UNIVERSIDAD  AUTONOMA  DE  CHIAPAS   CAMPUS  IV   FACULTAD    DE  CIENCIAS  QUIMICAS          

MANUAL DE PRACTICAS      

* HEMATOLOGIA *

         Titular  de  la  Materia:  DRA.  CONSUELO  CHANG  RUEDA       NOMBRE  DEL  ALUMNO:__________________________   CICLO ESCOLAR:___________________________________

       

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      *  I  N  D  I  C  E  *                     PRACTICA No. 1 EXAMEN DE SANGRE Y TOMA DE MUESTRA . PRACTICA NO. 2 RECUENTO DE RETICULOCITOS . . . PRACTICA NO. 5 DOSIFICACION DE HEMOGLOBINA . . . PRACTICA NO. 6 VELOCIDAD DE SEDIMENTACION GLOBULAR . PRACTICA NO. 7 HEMATOCRITO . . . . . . PRACTICA NO. 8 RECUENTO DE ERITROCITOS . . . . PRACTICA NO. 9 RECUENTO DE LEUCOCITOS . . . . PRACTICA NO. 10 RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS . PRACTICA NO. 11 EOSINOFILOS EN MOCO NASAL . . . RECOMENDACIONES PARA EL LABORATORIO DE HEMOSTASIA . . . . . . . PRACTICA NO. 12 TIEMPO DE SANGRADO . . . . . PRACTICA NO. 13 TIEMPO DE COAGULACION . . . . PRACTICA NO. 14 RECUENTO DE PLAQUETAS . . . . . PRACTICA NO. 15 TIEMPO DE PROTROMBINA . . . . PRACTICA No. 16 TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA

Dra en Ciencias Consuelo Chang Rueda

 

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PRACTICA no. 1

OBTENCION DE MUESTRAS SANGUINEAS FUNDAMENTO: En todo laboratorio clínico, podemos afirmar que la calidad de un exámen empieza con la calidad de la muestra. El de hematología no es la excepción. Por lo que resulta fundamental conocer la metodología correcta para la obtención de las muestras, así como las ventajas, las desventajas, las indicaciones y los riesgos. Determinadas exploraciones de los elementos formes de la sangre periferíca, sus precursores y algunos de sus productos, constituyen una rama separada de la ciencia llamada HEMATOLOGÍA. Las exploraciones de la sangre tienen valor para el diagnóstico de los pacientes, en cuanto se realacionan estrechamente con la totalidad del cuadro clínico. La sangre está formada por un líquido de composición complicada y variable: el plasma, que contiene leucocitos, eritrocitos y plaquetas en suspención. Impidiendo la coagulación, los elementos formes pueden ser separados del plasma que tiene un color paja pálido. Cuando la sangre se coagula, el líquido que queda despúes de separarse el coágulo, se denomina suero. La diferencia fundamental entre el suero y el plasma consiste en que el suero pierde el fibrinógeno protéico, que se convierte en filamentos insolubles de fibrina en el curso de la coagulación. Las técnicas hematológicas tratan sobre todo los componentes celulares de la sangre, su número o concentración; la distibución relativa de diversos tipos de células y los transtornos estructurales o bioqímicos que pueden producir una enfermedad. la sangre para pruebas de laboratorio puede ser capilar o periferica y venosa. Una y otra tienen sus defensores, ventajas e inconvenientes.

