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Sistema de Revisiones en Investigación Veterinaria de San Marcos
Glicosilación de las Proteínas Sanguíneas
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA - 2009 Autores: MV Efrain Mato Felix Universidad Nacional Mayor de San Marcos Facultad de Medicina Veterinaria Curso: Investigación II Maestría en Salud Animal
Salud Animal
GLICOSILACIÓN DE LAS PROTEÍNAS SANGUÍNEAS
I. Presentación
II. Hemoglobina Glicosilada
El diagnóstico clásico de diabetes mellitus e insulinoma en perros se basa en los signos clínicos y en la evaluación de las concentraciones de glucosa sanguínea. A pesar que el diagnóstico de estas enfermedades es relativamente sencillo, existen otros procesos que pueden cursar con signos clínicos similares. Además, hay que tener en cuenta que la glucemia en condiciones normales sufre grandes variaciones a lo largo del día, debido al ejercicio, estrés, alimentación o tratamiento con algunos fármacos. Por lo tanto, un único análisis de glucosa refleja la concentración de glucemia que tiene el animal en el momento en que se ha recogido la muestra, pudiendo no ser suficiente para el diagnóstico y sobre todo para el control del tratamiento.
A finales de la década de los 60 se comprobó que fracciones menores de la hemoglobina, identificadas mediante electroforesis en agargel o cromatografía de intercambio iónico, se encontraban elevadas en diabéticos. Esto condujo a la caracterización de estas fracciones menores como combinaciones de glucosa y hemoglobina formadas por modificaciones posttraslacionales, a las que se denominó hemoglobina glicosilada (Bunn et al., 1975; Bunn, 1981).
Se ha determinado que en las semanas que siguen a un control óptimo de la diabetes esta hemoglobina glicosilada tiende a disminuir lentamente, mientras que aumenta al empeorar el control de la enfermedad. En base a este hecho, la determinación de la hemoglobina glicosilada ha llegado a convertirse en el «estándar de oro» para Desde hace algún tiempo se sabe que la valoración del control metabólico durante las diversas proteínas sanguíneas son capaces de unirse semanas precedentes (Gabbay et al., 1977; a la glucosa dando lugar a la formación de unos Shamoon et al., 1986). compuestos glicados (fructosamina y hemoglobina glicosilada), cuya evaluación nos permite conocer La hemoglobina glicosilada (HbA1c) es el los niveles de glucosa a más largo plazo (Armbruster, producto de una reacción lenta, no enzimática e 1987). Se ha comprobado que hiperglucemias irreversible y está directamente relacionada con las agudas y transitorias no producen cambios concentraciones de glucosa sanguínea y la vida media significativos en las concentraciones de fructosamina de los eritrocitos (120 días). La fracción glicosilada y hemoglobina glicosilada en perros sanos (Marca más importante de la hemoglobina es la hemoglobina MC et al, 2000). A1c (Yue et al., 1982). En condiciones normales, la hemoglobina glicosilada refleja la glucemia media que ha tenido el animal durante los 2 a 3 meses anteriores al análisis (Dennis, 1989).
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La formación de hemoglobina glicosilada tiene lugar mediante un proceso de glicosilación no enzimática (Brownlee et al., 1984). La glicosilación no enzimática de las proteínas ocurre en los grupos aminoterminales y en los grupos épsilonamino de los aminoácidos intracatenarios (por ejemplo, lisina). Se forma por la adición de glucosa a la proteína mediante una reacción continua y lenta que es función del tiempo de contacto entre los reactantes y de la concentración de glucosa integrada durante dicho periodo de contacto (Calle, 1992). La hemoglobina glicosilada más abundante es la HbAlc, que se forma por la adición de glucosa a los grupos valinaterminales de las cadenas beta de la hemoglobina. En esta condensación, el grupo aldehído de la glucosa forma una unión reversible baseSchiff, o aldimina, con el Nterminal de la cadena beta. A continuación, estas bases de Schiff sufren una reestructuración del doble enlace del tipo Amadori (en honor del químico que describió en primer lugar este tipo de reajuste), formándose una cetoamina estable. Los niveles de equilibrio de los productos tipo Amadori y baseSchiff se alcanzan en semanas y horas, respectivamente (Brownlee et al., 1984). Esta reacción, como hemos dicho, no es enzimática y es dependiente del tiempo de contacto y de la concentración de glucosa a la que esta expuesto el eritrocito). Como la vida media del glóbulo rojo es de 120 días, la concentración de la cetoamina reflejará la glucemia a la que ha estado expuesto durante este tiempo ya que, sin ser un producto totalmente estable, la reversibilidad se produce a una velocidad tal que no es apreciable durante la corta vida media del hematíe (Bunn, 1981).
