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Javier Ibáñez Instituto de Ciencias de la Vid y del Vino (ICVV) Logroño (La Rioja)
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
Introducción Análisis de ADN Marcadores RAPD Marcadores SSR (microsatélites) Marcadores AFLP Marcadores SNP Marcadores específicos Conclusiones y futuro
Entre los objetivos de la caracterización de variedades se incluyen:
Identificación inequívoca de cualquier variedad
Establecer las relaciones genéticas existentes entre las variedades
Gran extensión cultivo: Espacio Tiempo
Gran número de variedades Enorme confusión en las denominaciones: sinonimias y homonimias
Petit Bouschet Cruzamiento
Garnacha Tintorera
Garnacha
Mutación genética
Garnacha peluda
Cambio denominación
Tinto de Navalcarnero
Negrón de Aldán Petit Bouschet
Garnacha
Lladoner
Gironet
Garnacha Moratón Navarro Garnacha Tinto de tinta Aragón Alicante Garnacho Cruzamiento Cambio Colorina Mutación Bouschet negro Garnacha Garnacha genética denominación Tintorera Aragón gris C. de Rioja Garnacha Garnacha Tinto de de Liria Tintorera peluda Navalcarnero Tintorera Garnacha Garnacha Garnacha Negra del Tinto país de dorada Tinto Tinto fina Negral Garnacha Navalcarnero Aragonés Aragonés
Particulares, Viveristas Oficina Española de variedades vegetales (OEVV) Consejos Reguladores de las Denominaciones de Origen Propietarios y licenciatarios de variedades patentadas
¿Qué es un marcador genético?
Cualquier diferencia detectable controlada genéticamente: • Color del fruto • Época de fructificación • Resistencia al ataque de un determinado hongo • Una secuencia de ADN
Reproducción vegetativa o asexual: variedades muy uniformes (vg. Vid, patata) Reproducción sexual:
Autógamas: variedades muy uniformes (vg. Trigo,
tomate) Alógamas: variedades heterogéneas (vg. Maiz, calabaza)
Descripciones morfológicas: Ampelografía Descriptores para: Sumidad Hoja joven Hoja adulta Racimo Baya
Tiempo (largo) Material (falta de disponibilidad según la época del año) Número limitado de caracteres estudiables (falta de capacidad de discriminación) Subjetividad de algunos descriptores Influencia del ambiente (falta de reproducibilidad)
1.
Marcadores de ADN para una identificación rápida
2.
Descripción morfológica comparativa con la variedad de referencia
Molécula hereditaria Dos cadenas de nucleótidos formando una doble hélice
PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa Reproduce in vitro lo que ocurre en las células durante la replicación del ADN Amplificación exponencial en un tubo de ensayo de segmentos pequeños de ADN
1 molécula inicial 31 ciclos
230 = 1.073.741.824 moléculas
Obtener el material vegetal Extraer el ADN Aplicar al ADN la técnica molecular Obtener los resultados Interpretar los resultados APLICACIÓN
Random Amplified Polymorphic DNA
Consiste en la amplificación mediante PCR de fragmentos anónimos de ADN, utilizando para ello un cebador de secuencia arbitraria Normalmente se usa un solo cebador, de 10 nucleótidos de longitud y con un contenido alto en G+C Ejemplo: OP-A01 CAGGCCTTCG
−
+
1
1
2 −
2
+
Herencia dominante Reproducibilidad intra-laboratorio Interpretación de bandas Transferibilidad a otros laboratorios
Microsatélites (Simple Sequence Repeats)
Repeticiones de secuencias cortas de ADN Muy variables Muy abundantes Muy extendidas
ADN genómico
Microsatélite ..CAGCCCGTAAATGTATCCATCATTAGCTTTCGATAAAGACCATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTGTGAAACCCAGTTGAATTAGAATTTTGAATTT.. ..GTCGGGCATTTACATAGGTAGTAATCGAAAGCTATTTCTGGTAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACACTTTGGGTCAACTTAATCTTAAAACTTAAA..
