INMUNOLOGÍA

LA INFLUENZA A(H1N1)* Inés García Rodríguez**

L

a cepa H1N1 o H1N1 humana es un subtipo de Influenzavirus tipo A del virus de la gripe perteneciente a la familia de los Orthomyxoviridae.

sos, 88 casos confirmados(incluyendo 2 fallecimientos), 9 casos probables y 1.440 casos descartados (1.283 por laboratorio y 157 que no cumplen definición de caso).

El H1N1 ha mutado en diversos subtipos que incluyen la gripe española (extinta en la vida Silvestre), la gripe porcina, la gripe aviar y la gripe bovina. La cepa mantiene su circulación después de haber sido reintroducida en la población humana en los años 1970.

Los casos confirmados a 28 de Junio, eran: 4 en Cundinamarca, 29 en Bogotá (incluidos 2 fallecimientos),10 en Cali - Valle del Cauca, 1 en Sevilla - Valle del Cauca, 9 en Yopal - Casanare, 9 en Medellín - Antioquia, 1 en Guatapé - Antioquia, 1 en Itaguí - Antioquia, 1 en Cartagena - Bolívar, 9 en Barranquilla - Atlántico, 3 en Santander, 1 en Risaralda y 2 en Tunja - Boyacá.

Cuando se comparó el virus de 1918 con el actual, el virólogo Jeffery Taubenberger descubrió que únicamente hubo alteraciones en solo 25 a 30 aminoácidos de los 4.400 que componen el virus. Estos ligeros cambios pueden convertir al virus en una mortífera enfermedad que se puede transmitir persona a persona. Actualmente, existen algunas mutaciones del virus H1N1 en la vida silvestre, causando al menos la mitad de infecciones de gripe ocurridas durante el año 2006. Desde mediados de marzo del 2009, al menos 900 casos mortales han ocurrido en Europa y América por la pandemia de una nueva cepa de H1N1, otras 100 muertes en México aún no están oficialmente confirmadas como casos de influenza H1N1.

Colombia fue el primer país de Suramérica en detectar presencia de la enfermedad, el pasado 3 de Mayo. La primera víctima del virus, una mujer de 24 años falleció el 5 de Junio en el Hospital de Meissen en Bogotá donde fue internada por una fuerte neumonía. El 19 de Junio falleció también en Bogotá un paciente de 28 años, que 2 días antes presentó un caso bastante agresivo, extenso y fulminante por complicaciones asociadas al virus A(H1N1). Según autoridades sanitarias en ambos casos las víctimas no tuvieron contacto con nadie que hubiera viajado al exterior, por tanto se plantean como casos de “circulación autóctona del virus”.

Avanza la Influenza A (H1N1) en Colombia Hasta el pasado 29 de Junio en Colombia se habían presentado 2.309 alertas de posibles sintomáticos con antecedentes de viaje a áreas afectadas o de contacto con casos de Influenza A(H1N1), 759 casos sospecho-

* El presente artículo se elaboró con base en la revisión de documentos estadísticos de Salud Pública, Informes de la OMS, Datos tomados por Internet del Manual WHO Genova 2005, Manual Vigilancia MPS. ** Bacterióloga Universidad Javeriana, MSc Microbiología London University, Gerencia y Administración de Salud CEAD e-mail: [email protected]

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Primera Pandemia del siglo XXI La Organización Mundial de la Salud (OMS) declaró el pasado 11 de Junio la fase 6 de alerta por el virus Influenza A (H1N1), esto declara la primera pandemia del siglo XXI ante pruebas incuestio nables de una propagación comunitaria del nuevo virus en varios paises de las diferentes regiones de la OMS. El nivel 6 es caracterizado por la existencia de una transmisión elevada y sostenida en el mundo, en una situación de pandemia declarada, implicando diseminación y no mayor gravedad.

ficie del virus Hemaglutinina (H) y Neuraminidasa (N). Todos los virus de influenza contienen estas proteínas, pero la estructura de las proteínas difiere de cepa a cepa debido a una rápida mutación genética en el genoma viral. Las cepas del virus Influenza A tienen asignada la nomenclatura H-Número y N-Número según las variantes de las 2 proteínas que contiene. Hay 16 subtipos H y 9 subtipos N, conocidos en aves. Solo 3 H y 2 N se encuentran en humanos.

