“Malassezia spp. en perros y gatos” Relevamiento bibliografico Casos Tratamientos

Gustavo Pablo Tártara Especialista Médico Veterinario

Tártara, Gustavo Pablo Malassezia spp en perros y gatos : relevamiento bibliográfico : casos, tratamientos / Gustavo Pablo Tártara. - 1a ed . - Rosario : UNR Editora. Editorial de la Universidad Nacional de Rosario, 2016. Libro digital, PDF Archivo Digital: descarga y online ISBN 978-987-702-149-3 1. Microbiología Veterinaria. I. Título. CDD 636.0891

Malassezia spp.

“Relevamiento Bibliográfico de Malassezia spp. en perros y gatos”

E

l presente libro contiene los resultados obtenidos en la búsqueda bibliográfica llevadas a cabo en la Cátedra de Microbiología de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de Rosario bajo la dirección de la Dra. Laura Ramos. La incorporación de casos clínicos y tratamientos ha sido lograda por la participación de destacados colegas dermatologos de Latinoamerica con supervision del Dr. Fernando Fogel.

Objetivos generales Realizar una actualización bibliográfica de las especies del género Malassezia para conocer su rol en las infecciones en gatos y perros aportando información para su tratamiento y comprensión de su interacción con el sistema inmune.

Objetivos específicos Realizar búsqueda bibliográfica sobre el género Malassezia de los siguientes ítems: Ecología. Taxonomía. Estructura, fisiología y biología. Cultivo, identificación y preservación. Asociación con enfermedades de piel en perros y gatos. Interacción con el sistema inmune del hospedero. Tratamiento. Casos clínicos. Bibliografía

Agradecimientos

A

mis padres Susana Riboldi y Pedro Tártara que me plantearon oportunamente las opciones de estudiar o trabajar. A mi esposa María Eugenia Felizia que siempre supo ver lo mejor en mí y al momento no entiendo como lo logra. A mis hijos Margarita Eugenia y Gerónimo Pablo que son seres humanos increíbles, de los que aprendo todos los días. A Laura Ramos por haberme dirigido

en la realización de esta tesina desafiando a su destino y demostrar en todo momento un gran interés en mi producción tanto que en momentos pudo haber sido hasta mayor al mío. A Clara López que ha sido la persona que me abrió la puerta a este mundo de la micología. A Silvana Ramadán que me cedió gentilmente parte de su esfuerzo para que el mío no sea mayor. A Oscar Bottasso que me ha sabido

orientar y ante mis consultas recurrentes no me golpeó ni una vez. A los miembros del CEREMIC que me han tratado como una persona de bien y responsable, lo que no me ha dado opción para comportarme de otra manera.

Índice

A los docentes de la especialidad que han dedicado un tiempo a disminuir mi ignorancia. A los compañeros de la especialidad que fueron el motivo para llegar antes de hora a las clases. A Claudia Echenique por empapelarme con trabajos publicados y no darme la posibilidad de excusarme de no haber encontrado bibliografía. A las autoridades de la Facultad de Ciencias Veterinarias U.N.R. que en su momento confiaron y optaron por financiar mi especialidad. A los colegas que han participado generosamente. A todos aquellos que contribuyeron a que haya podido concretar esta etapa de mi vida. Por último al Dr. Fernando Fogel cuya generosidad y hombría de bien ha permitido consolidar la dermatología veterinaria en Latinoamerica. Muchas gracias.

Agradecimientos …………………........................……............................................…..7 1- Introducción …………………........................……….................................................11 2- Ecología y distribución…………………...................................................………..17 3- Epidemiología …………………........................……............................................…..19 4- Estructura, fisiología y biología ………………….................................………..23 5- Taxonomía …………………........................……...................................................…..31 6- Toma de muestras…………………............................................................………..37 7- Aislamientos e identificación …………………........................…….............…..39 Características morfológicas y fisiológicas …………………...................41 Esquema de identificación…………………........................……................…..47 Descripción de las especies…………………........................…..............……..54 Biología molecular…………………........................……..................................…..78 Diagnóstico………………….........................................................................………..90 8- Algunos casos clínicos …………………..................................................………..93 9- Patogenicidad e inmunología …………………...............................………..115 10- Conservación de las cepas …………………..................................………..173 11- Terapia antifúngica…………………........................…….............................…..177 12- Conclusiones …………………........................…….........................................…..185 13- Bibliografía…………………........................………..................................................189

“1874 el histólogo y fisiólogo francés Louis Malassez señaló su naturaleza levaduriforme y en 1889 Baillon creó el género Malassezia en honor al autor anterior.”

1

er. Capítulo

L

Introducción

as especies del género Malassezia son organismos levaduriformes lipofílicos y no lipofílicos incluídas en la clase Basidiomycetos considerados comensales en el hombre y en animales (Mellado Ramos - Guillot 1999- Hernández Escareño). Si bien han sido reconocidas por más de un siglo como habitantes normales de la piel humana y en ciertos animales de sangre caliente, también se los ha vinculado a un amplio rango de enfermedades y es por este motivo, que resulta muy

importante conocer su biología para poder realizar el tratamiento correcto en las infecciones en perros y gatos producidas por especies de Malassezia las cuales han ido adquiriendo importancia considerable por su asociación a procesos patológicos como agentes de micosis superficiales y diseminadas siendo hoy considerados agentes patógenos emergentes en humanos (Hernández Escareño). Su asociación con la pitiriasis versicolor (PV) se conoce desde 1846 cuando Eichstedt propuso el

y Guého quienes en ese año identificaron una nueva especie, M. sympodialis.

En 1853 Robin consideró al microorganismo como un dermatofito y lo llamó Microsporum furfur y a la enfermedad tinea versicolor. En 1874 el histólogo y fisiólogo francés Louis Malassez señaló su naturaleza levaduriforme y en 1889 Baillon creó el género Malassezia en honor alautor anterior. Morris Gordon en 1951 fue quien realmente lo aisló y utilizó el nombre de Pityrosporum orbiculare, colocándolo en el mismo género creado por Sabouraud en 1904 para el agente de la dermatitis seborreica. Luego se denominó Pityrosporum ovale (Castelllani y Chalmes, 1913). Acton y Panja en 1927, tratando de mantener un solo género, la llamaron Malassezia ovalis (Panja, Arenas 2000). Macleod y Dowling en 1928 fueron los primeros en obtener cultivos de P. ovale y M. furfur en medio Petroff modificado (Hernández Hernández 2004).

En 1996 Guého y col. realizaron una revisión taxonómica del género, basados en características morfológicas, fisiológicas, ultraestructurales y moleculares, agregándose a las especies ya conocias (M. furfur, M. sympodialis, y M. pachydermatis) cuatro nuevas: M. slooffiae, M. obtusa, M. globosa y M. restricta (Guého 1996, Fell).

Entre 1993 y 1934, Huang y Rhoda, individualmente, aislaron P. ovale y demostraron su lipofilia (Padilla). En 1935 Weidman aisló en la piel de un rinoceronte P. pachydermatis y luego Gustafson en 1955 lo identificó como agente de otitis en perros. En 1935, Dodge consideró al género Pityrosporum como sinónimo de Malassezia, incluyendo en su libro las especies M. furfur, M.ovalis, M. macfadyeni (sinónimo de Malassezia furfur propuesto por Castellani en 1908 (Ochoa), M. tropica y M. pachydermatis (Pereiro). En 1951 Gordon realizó cultivos en medios enriquecidos con lípidos y describió una tercera especie, P. orbiculare, que asoció con piel sana y pitiriasis versicolor (Arenas 2000). En una revisión hecha por Sloof en 1970 se estableció la diferencia entre levaduras que habitan normalmente la piel y las levaduras que causan dermatitis seborreica o pitiriasis capitis, creando la especie M. furfur para el agente de la pitiriasis versicolor (Hernández Hernández 2004). Cuando se realizaron los cultivos, diferentes investigadores observaron el cambio de un tipo morfológico a otro, lo que llevó a la conclusión de que P. orbiculare, P. ovale y M. furfur son variantes de la misma especie. En 1984, Yarrow y Ahearn las consideraron pertenecientes al género Malassezia, a la división Basidiomicotina y a la familia Cryptococcaceae (Padilla). En 1985, Borelli comunicó los datos preliminares sobre una forma clínica que denominó pitiriasis versicolor ovalis y llamó M. ovalis al agente causal (Guého 1996, Fell). Es sorprendente como el conocimiento sobre este hongo ha ido en aumento en poco tiempo, principalmente con la aparición de nuevas técnicas de biología molecular ya que su dificultad para el cultivo y su naturaleza dimórfica hizo que los micólogos creyeran que las distintas formas correspondían a organismos diferentes, lo que llevó a que se incluyeran en dos géneros separados: Pytirosporum para la fase levaduriforme y Malassezia para la micelial. Por este motivo durante muchos años coexistieron ambos sistemas taxonómicos (Mellado). En 1990 se inició una nueva época con la introducción de técnicas moleculares en la identificación de los hongos y fueron Simmons