incluimos también a la aldimina lábil, la preAlc. Otras hemoglobinas glicosiladas de menor entidad incluyen a la HbAla y la HbAlb, formadas por la adición de fosfatos de azúcar a la valinaterminal de las cadenas beta de la hemoglobina A o por una modificación ulterior de la HbAlc. En conjunto, estos componentes se conocen como HbA1 (que puede ser estable o total, dependiendo de si se ha eliminado o no la fracción lábil). Además, existen las hemoglobinas glicosiladas no I7IbA1, formadas mediante la adición de glucosa al aminoácido N terminal de la cadena alfa o a los grupos épsilon de los residuos de lisina. Estos componentes pueden interferir en ensayos químicos, pero no en la cromatografía de intercambio catiónico o en la electroforesis (Calle, 1992). Determinación Cromatografía Los métodos cromatográficos son los más comúnmente utilizados. Incluyen grandes macrocolumnas para determinar HbAlc y microcolumnas que, habitualmente miden HbAl, así como cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) que determina HbAlc. Con todos estos métodos se necesita eliminar previamente la base Schiff lábil ya que, en caso contrario, se estará midiendo una cantidad de preAlc que será proporcional a la concentración de glucosa en el momento de tomar la muestra de sangre (Calle, 1992).
Hay que tener en cuenta que estas pruebas pueden estar interferidas por una serie de circunstancias: en la uremia (se forma hemoglobina La HbAlc estable se refiere tan sólo a la carbamilada) y alcoholismo (se forma HbAA. cetoamina, mientras que cuando hablamos de total producida por la adición de acetaldehído a la 2 Curso: Investigación II 2008 II. Maestría en Salud Animal
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hemoglobina) se produce coelución con la HbAla+b, mientras que en el embarazo, talasemia y otras hemoglobinopatías se forma hemoglobina fetal, que coeluye con la HbAlc. Esto puede producir determinaciones de hemoglobina glicosilada falsamente elevadas. Por el contrario, en casos de hemoglobinas que emigran lentamente (como en la anemia de células falciformes HbS y HbC), aunque se glucosiden no son medidas por técnicas cromatográficas, dando valores falsamente bajos. También la aspirina y plasmas lechosos pueden interferir en la técnica (Calle, 1992). Electrofor ésis Este método incluye enfoque isoeléctrico en geles de poliacrilamida (da amplia separación de los componentes de la hemoglobina) y electroforesis en gel agar (mide sólo HbAl y requiere personal especializado y un densitómetro exacto). También requieren separación previa de la fracción lábil y, a pesar de su precisión, no se emplean mucho por lo complicados que son.
