Universidad Veracruzana Xalapa Facultad de Bioanálisis

Manual de Prácticas de Parasitología Clínica

Q.C. Claudia Arronte [NOMBRE DE LA COMPAÑÍA] | [DIRECCIÓN DE LA COMPAÑÍA]

ÍNDICE ÍNDICE .......................................................................................................................................................... 1 EXÁMEN DIRECTO .................................................................................................................................... 2 COPROPARASITOSCÓPICO MEDIATO O INMEDIATO CON COLORANTES VITALES ............ 3 AMEBAS DE VIDA LIBRE ......................................................................................................................... 4 INVESTIGACIÓN DE PROTOZOARIOS DE CAVIDAD ....................................................................... 5 INVESTIGACION DE TOXOPLASMA GONDII ...................................................................................... 6 INVESTIGACIÓN DE PROTOZOARIOS PULMONARES .................................................................... 7 INVESTIGACIÓN DE PLASMODIUM ...................................................................................................... 8 ESTUDIO DE HEMOFLAGELADOS ...................................................................................................... 10 CPS DE FLOTACIÓN CON SOLUCIÓN DE SACAROSA (SHEATHER) ........................................ 11 MÉTODO DE CONCENTRACIÓN POR FLOTACIÓN MÉTODO DE FAUST ................................ 12 MÉTODO DE CONCENTRACIÓN POR FLOTACIÓN WILLIS.......................................................... 13 MÉTODO DE CONCENTRACIÓN POR SEDIMENTACIÓN RITCHIE ............................................ 14 MÉTODO DE GRAHAM ........................................................................................................................... 16 MÉTODO CUANTITATIVO DE DILUCIÓN TÉCNICA DE STOLL .................................................... 17 METODO CUANTITATIVO DE FROTIS GRUESO KATO ................................................................. 19 MÉTODO DE BAERMAN ......................................................................................................................... 21 HARADA-MORI ......................................................................................................................................... 23

1

EXÁMEN DIRECTO OBJETIVO: Observación de los protozoos en fresco y coloreados con lugol.

GENERALIDADES: Este método es el más antiguo que se conoce; por los datos históricos que se tienen en relación con los primeros microscopios probablemente Anton van Leewenhoek, a mediados del siglo XVII, fue de los primeros en utilizarlo, al observar y encontrar en sus propias heces fecales trofozoitos de Giardia lamblia. Este método tiene, entre sus características, la sencillez y rapidez para llevarlo a cabo, además de la economía, pues es el que requiere menos material. Este método es el indicado para búsqueda de trofozoitos. En la práctica ha demostrado su eficacia cuando se utiliza lugol para la identificación de quistes, huevos y larvas. MATERIAL Y EQUIPO 

Aplicadores de madera



Portaobjetos de 25 X 76 mm



Cubreobjetos de 22 X 22 mm



Solución salina isotónica



Lugol



Microscopio

METODO

1. En un portaobjetos limpio y desengrasado, se colocan separadamente, una gota de solución salina y otra de lugol. 2. Con el aplicador de madera se toma una muestra de 1 a 4 mg de heces 8 en muestras con sangre y moco elegir esa parte para estudiar) y se mezcla con la solución, con el mismo aplicador se retiran las fibras y otros fragmentos gruesos, procurando hacer una suspensión no un frotis. 3. Colocar el cubreobjetos. 4. Repetir estas operaciones en la gota de lugol. 5. Observar al microscopio con objetivos de 10X y 40X. 6. Reportar dibujos de observación y resultados

2

COPROPARASITOSCÓPICO COLORANTES VITALES

MEDIATO

O

INMEDIATO

CON

OBJETIVO: Conocer los diferentes colorantes y su afinidad con los protozoos en la facilitación de la observación.

GENERALIDADES: La utilidad de los colorantes vitales (azul de metileno, rojo congo, eosina, verde de malaquita, verde de Janus, Safranina) para poder diferenciar correctamente los diferentes protozoos basándose en las características morfológicas de cada uno de ellos observando sus núcleos, endosomas, etc. MATERIAL Y EQUIPO · Aplicadores De madera · Portaobjetos de 25 X 76 mm · Puente de tinción · Lámpara de alcohol · Azul de metileno al 3.5% · Agua destilada · Microscopio METODO 1. En un portaobjetos se coloca una gota de azul de metileno al 3.5% 2. Se toma una porción pequeña de heces fecales con un aplicador y se realiza una suspensión homogénea con el colorante. 3. Se deja actuar el colorante por 3 minutos o bien se flamea pero sin que hierva la muestra, sólo hasta la emisión de vapores. 4. Observar al microscopio con objetivos de 10X y 40X. 5. Anotar dibujos de observación y resultados.