En 2002 Sugita y col. hicieron una descripción de otra nueva especie: M. dermitis, la cual fue identificada mediante análisis de las secuencias del gen ARNr (regiones D1 y D2 del 26S del ADNr y los ITS (Internal Transcribes Sapacer), a partir del aislado de una persona con dermatitis atópica (Sugita 2002). El mismo grupo de investigadores describió al año siguiente M. japonica identificada también por métodos moleculares (PCR anidado). En 2004, el grupo japonés de Hirai y col. describió M. nana, en animales, utilizando secuenciación de ADNr de la subunidad 26S y de la ITS1 (Hernández Hernández 2004). Ese mismo año Sugita y col. (Sugita 2004) caracterizaron a M. yamatoensis y determinaron diferencias moleculares con M. furfur, M. obtusa y M. japonica aunque filogenéticamente especies cercanas cercanas. En 2006 se aislaron por medio de análisis comparativos de marcadores moleculares de regiones D1/D2, análisis de la subunidad 26S de ADNr y secuencias de nucleótidos, dos nuevas variedades; las cuales se identificaron en animales domésticos y denominándose M. caprae (aislada de cabras) y M. equina (aislada principalmente en caballos), las cuales presentan características morfológicas y fisiológicas distintivas (Cabañes 2007). En 2010 Cabañés y col. (Cabañes2010)presentaron una nueva especie: M. cuniculi sp. nov. ,hasta el momento la última especie de Malassezia lipodependiente descripta.

“Aunque no se detectó la reproducción sexual (forma Teleomorfa) para Malassezia spp, su alto contenido de G+C (mayor al 50%), la naturaleza lamelar, la composición bioquímica de su pared celular, la reacción positiva a la tinción con Azul de Diazonio y su actividad ureasa, claramente indican que pertenecen a la clase Basidiomycetes (Mellado, Hoog, Guého 1989, Simmons, Chang, Giusiano).” Así mismo la variabilidad morfológica y los estrictos requerimientos lipídicos del género han impedido por décadas el estudio in vitro de estas levaduras.

Aún hoy la metodología de laboratorio presenta complicaciones para su aislamiento, mantenimiento e identificación.

Introducción :: 13

Introducción :: 12

origen micótico de la PV y Sluyer completó los estudios en 1847.

El esquema de identificación basado en sus propiedades bioquímicas y fisiológicas permite en la actualidad reconocer 14 especies: M. furfur; M. pachydermatis; M. sympodialis; M. slooffiae; M. obtusa; M. globosa, M. restricta; M. dermatis; M. japonica; M. nana; M. equina; M. caprae; M. yamatoensis; M. cuniculi sp. nov. (Sosa, Gupta 2000 a, Sugita 2002, Hirai, Kiuchi, Cabañes 2010). Un rasgo fisiológico distintivo que poseen estas levaduras es la de utilizar los lípidos como única fuente de carbono. Esta afinidad varía entre especies de este género, pudiendo hablar de lipodependientes aquellas que necesitan ácidos grasos de cadena larga (C12 a C24) y de levaduras no lipodependientes aquellas que utilizan ácidos grasos de cadena corta (Hernández Escareño, Cafarchia 2004, Guého 1996, Fell, Gupta 2000 a). La transferencia zoonótica ha sido bien documentada de perros hacia pacientes humanos inmunocomprometidos (Chang), como ejemplo cabe nombrar el brote en terapia intensiva

de pediatría del DartmounthHitchcock Medical Center en Lebanon, New Hamphire, Inglaterra en 1993, donde dos bebés prematuros padecieron una infección sistémica a raíz de que la enfermera tenía las manos contaminadas con Malassezia pachydermatis (Chang, Morris 2005). La malasseziosis, en perros y gatos es causada principalmente por una especie zoofílica: Malassezia pachydermatis (Paterson), su invasión a los estratos epidérmicos está asociada con factores predisponentes como: cambios en el microclima de la superficie, incremento de la producción de cerumen /sebo, maceración húmeda de la piel, traumatismos, estados alérgicos, infecciones bacterianas,enfermedad endócrina, enfermedad interna y efectos secundarios de terapias aplicadas (Paterson). Actualmente se ha detectado M. slooffiae en gatos de raza Devon Rex con dermatitis y seborrea (Ashbee 2007); como también Malassezia dermatis en perros con lesiones eritematosas pruriginosas con cuadros semejantes al síndrome de dermatitis atópica en humanos (Midgley 1989). En cuanto a sus factores de patogenicidad no están del todo claros aunque trabajos recientes le confieren a la fosfolipasa un rol en el aumento de la virulencia de este agente (Guého 1996, Fell).

Por su capacidad de infectar se la debe tener en cuenta al momento de realizar diagnósticos diferenciales de enfermedades infecciosas cutáneas tanto en perros como en gatos. Malassezia es un género al que se le van incorporando especies a raíz de nuevos hallazgos, lo que abre un espectro importantísimo de variables al momento de implementar un tratamiento médico responsable.

Introducción :: 15

Introducción :: 14

Si bien Malassezia posee características morfológicas y fisiológicas distintivas que permiten diferenciarla de otros géneros levaduriformes, sus especies comparten muchas características, no existiendo un método simple y rápido para su tipificación.

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“Está claramente establecido que M. pachydermatis forma parte normal de la microbiota cutánea de perros y gatos, por lo que puede aislarse a partir de la piel y de mucosas de estos animales, aunque el número de células recuperadas cambia de acuerdo a las diferentes localizaciones anatómicas (Giusiano, Paterson)”

do. Capítulo

Ecología y distribución

stá claramente establecido que M. pachydermatis forma parte normal de la microbiota cutánea de perros y gatos, por lo que puede aislarse a partir de la piel y de mucosas de estos animales, aunque el número de células recuperadas cambia de acuerdo a las diferentes localizaciones anatómicas (Giusiano, Paterson), Por ejemplo, en el perro puede aislarse frecuentemente del ano, cavidad oral, área interdigital, labio inferior y conducto auditivo externo y por el contrario, de manera menos frecuente a partir del área nasal,

prepucio, vulva, axila, ingle y dorso (Paterson). La ecología de esta levadura en la piel canina ha sido ampliamente estudiada debido a su importancia como patógeno oportunista (Raabe 1998). Esta levadura, puede llegar a ser patógena como consecuencia de cualquier alteración en el microambiente de la superficie de la piel o de las defensas del huésped. Los factores que favorecen la multiplicación de M. pachydermatis son: la producción excesiva y/o una modificación de

“Está aceptado que Malassezia spp. no se encuentra en el medio ambiente, aunque se aisló de arena (Marcelou-Kinti) y de nematodos de vida libre ambiental (Renker) lo cual constituye una curiosidad.”

la naturaleza del sebo o del cerumen, humedad elevada, una posible ruptura de la barrera epidérmica y la presencia de causas subyacentes, entre las cuales encontramos con frecuencia una hipersensibilidad cutánea (atopía y piodermitis), ectoparasitosis y en particular una demodeccia, endocrinopatías y otras alteraciones metabólicas que provocan seborrea (Midgley 1993, Mayser 1997, Sugita 2001a).