SANGRE CAPILAR O PERIFERICA. INTRODUCCIÓN Se dice que la sangre que llamamos periférica es más bien arteriolar que capilar. Para la mayoria de los exámenes clínicos, incluyendo los recuentos de células y las determinaciones de la concentración de hemoglobina, es mejor tomar sangre de una vena. Pero para hacer formulas leucocitarias y también para contar los elementos celulares, puede sacarse del lobulo de una oreja, del pulpejo de un dedo o tratándose de niños del pulpejo del dedo gordo del pie o del talón. Si se saca de la oreja, la punción se hará en el borde libre del lóbulo, no en la superficie del mismo. Se procederá con decisión y despacio, pues apenas duele y deberá profundizarse hasta unos 3 mm. De una punción bien hecha puede prepararse 100 extensiones o recoger varis centímetros cubícos de sangre. Si el paciente guarda cama, resultará ma´s cómodo hacérsela en el dedo, por ser más accesible; por lo demás, es preferible hacer la punción en la oreja, por ser ésta menos sensible. No deberá hacerse en una parte adematosa o congestionada, ya que es esencial que la sangre pueda fluír libremente para obtener resultados reproducibles que se puedan comparar con los de la sangre venosa. La piel fría y cianótica es una fuente de errores, pues da cifras altas falsas de glóbulos rojos y blancos; esto se evita dando un masaje a la piel hasta que esté rosada y caliente antes de la punción. Pero no se debe frotar fuertemente la piel, una vez que la punción esté hecha, por que se originan errores.

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OBJETIVOS: Al terminar la práctica, el alumno será capaz de: 1. Justificar la indicación de los metodos de obtención de muestras 2. Obtener correctamente analítica

muestras capilarews y venosas de calidad

EQUIPO: Ninguno MATERIAL - Al mohadillas de gasa esteril. - Una lanceta o una hoja de sacapelo. Hay varios modelos de lancetas.Se recomienda el uso de lancetas u hojas desechables. Si se piensa volver autilizar la misma lanceta en varios pacientes, deberá esterilizarse en autoclave antes. Las soluciones desinfectantes sencillas no son suficientes para destruír el agente etiológico de la hepatitis.

PROCEDIMIENTO: La obtención de las muestras de sangre para efectuar el estudio hematológico se realiza en general por punción venosa de los pacientes en condiciones basales (reposo) y en ayunas. A tal efecto se evitará la compresión demasiado enérgica del brazo, que contengan anticoagulantes. Antes de realizar la venopunción, verifique que cuenta con el siguiente material: a) b) c) d)

Todos los tubos correctamente identificados. Soportes y agujas apropiados. Algodón y/o gasas secas y estériles, torniquetes, vendajes adhesivos. Alcohol isopropílico al 70% y solución de yodo para muestras estériles.

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Rompa el sello de seguridad de la aguja sin quitar el protector de la misma. Colóquela en el soporte.

1.1 Inserte el tubo en el soporte asegurándose que la aguja quede en el centro del tapón y que el tubo no pase la marca horizontal del soporte, ya que perdería el vacío. 2. Aplique el torniquete si es necesario y limpie el sitio seleccionado para la venopunción con una solución anteséptica. NO TOQUE EL ÁREA DE LA PUNCION VENOSA DESPUÉS DE LIMPIARLA. 2.1 Asegurándose que el brazo del paciente esté hacia abajo y el tapón del tubo hacia arriba, lleve acabo la venopunción como se muestra en el esquema. 2.2 Perfore el tubo presionándolo mas allá de la marca horizontal del soporte. 3. En caso de haber sido utilizado, afloje el torniquete tan pronto comola sangre comience a fluir dentro del tubo (Ver el esquema). 3.1 Una vez que el primer tubo se ha llenado en su totalidad, retírelo. 3.2 Coloque los siguientes tubos en el soporte perforando los tapones para iniciar el flujo de la misma manera que con el primero. RETIRE LA AGUJA UNA VEZ QUE HAYA LLENADO TODOS LOS TUBOS REQUERIDOS. 4. Invierta los tubos con aditivo de 8 a 10 veces. NO LOS AGITE. El mezclar vigorosamente puede producir hemólisis. 5. Tan pronto el ultimo tubo haya sido llenado retírelo y posteriormente retire la aguja de la vena y presione el sitio de la venopunción con una gasa seca. Manteniéndola en su lugar. Dra en Ciencias Consuelo Chang Rueda

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RECOMENDACIONES Si la sangre no fluye al interior del tubo o decrece el flujo antes de recolectar una muestra adecuada, siga las siguientes recomendaciones: a) Confirme la posición correcta de la aguja en la vena. •

La abertura de la aguja puede estar contra la pared interna de la vena, gire lentamente el soporte de la aguja y la sangre debe empezar a fluir.