La directora de la OMS Margareth Chan, reconoció “el virus no puede ser detenido”, explicó, el virus A (H1N1) se transmite entre humanos, pero la pandemia es moderada y se espera no llegar a un aumento dramático de infectados. Se mostró preocupada por el imprevisible comportamiento de un patógeno infectando sobre todo a jóvenes menores de 25 años.

(HA) Hemaglutinina (NA) Neuraminidasa

Hasta el día 30 de junio se habían notificado oficialmente 77.250 casos de influenza A (H1N1) en 120 países y el total de fallecidos era de 332 personas. Hasta agosto 25/09 se habían registrado en Colombia 507 casos positivos y 29 fallecimientos. NOMENCLATURA Todos los Influenzavirus tipo A están categorizados de acuerdo a las 2 proteínas encontradas en la super-

enco-des US1 and NEP

1918 “Spanish influenza”

1957 “Spanish influenza”

1968 “Hong Kong influenza”

H1N1 influenza virus

H2N2 influenza virus

H3N2 influenza virus

H2N2 avian virus

H1N1 human virus

H3 avian virus

H2N2 human virus

Bird-to-human transmission of H1N1 virus

Haemagglutinin Neuraminidase

All eight genetic segments thought to have originated from avian influenza virus

Reassortment

Reassortment

Three new genetic segments from avian influenza virus introduced (H, N, PB1); contained five RNA segments from 1918

Two new genetic segments from avian influenza virus introduced (H, PB1); contained five RNA segments from 1918

Next pandemic influenza

Avian virus or H3 H3N2 avian virus human virus

All eight genes new or further derivative of 1918 virus

Copyright © 2006 Nature Publishing Group Nature Reviews Y Drug Discovery

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FISIOPATOLOGÍA Los virus de Influenza se enlazan mediante hemaglutinina en residuos de azúcares de ácido siálico en las superficies de las células epiteliales; típicamente en la nariz, garganta y pulmones de mamíferos o en el intestino de las aves.

das por la tos o estornudos y por contacto con las superficies contaminadas. Esto ocurre desde un día previo al inicio de síntomas y hasta 7 días después del inicio. Los síntomas son similares a los de la influenza estacional, fiebre, tos, mialgias, odinofagia, cefalea, letargia, en algunas personas se presenta secreción nasal, náuseas, vómito y diarrea. REMISIÓN Y TRATAMIENTO DEL VIRUS Se hará de acuerdo a la GUÍA DE ESTUDIO Y MANEJO DE CASOS Y SUS CONTACTOS PARA ENFERMEDAD SIMILAR A INFLUENZA incluyendo diagnóstico, manejo clínico y terapéutico con los lineamientos emitidos por Ministerio de Protección Social (MPS) y Secretaría Distrital de Salud (SDS). Los antivirales utilizados pueden variar en la medida que se disponga de más información sobre su eficacia, el espectro clínico de la enfermedad, eventos adversos y susceptibilidad. La formulación es responsabilidad del médico tratante.

SINTOMATOLOGÍA En la mayoría de los casos de infección por el subtipo H1N1 se manifiesta de forma similar y con síntomas clásicos a cualquier caso de infección por gripe común (influenza tipo A), Aumenta la secreción nasal, tos, dolor de garganta, fiebre alta (mayor a 38°C), malestar general, pérdida de apetito, dolor en articulaciones, vómito, diarrea, y en casos de mala evolución, desorientación y perdida de conciencia. Los individuos inmunosuprimidos sufren mayor agresión del virus, y pueden contraer neumonía fácilmente. GRUPOS POBLACIONALES MÁS VULNERABLES Las personas mayores de 65 años. Los niños entre 6 meses y 2 años. Embarazadas cursando el 2° y 3° trimestre de gestación Niños prematuros con peso menor a 1.500 gramos. Paciente con afecciones crónicas en sistema cardiovascular y pulmonar. Pacientes con insuficiencia renal y enfermedades metabólicas. Pacientes inmunosuprimidos. Niños y Adolescentes con terapia prolongada con ácido acetilsalicílico (Aspirina). COMPORTAMIENTO Y TRANSMISIÓN DEL VIRUS La transmisión del virus H1N1 se produce por vía respiratoria principalmente por gotas de saliva produciLaboratorio Actual • Año 25 • No. 41 • Octubre de 2009