3

AMEBAS DE VIDA LIBRE OBJETIVO: observación de amebas de vida libre con hábitat en la tierra y agua. GENERALIDADES: Entre las numerosas amebas de vida libre, Acanthamoeba culbertsoni y Naegleria fowleri son parásitos facultativos del hombre causando meningoencefalitis amebiana primaria. El paciente se infecta por nadar en aguas termales o estancadas de 3 a 6 días antes del comienzo de cefalea frontal intensa, fiebre y constipación nasal, seguidas de afección del sistema nervioso central. Puede haber alteraciones del gusto y olfato, así como rigidez de la nuca. También puede producir úlceras en la córnea que conducen a la ceguera e infecciones granulomatosas de la piel. MATERIAL Y EQUIPO 

Microscopio



Portaobjetos de 25 X 76 mm



Cubreobjetos de 22 X 22 mm



Pipeta Pasteur



Aguas negras

METODO 1. Se coloca una gota de aguas negras en un portaobjetos. 2. Se coloca el cubreobjetos encima. 3. Observar al microscopio con objetivos de 10X y 40X. 4. Anotar resultados de observación y hacer dibujos.

4

INVESTIGACIÓN DE PROTOZOARIOS DE CAVIDAD OBJETIVO: Demostrar la presencia de protozoarios flagelados en exudados vaginales y uretrales y en orina por medio de examen directo. GENERALIDADES: Las parasitosis por Tricomonas vaginalis carece de hospedero intermediario. En la transmisión sexual, el hombre funciona como vector y la mujer infectada como reservorio del parásito; la infección es más frecuente en grupos de mujeres donde la higiene es deficiente, siendo el contacto sexual el mecanismo más frecuente por el que se adquiere el parásito; sin embargo se sabe de casos de tricomoniosis que se han adquirido en el momento del parto, por contacto con ropa, toallas, baños, instrumentos de exploración ginecológica u otros objetos contaminados. La presencia del parásito en el tracto urinario del varón pasa inadvertida con mayor frecuencia que en el de la mujer o las molestias son mínimas. MATERIAL Y EQUIPO 

Microscopio



Hisopo



Portaobjetos y Cubreobjetos



Tubo de ensaye con sol. Isotónica estéril



Espejo vaginal



Puente de tinción



Pipeta Pasteur con bulbo



Aceite de inmersión



Colorante de Wright



Secreción vaginal, uretral u orina



Pizeta con agua destilada

METODO 1. Se coloca a la paciente en posición ginecológica. 2. Introducir con cuidado el espejo vaginal. 3. Con un hisopo tomar la muestra del fondo de saco posterior. 4. Depositar la primera toma en un portaobjetos limpio y hacer un extendido. 5. La segunda toma depositarla en un tubo de ensaye con solución salina conservando a 37°C. 6. Una vez seco el extendido se procede a teñir con el colorante de Wright de 1 a 3 min. 7. Se observa al microscopio con objetivos de 10X, 40X y 100X agregando a éste último aceite de inmersión. 8. Con una pipeta Pasteur se toma una gota del fondo del tubo de ensaye y se deposita en un portaobjetos y se cubre. 9. Examinar con objetivos de 10X y 40X. 10. Anotar resultados de observación y hacer dibujos.

5

INVESTIGACION DE TOXOPLASMA GONDII OBJETIVO: Estudiar las características morfológicas y tintoreales de Toxoplasma gondii tanto en heces frescas de gato como en preparaciones fijas y teñidas. GENERALIDADES: La toxoplasmosis es una enfermedad parasitaria producida por Toxoplasma gondii el cual lleva su fase sexual de reproducción en su hospedero definitivo que es el gato y otros felinos salvajes y su fase de multiplicación asexuada en los tejidos de una gran variedad de mamíferos, aves y el hombre. La toxoplasmosis se presenta con una diversidad de signos y síntomas. De las entidades clínicas que destacan son meningoencefalitis, retinocoroiditis y abortos. En el examen microscópico, puede observarse la forma proliferativa en media luna o banana, con un extremo redondeado y otro afilado, con un solo núcleo central que se tiñe de color rojo y citoplasma de color azul. Se pueden encontrar en forma individual o en grupos. La forma quística la podemos encontrar en tejidos teñidos. En los felinos las esporas del parásito se encuentran en la luz intestinal ya que ahí llevan a cabo su ciclo vital pues es una coccidia.

