III. MATERIALES Y METODOS

3.1 Materiales -

6 Tubos para la digestión Kjeldahl

-

10 balones de fondo redondo

-

Thimbles

-

6 matraces de Erlenmeyer de 500 y 2000 mL.

-

6 Embudos grandes

-

2 pinzas (nueces).

-

1 soporte universal

-

1 pipeta de 10 mL.

-

1 Probeta de 100 mL.

-

1 frasco gotero de 25 mL.

-

1 pisceta grande con agua destilada.

-

1 Bureta de 50 mL.

-

1 par de guantes de Cuero.

-

1 pinzas largas.

-

Papel de filtro.

3.2 Equipo s -

Equipo digestor Kjeldahl modelo Velp Scientific

-

Espectrofotómetro de Infrarrojos modelo IFTIR-8400S

-

Equipo Destilador

-

Bomba de água

-

Balanza analítica +/- 0,0001 g.

-

Estufa modelo FANEM +/- 105 °C

-

Soxhlet

3.3 Reactivo s -

Rojo de metilo al 0.1% diluido en alcohol al 95%.

-

Ácido bórico al 2% - 4%.

-

Ácido clorhídrico 0.2N (solución valorada) y Concentrado 17

-

Hidróxido de sodio al 30% - 40%.

-

Ácido sulfúrico concentrado.

-

Mezcla catalizadora para la digestión

3.5 g de K2SO4 . y 0.4g de

CuSO4 · 5H2O. -

Indicador Tashiro: se prepara de la siguiente manera:

o de metilo al

01% en solución alcohólica y azul de metileno al 01% en solución alcohólica -

Mezclar: 2 partes de Rojo de metilo.

-

Hexano para análisis

-

Muestras de los diez cromotipos de maca

-

Cinta de Magnesio

-

Gelatina

-

FeCl3

-

Borntrager

-

Solucion de Fehling

-

Sulfato de cobre

-

Tartrato de sodio y potasio

-

solución de Luff – Schoorl

-

Yoduro de potasio

-

Almidón

-

sulfato cúprico (CuSO4. 5H2O)

-

50 g de ácido Cítrico (C6H8 O7.H2 O)

-

CO2 Na3

-

Tiosulfato de sodio

18

3.4 Mé todo s 3.4.1 Determinació n de proteínas 3.4.1.1 Preparación de la mues tra para la dig e s tión a. Pesar la muestra si es sólida aproximadamente 1 g anotar peso. Evitar que las muestras se adhieran a las paredes. b. Añadir el catalizador previamente pesado. c. Adicionar de 10 -15 mL de H2SO4 Concentrado. d. Adicionar perlas de ebullición para evitar que la espu

formada

rebalse en el tubo de muestra. e. Someter las muestras a digestión. El tiempo dependerá de los programas establecidos (rampas: Tiempo y temperatura).

gestión

termina cuando el color de la muestra sea azul-verde claro. f. Adicionar 50 - 70 mL de agua fría cuidadosamente, poco a poco, a La muestra digerida. Mezclar y dejar enfriar. Esto se hace para diluir el H2SO4 Presente en la muestra.

Figura 02: Muestras en digestión: T a 400 ºC y tiempo: 60 minutos Fuente: Elaboración propia, SEHS

19

3.4.1.2 Des tilac ión a. Encender y programar el equipo destilador. b. Abrir la llave de agua para tener el agua circulando t

o el tiempo.

c. Adicionar a 50 mL de NaOH al 30% (Neutralización). Colocar el tubo al equipo de destilación. 6-8 minutos. d. Colocar en el erlenmeyer donde se recogerá el destilado 20 mL de acido bórico del 2- 4% y dejar destilar hasta alcanzar un volumen entre 150 200 mL. e. Cuando termina el destilado retirar el matraz con el destilado para titular con HCl al 0.2 N, usando como indicador rojo de metilo. f. Al tubo destilado se saca con cuidado y los residuos se colocan en un recipiente para neutralizar (Líquidos contaminantes debemos tratar antes de eliminar al desagüe).