La presentación de OSELTAMIVIR en cápsulas, disponible a la fecha está indicada para tratamiento en adultos. Es necesario tener en cuenta para el uso pediátrico debe diluirse según las indicaciones del laboratorio fabricante, procedimiento cuya responsabilidad tiene el servicio farmacéutico en cada institución. La Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos (FDA por su sigla en inglés), autorizó el uso de TAMIFLU y RELENZA en casos de emergencia y una prueba de diagnóstico para ayudar a controlar una nueva cepa de gripe porcina. Al respecto, se tiene un ensayo Quick View para Influenza Tipo A y B, que está compuesto por un hisopo largo, que es bañado en una solución sensible que detecta, por medio del color el virus. El hisopo se introduce en la nariz, en la zona más profunda y con sólo unos segundos de estar en el área es suficiente para absorver parte del virus; luego se introduce en una solución que colorea (de acuerdo a diversas tonalidades ya preestablecidas) y si , tiene cierto tono, es virus de la Influenza, ya sea tipo A o B. Sólo se requieren diez minutos para que el hisopo se tiña de cierto color, lo cual es fundamental para lograr un diagnóstico adecuado. También, se cuenta con la prueba diagnóstico rRT-PCR Swine Flu Panel que fue autorizado por la (FDA) para analizar muestras de pacientes de gripe a fin de determinar, si tienen la nueva cepa. Laboratorios calificados pueden usar en caso de urgencia el Panel en Tiempo Real - PCR para la detección del Virus de la Influenza en presuntos casos para diagnosticar la nueva cepa H1N1. Este panel está autorizado solamente para uso en individuos que hayan

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sido diagnosticados con Influenza A y que no puedan ser diagnosticados por la metodología actual aprobada por la (FDA). El análisis debe realizarse siguiendo adecuadamente las instrucciones para su uso, y con las limitaciones que presenta. Este panel para detección in vitro del virus, utiliza hisopos de muestras nasofaríngeas y/o nasales de pacientes con signos y síntomas de enfermedad infecciosa y cultivo viral para detección de Influenza A(H1N1), y se realiza en un equipo de Applied Byosistems 7500 Fast Dx Real Time PCR. Los laboratorios calificados para realizar este proceso deben reportar sus resultados a las autoridades de salud de su país, y el Centro de Control de las Enfermedades (CDC por sus siglas en inglés) en Washington, D.C. será quien realice el seguimiento de los eventos. OPERADORES DE SALUD Y BIOSEGURIDAD

Enjuagar con abundante agua para que sea efectivo el lavado.

Finalizar secando con toalla dese­ chable preferiblemente.

BIOSEGURIDAD PARA PREVENIR INFECCIÓN DEL VIRUS A(H1N1) * Medidas de distancia social y aislamiento de personas con infección respiratoria.

Se debe aplicar las máximas medidas de bioseguridad durante la atención de los pacientes. Utilizar siempre elementos de protección personal y desecharlos de acuerdo a las normas de bioseguridad y el plan de gestión integral de residuos hospitalarios y similares.

* Usar tapabocas las personas con gripa.

Después de toda atención los profesionales de salud deben aplicar el protocolo universal de lavado de manos.

* No compartir alimentos, vasos, cubiertos.

Técnica para el lavado de manos de rutina

Humedecer las manos con abundante agua.

* No saludar de beso, ni de mano. * Ventilar y permitir entrada del sol en casa, oficina y lugares cerrados.

* Mantener limpias las cubiertas de cocina, baños, manijas, barandas, juguetes, teléfonos y demás objetos de uso común. * Estar abrigado y evitar cambios bruscos de temperatura. * Comer frutas y verduras ricas en vitamina A y C (zanahoria, papaya, guayaba, naranja, lima, limón y piña). * Lavar las manos frecuentemente con agua y jabón. * Evitar exposición a contaminantes ambientales.

Aplicar un promedio de 5 c.c. del jabón líquido antiséptico, preferiblemente con componente yodado.

* No fumar en lugares cerrados ni cerca de niños, ancianos o enfermos. * Acudir al médico inmediatamente presente signos de alarma como tos, fiebre de 38°C o más. * No asistir a actividades masivas con síndrome gripal, usar tapaboca.

Frotar palmas y dorsos 5 cm por encima de la muñeca.

TOMA DE MUESTRA EN PACIENTE AMBULATORIO Condiciones generales del paciente para la toma de muestra

Frotar dedo por dedo, espacios interdigitales y las uñas.

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Antes de realizar cualquier procedimiento, explique al paciente el procedimiento a realizar y las molestias que

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éste le puede causar. Sin embargo, aclare la necesidad de realizarlo con su colaboración para tener éxito en el procedimiento y obtener una muestra adecuada para la identificación viral. El paciente debe ubicarse en una silla cómoda, con la cabeza ligeramente inclinada hacia atrás para proceder a realizar según elección la siguiente toma de muestra.