MATERIAL Y EQUIPO 

Microscopio



Portaobjetos



Cubreobjetos



Aplicadores de madera



Sol. Salina



Aceite de inmersión



Preparaciones fijas de Toxoplasma gondii



Materia fecal de gato

METODO 1. 2. 3. 4. 5.

En un portaobjetos depositar 1 gota de solución salina. Agregar 1 mg de la muestra y homogeneizarla en la solución salina. Quitar las partículas gruesas y colocar el cubreobjetos. Observar al microscopio con objetivos de 10X y 40X. Colocar al microscopio la preparación fija y teñida, observar con objetivos de 10X , 40X y 100X utilizando en este último aceite de inmersión. 6. Anotar resultados de observación y hacer dibujos.

6

INVESTIGACIÓN DE PROTOZOARIOS PULMONARES OBJETIVO: Investigar en secreciones pulmonares, presencia de protozoarios. GENERALIDADES: Pneumocystis carinii es un parásito extracelular, que produce neumonía intersticial de células plasmáticas, la cual se observa en niños prematuros, desnutridos, en personas inmunocomprometidas (SIDA, procesos malignos, inmunosuprimidas por transplantes, etc.) Se considera como un elemento oportunista, pues lo podemos encontrar en el cuerpo humano sin dar lugar a síntomas. MATERIAL Y EQUIPO 

Microscopio



Portaobjetos 25 X 76 mm



Aplicador de madera



Mechero



Puente de tinción



Colorante de Giemsa



Sol. Buffer ph 7.0-7.2



Aceite de inmersión



Frasco con expectoración o material de aspiración bronquial

METODO 1.- En un portaobjetos limpio y desengrasado hacer un frotis de la expectoración. 2.- Dejar secar 5 minutos. 3.- Proceder a teñir cubriendo el frotis con sol. colorante de Giemsa por 30 minutos, escurrir y lavar con sol. buffer, escurrir y dejar secar. 4.- Observar al microscopio con objetivos de 10X, 40X y 100X agregando a esta última observación aceite de inmersión. 5.- Anotar resultados de observación y hacer dibujos.

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INVESTIGACIÓN DE PLASMODIUM OBJETIVO: Conocer los procedimientos de laboratorio útiles en el diagnóstico del paludismo ya que podemos encontrarlo en forma aislada en nuestro país. GENERALIDADES: El procedimiento para el diagnóstico de protozoos en sangre circulante es el estudio al microscopio de preparaciones en portaobjetos las cuales son la extensión fina y la gruesa. La extensión fina ideal es la que tiene el grosor de una célula y en la que los elementos celulares aparecen algo aplanados. La extensión fina es útil para estudiar detalles de los hematíes y de los parásitos de la sangre, su principal limitación es que la cantidad de sangre presente en la muestra es pequeña. La extensión gruesa contiene 6-20 veces más sangre por unidad de superficie que la extensión fina. Es fundamental que no se fije antes de la tinción ya que los hematíes tienen que deshemoglobinizarse durante el procedimiento. La rotura de los hematíes y la pérdida de su hemoglobina permite la visión microscópica de las demás estructuras, incluidos los parásitos sanguíneos, aunque se encuentren en la parte más profunda de la extensión. La extensión gruesa resulta útil para el diagnóstico rápido de las parasitemias demasiado leves para apreciarse en la extensión fina, pero no sirve para estudios anatómicos finos. La toma de sangre periférica para Plasmodium vivax y P. Malarie deben efectuarse cuando el paciente presenta escalofríos para la búsqueda de esquizontes maduros. Para P. Falciparum se debe tomar la muestra después del acceso febril para observar los eritrocitos con varios trofozoitos antes que estos desaparezcan en capilares de órganos internos. Con el colorante Giemsa las estructuras se tiñen de la siguiente manera: Plasmodium: Citoplasma azul o azul grisáceo. Eritocitos: Azulosos, grisáceos y en ocasiones rosados. Núcleo de los Leucocitos: Violeta o morado. Plaquetas: Violeta ligero o rosa pálido. MATERIAL Y EQUIPO 