•

Si la aguja no está completamente en la vena, empuje ligeramente el soporte.

•

Si la aguja ha pasado a través de la vena, jale ligeramente el soporte.

b) Solicite  al  paciente  que  abra  y  cierre  el  puño,  esto  debe  estimular  el  flujo  de  sangre.     c) Confirme   la   posición   correcta   del   tubo,   puede   estar   insertado   de   tal   manera   que   la   cánula   posterior   no   atraviesa  completamente  el  diafragma  del  tapón,  retire  el  tubo  y  coloque  un  tubo  nuevo  en  el  soporte.     d) Pérdida  de  vacío  por  perforación  prematura  del  diafragma  interior  del  tapón.  Use  un  tubo  nuevo  y  respete  la   línea  guía  en  el  soporte.    

BIBLIOGRAFIA. Davidsohn, I., J.B. Henrry , Diagnóstico Clínico por el laboratorio. 6ª Ed. Salvat Barcelona. España . 1978 Houwen, B. “Random error in hematology test; a process control approach” Clinical Laboratory Hematology . Vol 18 . 1990 Lynch, M. J. S. Rápale, I. D. Mellor, P. D. Spare, M. J. Inwood Métodos de laboratorio. 2ª Ed. Interamericana. México, D. F. 1987 Moran Villatorio, Luis E. Obtención de muestras de Calidad Analítica. Ia. Ed. Manual moderno

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PRACTICA No. 2

RECUENTO DE RETICULOCITOS INTRODUCCION: El reticulocito es un glóbulo rojo joven que se forma cuando el núcleo del normoblasto viejo se expulsa. Su nombre proviene de que contiene una red de material basófilo que al ser sometido a métodos especiales de tinción (coloración supravital) revelan en su interior la existencia de una sustancia filamentosa o granulosa. Generalmente, entre más joven el reticulocito, más difuso es el retículo. Al madurar la célula, este caracter disminuye hasta que finalmente quedan unos cuantos gránulos. Los reticulocitos son un poco mayor en tamaño que los eritrocitos y su abundancia en la circulación es un índice de la actividad hematopoyética.

METODO "HUMEDO" EN TUBO: FUNDAMENTO: Los reticulocitos contienen restos de ácidos ribonucleícos (RNA) que al ser precipitados y teñidos por una coloración vital permiten que sean reconocidos como filamentos o granulos. Ya teñidoso se cuentan en un frotis sanguíneo y pueden expresarse como por ciento de los eritrocitos o en forma semicuantitativa relacionando el % de reticulocitos con la cuenta de eritrocitos.

OBJETIVO: Al terminar la práctica, el alukmno será capaz de: 1. Identificar la importancia y utilidad clínica de los reticulocitos 2. Realizar correctamente el recuento porcentual de reticulocitos en muestra sanguínea 3. Calcular a partir del recuento porcentual, las cifras absolutas de reticulocitos por uL de sangre.

EQUIPO: Baño maria Microscopio MATERIAL: Dra en Ciencias Consuelo Chang Rueda

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a).Biológico Sangre obtenida con EDTA b) De laboratorio Tubos de ensayo de 10x75 Pipeta Pasteur Portaobjetos Gradilla Acdeite de Inmersión REACTIVOS: Azul de cresil brillante Citrato de Sodio Formol al 4 % Solución salina fisiológica.c.b.p

1.0 g 0.4 g 0.2 ml 100 ml

Mezclar, disolver, filtrar y conservar en el refrigerador en frasco ámbar. Filtrar antes de usarse estable por varias semanas.