Ecología y distribución :: 18

“Las principales infecciones asociadas a M. pachydermatis en los animales son otitis externas y dermatitis seborréicas, que afectan principalmente a los carnívoros, en especial perros y gatos (Bond 1995 b). “ Sin embargo esta especie también ha sido encontrada en la piel sana de animales diversos como conejos, cerdos, ovejas, cabras, vacas, caballos, cobayos, rinocerontes, elefantes, ciervos, aves, primates, osos, hurones, focas, zorros y osos hormigueros. (Mittag, Gupta 2004 a, Raabe 1998, Bond 1997 a, Kurtzmann). En el hombre ha sido implicada únicamente y de forma ocasional en casos de infecciones sistémicas, usualmente en neonatos prematuros de bajo peso, internados durante

largos períodos en unidades de cuidados intensivos y que han recibido antibióticos de amplio espectro y alimentación parenteral basada en lípidos, así como en pacientes inmunocomprometidos (Anthony, Cafarchia 2007). De hecho, algunos estudios sugieren que su presencia en la piel humana se debe a la transferencia de M. pachydermatis desde la piel de los animales (Yarrow).

3 E

er. Capítulo

Epidemiología

l género Malassezia como se ha dicho, incluye levaduras lipofílicas comensales de la microflora de la piel tanto de humanos como de la mayoría de los mamíferos y aves. Luego del primer aislamiento en un rinoceronte de la India (Weidman 1925) Malassezia spp. fue encontrada en otras especies silvetres como: osos (Ursus), lobos (Canis lupus), coyotes (Canis latrans), zorros (Vulpes vulpes), focas (Phocidae), llamas (Lama glama), puercoespínes (Couendo

prehensilis), elefantes (Loxodonta africana), oposum (Rubida de Monodelphis), monos (Simios), hurones (Mustela), fenec (Vulpes zerda), chita (Acinonyx jubatus) y mamíferos domésticos como: perro (Canis lupus familiaris), gato (Felis silvestris catus), caballo (Equus caballus), vaca (Bos taurus), oveja (Ovis aries), cabra (Capra), cerdo (Sus scrofa domestica) y conejo (Oryctolagus cuniculus). Algunos estudios en roedores y lagomorfos no permtieron el aislamiento de esta levadura,

Varias especies de aves fueron encontradas como hospederos de Malassezia spp. (Dufait 1985, Midgley 1969), por lo que se supone que estas levaduras podrían estar presentes en todos los vertebrados homeotermos (ver Tabla I).

Epidemiologia :: 20

Está aceptado que Malassezia spp. no se encuentra en el medio ambiente, aunque se aisló de arena (Marcelou-Kinti) y de nematodos de vida libre ambiental (Renker) lo cual constituye una curiosidad. Los mismos autores indican que estas levaduras podrían colonizar también hospederos invertebrados que actuarían como vectores.

TABLA II

en animales con o sin otitis, o con y sin dermatitis. En cuanto a la colonizaciónen en perros tampoco observaron diferencias con respecto al sexo, edad y raza, aunque otros autores (Carlotti 2001) indicaron ciertas razas como más predisponentes: West Higland White Terrier, Basset Hound, Dachshund, Cocker Spaniel, Poodle, German Shepherd, Collies, Shetland, Springer Spaniel y Shar Pei. En el Basset hound se han aislado un alto número de levaduras en la piel y membranas mucosas de perros sanos (Bond 1997 a). Kennis y col. (Kennis) demostraron que es común la colonización en la piel perioral y del mentón de perros sanos. Cafarchia y col. (Cafarchia 2005 a), coincidiendo con Bond y col. (Bond 1995 a, Bond 1995 b), encontraron que la región perianal es el área más frecuentemente colonizada (60,6%), mientras que la región inguinal es la menor (3%), y la de mayor número de aislamientos de Malassezia recuperadas fueron del área perioral y el canal del oído externo.

“Algunos autores (Dufait 1985) han encontrado igual cantidad de levaduras tanto en perros con piel sana como con dermatitis, mientras que otros (Cafarchia 2005 a) observaron mayor densidad de levaduras en perros con lesiones en piel que en los sanos.”

Especies de Malassezia descritas hasta la fecha y sus principales hospederos* Malassezia spp

Principales hospederos/otros

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 10. 11. 12. 13. 14.

Cabra / Caballo Conejo Hombre Caballo / Vaca Hombre / Vaca, elefante, cerdo, mono, avestruz, pelicano Hombre / Guepardo, vaca Hombre Gato, vaca / Perro Hombre Perro, gato / Carnivoros, aves Hombre Hombre, cerdo / Cabra, oveja Hombre / Caballo, cerdo, oveja Hombre

M. caprae M cunicul sp. nov M dermitis M. esquina M. furfur M. globosa M. japonica M. nana M. obtusa M. restricta M. slooffiae M. sympodialis M. yamatoensis

*Adaptado por Cabañes (204)

Estudios epidemiológicos realizados en perros y gatos demostraron diferencias en cuanto a la localización de esta levadura en el cuerpo del hospedador, como también en las especies de Malassezia involucradas. Según Galuppi en una experiencia con 178 perros y 70 gatos provenientes del norte de Italia, Malassezia spp. fue encontrada en el 62,9% de los perros y en el 11,4 % de los gatos (Galuppi 2008). Estas levaduras se pudieron encontrar al menos en dos sitios diferentes del cuerpo,

Según Galuppi y col. (Galuppi 2008) aislaron Malassezia pachydermatis de conjuntiva y mucosa oral en 16 de 92 perros examinados (17,4%); Raabe y col. (Raabe 1998) encontraron estas levaduras en materia fecal de perros, asumiendo que han podido sobrevivir al pH ácido del aparato gastrointestinal luego de haber sido lamidas de la piel. Hasta hace 25 años atrás, en la medicina veterinaria, se conocían solamente dos especies del género Malassezia: M. pachydermatis y M. furfur, la primera en carnívoros domésticos, particularmente en perros, mientras que en otros animales domésticos como porcino, bovino y especies aviares estaba solamente una especie lípido dependiente: M. furfur (Guillot 1994).

Posteriormente fueron descriptas nuevas especies lípido-dependientes, y el rango de animales hospederos se enriqueció con nuevos hallazgos. Bond y col. (Bond 1996 a) reportaron en gatos el primer aislamiento de Malassezia sympodialis. Subsiguientemente otros estudios detectaron M. furfur y M. globosa en piel, mucosa y canal auricular externo en gatos sanos (Bond 1997a, Bond 1997 b, Crespo 1999, Corazza). M. nana fue descripta en gatos y en bovinos (Hirai). M. pachydermatis, M. obtusa, M. globosa, M. slooffiae, M. furfur y M. sympodialis fueronencontradasenganadovacuno (Duarte 1999). M. pachydermatis (Duarte 1999) y M. sloffiae (Guillot 1998 a, Uzal) se encontraron en cabras y más recientemente una nueva especie lípido dependiente, M. caprae fue descripta (Cabañes 2007). En cerdos

Epidemiologia :: 21

probablemente por la baja concentración de sebo (Guillot 1994) aunque otros investigadores informaron su aislamiento. En la zona amazónica de Brasil se estudiaron hisopados de 30 meatos acústicos de murciélagos encontrándose 15 M. pachydermatis, 1 M. furfur, 3 M. globosa y 1 M. sympodialis. (Scorzetti). En estudios de Galuppi y col. no se aisló esta levadura de ratas de laboratorio (Galuppi 2008), otros autores (Dufait 1985, Drouhet) hallaron M. pachydermatis en cerdos de Guinea, conejos y lograron causar experimentalmente dermatitis seborreica en ratones (Mus musculus) y ratas (Rattus norvegicus) con M. furfur y M. globosa respectivamente.