Microscopios



2 portaobjetos limpios y desengrasados



1 lanceta desechable



Puente de tinción



Caja de Petri



Pipeta Pasteur con bulbo



Torundas de algodón con alcohol al 70%

8



Sol. Colorante de Giemsa



Alcohol metílico



Aceite de inmersión



Agua destilada



Algodón



Preparaciones teñidas de Plasmodium

METODO 1.- En cada mesa se seleccionará un alumno, para puncionar el dedo pulgar o el lóbulo de la oreja previa asepsia de la región con alcohol al 70%. Una vez que se evapora el alcohol se realiza la punción, colocando 3 a 4 gotas de sangre en un extremo del portaobjetos y una gota pequeña en el extremo opuesto. 2.- Las 3 gotas se extienden con el canto de otro portaobjetos y la gota se redondea con uno de los ángulos de dicho portaobjetos a dejarla de 1 cm de diámetro. 3.- Dejar secar las dos preparaciones a temperatura ambiente durante una hora y media, para que se fije bien la gota gruesa. 4.- Una vez seca la preparación fina cubrir con alcohol metílico durante uno o dos minutos, procurando que no toque el alcohol a la gota gruesa. 5.- Pasado este tiempo, desechar el exceso de alcohol y dejar secar por evaporación. 6.- Colocar algodón húmedo en la caja de Petri y encima el frotis. 7.- Cubrir el frotis con colorante de Giemsa. 8.- Taparlo para evitar que se seque, dejar actuar el colorante durante 10 minutos. 9.

Lavar con agua destilada.

10. Escurrir y dejar secar. 11.- Observar al microscopio con objetivos de 10X, 40X y 100X agregando a este último aceite de inmersión. 12.- Anotar resultados de observación y hacer dibujos.

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ESTUDIO DE HEMOFLAGELADOS OBJETIVO: Investigar protozoarios flagelados de la sangre y tejidos del hombre, utilizando ranas en las cuales los parásitos viven como hospederos comensales. GENERALIDADES: Los protozoarios de la familia Trypanosomidae se caracterizan por tener un solo flagelo, un núcleo y una estructura llamada cinetoplasto, de la cual se origina el flagelo. Se conocen cuatro formas cíclicas: amastigote, promastigote, epimastigote y tripomastigote. La familia tiene 6 géneros, cinco son parásitos de animales y uno de las plantas. MATERIAL Y EQUIPO: 

Microscopio



Portaobjetos y Cubreobjetos



Pipeta Pasteur con bulbo



Caja Petri



Bisturí



Puente de tinción



Sol. Salina 0.7%



Aceite de inmersión



Agua destilada



Colorante de Wright



Rana Pipiens o Pretiosa

METODO 1.- Sujetar la rana para mantenerla estable. 2.- Cortar uno o dos dedos de la extremidad posterior. Dejar caer una gota de sangre al portaobjetos. 3.- Agregar una gota de solución salina 0.7%. 4.- Con el canto de un cubreobjetos mezclarla bien y colocar el cubreobjetos procurando no hacer vacíos. 5.- Examinar al microscopio con objetivos de 10X y 40 X. 6.- En otro portaobjetos dejar caer 2 gotas de sangre y hacer una extensión, dejar secar al aire. 7.- Teñir con solución colorante de Wright durante 1 a 3 minutos. 8.- Pasado este tiempo lavar con agua destilada. Dejar escurrir y secar al aire. 9.- Observar con objetivos de 10X, 40X y 100X utilizando con éste último aceite de inmersión. 10.- Anotar dibujos y resultados.

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CPS DE FLOTACIÓN CON SOLUCIÓN DE SACAROSA (SHEATHER) OBJETIVO: Realizar técnica de flotación cuando no se tienen a la mano otros reactivos, generalmente utilizado en trabajo de campo.

MATERIAL: -

Vaso de precipitado de 50 ml Abatelenguas Cubreobjetos Portaobjetos Lugol Solución sobresaturada de sacarosa con densidad de 1.180º Baumé

MÉTODO: 1. Con un abatelenguas se homogeniza la muestra y se hace una suspensión de aproximadamente 1 gr de materia fecal, en el vaso de pp, con un poco se solución de sacarosa, hasta lograr una buena mezcla. 2. Mientras se mezcla con el abatelenguas, se incorpora paso a paso la solución de sacarosa hasta que llegue al tope. 3. Se coloca el cubreobjetos en la boca del frasco de manera que quede en contacto con la solución. Evitar en lo posible la formación de burbujas. Se deja reposar durante 5 minutos. 4. Se toma el cubreobjetos y se coloca sobre un portaobjetos en el cual se colocó previamente una gota de lugol. 5. Se observa al microscopio con objetivo de 10X y 40X. 6. Reportar dibujos de observación y hacer dibujos.