Químicos Estos métodos comprenden las técnicas colorimétricas, fluorométricas y de cromatografía de afinidad. Todas son específicas para la cetoamina estable, no precisando separar antes la fracción lábil. Miden la hemoglobina glicosilada total, incluyendo los residuos glico en los grupos épsilon amino y en los aminoterminales de las cadenas alfa y beta. No son técnicas caras, pero sí difíciles de estandarizar, relativamente largas y que pueden dar valores espúreamente elevados por formación de novo de HbAlc durante el ensayo. Por el contrario,
no se ven afectadas por otras variantes de la hemoglobina y, si se vencen las dificultades, son muy precisas (Calle, 1992). Radioinmunoensavo Se ha desarrollado un radioinmunoensayo específico para la determinación de la HbAlc, pero ha tenido un uso limitado. Utilidad Clínica La hemoglobina glicosilada ha probado ser un buen marcador del control glucémico medio durante la vida del eritrocito, aunque los valores más recientes tienen, proporcionalmente, un mayor peso (Beach, 1979). Esto es especialmente cierto para la hiperglucemia, comparado con la hipoglucemia, dando lugar al aforismo de que la hemoglobina glicosilada es «más sensible al pecado que a la penitencia», posiblemente debido a la irreversibilidad relativa del reajuste de Amadori para formar la cetoamina. Aún así, su uso se considera hoy de capital importancia en la práctica clínica a la hora de evaluar el control metabólico, especialmente de las últimas 48 semanas (Koenig et al, 1976; Bunn, 1981). Cuando el control del azúcar es muy inestable se reduce la correlación con la glucemia media (Beach, 1979; Boden et al., 1980; Pecoraro et al, 1982). La hemoglobina glicosilada también se correlaciona con otra serie de parámetros de control glucémico, como glucosa plasmática basal y postprandial, desviación estándar de la glucemia, suma de las concentraciones de glucosa pre y postprandiales, glucosurias de 24 horas, etc. Sin embargo, estos productos precoces de la glicosilación de las proteínas no continúan
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acumulándose en el colágeno y otras proteínas tisulares estables a lo largo de los años de evolución de la diabetes, de modo que su concentración no guarda correlación con la presencia ni la severidad de las complicaciones de la diabetes (Vishwanath et al., 1986). Aún así, este tema es controvertido y se han publicado datos contradictorios (Ezcurra et al., 1990). Parece ser que los responsables no serían estos productos de glicosilación precoces «per se» sino otros que se forman más lentamente. En efecto, los productos de los que se ha hablado alcanzan un equilibrio tras varias semanas y no se produce más acumulación posteriormente. Pero hay reacciones de Amadori subsiguientes que dan lugar lentamente a productos finales de glucosilación avanzados, que no están en equilibrio y que se acumulan indefinidamente en moléculas de vida más larga, produciéndose de este modo un nexo de unión entre la hiperglucemia crónica (y, por tanto, las cifras de hemoglobina glicosilada elevadas) y los procesos patofisiológicos que conducirán a las complicaciones tardías de la diabetes (Brownlee et al., 1984; Steffes y Mauer, 1991).
sostenían lo contrario, pero éstos adolecían de una selección de sujetos inadecuada (obesos, sometidos a estrés crónico o con una dieta con un contenido en hidratos de carbono incorrecto). Larsen et al. (1990) comprobaron que el hecho de conocer el valor de la hemoglobina glicosilada se traducía en un control metabólico significativamente mejor, con un menor número de hospitalizaciones por hipo o hiperglucemia, cuando se comparaba con los resultados obtenidos en grupos en los que no se daba a conocer este dato.
En general, podríamos decir que la determinación de hemoglobina glicosilada es especialmente útil en pacientes en los que se busque un control metabólico optimizado, como durante el embarazo, aunque también es un instrumento muy útil en cualquier otro tipo de diabéticos. En aquellos pacientes que rechacen o que no sepan hacer autocontrol es aún de mayor utilidad, así como en los que silo hagan, como control de calidad del mismo. De igual modo, los que realicen autocontrol con tan sólo glucosurias pueden beneficiarse de la medición de este parámetro (Calle, 1992).
Como ya se ha dicho, la hemoglobina glicosilada documenta el control durante la vida del eritrocito (120 días), pero especialmente durante las últimas 4 a 8 semanas. Durante periodos de estabilización debiera medirse cada 1 a 2 meses. Una vez conseguida dicha estabilización, podría bastar hacerlo cada 2 a 4 meses (Beach, 1979).
Sin embargo, la hemoglobina glicosilada no es útil para el diagnóstico de la diabetes, por su menor sensibilidad y por la ausencia de estandarización. Asimismo, en pacientes diabéticos tipo 2 muy estables la utilidad disminuye, por existir en dichos pacientes buena correlación entre control metabólico global y glucemias basales. (Calle, 1992).