Procedimiento para la toma de Hisopado/Frotis nasal

4. Marcar el recipiente de la muestra.

Tracto respiratorio superior

1. Insertar un escobillón en la ventana nasal, paralelo al paladar, y deslizar por el piso de la mucosa permaneciendo en el lugar por unos segundos.

Procedimiento para la toma de muestra de Hisopado/ Frotis faríngeo.

1. Pida al paciente que abra la boca y saque la lengua, repitiendo reiteradamente la letra “a” con el fin de mantener la faringe cerrada.

2. Con la ayuda de un bajalenguas, presione la lengua. La manipulación en este momento de la toma de muestra es de gran importancia para evitar la lengua y la contaminación que de ella se derive.

3. Colocar el escobillón en el vial que contiene el medio de transporte viral, cortar el resto del escobillón y tapar el vial.

2. Rotar el escobillón lentamente.

Procedimiento para la toma de Hisopado/Frotis nasofaríngeo

3. Tome el hisopo, colóquelo en la parte posterior y superior de la faringe, lo más cercano a la nasofaringe. 4. Luego rote el hisopo por la parte posterior de las tonsilas, mediante movimiento enérgico rotatorio y a la vez de arriba hacia abajo, con el fin de lograr obtener el mayor número de celulas.

5. Coloque el hisopo con la muestra en el vial medio de transporte viral o virocult® y marque el recipiente (nombre, apellidos, edad, fecha y hora).

El medio VIRAL contiene BHI + Albúmina + Fungizone + Gentamicina. Los hisopos utilizados deben ser en dacron, rayón o fibra poliéster, no de algodón. Laboratorio Actual • Año 25 • No. 41 • Octubre de 2009

1. Insertar el escobillón en la ventana nasal paralela al paladar. Deslizar por la mucosa del piso de la fosa nasal hasta tocar la pared posterior de la faringe, asegurándose que se encuentra en el área de la nasofaringe. 2. Frotar la zona de la nasofaringe haciendo girar el escobillón para obtener una buena cantidad de células epiteliales. 3. Retirar lentamente el escobillón con movimiento giratorio para absorber las secreciones. 4. Repetir el procedimiento en la otra ventana nasal utilizando otro hisopo. 5. Colocar los escobillones en el vial que contiene el medio de transporte viral, corte el resto del escobillón y tape el vial. 6. Marcar el recipiente de la muestra.

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CONSERVACIÓN DE MUESTRAS Siempre habrá que adoptar las precauciones convencionales y aplicar métodos de protección de barrera cada vez que se obtengan muestras de pacientes, conservando la cadena de frío.

Si la muestra es depositada en:

Virocult©

Medio de transporte viral INS

cipiente primario debe ser a prueba de fugas (debe ser tapa rosca) y colocado de tal forma que conserve la posición vertical (en gradilla u otro soporte). El recipiente secundario o de transporte que contiene las muestras debe ser de plástico, hermético y a prueba de fugas de líquido. Además debe contar con la respectiva identificación que incluye: nombre del paciente, número de historia clínica, tipo de análisis y/o breve descripción del cuadro clínico. No se debe envolver alrededor del tubo o del recipiente primario, sino que se debe colocar por separado preferentemente en bolsas plásticas. El transporte de material infeccioso está sometido a reglamentaciones nacionales e internacionales según las especificaciones de Naciones Unidas de la División en que están incluidas sustancias infecciosas. Características del embalaje

CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS SEGÚN MEDIO



Medio de transporte viral INS

Virocult©

Tiempo Temperatura Tiempo Temperatura

1 semana

4ºC a 8ªC

2 meses (-) 20ºC 6 - 8 meses (-) 70ºC

2 días

4ºC a 8ºC

No debe ser congelada

Si la muestra es de aspirado nasofaríngeo, aspirado bronquial o lavado broncoalveolar los cuales se obtienen con solución salina estéril en ausencia del medio de transporte viral bajo los parámetros del INS, deben refrigerarse inmediatamente y transportarse al LSP a la mayor brevedad (antes de 24 horas).

Aislamiento del virus

El embalaje debe ser de buena calidad lo suficientemente fuerte, para soportar golpes y cargas que normalmente se presentan durante el transporte. Deben estar cerrados para prevenir pérdida del contenido causado bajo las condiciones normales del transporte, vibración, o por cambios de temperatura, humedad o la presión.