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MÉTODO DE CONCENTRACIÓN POR FLOTACIÓN MÉTODO DE FAUST OBJETIVO: Realizar un método de concentración por flotación utilizando Sulfato de Zinc con densidad de 1.180º Baumé. GENERALIDADES: Este método hace una buena concentración de quistes, huevos y larvas; es una técnica preferida por la generalidad de los laboratorios porque las formas parasitarias son encontradas con facilidad pues las preparaciones quedan con pocos artefactos. MATERIAL: -

Tubos de ensaye de 13 x 150 Vasos de precipitado de 100 ml Embudo Gasa Asa bacteriológica Portaobjetos Cubreobjetos Abatelenguas Lugol Sulfato de Zinc 1.180ºBé Microscopios

MÉTODO 1. Se hace una suspensión homogénea con 1-2 g de materia fecal y 10 ml de agua de la llave. 2. Se pasa a través de gasa colocada en el embudo y se recolecta la suspensión directamente en el tubo. 3. Los tubos así preparados, se centrifugan a 2000 rpm durante un minuto. 4. Se decanta el sobrenadante y se resuspende el sedimento con agua. 5. Se agregan 2 a 3 ml de solución de Sulfato de Zinc a los tubos y se homogenizan, se llenan los tubos hasta 0.5 a 1 ml por abajo del borde. 6. Se centrifugan a 2000 rpm durante 1 min. 7. Se colocan 2 gotas de lugol en el portaobjetos y con el asa limpia, se recoge la muestra de la película superficial que se encuentra en el menisco, durante 2 o 3 ocasiones sucesivas y se homogeniza. 8. Se lleva la preparación al microscopio y se observa con los objetivos de 10 y 40 X. Hacer dibujos de observación y resultados.

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MÉTODO DE CONCENTRACIÓN POR FLOTACIÓN WILLIS OBJETIVO: Realizar método de concentración por flotación simple. GENERALIDADES: En 1921 Willis, basándose en métodos de flotación simple anteriores describió el método que lleva su nombre, el cual dada su sencillez, se puede utilizar en trabajos de campo, ya que para realizarlo únicamente se requiere microscopio y laminillas. Este método se basa en un principio de flotación simple, utilizando una solución de cloruro de sodio de una densidad entre 1.200 y 1.250, en la cual los quistes, huevos y larvas flotan perfectamente. MATERIAL Y EQUIPO: ·

Vasos de precipitado de 50 ml

·

Tubos de ensaye de 13 X 100 mm

·

Gradilla

·

Abatelenguas de madera

·

Portaobjetos de 26 X 76 mm

·

Cubreobjetos de 22 X 22 mm

·

Microscopio

·

Solución de salmuera o solución saturada de cloruro de sodio

·

Lugol

METODO 1.- Se colocan en el vaso de precipitado de 2 a 3 gr de materia fecal, se añade una pequeña cantidad de solución saturada de cloruro de sodio, se homogeniza. 2.- Se vierte en un tubo de ensaye hasta el borde, se coloca el cubreobjetos de tal manera que quede en contacto con la suspensión y se deja reposar durante 15 minutos. 3.- Transcurridos los 15 minutos se toma el cubreobjetos y se coloca sobre un portaobjetos al cual se le ha puesto previamente una gota de lugol. 4.- Se observa al microscopio con objetivos de 10X y 40 X. 5.- Anotar resultados de observación y hacer dibujos.

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MÉTODO DE CONCENTRACIÓN POR SEDIMENTACIÓN RITCHIE OBJETIVO: Realizar un método de sedimentación con gran sensibilidad para detectar infecciones leves. GENERALIDADES: En 1917 Carles y Barthelemy describieron el primer método de concentración por sedimentación utilizando solución salina, éter y formaldehído, años más tarde, en 1948 Ritchie describió un método semejante, el cual hasta la fecha se sigue utilizando. En evaluaciones comparativas con este método, se ha demostrado su utilidad para el diagnóstico de parasitosis intestinales leves o moderadas. El empleo de éter y formaldehído, permite con el primero, liberar las formas parasitarias de las grasas, por disolución de las mismas y con el formol se fijan y conservan. La concentración se hace por centrifugaciones sucesivas. Unas ventajas que tiene este método es concentrar y no deformar las formas parasitarias, permite el transporte y almacenamiento de la materia fecal procesada antes de ser examinada, se usa cuando se necesita una técnica para evaluación de tratamiento y determinación de frecuencia.