PROCEDIMIENTO: 1.- En un tubo de 10 x 75 mm. Poner igual volumen de sangre y colorante. 2.- Mezclar suavemente y dejar en reposo por 10 minutos para teñir los reticulocitos. 3.- Hacer un frotis delgado con la mezcla, dejar secar al aire. 4.- Con objetivo de inmersión contar el número de reticulocitos con la cuenta de eritrocitos.

CALCULOS: # DE RETICULOCITOS CONTADOS % DE RETICULCITOS= _______________________________ X 100 # DE ERITROCITOS CONTADOS % DE RETICULOCITOS RETICULOCITOS/uL =________________________ X ERITROCITOS/M3 100

CIFRAS NORMALES: Dra en Ciencias Consuelo Chang Rueda

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ADULTOS NIÑOS

0.5 - 1.5 % 2 - 6 % ( RECIEN NACIDOS ).

EN VALORES ABSOLUTOS: NIÑOS (R.N.) ADULTOS

100 000 - 250 000/ mm3 60 000/mm3.

Terminada la practica se obtuvierón los siguientes resulltados:

% DE RETICULCITOS= _______________________________

RETICULOCITOS/uL =_________________________________

BIBLIOGRAFIA R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno

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PRACTICA No. 5 DOSIFICACION DE HEMOGLOBINA. INTRODUCCION La hemoglobina es una proteína conjugada formada por un grupo prostético denominado HEM, Es un pigmento rojo que contiene hierro al estado ferroso y a la que le corresponde la función fisiológica del transporte de oxígeno y del anhídrido carbónico. Alrededor del 55 % de la célula roja esta consituído por hemoglobina que tiene un PM de 64 468 con 0.34 % de hierro y que es capaz de ligar una molécula de oxígeno gaseoso por equivalente. Cuando la hemoglobina se expone a la acción de varios gases o agentes tóxicos sobrevienen cambios en su constitución que resultaran reversibles o irreversibles.

FUNDAMENTO: Los eritrocitos se hemolizan y la hemoglobina primero se oxida a metahemoglobina con el ferricianuro, y despues reacciona con el cianuro de potasio para formar la cianometahemoglobina. OBJETIVOS: Al terminar la práctica, el alumno será capaz de: 1. Identificar la importancia y utilidad clínica de la cuantificación de hemoglobina 2. Cuantificar con precisión y exactitud la hemoglobina en muestras sanguíneas

EQUIPO: Espectrofotómetro Reloj de laboratorio

MATERIAL: A).

Biológico Sangre obtenida con EDTA

B)

De laboratorio Pipeta de Salí con boqui Pipeta volumetrica de 5 ml Tubos de ensayo de 13x100 mm Celdas para espectofotometro Gradilla Papel milimétrico Pipetas sexológicas de 1 y 5 ml

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C).

Reactivos Diluyente de Drabking Sol. Patron de hemoglónina de 60 mg/dL

REACTIVO DE DRABKING: Cianuro de potasio Ferricianuro de potasio Bicarbonato de sodio Agua destilada c.b.p.

0.050 gr. 0.200 gr. 1.000 gr. 1000 ml.

La solución debe ser transparente y colocada en frasco resguardada de la luz. Estable por 2 meses

de vidrio obscuro

PROCEDIMIENTO DE VALORACION: En 1964 el subcomité técnico de hemoglobinometría del Comité Internacional de Standarización en Hematología recomendo el METODO DE CIANOMETAHEMOGLOBINA. CURVA DE CALIBRACION DE HEMOGLOBINA. La solución valorada de Cianometahemoglóbina (Hycel) y el reactivo de drabkin (que puede ser también comercial), se utilizan para la determinación cuantitativa de hemoglóbina. Principio químico: El reactivo de drabkin, en donde se emplea una solución de ferrocianuro y cianuro de potasio, el ferrocianuro convierte al hierro ferroso de la hemoglóbina en férrico para formar cianometahemoglobina. PATRON DE HEMOGLOBINA.- Hay varios tipos comerciales recomendables como accuglobina, accurate, etc. en los que su equivalencia al contenido de hemoglobina dependerá de la dilución que de ella se haga. PARA VOLUMEN DE 5 mL: 1.- Marcar 6 tubos de ensaye y pipetear de acuerdo a la siguiente tabla: Conc. De Hb (g/dL) Sol. Valoradora de Hycel Reactivo de Drabkin