Microsatélite
Variedad A
Extracción ADN
Variedad B
Amplificación
Separación + Detección
VVS29
VVMD7
VVS2
VVS1
VVMD5
Perlette
170 178 246 252 133 145 181 188 232 234
Rodi
170 178 238 248 149 151 180 181 230 232
Rutilia
170 174 238 242 143 151 181 190 232 232
Sultana Moscata 170 178 238 248 149 151 181 188 226 232 Sugraone
170 178 238 248 135 135 181 181 224 234
Fiabilidad de la identificación para una variedad concreta (Sugraone): 6 microsatélites. LR = 1 en 87.000 9 microsatélites. LR = 1 en 156.000.000
Hasta ahora, usando el set de 9 microsatélites, se han distinguido cualesquiera dos variedades que provengan de un cruzamiento. En general, no se pueden distinguir clones ni variedades originadas por una mutación somática. 1 caso: 1 alelo Máxima Variación intra-varietal 2 casos: 2 alelos Mínima Variación intervarietal
Requiere conocimiento previo del genoma: Inicialmente lentos Inicialmente costosos
Categorización de alelos (“allele binning”) Coste medio
Amplified Fragment Length Polymorphism
Desarrollo de marcadores moleculares en vid: AFLPs
No mejora el sistema de identificación con microsatélites
Meneghetti et al. (2012). "Inter- and Intra-Varietal Genetic Variability in Malvasia Cultivars." Molecular Biotechnology 50(3): 189-199.
Single Nucleotide Polymorphism
Single Nucleotide Polymorphisms
SNPs
Frecuencia muy alta Ubicuos Bi-alélicos Co-dominantes
Allele binning simple Repetibles Automatizable Transferibles entre laboratorios Baratos
Microsatélites
Frecuencia alta Menos ubicuos Multi-alélicos Co-dominantes
Allele binning complejo Repetibles Menos automatizable Menos transferibles entre laboratorios Baratos
Conjunto de 48 SNPs Identificación genética
Conjunto de 240 SNPs Estructura genética Pedigríes Mapas genéticos
Muestras de España, Argelia, Argentina, Australia, Bélgica, Francia, Irán, Italia, Marruecos, Montenegro, Portugal, Túnez
6906 muestras analizadas 1670 genotipos únicos 314 genotipos de vides silvestres
Variedades más próximas difieren en 5 alelos Clones y sports muestran genotipos idénticos en general. No es útil para portainjertos y especies no viníferas
431 variedades de la colección de vid de El Encín como candidatos 243 SNPs 26 microsatélites nucleares 4 microsatélites cloroplásticos 40 caracteres morfológicos
Castellana Blanca
Albillo Mayor
Benedicto
Tempranillo
Albillo Dorado
Benedicto Falso de Aragón Marufo
Coloraíllo
Moribel
Marcadores específicos
El desarrollo del color de la piel de la baya está determinado por los tipos y cantidad de diferentes pigmentos antocianos. Una inserción de ADN en el gen “del color” impide su expresión
ITA ALF
FENOTIPO GENOTIPO
Negro
ALF/ALF
Rojo
ITA/ALF
Blanco
ITA/ITA
Conclusiones
Mediante análisis de ADN, se pueden distinguir cualesquiera dos variedades que provengan de un cruzamiento. En general, no se pueden distinguir clones ni variedades originadas por una mutación somática. Cuando se conoce la base genética de la variación sí se pueden distinguir mediante análisis de ADN.
¿Cómo puede ayudar la era genómica? Nuevos marcadores específicos de genes concretos: Distinguir clones Distinguir variedades originadas por una mutación
somática.
Kits identificación rápida
Grupo Genética y Genómica de la Vid (ICVV) José Miguel Martínez Zapater Pablo Carbonell Jerome Grimplet José Díaz Riquelme Nieves Diestro Lalla Hasna Zinelabidine Javier Tello Gema Bravo Ignacia Montemayor Silvia Hernáiz Virginia Rodríguez Beatriz Larreina Carolina Royo Brun Elisabet Vaquero Jiménez Rufino Aguirrezábal
CEAZA, Chile (Andrés Zurita). CSIRO, Australia (Mark Thomas). IASMA Italia, (Stella Grando, Riccardo Velasco). ICIA, Canarias (Inmaculada Rodríguez-Torres). IMIDA , Murcia (Juan Carreño). IMIDRA, Madrid (Félix Cabello, Maite de Andrés). INRA Montpellier, Francia (Laurent Torregrosa, Patrice This, Loic Le Cunff). INRA Colmar, Francia (Didier Merdinoglu, Eric Dûchene). INRA Evry, Francia (Anne Françoise Adam-Blondon). INRB, INIA-Dois Portos , Portugal (José E. Eiras-Dias). IRA, Túnez (Sana Ghaffari). ISVV Bordeaux, Francia (Natalie Ollat, Serge Delrot). ITQB, Lisboa, Portugal (Pedro Fevereiro, Jorge Cunha). Julius Kühn Institut Geilweilerhof, Alemania (Eva Zyprian, Reinhard Toepfer). Universidad de Cuyo, Mendoza, Argentina (Diego Lijavetzky). Universidad de Navarra (Manuel Sánchez, Fermín Morales). Universidad de Sevilla (Rafael Ocete). Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Portugal (Paula Lopes).