MATERIAL Y EQUIPO 

Microscopio



Centrífuga



Tubos de ensaye cónicos de 15 ml



Gasa cortada en cuadros de 15 cm por lado



Embudos de polietileno



Vasos de precipitado de 50 ml



Aplicadores de madera



Pipetas Pasteur con bulbo



Portaobjetos de 26 X 76 mm



Cubreobjetos de 22 X 22 mm



Solución salina isotónica



Solución de formaldehído al 10%



Éter etílico comercial

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METODO 1.- Con el aplicador de madera se coloca aproximadamente 1 gr. de la materia fecal en el vaso de precipitado, se añaden 10 ml de solución salina y se homogeniza. 2.- Se filtra la suspensión a través de la gasa colocada en el embudo, recogiendo el filtrado en el tubo cónico. 3.- Se centrífuga la suspensión durante 1 min a 2000 rpm. 4.- Se decanta el sobrenadante y se resuspende el sedimento con solución salina, centrifugando, decantando y resuspendiendo las veces necesarias hasta que el sobrenadante sea claro. 5.- Al último sedimento se agregan 10 ml de solución de formaldehído al 10%, se mezcla y se deja reposar durante 10 min. 6.- Se añaden después 5 ml de éter, se tapan los tubos con tapones de caucho y se agitan enérgicamente durante 30 segundos. 7.- Se centrífuga durante 2 minutos a 1500 rpm. 8.- Después de centrifugar se observan 4 capas: a)

éter en la superficial,

b)

un tapón de restos fecales,

c)

formaldehído,

d)

sedimento en el fondo del tubo, conteniendo los elementos parasitarios.

9.- Se introduce la pipeta Pasteur hasta la capa d, se extrae con cuidado una gota del sedimento y se coloca en un portaobjetos. 10.-Se le añade una gota de lugol y con uno de los ángulos del cubreobjetos, se homogeniza, cubriéndolo con el mismo. 11.-Se observa la preparación en el microscopio con objetivos de 10X y 40X. 12.-Se anotan resultados de observación y hacer dibujos.

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MÉTODO DE GRAHAM OBJETIVO: Encontrar por de Enterobius vermicularis.

medio

del

raspado

perianal

huevos

GENERALIDADES: Vix en 1860 recomendó por primera vez el uso de una torunda o un raspador anal para obtener material para el examen microscópico en busca de huevos de Enterobius. Graham (1941) y Jacobs (1942) introdujeron independientememnte una técnica de cinta adhesiva de celulosa Scotch para obtener huevos de Enterobius de la región perianal. Esta técnica se basa en que la hembra adulta de Enterobius vermicularis habitualmente no deposita sus huevos en el interior del intestino, sino que por lo general emigra durante la noche, hacia las márgenes del ano, depositando los huevos en los pliegues perianales. Es por esto que la toma debe efectuarse en la mañana indicando que debe ir a defecar y no debe bañarse. Ocasionalmente se pueden encontrar huevos de Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Hymenolepis nana, Taenia sp. MATERIAL Y EQUIPO 

Portaobjetos De 26 X 76 mm



Abatelenguas



Cinta de celulosa Scotch



Microscopio

METODO 1.- Sobre un extremo del abatelenguas se coloca la cinta Scotch con la parte adherente hacia fuera, sujetándola con los dedos pulgar e índice. 2.- Se presiona la superficie sobre la región perianal hacia uno y otro lado, finalmente se hace un frote perianal. 3.- Separar cuidadosamente la cinta del abatelenguas y adherirlo sobre un portaobjetos. 4.- Observar con objetivo de 10X.