Frecuencia de la Determinación
Por supuest o, esto se refiere a la determinación de la fracción estable. Cuando se mide a diario la hemoglobina glicosilada en pacientes diabéticos se observa que prácticamente no hay variaciones día a día en la parte estable, mientas La edad no influye en la glucosilación de las que en la lábil se producen oscilaciones importantes proteínas (Kabadi, 1988), aunque estudios previos (Compagnucci et al., 1981). Este componente lábil 4 Curso: Investigación II 2008 II. Maestría en Salud Animal
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se correlaciona con la glucemia en ayunas en ese alternativo al cálculo de la proteína glicosilada. La momento, lo que no sucede con el estable denominación en sí es equívoca, ya que parece (Compagnucci et al., 1981). implicar incorrectamente que el monosacárido fructosa desempeña un papel esencial en la reacción Si se trata de la HbAlc total (lábil más (Calle, 1992). estable) pueden producirse cambios del 1 ó 2% tras aumentos o disminuciones agudas de las cifras de A pesar que la fructosamina refleja la glucemia (Compagnucci et al., 1981; Johnson et glucosilación total de las proteínas séricas, el 90% al., 1983). de su valor corresponde a la albúmina glicosilada (Baker et al., 1985). La fructosamina mide también III. Fructosamina un sustrato no identificado, aparte de las proteínas séricas glicosiladas (Schleicher et al. , 1988). La fructosamina es una proteína glicosilada Aunque se ha propuesto ajustar los resultados de la que se produce continuamente en el cuerpo producto fructosamina al contenido de albúmina o proteínas de una reacción no enzimática e irreversible entre la totales en suero (Mc Cance et al., 1987), esto no glucosa y el grupo amino de las proteínas parece ser necesario en pacientes que no padezcan plasmáticas. La concentración plasmática de enfermedad aguda o nefropatía severa, ya que fructosamina depende principalmente de los niveles aumenta los costos en reactivos, equipo y técnica de glucosa y de la vida media de las proteínas. sin aportar un beneficio clínicamente apreciable (Reusch y Haberer, 2001). La vida media de esta (Howey et al., 1989; Brown y Grunberger, 1991). proteína glicosilada en perros y gatos es de una a dos semanas (Kaneko et al., 1992; Jensen, 1995; Se ha dicho que la albúmina o las proteínas Reusch y Haberer, 2001). Según Loste y Marca glicosiladas correlacionan mejor que la fructosamina (2001), la fructosamina, al ser un reflejo de los con la HbAlc, lo que se explica porque, como hemos niveles plasmáticos de glucosa en el tiempo, es de dicho, la fructosamina mide, además de la utilidad al momento de diagnosticar y controlar al glucosilación de las proteínas séricas, un sustrato paciente diabético. no identificado, introduciendo un factor de error potencial (Schleicher et a., 1988; Winocar et al., Johnson, el año 1982, ideó un método 1989). Pero otros estudios no encuentran estos simple, rápido, barato y preciso para la medición inconvenientes a la fructosamina, contando ésta con de proteínas plasmáticas glicosiladas (Johnson et la ventaja adicional de consistir en un ensayo al., 1983) que, ligeramente modificado por Baker automatizado, con una utilidad clínica similar a la de (Baker et al, 1985), se sigue utilizando en la la hemoglobina o la albúmina glicosiladas y actualidad. Este método se conoce como el de la considerablemente más económico y rápido que los fructosamina y se basa en la capacidad del residuo anteriores (Winocour et al., 1989; Sobel y Abbassi, cetoamina, en pH alcalino, para reducir las sales de 1991). tetrazólium (nitroazul tetrazólium o NBT). La prueba de la fructosamina no mide nada nuevo sino Además, a pesar de detectar cambios en el que apenas representa un enfoque analítico control glucémico a más corto plazo que la 5 Curso: Investigación II 2008 II. Maestría en Salud Animal