“Estas levaduras presentan también una capa lamelar por fuera de la pared, la cual podría ser responsable de la adhesión del organismo tanto a la piel humana como a la superficie de catéteres (Mittag, Nazarro-Porro).”

fue aislada principalmente M. slooffiae (Guého 1996, Matousek 2002) y Gallupi y col. (Galuppi 2004) reportaron M. slooffiae asociada con M. sympodialis de piel y del conducto auditivo externo en cerdos sanos. También M. sympodialis (Matousek 2002, Senczek) y M. equina fueron descripta en caballos (Cabañes 2007, Cabañes 2010). Las especies lípido dependientes se presentan comúnmente en piel de humanos, pero Malassezia pachydermatis fue encontrada en un caso de septicemia neonatal en una unidad de cuidados intensivos (Nell). La infección fue relacionada al rol transportador de las enfermeras con Malassezia de sus propios perros (Chang), lo que muestra el potencial zoonótico de esta levadura.

Epidemiologia :: 22

Todavía no está profundamente estudiado esta vía de portador de M. pachydermatis, y a pesar de los aislamientos de especies lípido dependientes, indiscutiblemente es la cepa prevalente en perros. Algunos autores encontraron una frecuencia del 59,73 % para M. pachydermatis y del 4,03% para cepas lípido dependientes en perros, mientras que en gatos 9,23% y 4,61% respectivamaente (Bonoli). De la piel de perros se aislaron cepas que se comportaban como levaduras lípido dependiente, siendo confirmadas como M. pachydermatis por cariotipificación y además crecieron en un medio regular de laboratorio luego del repique (Bond 1995). En un reciente trabajo Shokri y col. (Shokri) evaluaron la presencia de diferentes especies del género Malassezia en el conducto auditivo externo de gatos con y sin otitis externa. Fue un grupo amplio de 31 gatos sanos y 82 con otitis externa de hallazgo clínico. En primer término cabe aclarar que del 95,1% de gatos con otitis se aislaron especies de Malassezia y también del 48,4 % de gatos sin otitis. Del total de 137 aislamientos el 57,7% correspondió a M. pachydermatis, 15,4% a M. obtusa, 11,4% a M. globosa, 7,3% a M. slooffiae, 4,1 % a M. sympodialis, el 2,4 % a M. furfur, y 1,6 % a M. restricta. El rango de edad de 1 a 4 años (42,7% de aislamientos). Esto indica que en las otitis externas de los felinos están asociadas a especies de Malassezia lípido dependientes como a las no- lípidodependiente. Esto indujo a acalorados debates entre varios autores en el pasado (Bonoli, Guého 1999) por lo que Galuppi y col. profundizaron el estudio de la variabilidad de Malassezia pachydermatis (Galuppi 2008).

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to. Capítulo

Estructura, fisiología y biología

ertenecientes a los Basidiomycetes, estas levaduras, ocupan una posición aislada en esta clasifición.

representa una característica única en los Basidiomicetes (Hernández Escareño, Cafarchia 2004, Guého 1996, Fell 2000).

A través de estudios ultraestructurales, ha sido posible observar que la capa interna de la pared se encuentra estrechamente unida a la membrana plasmática, presentando una configuración cerrada y que a cada invaginación de la membrana le corresponde una banda electrolúcida que interrumpe transversalmente toda la pared celular adquiriendo una disposición helicoidal. Este rasgo

El estudio del dimorfismo realizado en 1986 para la unificación de la nomenclatura del género, demostró que la forma levaduriforme se encuentra comúnmente asociada a la piel normal y predomina en los cultivos, mientras que algunas especies pueden presentar su forma filamentosa en la piel (Guého 1996, Fell 2000, Marcon).

La pared celular de estas especies es más gruesa en comparación a las de otras levaduras (aproximadamente 0.12 um) y conforman del 26 al 37% del volumen celular.

Estructura, fisiologia, biologia :: 24

Los principales constituyentes de la misma son azúcares (70%), proteínas (10%), lípidos (15 al 20%) y quitina (1 al 2%), con pequeñas cantidades de nitrógeno y azufre (Ashbee 1993, Mittag). La característica ultraestructural más interesante es la naturaleza corrugada de la superficie interna de la pared, esta estructura, única en el Reino Fungi, corresponde a invaginaciones de la membrana plasmática alrededor de la célula. Estas levaduras presentan también una capa lamelar por fuera de la pared, la cual podría ser responsable de la adhesión del organismo tanto a la piel humana como a la superficie de catéteres (Mittag, Nazarro-Porro). Durante muchos años se conoció poco acerca de la fisiología de este hongo debido a la dificultad en aislarlo y mantenerlo en cultivo. La característica fisiológica distintiva de estas levaduras es que pueden usar a los lípidos como única fuente de carbono (Ashbee 2002), de hecho a excepción de M. pachydermatis (que puede crecer utilizando los ácidos grasos presentes en los medios de cultivo utilizados de rutina), las especies restantes (lipofílicas estrictas) dependen de la suplementación con ácidos grasos de cadena larga al medio de cultivo para su desarrollo. Este requerimiento lipídico se debe a la incapacidad de estos organismos para producir ácidos grasos de cadena larga (C14 o C16) debido a un bloqueo en la síntesis “de novo” del ácido mirístico (Sgifrine, Mayser 1998 a). Estas levaduras no requieren de vitaminas para crecer, usan metionina, cistina o cisteína como fuente de azufre, varios aminoácidos y sales de amonio como fuente de nitrógeno (Sgifrine, Mayser 1998 b, Yarrow). Por último a diferencia de otras levaduras, las pruebas de fermentación de azúcares son negativas y no pueden aplicarse las pruebas de asimilación porque estas levaduras lipofílicas no crecen en los medios comunes de aislamiento (Ran). Las especies lipofílicas de Malassezia forman parte de la micota normal de la piel de humanos, aislándoselas a partir de áreas ricas en glándulas sebáceas, particularmente del tronco y regiones de la cabeza (Bandhaya). Las especies de Malassezia poseen diferentes mecanismos patogénicos, como

“En general la portación de Malassezia se incrementa en la pubertad, correlacionándose con el incremento en la actividad de las glándulas sebáceas en ese momento.” su gran capacidad queratolítica que produce la ruptura mecánica o química de la queratina de las células invadidas. Por otro lado, producen una enzima con actividad lipoxigenasa que resulta en la producción de lipoperóxidos, dañando las membranas celulares y consecuentemente interfieren con la actividad celular. Este mecanismo ha sido particularmente estudiado en PV.

“Con respecto a la diferente pigmentación de la piel en PV se cree que hay un bloqueo en la transferencia del melanosoma al queratinocito, producción de productos indólicos que son potentes filtros ultravioletas, inhibición de la producción de melanina por sustancias como el ácido azelaico e intoxicación de los melanocitos por inhibición de la tirosinasa a partir de metabolitos como ácido dicarboxílico.” Se ha demostrado la capacidad lipasa y lipoxigenasa de M. furfur y M. pachydermatis liberando proteasas y fosfolipasas, produciendo esta última ácido araquidónico que está involucrado en la inflamación de la piel, lo que ha sido sugerido que sea ese el mecanismo por el cual estas especies podrían desencadenar el proceso inflamatorio. De la misma manera que en otras levaduras, la actividad fosfolipasa y proteinasa de Malassezia spp., puede ser considerada un potencial determinante de virulencia y probablemente juegue un activo rol en la invasión de los tejidos del hospedero induciendo la formación de poros en las membranas de las células epiteliales de los mamíferos afectando las funciones celulares y

favoreciendo la invasión del tejido. Malassezia spp. produce foliculitis por oclusión folicular y posterior sobrecrecimiento en el folículo piloso, siendo favorecida por factores externos y/o la reducida resistencia del hospedador. Generalmente presentan inflamación que se debería a la presencia de los metabolitos de la levadura y a los ácidos grasos con la correpondiente liberación de ácido araquidónico como resultado de la actividad lipasa de este hongo. La dermatitis atópica (DA) es una patología basada en una predisposición genética que se manifiesta como una reactividad cutánea anormal a determinados alergenos. De la misma manera que

Estructura, fisiologia, biologia :: 25

Estas levaduras se reproducen asexualmente a través de una brotación monopolar enteroblástica. En la misma, la célula madre e hija son divididas por un septo, separándose la célula hija por fisión, dejando una cicatriz o “collarete” (característico del género) a través de la cual los brotes sucesivos se liberan (Guého 1989, Faergemann 2002).

