génicas y polimorfismos del DNA Bibliografía: Griffits AJ et al

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Genética Médica – Tema 2

Estructura y organización del genoma humano: genes, familias génicas y polimorfismos del DNA Bibliografía: Griffits AJ et al. (2000) pp23-28; pp376-378 Tamarin RH (1996) pp203-220, pp414-419 Klug WS y Cummings MR (1999) pp277-298, pp528-539

Inma Martín Burriel Curso 2008-09

Genética Médica. Tema 2 Estructura y organización del genoma

Tema 2 • Estructura y organización del Genoma • Polimorfismos genéticos: – Variaciones en el número de repeticiones – Mutaciones puntuales

• Aplicaciones de los polimorfismos genéticos en Medicina

1

Estructura en doble hélice del DNA:

10pb /vuelta Destrógira Bases apiladas perpendicularmente

Genoma

DNA eucariótico Genes funcionales de copia única

DNA de secuencia repetida

DNA separador

Secuencias sin función conocida

Secuencias funcionales Secuencias funcionales No codificantes

Repeticiones heterocromatina Del centrómero

Familias de genes codificantes (y pseudogenes asociados)

VNTR

Familias de genes dispersos

Secuencias derivadas De transposiciones

Familias de genes en tándem Transposones Retrotransposones

2

Genoma

DNA eucariótico Genes funcionales de copia única

DNA de secuencia repetida

DNA separador

Secuencias sin función conocida

Secuencias funcionales Secuencias funcionales No codificantes

Repeticiones heterocromatina Del centrómero

Familias de genes codificantes (y pseudogenes asociados)

VNTR

Familias de genes dispersos

Secuencias derivadas De transposiciones

Familias de genes en tándem Transposones Retrotransposones

Genes de copia única Gen eucariota Inicio transcripción Promotor

Región reguladora aguas arriba

Exón 1

5’UTR

Intrón 1

Intrón 2

Exón 2

Exón 3

Región reguladora interna

Intrón 3

Fin transcripción

Exón 4

Región reguladora aguas abajo

Unidad de transcripción

• Codifican para una única proteína • Se encuentran en una única posición del genoma (un individuoÆ 2 copias)

3

Genoma

DNA eucariótico Genes funcionales de copia única

DNA de secuencia repetida

DNA separador

Secuencias sin función conocida

Secuencias funcionales Secuencias funcionales No codificantes

Repeticiones heterocromatina Del centrómero

Familias de genes codificantes (y pseudogenes asociados)

VNTR

Familias de genes dispersos

Secuencias derivadas De transposiciones

Familias de genes en tándem Transposones Retrotransposones

Familias génicas • Familia génica: – “grupo de genes de un genoma que derivan de un ancestro común” ¾Familia de las globinas (beta globina): ƒ 5 loci en HSA11 ƒ Orden según la expresión en el desarrollo ƒ Posición y longitud de intrones similar ƒ Evolución concertada

4

Familias de genes en tándem – Genes cuyos productos son requeridos en grandes cantidades: • Organizador Nucleolar (NO): – Localizado en los brazos cortos de cromosomas acrocéntricos (13, 14, 15, 21 y 22) aunque pueden traslocarse – Contiene hasta 800 copias del gen del rRNA (18S + 28S)

• Genes del RNAt: – 50 sitios cromosómicos – 10 a 100 copias/sitio

• Genes de las Histonas

– Se mantiene la identidad de secuencia

5

Familia de genes dispersos • Familias de genes dispersos: – – – – – – –

Actinas: de 5 a 30 genes Queratinas: + de 20 Cadena pesada de la Miosina: 5-10 Tubulinas: 3-15 Globinas: hasta 5 Región variable de las inmunoglobulinas: 500 Histonas: 100-1000

• Las secuencias entre genes pueden variar • Genes homólogos pueden tener funciones diferentes • Algunos pierden la función Æ pseudogenes

Genoma

DNA eucariótico Genes funcionales de copia única

DNA de secuencia repetida

DNA separador

Secuencias sin función conocida

Secuencias funcionales Secuencias funcionales No codificantes

Repeticiones heterocromatina Del centrómero

Familias de genes codificantes (y pseudogenes asociados)

VNTR

Familias de genes dispersos Secuencias derivadas De transposiciones Familias de genes en tándem Transposones

Retrotransposones

6

DNA repetido Secuencias de DNA no codificante dispersas y repetidas en tándem

¿DNA basura? - ¿Regulación de la expresión? - ¿Mecanismo de reparación? - ¿Puntos de recombinación?