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hemoglobina glicosilada, no se afecta por las Utilidad Clínica modificaciones agudas de la glucosa, midiendo sólo el componente cetoamina y siendo independiente Aunque algunos autores disientan (Dominiczak de la glucemia en el momento de la prueba (Sobel y et al., 1988), la mayoría encuentra buena correlación Abbassi, 1991). entre la fructosamina y otros parámetros de control metabólico como la hemoglobina glicosilada, la glucemia Pasamos ahora a comentar algunos datos media o la glucemia basal (Winocour et al., 1989). Se respecto a las interferencias y utilidad clínica de estas ha visto que la correlación es mejor en aquellos pruebas. pacientes que todavía conservan reserva pancreática de insulina (Brichard et al., 1989). Interferencias La fructosamina, dada la vida media En cuanto a las interferencias del test de la notablemente más corta del sustrato que mide, fructosamina hay que constatar, en primer lugar, que comparado con la hemoglobina glicosilada (2.5 no existe una modificación importante de la semanas versus 4 semanas), refleja el control concentración o de la velocidad de renovación de glucémico de un periodo también sensiblemente más las proteínas séricas. En situaciones de corto que la hemoglobina glicosilada, del orden de 1 a hipoproteinemia (hipercatabolismo, pérdidas por la 4 semanas (Flúckiger et al., 1987; Alígrave y Cockrill, orina, déficit de síntesis, hemodilución) se obtienen 1988; Ashby y Fier, 1988; Maugendre et al., 1990). valores falsamente bajos. Esta influencia es Evidentemente, esto supone que la fructosamina es más despreciable si el nivel de proteínas supera los 6.5 sensible a los cambios producidos en un corto periodo g/dl o el de albúmina los 3.03.5 g/dl (Van Dieijen de tiempo. Esta variabilidad ha sido empleada como Visser et al., 1986; Leutenegger, 1991) También el arma por los detractores de la técnica, aduciendo que aumento del «turn over» de las proteínas, como al estar sometida a tantas oscilaciones es menos fiable ocurre en casos de hipertiroidismo o enteropatía que la hemoglobina glicosilada, la cual sería más fiable perdedora de proteínas, da valores de fructosamina por su menor heterogeneidad y mayor estabilidad, espúreamente disminuidos (Lloyd y Marpies, 1986). generando mayor confianza a la hora de interpretar A la inversa, si existe hiperalbuminemia o resultados (Howey et al., 1989). hipotiroidismo, la fructosamina puede estar falsamente elevada. Esta postura no deja de ser algo maniquea. También hay que tener en cuenta que la En efecto, la fructosamina no viene a sustituir sino a reducción del NBT no es privativa de la completar a la hemoglobina glicosilada, ya que la fructosamina. Para minimizar interferencias hay que información que ofrece es complementaria (Ashby y ajustar el tiempo de reacción y el pH a las Frier, 1988; Winocar et al., 1989). En situaciones en recomendaciones actuales. Aún así, ciertos las que se deben registrar cambios rápidos en el control componentes de la sangre pueden reducir el NBT, de la diabetes, la fructosamina puede ser de mayor como los triglicéridos o la bilirrubina. También la valor que la hemoglobina glicosilada. Entre estas heparina puede interferir (Maugendre et al., 1990). situaciones podemos citar que es debido a que:
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· Diabetes inestable. · No depende del paciente, de la hora del día o · Evaluación de cambios en los regímenes de de las comidas. tratamiento. · Sirve como control de calidad de las · En el embarazo, donde el control metabólico es determinaciones de glucemia, detectando datos especialmente estricto y se realizan ajustes con fraudulentos o erróneos e indicando la periodicidad muy pequeña. Hay que tener en necesidad de revisar el programa de tratamiento cuenta la influencia de la hemodilución que con y educación del propietario de la mascota frecuencia se presenta en las gestantes (humanos). diabética · En trastornos hematológicos como hemoglobinopatías o anemias. Desventajas · En la insuficiencia renal la fructosamina sufre muchos menos cambios que la hemoglobina · Documentan si el control metabólico es bueno glicosilada. o malo, pero no dicen qué hay que hacer para · En casos de etilismo (humanos). mejorarlo. · Cifras buenas pueden ocultar oscilaciones Entre los defectos de la fructosamina hay que decir inaceptables y, especialmente, hipoglucemias que adolece de estandarización (Maugendre et al., asintomáticas. 