Candida, Malassezia es considerado un factor exacerbante de DA en zonas seborreicas.

a que su presencia es transitoria, por lo que no se considera comensal de la misma (Gupta 2004 a, Bernier).

La función barrera de la piel está afectada por las excoriaciones producidas por el rascado que genera el intenso prurito, los antígenos de las levaduras presentes entran en contacto con el sistema inmune del hospedero y generan una respuesta alergénica por lo que se considera que Malassezia juega un importante rol como alergeno. Por otro lado, un trabajo reciente asegura que los niveles de IgE anti M. furfur son marcadores específicos de la DA de cabeza y cuello y están correlacionados con la gravedad de la enfermedad.

Por otro lado, Malassezia pachydermatis es parte de la microflora cutánea normal de la mayoría de los vertebrados de sangre caliente, a tal punto que es comúnmente aislada en perros saludables de sus canales auriculares, de los labios, axilas, espacios interdigitales, sacos anales, recto y menos comúnmente del hocico y vagina. Esta levadura deviene en patógena cuando se dan alteraciones en el microclima de la superficie de la piel o en las defensas del hospedero, y actualmente está ampliamente aceptada como asociada a enfermedades de la piel en perros.

Mayser y col. describieron, en especies de Malassezia, cultivadas con triptofano la producción de fluorocromos y pigmentos. Éstos aparentemente darían protección para la radiación UVA y UVB in vitro y se caracterizan por ser alcaloides indólicos, siendo solamente M. furfur la única que genera in vitro compuestos indólicos que fluorescen bajo la luz de Wood (Mayser 1998 a, Chang). La pityriarrubina es un inhibidor respiratorio aparentemente responsable de la reducida reacción inflamatoria en las lesiones de pitiriasis versicolor. Para los organismos saprófitos como Malassezia, los mecanismos productores de las defensas del hospedero son muy importantes para sobrevivir en un medio ambiente normal. Recientemente fue reportada la presencia del pigmento “melanin-like” en las levaduras in vitro e in vivo en lesiones de PV y DS. Los hongos “melanizados” son menos susceptibles a la reacción de oxígeno generadas durante las respuestas inmunológicas y la producción de melanina es conocida como un importante factor de virulencia en Cryptococcus spp. y Malassezia spp. suelen emplear un mecanismo de defensa similar. Se ha decodificado el gen de una lipasa extracelular en M. furfur (Riciputo), MfLiP1 que codifica una proteína de masa molecular de 54.3 kDa y un pH óptimo de 5.8 con actividad hidrolítica de los Tweens, frecuentemente usados en los medios de cultivo. También se demostró que (Giusiano 2003) en estado activo la fosfolipasa A2 es capaz de liberar ácido araquidónico (Ashbee 2002, Giusiano 2003, De Luca, Leeming 1989). M. pachydermatis es recuperada ocasionalmente de la piel humana, debido

El cambio de opinión de la importancia de esta enfermedad en la dermatología veterinaria está demostrada por el número de artículos y publicaciones de dermatitis por Malassezia en la literatura científica luego de la primera descripción hecha por Dufait en 1983. A tal punto que se han publicado casos de zoonosis causados por Malassezia pachydermatis (Morris 2005). La dermatitis por Malassezia spp. puede ocurrir en perros de distintas edades, sexo y raza. Con algunas de ellas con mayor predisposición, por ejemplo: West Highland white terriers, Basset hounds, Poodles, Austrian silky terriers and American cocker spaniels (Scott 2001a, Dufait 1983, Mauldin 1997, Plant). La dermatitis por Malassezia en perros puede ser localizada o generalizada, siendo las lesiones de piel usualmente en el rostro (canal auricular, piel perioral, periocular y ventral del cuello) o en los pliegues cutáneos (axilas, ingle, piel interdigital, y pliegues ungueales). Los signos clínicos son variables: eritema, a veces severo prurito, alopecia, exudación seborreica en aumento y generalizada. Las lesiones secundarias pueden ser, escoriaciones, liquenificación, hiperpigmentación y exudación. En casos generalizados, un olor agresivo y rancio es comúnmente reportado. En los casos de paroniquia por Malassezia spp. es comúnmente visible un color rojizo amarronado en los pliegues ungueales. Finalmente algunas otitis externas pueden estar asociadas con estas levaduras (Bond 1997 b, Muse). El rol de M. pachydermatis, como patógena fue discutida mucho tiempo. Dufait y luego Mason, fueron los primeros en establecer a estas levaduras como agentes causales de enfermedad (Mason 1991). Se sospecha que la proliferación de levaduras es promovida por la excesiva producción de serumen o la afección de las barreras epidérmicas como

Estructura, fisiologia, biologia :: 27

Estructura, fisiologia, biologia :: 26

El rol de Malassezia como agente secundario en otras afecciones está en estudio, encontrándose que la sobreinfección de la psoriasis por las especies de este género pueden causar un agravamiento de la misma, y el tratamiento de ella resulta en un mejoramiento del paciente. Probablemente los metabolitos, ya citados, de las levaduras contribuyen con la inflamación asociada con esta enfermedad (Giusiano).

“La aplicación de glucocorticoides por tiempo prolongado podría incrementar la población de Malassezia (White S 1998), mientras que todos los autores consideran que la administración de antibióticos no es un factor predisponente (Matousek 2002).”

Estructura, fisiologia, biologia :: 28

El criterio diagnóstico para la dermatitis por Malassezia en perros no esta todavía claramente definido. Se ha propuesto que el diagnóstico puede ser establecido cuando el perro con alta población de M. pachydermatis en lesiones de piel muestre una buena respuesta clínica y citológica a la terapia antifúngica apropiada (Bond 1997 c). El diagnóstico se obtiene por observación directa de las levaduras, por cultivo y técnicas histopatológicas, no estando definido que con el recuento de levaduras pueda considerarse un valor determinado nocivo para el animal. Además, el diagnóstico basado en el número de levaduras no tiene en cuenta el potencial de virulencia de las mismas, o la naturaleza de la sensibilidad del hospedero a esta levadura (por ej.: hipersensibilidad a Malassezia spp.). En ambos casos es probable el desarrollo de signos de dermatitis por Malassezia con la presencia de un bajo número de levaduras.

Las opciones terapéuticas comunes para la dermatitis canina por Malassezia que fueron publicadas incluyen terapia sistémica con ketoconazol o itraconazol y/o terapia tópica con derivados azólicas u otros agentes como compuestos con Selenio y Clorhexidina (Mason 1993). Los principios de medicina basados en pruebas pueden ser usados con cuidado para valorar la calidad de procesos clínicos, examinar sistemáticamente y evaluar la eficacia de intervenciones antiMalassezia. Con respecto a la asociación con otras enfermedades como demodicosis canina, leishmaniosis y dermatitis atópica, la baja proporción de evaluaciones en los protocolos de tratamientos ha sido insuficiente (Mueller 2004, Olivry 2003, Negre). En los gatos, las Malassezia spp. son frecuentemente aisladas de su piel y de sus mucosas. En gatos sanos no es infrecuente encontrar una colonización por M. pachydermatis como también las especies lípido dependientes como M. sympodialis

(Bond 1996 a, Bond 1997 b), M. globosa (Bond 1997 b), M. furfur (Crespo 1999) y más recientemente M. nana (Hirai) y M. cuniculli sp.nov. (Cabañes 2010). Enfermedades metabólicas como diabetes mellitus, virosis inmunosupresoras como FeLV y FIV (Feline Leukemia Virus y Feline Immunodeficiency Virus), y desórdenes paraneoplásicos (alopecia paraneoplásica pancreática, dermatitis exfoliativa con timoma) pueden favorecer la infección en estos hospederos (Mauldin 2002, Perrins 2007, Cabañes 2010).