Blanco 0.0

4.0 1.0

8.0 2.0

12.0 3.0

16.0 4.0

20.0 5.0

5.0

4.0

3.0

2.0

1.0

0.0

2.- Mezclar bien y Tranferir las soluciones a cubetas o celdas según sea el caso y medir las absorbancias de cada dilucón contra el blanco. Dra en Ciencias Consuelo Chang Rueda

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3.- Graficar la absorbancia de cada dilución en las ordenadas contra su concentración en las abcisas. UN FACTOR DE CALIBRACION SE OBTIENE DE LA SIGUIENTE MANERA: F = Concentración del estándar Absorbancia Una vez obtenido éste, la concentración de hemoglobina en una mujestra se obtiene de la siguiente manera: [Hemoglobina] = Absorbancia x Factor

PROCEDIMIENTO PARA LA DOSIFICACION DE HEMOGLOBINA: 1.- En un tubo de 13x100 mm, medir 5ml de diluyente de Drabking y lavar en ellos 0.02ml de sangre bien mezclada con pipeta de shali. Mezclar. 2.- Reposar a temperatura ambiente por 15 minutos y leer contra diluyente de Drabking como blanco a 540 mu. 3.- Leer el % de Hemoglobina en la curva de calibración.

VALORES DE REFERENCIA NORMALES: HOMBRES MUJERES

13.5 a 17.5 gr% 11.5 a 16.5 gr%

NOTA: Este procedimiento dosifica todas las hemoglobinas, excepto la Sulfohemoglobina. El tiempo requerido para que la muestra se convierta en cianometahemoglobina depende de la lisis de los eritrocitos y no de la reacción química que es rapídisima.

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RESULTADOS: Después de realizar la práctica se pueden hacer las siguientes consideraciones: a). Curva de calibración

b).- Muestras sanguíneas

BIBLIOGRAFIA 1- RUIZ ARGUELLES, G. I. FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGIA.

ED. PANAMERICANA

MEXICO D. F. 1991 2- WOODDLIFF H.J., R.P. HERRMANN. HEMATOLOGIA CLINICA. ED. EL MANUAL MODERNO. 1995 3- MCKENZIE, SHIRLYN B. HEMATOLOGÍA CLINICA. ED. EL MANUAL MODERNO. 1997 4- GARCIA G. RAFAEL. MANUAL DE LABORATORIO DE HEMATOLOGIA. UNIVERSIDAD VERACRUZANA. 1997

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PRACTICA No. 6

VELOCIDAD DE SEDIMENTACION GLOBULAR FUNDAMENTO: En una sangre dejada en reposo, los eritrocitos se sedimentan separándose de la mezcla y formando en el fondo del recipiente, un sedimento, ya que el eritrocito es más denso que el plasma. La velocidad con que lo hace depende de tres factores: 1) Formación de grumos (pilas de monedas): Es el factor que más aumenta la eritrosedimentación y resulta de alteraciones físico-químicas que abaten la tensión superficial en la interfase glóbulo plasma. 2) La concentración del fibrinógeno del plasma: La tasa directamente proporcional a la sedimentación.

del fibrinógeno es

3) Concentración de globulinas alfa y beta: Aumenta su proporción en el plasma cuando disminuye la albúmina, que es el principal factor de densidad del mismo. Hay tres etapas en el proceso de la velocidad de sedimentación: a).- El período inicial, de pocos minutos, con la formación de pilas de monedas. b).- Período de 1 a 2 hrs. durante las cuales la sedimentación ocurre a velocidad más o menos constante. c).- Período de empaque lento. Es obvio que el segundo período es el importante y por ello las pruebas deben de montarse dentro de 2 horas.