1990). Como se ha venido diciendo de la hemoglobina · Tienen poco significado para los pacientes. glicosilada, también en la fructosamina, como de otras · Los días inmediatos a la toma de la muestra proteínas séricas glicosiladas, tienen más peso los influyen más en el valor total que la parte alícuota últimos días, especialmente si se ha producido que les correspondería (sobre todo por lo que hiperglucemia (Alígrave y Cockrill, 1988; Winocour respecta a la hiperglucemia). et al., 1989). El uso conjunto de la fructosamina y de · Requieren una tecnología avanzada y costosa la hemoglobina glicosilada permite detectar a algunos y personal especializado. Este inconveniente se pacientes «manipuladores», que intentan mejorar minimiza en el caso de la fructosamina. notablemente su control justo antes de acudir a revisión (en este caso, veriamos una fructosamina Como ya hemos comentado, el uso tanto desproporcionadamente buena con respecto a la de la hemoglobina glicosilada como de las proteínas hemoglobina glicosilada). séricas glicosiladas o de la fruct osamina (especialmente de esta última, por razones de IV. Ventajas y desventajas de la determinación viabilidad económica, sencillez, precisión y rapidez, de las proteínas glicosiladas aún a costa de cierta menor sensibilidad) se enriquece por reportar informaciones distintas y Ventajas complementarias. Leutenegger (1991) ha ideado una fórmula que relaciona la fructosamina y la HbAlc: · Con un solo test abarcamos un periodo de varias semanas. R = [fructosamina (micromol/l) x 2.2] / HbAlc (%) · Es objetivo.
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Lo normal es que este cociente sea igual a V. Literatura Citada 100. Por encima revelaría una descompensación reciente de la enfermedad, mientras que por debajo 1. Alígrave J, Cockrill BL. 1988. Fructosamine indicaría que se está produciendo una mejoría. Hay or glycated haemoglobin as a measure of diabetic que señalar que cifras superiores a 150 o inferiores a control? Arch Dis Chid 63: 41822. 60 hacen pensar en interferencias y no son 2. Armbruster DA. 1987. Fructosamine: structure, interpretables.( Leutenegger. 1991.) analysis and clinical usefulness. Clin Chem 33: 2153 2163.
Si hubiera que elegir entre ambos métodos ese escogería la hemoglobina glicosilada, sin embargo, la adición de la determinación de la fructosamina sólo ocasiona un incremento del 10 al 15% del costo de la hemoglobina glicosilada (Alígrave y Cockrill, 1988), por lo que sería un ahorro no justificado en términos de costo/beneficio. El binomio hemoglobina glicosiladafructosamina complementaría, a su vez, la información suministrada por el autocontrol de la glucemia. Todo ello, en conjunto, contribuye y es parte indispensable en el empeño de lograr una optimización del control metabólico en la diabetes. (Calle, 1992). Diversos autores han estudiado los niveles de fructosamina y hemoglobina glicosilada en perros diabéticos. Todos ellos coinciden en la importancia de la determinación de ambos compuestos para el diagnóstico y control del tratamiento en animales con diabetes mellitus. Como conclusión, podemos decir que el análisis de fructosamina y hemoglobina glicosilada en perros es de gran utilidad en el diagnóstico y seguimiento del tratamiento en perros con diabetes mellitus o insulinoma; si bien es importante conocer el historial clínico, así como el perfil hematológico y bioquímico del animal. La elección de analizar la fructosamina o la hemoglobina glicosilada estará en función de las características y posibilidades analíticas del laboratorio, así como del número de muestras a analizar.
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1 0 Curso: Investigación II 2008 II. Maestría en Salud Animal