Estructura, fisiologia, biologia :: 29

ocurre en las enfermedades de hipersensibilidad (atopía, reacciones adversas al alimento o alergia por contacto), desórdenes de cornificación, infestación por ectoparásitos, piodermia bacteriana y enfermedades endócrinas (hiperadrenocorticismo, hipotiroidismo, diabetes mellitus) (Bond 1996 b).

5 E

“El hecho de que alguna de las especies de Malassezia que afectan a humanos tengan presentación dimórficas, sumado a que fue imposible obtener cultivos de las mismas durante mucho tiempo, hizo que los investigadores creyeran que las distintas formas correspondían a organismos diferentes, lo que llevó a que las incluyeran en dos géneros separados: Pytirosporum para la fase levaduriforme y Malassezia para la micelial.”

to. Capítulo

Taxonomía de las especies del género Malassezia

l hecho de que las especies de Malassezia sean dimórficas, sumado a que fue imposible obtener cultivos de las mismas durante mucho tiempo, hizo que los investigadores creyeran que las distintas formas correspondían a organismos diferentes, lo que llevó a que las incluyeran en dos géneros separados: Pytirosporum para la fase levaduriforme y Malassezia para la micelial. Por este motivo durante muchos años coexistieron ambos sistemas taxonómicos (Cafarchia 2004, Aspíros 1997, Aspíroz 1999, Aspíroz 2002).

El género Pityrosporum fue la nomenclatura elegida por dermatólogos, en el que incluían tres especies: Pytirosporum orbiculare, presentando células redondas y asociado a la pitiriasis versicolor (PV), P. ovale, con células ovales, asociado a la dermatitis seborréica (DS), P. pachydermatis como flora colonizante e infectante en animales. El género Malassezia fue el sistema preferido por los botánicos, que demostraron que la fase filamentosa podía formarse a partir de levaduras

y describieron dos especies:

VARIABILIDAD DE M. pachydermatis

Malassezia furfur (lípido dependiente y responsable de infecciones en humanos) y M. pachydermatis (no lípido dependiente, asociada con animales y causante de infecciones sistémicas en humanos). La tercera especie, M. sympodialis (lípido dependiente y responsable de infecciones en humanos), recién se describió en 1990 (Simmons).

Entre las especies lípido dependientes de Malassezia, en los últimos años, se han descripto numerosas especies nuevas, siendo M. pachydermatis la única especie no lípido dependiente.

De acuerdo a los hallazgos de la biología molecular, taxonómicamente se clasifica en:

Taxonomía de las especies del género Malassezia :: 32

Clase: Ustilaginomycetes Orden: Malasseziales Género: Malassezia Especies: M. furfur; M. sympodialis, M. pachydermatis; M. slooffiae; M. obtusa, M. globosa, M. restricta; M. dermatis; M. japonica; M. nana; M. yamatoensis; M. equina; M. caprae y M. cuniculi sp. nov.. Los cambios taxonómicos de estudios previos con respecto a los actuales lo mostramos en la siguiente Tabla 1. Tabla 1 Nombres actualizados con su respectivo nombre predecesor de las especies del género Malassezia

Nombres Anteriores usados como sinónimos Pityrosporum orbiculares (Midgley 1989); M. furfur Serovar B (Midgley 1993) Pitirosporum ovale Form 1 (Midgley 1989) Pitirosporum ovale Form 2 (Midgley 1989) M. sympodialis; M. furfur Serovar A; P. ovale Form 3 (Midgley 1989) M. furfur (Midgley 1989) M. furfur Serovar C (Midgley 1993) P. pachydermatis (Midgley 1989); M. pachydermatis (Midgley 1993) ..................... ..................... ..................... ..................... ..................... ..................... .....................

b.- Cultivos: Desarrollo en medio de cultivo ASG: Se observó también distintas morfologías en las colonias en Agar Sabouraud Glucosa (ASG): pequeñas o grandes colonias, no relacionadas con el aspecto microscópico (Huang). Esto está vinculado con la habilidad de crecimiento en medios sin suplemento de lípidos. Se han encontrado varias cepas que no crecieron en ASG en el primer aislamiento, pero luego de uno o más pasajes en agar Dixon modificado, obtuvieron un buen crecimiento en ASG (Bond 1995). Según otros autores el 27,8% de las cepas aisladas han mantenido un pobre crecimiento en ASG, con colonias pequeñas, puntiformes, mientras que otras han tenido un buen crecimiento con colonias de buen tamaño en este medio (Huang, Hammer 2000 a). c.- Pruebas Bioquímicas: la mayoría de los parámetros usados para la diferenciación del perfil bioquímico de las especies lípido-dependientes son extremadamente variables en M. pachydermatis. Temperatura de incubación: Está descripto que esta especie crece a 40ºC (Cafarchia 2004, Mayser 1998 a, Hirai, Sloff, Guillot 1996) pero Galuppi y col. comprobaron que si bien algunas desarrollaron a esa Tº otras no crecieron bien y más del 30% de las especies cultivadas no lo hicieron, mostrando mayor variabilidad de la que figura en la literatura (Guillot 1998 a). Reacción de la Catalasa: También se encontró gran variación en la reacción de catalasa, resultando: negativa o débil (Kiss), pobre (Hirai) y marcadamente positivo (Anthony). Test de Tween: Con respecto al test de Tween, según la técnica de Guillot y col. (Kiss), M. pachydermatis muestra un crecimiento en toda la superficie de ASG, pero en algunos aislamientos el crecimiento fue inhibido directamente alrededor de Tween 20,40, 60, 80 y en otros fueron inhibidos con alta concentración de Tween 20. En otros estudios observaron

Taxonomía de las especies del género Malassezia :: 33

División: Basidiomycota

M. Globosa (6) M. Slooffiae M. Obtusa (6) M. Sympodialis (6) M. Furfur M. Restricta (6) M. Pachydermatis (6) M. Dermatis (Sugita 2002) M. Japonica (Sugita 2003) M. Nana (Corazza) M. Yamatoensis (Sugita 2004) M. Esquina (Nell) M. Carprae (Cabañes 2007) M. Cuniculi sp. nov. (Cabañes 2010)

Por ejemplo: a.- Morfología: hay dos tipos de morfología microscópica descripto, una de forma pequeña y ovoidea (2,5-4,8 x 2.6-5 um) y la segunda más grande con forma de clava (3,8-6.0 x 4,8-7 um) (Sloff). En otros estudios Galuppi (Galuppi 2008) encontró un tercer tipo celular con células pequeñas redondeadas (1,66 x 1,67 um).

Reino: Fungi

Nombres Actuales Aceptados

Algunos estudios basados en los perfiles moleculares, morfológicos y bioquímicos muestran una importante falta de homogeneidad en este género.

Taxonomía de las especies del género Malassezia :: 34

Comportamiento en agar Dixon: Con respecto a la presencia de precipitados en agar Dixon modificado Bond y Anthony observaron este fenómeno en todas las cepas estudiadas, hallazgo que no coincidió con los de otros autores (Bond 1996 a). Hidrólisis de la esculina: los resultados de esta prueba, de acuerdo a Guého y col. (Guého 1996, Mayser 1998 b, Hirai, Guillot 1996) fueron variables; el 83,6% de las cepas analizadas mostraron una zona negra alrededor de las colonias, el 11,3% presentó una pobre variación en el color, y el 5,1% no hubo cambio de color. d.- Estudios de biología molecular: Anthony y col. (Anthony) utilizando RFLP (Restriction Fragment Lengh Polymorphism Analisis), demostraron la presencia de 10 diferentes patrones en 33 aislamientos de M. pachydermatis. Guillot (Hammer 2000 a) investigó la diversidad de M. pachydermatis aisladas de un amplio rango de hospederos por secuencia parcial de la subunidad mayor (LSULarge Subunit Ribosomal) ribosomal RNA, pudiendo diferenciar siete tipos (IaIg): el tipo Ia es aparentemente ubicuo y observado en animales domésticos, carnívoros salvajes, monos y humanos, por otro lado las secuencias Ic, Id e Ig aparentan ser más específicas del hospedero. El estudio indicó que la piel del animal puede ser colonizada por más de un tipo de M. pachydermatis. El tipo Id formó pequeñas colonias sobre el ASG. Sugita y col. (Sugita 2005) indicaron que la secuencia de la región IGS de M. pachydermatis tiene una notable diversidad intra-especie. Aizawa y col. (Aizawa 1999, Aizawa 2001) y Castellà y col. (Castellà) con análisis de RAPD usando el mismo cebador (FM1), encontrando 4 perfiles genéticos, pero los patrones destacados fueron diferentes en cada uno. En la experiencia de Galuppi y col. sobre RAPD con el mismo cebador, encontraron un alto número de genotipos, acordando con Hossain y col. (Hossain) que observaron más de cuatro genotipos e indicaron una alta variabilidad de las cepas de M. pachydermatis. Cafarchia y col. (Cafarchia 2007) utilizando tres marcadores genéticos distintos encontraron multiples variantes genéticas en M. pachydermatis aisladas de perros. Por lo expresado, estas levaduras podrían estar en estado de diferenciación