El embalaje debe tener 3 componentes:

Recipiente Principal o Primario hermético éste contiene la muestra debidamente rotulada y envuelta en material absorbente, para contener los líquidos en caso de rotura. Embalaje Secundario hermético resistente e impermeable, éste contiene y protege el envase primario, debe resistir presión de 95kpa(0,95bar) a temperaturas de -40°C a 55°C debe ser asegurado con respecto al embalaje terciario con material acolchado, cartón acanalado o cavidad peltrada. El embalaje Exterior o Terciario debe ser rígido y proteger el empaque secundario y su contenido, debe llevar etiquetas que indiquen posición del paquete. PROCEDIMIENTO DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA De acuerdo a la “Prueba de inmunofluorescencia indirecta para virus respiratorios”, Código: MEN-R02003-5006, 4.7 Descripción de la técnica.

TRANSPORTE DE MUESTRAS Desde el consultorio al laboratorio, al interior de la institución. El recipiente que contiene la muestra o re-

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Identificación diagnóstica del virus Prueba de inmunofluorescencia indirecta para virus respiratorios, MEN R02003-5006. Descripción de 4.7 la técnica. Paciente

Definiciones de caso según protocolo de Enfermedad Similar a la Influenza.

4.7.1.5

Muestras: Hisopado faringeo, aspirados nasales o laxados broncoalveolares.

4.7.1.11

Retirar el escobillón

4.7.1.12

Vortex

4.7.1.13

Centrifugar el vial a 1700 rpm durante 10 minutos a 4ºC.

Lavar el pellet de células con PBS pH 7.2

Separar el sobrenadante y conservarlo en un vial plástico a -70ºC

4.7.1.14

Vortex

Centrifugar el vial a 1700 rpm durante 10 minutos a 4ºC

Decantar el sobrenadante

Adicionar al vial decantado, alrededor de 1,5 ml de PBS

Vortex

Centrifugar el vial a 1700 rpm durante 10 minutos a 4ºC

Decantar el sobrenadante

Adicionar al vial decantado, alrededor de 1,5 ml de PBS

4.7.1.15

4.7.1.16

IFI

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Prueba de inmunofluorescencia indirecta para virus respiratorios, MEN-R02003-5006, 4.7 Descripción de la técnica, parte 1.

4.7.1.16

Decantar el sobrenadante

Resuspender el pellet celular con mínimo 50 ml de PBS pH 7.2.

4.7.1.17

Homogenizar hasta obtener una suspensión opalescente

Mezclar muy bien y agregar 10 ml a cada pozo

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9

Dejar secar

Agregar Acetona helada, dejar secar durante 10 minutos

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Influenza A Influenza B Virus Sincitial Respiratorio Adenovirus Parainfluenza 1 Parainfluenza 2 Parainfluenza 3 Control Negativo Pool

4.7.1.19

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Prueba de inmunofluorescencia indirecta para virus respiratorios, MEN-R02003-5006, 4.7 Descripción de la técnica, parte 2.

Agregar 1 gota de anticuerpo monoclonal específico para la identificación de cada virus. 1

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4.7.2

4.7.2.2

Incubar a 37ºC durante 30 minutos en una cámara húmeda

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Escurrir fuertemente y de manera horizontal.

4.7.2.3

Colocar el portaobjetos en un recipiente de Coplin y cubrir con PBS Tween 20/azida de sodio y otro con agua destilada de 3 a 5 minutos cada uno. PBS

Dejar secar al aire dentro de la cámara de seguridad biológica

4.7.2.4

Agregar suficiente FIT C-labeled Anti-Mouse IgG Conjugate, para cubrir las células.

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Prueba de inmunofluorescencia indirecta para virus respiratorios, MEN-R02003-5006, 4.7 Descripción de la técnica, parte 3.

Incubar a 37ºC durante 30 minutos en una cámara húmeda

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9

Escurrir fuertemente y de manera horizontal

4.7.2.3

Colocar el portaobjetos en un recipiente de Coplin y realizar 2 lavados con PBS Tween 20/ azida de sodio uno de 2 minutos y el otro de 3-5 minutos.

4.7.2.7

PBS

Colocar el portaobjetos en un recipiente de Coplin y realizar 2 lavados con agua destilada uno de dos minutos y el otro de 3-5 minutos.

4.7.2.8

H 20

Dejar secar al aire dentro de la cámara de seguridad biológica

4.7.2.9

Colocar una gota de líquido de montaje a cada pozo con laminilla

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