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MÉTODO CUANTITATIVO DE DILUCIÓN TÉCNICA DE STOLL

OBJETIVO: Utilización de un método que nos sirve para hacer una evaluación de la intensidad de ciertas helmintosis como ascarosis, tricocefalosis, uncinaroisis, himenolepiosis y estrongiloidosis. GENERALIDADES: En 1923 Stoll y colaboradores describieron el método de dilución que lleva su nombre utilizando como solución diluyente Hidróxido de Sodio décimonormal. Este método se basa en los principios de saponificación, homogenización y aclaración. El NaOH 0.1 N al ponerse en contacto con las grasas de las heces se saponifica, hace que los huevos de los parásitos sean menos pegajosos, desinfecta y deodoriza la muestra. MATERIAL Y EQUIPO · Probeta graduada de 100 ml con tapón esmerilado. · Pipetas de Stoll o graduadas de 2 ml en 0.01 ml. · Varilla de vidrio de 20 cm de longitud. · Perlas de vidrio. · Microscopio. · Portaobjetos de 74 X 38 mm. · Cubreobjetos de 22 X 40 mm. · NaOH 0.1 N METODO 1.- Se coloca en la probeta Hidróxido de Sodio 0.1 N hasta la marca de 56 ml. 2.- Con la varilla de vidrio, se añade materia fecal hasta aforar a 60 ml. 3.- Si las heces son duras, se espera un tiempo a que se reblandezcan. 4.- Se añaden 15 perlas de vidrio, se tapa la probeta, se agita fuertemente, de arriba abajo, durante 1 minuto, hasta formarse una suspensión homogénea. 5.- Los huevos y restos empiezan a precipitar en cuanto cesa la agitación. Con la pipeta se toma inmediatamente 0.075 o 0.15 ml del centro de la suspensión. Se recomienda el segundo volumen, que da una muestra mayor para el recuento. Llevando la punta de la pipeta al centro del matraz, el error debido a la precipitación de los huevos disminuye.

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6.- Se pasa la totalidad del contenido de la pipeta a un portaobjetos y se cubre la gota con el cubreobjetos. 7.- Se examina la preparación sistemáticamente con el objetivo seco débil y se cuentan todos los huevos y larvas presentes cuidando no contar dos veces la misma estructura.

CALCULOS El número de huevos y larvas contados se multiplica por : ·

100, si la materia fecal es dura.

·

200, si la materia fecal es pastosa.

·

400, si la materia fecal es líquida.

Estos factores dependen de la cantidad de agua que las muestras contienen. El resultado se expresa en huevos o larvas por ml de heces (H.ml.H) Los quistes únicamente se reportan, sin cuantificarse.

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METODO CUANTITATIVO DE FROTIS GRUESO KATO OBJETIVO: Realizar un método cuantitativo de helmintos. GENERALIDADES: En 1954 Kato y Miura introdujeron la técnica de estudio de frotis grueso con buen resultado para contar huevos de helmintos. Martín y Beaver en 1968 desarrollaron modificaciones a esta técnica con lo que les permitió retirar fibras de la materia fecal, hacer una extensión uniforme del frotis y evitar aclaración excesiva

de

la

preparación.

Estudios

comparativos

con

otros métodos

coproparasitoscópicos han demostrado que la técnica de frotis grueso es digna de confiar, para el diagnóstico cuantitativo de helmintos, el único limitante es que no se pueden observar quistes y trofozoitos por lo cual no es recomendable para la detección de protozoarios. Este método se basa en la acción que tiene la glicerina como aclarador de los huevos de helmintos y el verde de malaquita como colorante de contraste. MATERIAL Y EQUIPO 

Microscopio



Aplicadores de madera



Malla de alambre



Portaobjetos de 38 X 76 ó de 26 X 76 mm



Papel celofán de grosor medio, no resistente a la humedad recortado en cuadros de 22 X 40 ó 22 X 30 mm



Recipiente conteniendo glicerol y verde de malaquita al 3%

METODO 1.- Con un abatelenguas, pasar 50- 60 mg de materia fecal a un portaobjetos a través de la malla metálica. 2.- Cubrir la muestra con el cubreobjetos de celofán embebido en la solución de verde de malaquita y glicerol. Invertir la preparación, presionar sobre una

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hoja de papel filtro contra la superficie de la mesa de trabajo, para lograr la extensión de la muestra hasta cubrir un área de 20 a 25 mm de diámetro. 3.- Dejar reposar la preparación con el cubreobjetos de papel celofán hacia arriba durante una hora a temperatura ambiente o 30 minutos a 34-40°C. Esto motivará la aclaración de las heces, sin que se aclaren los huevos de helmintos. 4.- Observar al microscopio, hacer el conteo de los huevos que se encuentren en la preparación. Para obtener la cifre total, cada cuenta alcanzada, multiplicarla por el factor correspondiente para expresarla en huevos por gramo de heces (h.g.h) Si se pesaron 50 mg , multiplicar por 20 que es un factor constante y el producto será la cifra a reportar. Debe evitarse exceder el tiempo de aclaración porque esto dificultaría la observación de los huevos de helmintos. Si fuese necesario demorar la observación puede detenerse el proceso de aclaración invirtiendo la preparación es decir colocarla con el papel celofán hacia abajo hasta el momento que se vaya a observar.