Variación en el número de repeticiones

Entrecruzamiento desigual

Fallo en la alineación de cadenas de DNA en la replicación

7

DNA repetido en tándem • DNA satélite:

– repeticiones de formaciones muy grandes (100 kb y algunas Mb) – DNA no transcrito – Regiones de heterocromatina, principalmente en centrómeros (DNA alfoide)

Modelos de organización centromérica

DNA repetido en tándem • DNA minisatélite (VNTR) – – – –

Repeticiones de tamaño moderado (60pb) Distribuidas por todo el genoma, principalmente en telómeros Normalmente no se transcriben Tipos: • DNA minisatélite hipervariable • DNA telomérico

Función DNA telomérico: Solucionar los problemas de replicación de los extremos del cromosoma

8

DNA repetido en tándem • DNA microsatélite (STR): – Short Tandem Repeat – Pequeñas formaciones (generalmente < 150pb) de repeticiones en tándem de secuencias muy simples (de 1 a 4 nucleótidos) – Repartidas por todo el genoma, normalmente en intrones. Frecuentes y altamente polimóficos (número medio de alelos 10) – Herencia mendeliana codominante Alelo 1 Alelo 2

CA

CA

CA

CA

CA

CA

CA

CA

CA

CA

CA

CA

CA

CA

CA

CA

DNA repetido en tándem VNTR

Tamaño (Kb)

Unidad repetición

Método detección

Satélites

100-500

20 kb

Centrifugación ClCs Elec. campos pulsados

Minisatélites (VNTR)

0,1-20

20-40 pb

Elec. agarosa

1-4pb

Elec. Acrilamida Secuenciación

Microsatélites pb (STR)

9

DNA repetido en tándem VNTR

Tamaño (Kb)

Unidad repetición

Método detección

Satélites

100-500

20 kb

Centrifugación ClCs Elec. campos pulsados

Minisatélites (VNTR)

0,1-20

20-40 pb 14-100 pb

Elec. agarosa

1-4pb

Elec. Acrilamida Secuenciación

Microsatélites pb (STR)

Polimorfismos de DNA: Presencia de distintos alelos en la población

Genética Médica

• Polimorfismo genético: – Cuando un locus presenta al menos 2 alelos y la frecuencia alélica del más raro es > 1% Æ locus polimórfico. – El polimorfismo (la variación) garantiza la adaptación de una especie a condiciones ambientales cambiantes, a expensas de producir mutaciones graves causantes de una enfermedad.

10

DNA minisatélite hipervariable

• Localización dispersa en todos los cromosomas, entre 0,1-20 kb de longitud, de repeticiones en tándem cortas • Secuencia repetida común (core): GGGCAGGAXG • Son muy polimórficas • Se encuentran en intrones • Estas secuencias se han empleado como “huellas dactilares”

DNA minisatélite hipervariable Detección del polimorfismo: RFLP + Southern (hibridación con sonda)

11

INDIVIDUO 2

4 5

6

7

8

9 10

11

INDIVIDUO 1

1

1’

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2 3 4 5 6 7

2

2’

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5

1 2 3 4

3’

1 2 3 4

1

1’

2

2’

3

3’

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 2 3 4 5

INDIVIDUO 2

VNTRs

INDIVIDUO 1

3

12

DNA minisatélite hipervariable • Funciones de los VNTRs: – Regulación de puntos activos de recombinación – Control de segregación de los cromosomas (por su localización centromérica) – Estabilización de los cromosomas durante la replicación (por su localización en telómeros) – Podrían dar estabilidad a los cromosomas

• Aplicaciones: – Identificación individual (medicina forense)

13

DNA microsatélite

• Localización dispersa en todos los cromosomas • Se encuentran en intrones y DNA espaciador, raramente en secuencia codificante. • A veces asociados a secuencias repetidas dispersas por el genoma (SINES o LINES). • Secuencia repetida de 1 a 4 pb. • Las secuencias flanqueantes a la repetición son únicas. • Son muy polimórficas.