y/o adaptación hacia un hospedador específico, asociado con un aumento en la dependencia de suplemento lipídico exógeno, explicando porque los

“La gran heterogeneidad genética y bioquímica confirma la observación de Kurtzmann y Robnett (Kurtzmann) con respecto a que hay una alta tasa de substitución de nucleótidos entre las especies de Malassezia, la cual por lejos excede los niveles de otros géneros de levaduras.” rasgos fisiológicos no son constantes. Estos hallazgos refuerzan la hipótesis de un rápido “reloj molecular”

resultando en un enorme polimorfismo en este género.

Taxonomía de las especies del género Malassezia :: 35

(Galuppi 2008) que las cepas que crecieron bien en ASG, lo hicieron con diferentes anillos de inhibición o halos alrededor de los distintos Tween. Por otro lado Guillot y col. (Kiss) encontraron que las cepas con bajo crecimiento en ASG, tienen un pobre crecimiento en medios suplementados con lípidos, con un patrón similar a las cepas lípido- dependientes.

6 L

to. Capítulo

Toma y remisión de Muestra

as escamas se obtienen por raspado de las lesiones, utilizando hojas de bisturíes y/o portaobjetos estériles como también con la técnica de la cinta adhesiva.

En el caso de muestras húmedas (como del conducto auricular externo o mucosas) se toman con hisopos estériles y se suspenden en tubos conteniendo solución fisiológica estéril.

7 P

“Cabe aclarar que la obtención de una coloración directa de muestras de las lesiones del paciente, es muy importante, pero el cultivo es fundamental para obtener genero y especie y poder implementar tratamientos que incluyan una visión epidemiológica.”

mo. Capítulo

Aislamiento e identificación

ara el aislamiento y la identific ación de todas las especies de Malassezia se pueden emplear los siguientes medios de cultivo: agar Dixon modificado (ADm) (100), el de Leeming & Notman (Leeming 1989) y ASG con y sin el agregado de aceite de oliva estéril. Los cultivos tomados a partir de la piel u otros materiales deben ser mantenidos por lo menos diez días para permitir el desarrollo de todas las especies y deben ser repicados mensualmente para asegurar su viabilidad.

La temperatura óptima de crecimiento de estas levaduras está entre 32-35ºC. El hecho de que Malassezia posea un comportamiento anamórfico hace que no pueda ser identificada por medio de los sistemas de clasificación fúngicos tradicionales, ya que los mismos se basan en las características sexuales. Además, al no presentar fermentación, y debido a su dependencia lipídica, las pruebas de identificación estándares (auxograma, zimograma, etc.) no pueden aplicarse a este organismo,

-Cultivo: en agar Dixon m (ADm), Sabouraud con y sin el agregado de aceite de oliva estéril, incubándolo a 32°C durante 7 días.

Los ensayos empleados para la identificación de rutina de las especies de Malassezia, incluyen: estudio de su morfología celular, crecimiento con diferentes detergentes no iónicos (Tween 20, 40, 60, y 80) como única fuente lipídica, actividad catalasa (Kiss), termotolerancia (Guého 1996), prueba de la esculina y crecimiento selectivo con Cremophor EL o aceite de ricino (Mayser 1998).

IDENTIFICACIÓN DE LAS ESPECIES DE MALASSEZIA

Teniendo en cuenta que la diferenciación de estas levaduras a través de sus características morfológicas es subjetivo, sumado a que las características fenotípicas pueden ser inestables o variables, en los últimos años se han desarrollado varios métodos moleculares para lograr una identificación más exacta de estas especies, como por ejemplo: determinación del contenido G+C, cariotipificación (Boekhout 1998, Boekhout 1994), análisis de ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD) (Boekhout 1994, Theelen), secuenciación (Guillot 1995, Sugita 2003, Pryce, Yamada, Makimura), análisis de polimorfismo de los fragmentos amplificados (AFLP) (Theelen), electroforesis en gradiente desnaturalizante (Theelen), PCR-análisis de restricción enzimática (PCR-REA) (Gupta 2000 a, Giusiano 2003, Gaitanis 2002, Guillot 2000), PCR fingerprinting (van Belkum) y recientemente PCRs anidadas, las que permiten realizar la identificación directamente sobre material clínico (Gaitanis 2002, Gemmer, Sugita 2001a).

ESTUDIO FENOTÍPICO:

El conocimiento del rol clínico de cada especie individual en las distintas patologías asociadas con Malassezia spp. se ha dificultado a causa de los problemas relacionados con el aislamiento e identificación de estas levaduras. Debido a que las mismas son encontradas en el diagnóstico clínico frecuentemente (Gupta 2000 a)

“y sabiendo que la eficiencia de las drogas antifúngicas varía dependiendo de la especie” (Gupta 2000 b, Hammer 2000 b, Nakamura 2000), es necesario contar con métodos que permitan una rápida y exacta identificación de los aislamientos clínicos para la elección de una terapia adecuada, para la prevención y control de brotes intrahospitalarios y para aumentar nuestros conocimientos sobre la epidemiología, inmunología y patología de las infecciones

causadas por estas levaduras.

La identificación de las especies de Malassezia aisladas a partir de muestras clínicas, se puede realizar en base a la observación de las características morfológicas, al estudio de las propiedades fisiológicas y moleculares de las mismas.

ESTUDIO MACROSCÓPICO Para la realización de la descripción macromorfológica de las levaduras, las colonias obtenidas se repican en placas de Petri con ADm y Sabouraud glucosa agar a 32ºC durante 7 días de incubación y se analizan las siguientes características: color, consistencia, forma, tamaño y bordes. ESTUDIO MICROSCÓPICO MICROSCOPÍA ÓPTICA La morfología de las células levaduriformes se examina después de una semana de incubación en ADm y Sabouraud glucosa agar a 32ºC, realizando un examen directo con Azul de lactofenol, tinta azul permanente y/o Blanco de clacofluor y observándolo posteriormente en un microscopio óptico. CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS Para realizar las pruebas fisiológicas es recomendable utilizar cultivos jóvenes que se obtienen después de realizar transferencia a medio ADm y Sabouraud glucosa agar y posterior incubación durante 48 a 72 horas a 32ºC (Guého 1996). REACCIÓN DE LA CATALASA

Marcha en el laboratorio a partir de una muestra

En un portaobjetos se realiza un extendido de la colonia a identificar, colocándole sobre el mismo una gota de peróxido de hidrógeno 10 vol. La producción de burbujas se considera como reacción positiva.

Aislamiento e Identificación

ESTUDIO DE LA LIPOFILIA

-Examen directo (ED): con colorante Azul de lactofenol, Blanco de Calcofluor y/o Tinta azul lavable (Parker).

Las colonias que se obtiene en ADm se repican en ASG para confirmar su carácter lipofílico. PRUEBA DE ASIMILACIÓN DE TWEEN 20, 40, 60 Y 80

Aislamiento e identificación :: 41

Aislamiento e identificación :: 40

siendo también inactivos en los sistemas de identificación comerciales para levaduras (API 20C Aux, API ID 32C) (Marcon).