Figura 03: Destilador Fuente: Elaboración propia, SEHS

20

Nota: Después de cada destilación hay que realizar un avado al equipo con aproximadamente 400 mL de agua y por 5 minutos. Colocar el agua en el tubo y realizar la misma operación como si fuera un destilado.

3.4.1.3 Titulación a.

Retirar el Matraz del destilador contendiendo el destilado, adicionar 5 gotas del indicador rojo de metilo y luego titular con el HCl 0.2 N. Anotar el gasto de la titulación de HCl. Se titula el exceso de acido bórico.

3.4.2 Po rcentaje de Materia Gras a - Método So xlhets 1. Pesar 5 g de muestra con aprox. 0.001 +/- 1 g dentro de un cartucho de papel de filtro y sellarlo. 2. Colocarlo dentro de un thimble y taparlo con algodón. 3. Pesar el balón (W1) y luego agregar unos 120 ml de hexano. 4. Luego colocarlo dentro del soxhlet y llevarlo a extracción por lo menos 5 h. 5. Recuperar el solvente y colocarlo el balón dentro de la estufa de 105 ºC x 2 horas hasta eliminar el olor del solvente. 6. Sacar de la estufa, enfriar en el desecador y pesar (W2). Cálculo y Expres ión de lo s res ultado s W = Peso en g de la muestra. W1 = Peso en g del Balón W2 = Peso en g del balón + el residuo. % Materia Gras a = W2 – W1 x 100 W 21

Figura 04: Determinación de % Materia Grasa Fuente: Elaboración propia, SEHS

3.4.3 Po rcentaje de Hume dad Pesar cerca de 5 g de muestra preparada con una aproximación de 0.01 g dentro de un vaso tarado. Deje el vaso y contenidos por 1 hora en la estufa a 103 +/- 2°C . Deje enfriar en el desecador y pesar. Repetir e calentamiento y el peso por periodos sucesivos de 30 minutos hasta que la pérdida en masa entre dos pesos sucesivos no excedan en 0.05 g por 100 g de muestra.

22

Figura 05: Determinación de % Humedad de las Muestras de Maca Fuente: Elaboración propia, SEHS

Cálculo s y Res ultado s P = Peso de la muestra tomada (g) A = Peso de la muestra después de calentar (g ) Humedad (%) = P – A x 100 P 3.4.4 Medida en el es pe ctro infrarro jo – IR a) Preparació n del extracto acuo s o Las muestras

provenientes de Cerro de Pasco, fueron

seleccionadas los diez cromotipos de maca. Se mando moler y se obtuvo harina de maca para la preparación del extracto se requiere 500 g de harina seca, luego se coloco en un m

z

conteniendo 1500 mL de agua y se dejo en ebullición por dos horas con agitación contantes, se dejo enfriar. Luego

filtro el

residuo obtenido de seco a temperatura ambiente y luego se llevo a leer en equipo FTIR. (Gonzales e t al., 2005) 23

Figura 06: Preparación del extracto acuoso para análisis de IR Fuente: Elaboración propia, SEHS.

Figura 07: filtración del extracto acuoso para análisis de IR Fuente: Elaboración propia, SEHS.