Detección del polimorfismo: PCR

14

DNA microsatélite • Visualización de los microsatélites: – http://www.unizar.es/lagenbio/recursos/ Secuenciación:

Genotipado:

ACGT

DNA microsatélite • Implicaciones de las secuencias microsatélites en medicina: – Expansión de microsatélites de trinucleótidos: • Síndrome de X frágil (FMR-1) (CCG)n • Distrofia miotónica (DM) (CTG)n • Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n • Ataxia de Friedreich (FA) • Nueve formas de ataxia espinocerebelar (SCA)

– Expansión de tetranucleótidos: DM2 – Expansión de pentanucleótidos: SCA10

15

DNA microsatélite • Mecanismos de patogeneicidad de los microsatélites: – Enfermedades de herencia recesiva ligada al X Æ expansión de tripletes que interfiere la transcripción del gen mutado (no proteína) – Enfermedades con herencia dominante Æ expansión de tripletes produce una proteína alterada – Enfermedades con herencia dominante producidas por expansiones en regiones no codificantes Æ expansiones en el ARN Æ función celular alterada?

DNA microsatélite

• Aplicaciones: – Identificación individual – Análisis evolutivo de poblaciones – Diagnóstico directo en enfermedades genéticas causadas por expansión de trinucleótidos – Diagnóstico indirecto de enfermedades genéticas: • Ligamiento entre microsatélites polimórficos y genes causantes de enfermedad.

16

Diagnóstico individual

Análisis de 15 marcadores microsatélites

Diagnóstico directo Ejemplo: Diagnóstico corea de Huntington Nº repet

Clasificación

E.H.

39

Penetrancia T

Si

45

1

2

22 20

18 3

4

5

6

16

7

12

1

2

3

4

5

6

7

17

Diagnóstico indirecto Ejemplo: Diagnóstico portadores enfermedades recesivas

Fibrosis quística HSA7

Ms1 CFTR Ms2 Ms3

127

125

123

?

?

CFTR*

222 152

220

220

154

150

125

CFTR* CFTR*

220

220

154

150

2

1

125

123

CFTR*

127

129

?

?

220

222

154

152

3

129

123 ?

?

218

218

222

152

150

152

152

5

?

?

220

4

129

127

218 152

6

Resumen de polimorfismos genéticos

Etiología Microsatélites

errores de DNAp

(short tandem repeats)

slippage

Minisatélites

entrecruzamiento no equilibrado

Detección PCR

Frecuencia genómica 1/30.000 bp

STRs

(variable no of tandem repeats)

VNTRs

Southern

variable, baja

unequal crossing over

RFLPs

mutaciones

SNPs

mutaciones

Southern-PCR

baja

(restriction fragment length polymorphisms)

PCR

1/1000 bp

(Single nucleotide Polymorphisms)

18

Mutaciones Puntuales Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales: • Variación de un nucleótido en una posición determinada.