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MÉTODO DE BAERMAN OBJETIVO: Recuperación de larvas en tierras contaminadas GENERALIDADES: Es un método muy conveniente para hacer una buena concentración de larvas del suelo de vida libre. En Parasitología Médica se utiliza para concentrar larvas de Strongiloides stercoralis, Necator americanus y Ancylostoma duodenale. MATERIAL. -

Embudo

-

Tubo de látex

-

Pinza

-

Soporte universal

-

Pinzasde Mohr

-

Gasa

-

Vasos de pp de 100 y 250 ml

-

Tripié

-

Malla de alambre con asbesto

-

Lugol, HCl o ácido acético

MÉTODO: 1. Armar el dispositivo según el esquema adjunto

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2. Se llena el embudo con agua caliente ( aprox. 40º) hasta el cuello, se coloca la gasa y encima la tierra o materia fecal sobre la gasa 3. Se deja reposar de 1 a 5 días, para que las larvas pasen al agua del embudo. 4. Pasado este tiempo, se abre la pinza, se deja salir el agua y se recibe en un vaso de precipitado. 5. Se centrifuga el líquido durante 1 minuto a 2000 rpm, se toma el sedimento y se coloca entre portaobjetos y cubreobjetos; se examina con el objetivo de 4X. 6. Se observan con detenimiento las larvas para la identificación in vivo, pues se observarán las cápsulas bucales incipientes en las de Necator americanus y Ancylostoma duodenale y la cola bifurcada en las de Strongiloides stercoralis. 7. Reportar dibujos de observación y resultados

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HARADA-MORI OBJETIVO: Realizar cultivo de huevos para obtener desarrollo de larvas y así poder precisar la especie. GENERALIDADES: Los huevos uncinariformes observados en muestras fecales pueden ser difíciles o imposibles de diagnosticar, mientras que las larvas que surgen de ellos se identifican fácilmente. Un problema práctico frecuente es la diferenciación de las infecciones por Necator de las producidas por Ancylostoma. Para cultivar larvas a partir de huevos, Harada y Mori (1955) describieron un método sencillo y limpio en tubos de ensaye. MATERIAL Y EQUIPO: 

Agua Destilada

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Tubos de ensaye de punta cónica de 15 ml

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Gradilla

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Abatelenguas o aplicadores de madera

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Tiras de papel filtro de 13 X 120 mm

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Portaobjetos de 26 X 76 mm

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Cubreobjetos de 22 X 22 mm

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Pipetas Pasteur con bulbo

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Sol. De lugol o ácido acético al 20%

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Microscopio

METODO: 1.- Se extiende una fina película de heces (de 1 a 2 mm) en un lado del tercio medio de una tira de papel filtro. 2.- Se coloca el papel en un tubo de ensaye con 3 ml de agua destilada forzando la tira hasta aproximadamente el nivel de 1 cm y presionando el lado limpio contra la pared del tubo. 3.- Se conserva el cultivo a temperatura ambiente (24-28°C) en la oscuridad durante un periodo de 1-5 días añadiendo agua según se vaya necesitando para mantener el nivel bastante por encima del extremo inferior del papel filtro.

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El flujo capilar del agua que sube a través del papel y la película fecal mantiene húmedas las heces y transporta sus elementos solubles hacia la parte superior del papel, donde se evaporan o acumulan en un depósito oscuro. Al alcanzar la fase infecciosa, las larvas migran hacia abajo contra la corriente del flujo del agua, y al alcanzar el nivel de ésta se sumergen hacia el fondo, donde pueden verse con una lupa y tomarse con una pipeta para su examen microscópico. La tira de papel filtro puede transferirse a un tubo limpio lleno de agua para recoger las larvas que hayan podido quedar en la película fecal. Algunas especies de larvas tienen tendencia a no migrar hacia abajo. Antes de retirarlas, las larvas pueden inmovilizarse introduciendo el tubo a baño María (50-60°C) o añadiendo una cantidad de ácido Acético al 20%.

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