ESQUEMA DE ALGORITMO DE TRABAJO I GUILLOT Y COL.

Se funden 16 ml de ASG, y se dejan enfriar hasta aproximadamente 50ºC. Luego, se adicionan al medio 2 ml de una suspensión de 105 células /ml de la levadura en estudio. La suspensión se mezcla vigorosamente y se vierte en una placa de Petri. Una vez que el medio solidificó, se hacen 4 pocillos de 2 mm de diámetro con sacabocados y se rellena con 1 gota de Tween 20, 40, 60 y 80, respectivamente. Las placas se incuban a 32ºC por una semana. La utilización de los Tweens se debe analizar por el grado de crecimiento y/o por la reacción de precipitación de las levaduras alrededor de los pocillos. PRUEBA DE LA ESCULINA

Aislamiento e identificación :: 42

Se colocan 3 ml de Agar Bilis Esculina (Britania) en tubos de hemólisis. Una vez solidificado este medio, se lo inocula en profundidad con la levadura en estudio y se lo incuba durante 5 días a 32ºC. El desdoblamiento de la esculina en esculetina y glucosa se observa por el oscurecimiento del medio, debido a la liberación de sales férricas incorporadas al mismo

Malassezia spp Cultivos en agar Sabouraud (+)

(-)

M. pachydermatis

80

Utilización de Tweens

20

Aislamiento e identificación :: 43

La habilidad de utilizar los distintos compuestos de Tweens como única fuente de carbono se realiza por medio del siguiente procedimiento.

PRUEBA DE ASIMILACIÓN DE ACEITE DE RICINO Se funden 16 ml de Mycosel estéril, dejándose enfriar hasta aproximadamente 50ºC.Con la levadura a identificar se prepara una suspensión (2 ansadas/ml) en 2 ml de agua destilada estéril, adicionándose luego la misma al medio anterior. Después de mezclado, el agar fue vertido en placas de Petri y una vez que el medio solidifica se realiza un pocillo que posteriormente se rellena con una gota de aceite de ricino. Las placas se incuban a 37ºC durante 10 días, analizándose el crecimiento alrededor del pocillo.

M. sympodialis

M. furfur

M. slooffiae

Aceite de ricino

(+)

Reacción de la catalasa

(-)

(+)

TERMOTOLERANCIA Para evaluar la capacidad de crecer a distintas temperaturas los aislamientos deben ser incubados en medio ADm durante 7 días a 37ºC y 42ºC.

(-)

M. furfur

De acuerdo a los resultados obtenidos en los cultivos y en la totalidad de las pruebas planteadas, Guillot y col. habían establecido el siguiente esquema de identificación (Esquema de Algoritmo de Trabajo I) (Guillot 1996).

Prueba de la esculina

(+)

Estudio microscópico

(-)

Células globosas M. sympodialis

M. slooffiae M. globosaM

Crecimiento

Células cilíndricas

Sin crecimiento

. obtusa

Crecimiento inferior al resto de los Tweens

TABLA IV: CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS DE LAS DISTINTAS ESPECIES DE MALASSEZIA

Como venimos observando, los miembros del género Malassezia poseen propiedades morfológicas y fisiológicas similares, la diferenciación entre ellas basadas en sus características fenotípicas es dificultosa, mientras que las técnicas de biología molecular son más específicas para la identificación pero no son accesibles para la mayoría de los laboratorios clínicos.

Resultados para: M. furfur

M. sympodialis

M. pachydermatis

M. globosa

M. slooffiae

M. restricta

M. obtusa

Reacción de catalasa

(+)

(+)

(V)

(+)

(+)

(-)

(+)

Crecimiento a 37”C

Bueno

Bueno

Bueno

Pobre

Bueno

Pobre

Pobre

Crecimiento a 42”C

Bueno

Bueno

Bueno

No

Bueno

No

No

Tween 20

(+)(

-)

(+)

(-)

(+)

(-)

(-)

Tween 40 o 60

(+)

(+)

(+)

(-)

(+)

(-)

(-)

Tween 80

(+)

(+)

(+)

(-)

(-)

(-)

(-)

Aceite de ricino

(+)(

-)

(V)

(-)

(-)

(-)

(-)

Descomposición de Esculina

(-)

(+)

(V)

(-)

(-)

(-)

(+)

No obstante, métodos económicos, sensibles y rápidos de tipificación, son necesarios para el diagnóstico clínico. Por lo relatado anteriormente el médoto de Guillot y col. (Guillot 1996) basado en el uso de patrones lipídicos, reacción de la catalasa, desarrollo a diferentes temperaturas y morfología de las células, puesto en práctica, no resultó suficientemente efectivo.

Aislamiento e identificación :: 44

Utilización de lípidos

Esto generó que Kaneko y col. (Kaneko 2005) investigaran distintos medios de cultivo ya existentes, concluyendo que con el agregado de bilis de buey, monoestearato de glicerol, glicerol y Tween 40 al CHROMagar Candida le permitió la diferenciación de las distintas especies de Malassezia como indica el Esquema de Algoritmo de Trabajo II.

ESQUEMA DE ALGORITMO DE TRABAJO II KANEKO Y COL.

Resultados para: Pruebas (*)

M. dermitis

M. japónica

M. nana

M. yamatoensis

M. caprae

Reacción de catalasa

(+)

(+)

(+)

(+)

(+)

Crecimiento a 37”C

Bueno

Bueno

Bueno

Bueno

(-).W

M. esquina

M. cuniculi sp. nov.

Cultivo de CHROMagar - Malassezia mod.

(+) W

Ausencia PP.

Producción PP.

(+)

Crecimiento a 42”C

Sub - Cultivo en SBG

Utilización de lípidos Tween 20

Aislamiento e identificación :: 45

Pruebas (*)

Catalasa

Grande rosa P.Rugosa

M. restricta

M. furfur

(+) (+)(

-)

(V)

(+)

Tween 40 o 60

(+)

(40:V 60:+)

(+)

(-)

Tween 80

(+)(

-)

(V)

(+)W

(-) W (-)

(-)

(-)

W

(-)

W

(-)

Aceite de ricino Descomposición de Esculina

(*) Datos tomados a partir de las siguientes referencias: (Guillot J., 1996), (Guého E., 1996) y (Mayser P., 1997); +, positivo; -, negativo; V, Variable. &, altas concentraciones de Tween 20; &´, bajas soncentraciones de Tween 80

M. pachydermatis

(-)

Esculina Tween 60

(D+)

(D+) (E+) M. sympodialis

(D+)

(E+)

(D+) (E-) M. dermatis

Esculina Tween 60

M. japonica (D-) (E-)

W = Weak 2007 ISHAM, Medical Mycology, 45, 287-283 (19) (134)

M. globosa

(E-) M. slooffiae (D-) (E+) M. obtusa

En CHROMMM se puede evaluar la presencia o no de precipitado; la morfología de la colonia: lisa o rugosa. En ASG, se puede observar la lípido – dependencia y en AE la capacidad para desdoblar la esculina en escutelina y glucosa con el oscurecimiento del medio. Además, con la prueba de la catalasa con peróxido de hidrógeno al 3% se puede constatar la presencia o no de esta enzima. En cuanto a la interpretación de los resultados: - Producción de precipitado y morfología de las colonias en CHROMMM En general M. pachydermatis, M. sympodialis y M. globosa producen precipitado luego de la incubación. M. furufur, M. slooffiae, M. obtusa y M. restricta no producen precipitados. M. furfur desarrolla generalmente su colonia de aspecto rugoso lo que, en esas circunstancias la hace distinguible de las tres restantes.

Solamente M. japonica, M. dermatis fueron sembradas en el medio de CHROMMM siendo de las dos, M. dermatis la que presentó precipitado. ESQUEMA DE IDENTIFICACIÓN • chrom-malassezia modificado presencia de pp. morfología tamaño pequeño (