24

Figura 08: secado de las muestras de maca para análisis de IR Fuente: Elaboración propia, SEHS

Figura 09: Colocando la muestra en el equipo de IR Fuente: Elaboración propia, SEHS

25

Figura 10: Lectura de los espectros en el equipo de FTIR - 8400S Fuente: Elaboración propia, SEHS

26

3.4.5 De terminació n de anális is fito quimico Muestra seca y molida (50 g)

Colocar a reflujo por 1 hora en etanol a 95% y luego filtrar

Concentrar la solución etanólica

Ca. 15 g extraer con HCl 5% alcalinizar con NaOH al 20%, extraer con CHCl3 y CHCl3 : EtOH (3:2)

Ca. 20 g extraer con éter de petróleo

Residuo extraer con etanol: agua (1:7) a 60 ºC Ext. Clorofórmico y ext. Clorofórmico: Etanólico (por separado)

Identificar

Concentrar, extraer con HCl 5% Flavono ide s Shinoda

Solución Acida

Antraquinonas Borntrager

Taninos Gelatina FeCl3

Saponinas Espuma

Alcaloide Dragendorff Mayer

Fuente: Lock, 1988

27

3.4.6 Po rcentaje de Azuc ares reducto res 1. Preparació n de la mues tra Pesar 25 g de muestra, licuar con 200 mL de agua y luego enrazar hasta 50 ml en un fiola volumétrica. Filtrar y tomar una alícuota de 25 mL. ü Tomar 25 ml de la muestra filtrada (que no contenga más de 50 mg

de azúcares) en un matraz con 25 de la solución de Luff – Schoorl. ü Añadir unas perlas de vidrio y conectar al refrigerante de reflujo. ü Calentar el matraz con potente llama hasta alcanzar en dos minutos

la ebullición y mantener esta durante diez minutos exactamente. ü Enfriar con agua por 5 minutos y cuando el matraz este frío, añadir

con cuidado 10 ml de yoduro de potasio, 25 ml de ácido sulfúrico y 2 mL de almidón. ü Valorar con

tiosulfato de sodio hasta viraje del indicador

(amarillento blanco). Si se hubiera empleado menos de

ml de la

valoración, repetir la determinación utilizando una dilución de la muestra más adecuada. 2. Cálculo s Ejemplo Prueba blanco: Titulado 24.90 mL de solución de Na2S2O3 Prueba Usado

: titulado 20.09 mL de solución de Na2S2 O3 4,81 mL de solución de tiosulfato es equivalente a

11,73 mg de glucosa (ver tabla 02). Consecuentemente en 2500 mg de papa contiene 11,73 mg de glucosa o como porcentaje.

La papa tiene =

100 x11.73mg = 0,47%azúcar 2500mg 28

No ta: determinar el factor de tiosulfato y tenerlo en cuenta al calcular el blanco y la muestra valorada. Tabla 2: Para 25 mL de reactivo Luff – Schoorl mL de Na2S2O3 0.1 N Glucosa, fructuosa, azúcares invertidos C6H12O6 mL

Mg

Diferencia

1

2,4

2,4

2

4,8

2,4

3

7,2

2,5

4

9,7

2,5

5

12,2

2,5

6

14,7

2,5

7

17,2

2,6

8

19,8

2,6

9

22,4

2,6

10

25,0

2,6

11

27,6

2,7

12

30,3

2,7

13

33,0

2,7

14

35,7

2,8

15

38,5

2,8

16

41,3

2,9

17

44,2

2,9

18

47,1

2,9

19

50,0

3,0

20

53,0

3,0

21

56,0

3,1

22

59,1

3,1

23

62,2

3,1

24

65,3

3,2

25

68,5

Fuente: Federación Internacional de Jugos y Frutas 1985

29

3.5 Técnicas para la evaluac ión de lo s dato s 3.5.1 S elección de lo s cro motipo s La selección de los cromotipos se hizo en muestras de maca seca y fresca como se indica en los resultados (figuras) para cada uno de los análisis según procedimientos.

3.5.2 Anális is Fís ico - químico y fitoquimico Se determino él % de proteínas; % humedad en muestras de maca fresca y seca, el % de materia grasa y análisis f quimico se

hizo

en

muestras

de

macas

secas.

Siguiendo

procedimientos descritos.

3.5.3 Gráfico s de res ultado s Los resultados se muestran en tablas y figuras, comparados con la literatura existente.

30