• Frecuencia:1/1000pb • También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) Alelo 1 Alelo 2

TACGAGCTA TACGGGCTA

En regiones codificantes:

Mutaciones: - Cambio de base - Inserción - Deleción

¾Mutaciones con cambio aminoacídico GCA (Ala) Æ GTA (Val) ¾Mutaciones sin sentido AAA (Lys) Æ TAA (stop) ¾Mutaciones silentes GCA (Ala) Æ GCC (Ala)

Metodología para determinar mutaciones puntuales • RFLPs: – Mutaciones puntuales que se localizan en una secuencia reconocida por una enzima de restricción. – Detección mediante enzimas de restricción y Southern Blotting – PCR + enzima de restricción – Baja variabilidad (2 alelos). – Localización: • Exones • Genes de copia única

• SNP:

– Mutaciones puntuales detectable por un variado número de técnicas: • Como los RFLP (si producen/eliminan un sitio de corte) • Secuenciación • Minisecuenciación • Sondas específicas • SSCPs • PCR en tiempo real…

– Baja variabilidad (2 alelos)

– Localización: • Exones • DNA de copia única

19

RFLPs

Determinación mediante Southern

Diagnóstico genético por RFLPs RFLP

Polimorfismo debido mutaciones puntuales

(Restriction fragment lenght polymorfism) Ms t I I

RE

RE

RE

RE

A

RE

a

A

a

AA Aa

Aa

aa

Aa

AA

aa

aa

Aa

aa

Aa

AA

aa

a

En el gen de la globina normal la secuencia correspondiente al 5th7th aminoácido del péptido betaglobina es CCTGAGGAG que es reconocida por la enzima de restricción MstII. En la variable patológica de la anemia falciforme, eritrocitos en hoz-sickle, se produce una mutación puntual de A a T, lo que invalida el reconocimiento por MstII. En la correspondiente digestión enzimática se genera un único fragmento de 1,3 kb en lugar de los dos fragmentos de 0,2 kb y 1,1 kb propios del gen normal. Los diferentes fragmentos se detectan por técnica de Southern blotting

20

Determinación de PCR-RFLPs Mutación: Alelo 1 Alelo 2

Aat II

TGGACGTCT TGGATGTCT

PCR: TGGACGTCT TGGAGGTCT

Fragmento PCR

Electroforesis PCR

Alelo 1 Alelo 2

Genética Médica Según metodología de detección

• RFLPs: – Mutaciones puntuales que se localizan en una secuencia reconocida por una enzima de restricción. – Detección mediante enzimas de restricción y Southern Blotting – PCR + enzima de restricción – Baja variabilidad (2 alelos). – Localización: • Exones • Genes de copia única

• SNP:

– Mutaciones puntuales detectable por un variado número de técnicas: • Como los RFLP (si producen/eliminan un sitio de corte) • Secuenciación • Minisecuenciación • Sondas específicas • SSCPs • PCR en tiempo real…

– Baja variabilidad (2 alelos)

– Localización: • Exones • DNA de copia única

21

SNPs • SNP: Single Nucleotide Polymorphisms: – Presentación muy frecuente (1/300 pb) – 10 a 30 millones de SNP en el genoma humano – Dos posibles alternativas en cada individuo – Herencia es muy estable (baja tasa de mutación 10-6 vs 10-3 de los microsatélites) – Fácil estandarización – Aplicaciones en la determinación de enfermedades y en farmacogenética

Secuenciación:

Determinación de SNPs

MCL1

PCR en tiempo real con sondas alelo específicas:

Minisecuenciación:

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Mutaciones puntuales • Implicaciones de las mutaciones puntuales en medicina: – Pueden originar diferencias muy sutiles o provocar la muerte – Mutaciones en líneas germinales: • Neurofibromatosis (dominante) • Acondroplasia (dominante) • Hemofilia (Factor VII, ligado al X) – Mutaciones somáticas: • Cáncer: mutaciones de protooncogenes – Origen: fallo en la reparación del DNA o agentes mutágenos

Genética Médica

• Aplicaciones de los polimorfismos del DNA: – Identificación individual (Medicina forense) – Construcción de los mapas génicos – Ligamiento con fenotipos

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Ejemplo: Determinación de portadores de Fibrosis Quística Nora Riveros Ka, Juan Ríos Hb (2005). Detección indirecta de portadores de fibrosis quística en dos familias chilenas mediante análisis de polimorfismos en el ADN asociados fuertemente al gen CFTR. Rev Méd Chile 2005; 133: 648-654

24

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