OBJETIVOS: Al terminar la práctica, el alumno será capaz de: 1. Determinar la velocidad de sedimientación globular en una muestra de sangre. 2. Identificar su utilidad clínica

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Equipo: Gradilla de Wintrobe Material A). Biológico Sangre obtenida con EDTA B). De laboratorio Gradilla Cronómetro Pipeta pasteur de punta larga con bulbo Tubos de wintrobe PROCEDIMIENTO: METODO DE WINTROBE: 1).- Con jeringa y cánula cargar de abajo hacia arriba sin dejar burbujas hasta la marca 100 (ó 10) en un tubo de Wintrobe. 2).- Dejar el tubo en posición perfectamente vertical y a la temperatura ambiente. 3).- Transcurrida una hora leer el "largo" de la columna de plasma sobre las células como valor de la eritrosedimentación. 4).- Puede corregirse con el nomograma de Wintrobe en caso de anemia.

C I F R A S N O R M A L E S: HOMBRE: 0 - 7 mm con promedio de 4 mm. MUJER : 0 – 15 mm con promedio de 10 mm. NIÑOS: 1 – 15 mm con promedio de 5 a 10 mm.

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NOTA: La prueba de sedimentación globular deben montarse antes de las 2 hrs. que siguen a la toma de la sangre. El hallazgo de una eritrosedimentación normal no excluye la posibilidad de enfermedad. Determine elhematocrito por centrifugación de acuerdo a la técnica descrita en la practica siguiente. Si el hematocrito es inferior a 47 en el hombre ó inferior a 42 en la mujer, corrija de acuerdo con la gráfica de Wintrobe. En el niño no se acostumbra hacer ninguna corrección por variar de una año de edad a otro el valor promedionormal de hematocrito.

RESULTADOS Terminada la practica, se obtuvieron los siguientes resultados: VSG SIN CORREGIR:__________ VSG CORREGIDA:_____________ BIBLIOGRAFIA: R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno

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PRACTICA 7

HEMATOCRITO FUNDAMENTO: El hematocrito es el paquete de glóbulos rojos, osea el volumen de los eritrocitos conglomerados en una cantidad dada de sangre (100ml de sangre total) y constituye un procedimiento util para el diagnóstico diferencial de las anemias. Para esta determinación se utilizan varios tipos de tubos de los cuales los mas usados son el de Wintrobe y el capilar.

OBJETIVOS: Al terminar la práctica, el alumno será capaz de: 1. Identificar la importancia y utilidad clínica de la determinación del hematocrito 2. Ejecutar correctamente la determinación de hematocrito usando macro y micrometodo 3. Justificar las ventajas y desventajas de amnbos métodos

EQUIPO: Lector de hematocrito Centrifuga Microcentrifuga Material: A). Biológico Sangre obtenida con EDTA B). DE laboratorio Tubos de Wintrobe Jeringa y canulas de Wintrobe (Se puede utilizar una aguja de raquia). Capilares de 75 x 1.5 mm heparinizados.

REACTIVOS: Anticoagulante EDTA al 10 %

PROCEDIMIENTO: Dra en Ciencias Consuelo Chang Rueda

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METODO DE WINTROBE: Consiste en llenar un tubo estrecho de 110 mm de longitud y de un diámetro de 2.5 a 3 mm, con fondo plano. El llenado del tubo se lleva a cabo de la mísma forma que en la practica #3, Se centrifuga el tubo a 2,500r.p.m. durante 30min. para llevara a volumen constante. Este volumen se reporta como % de volumen globular o hematocrito. El tubo tiene una doble escala de 0 a 10 cm, divididos en mm por la derecha y de 10 a 0 por la izquierda. Para la lectura del valor hematocrito se lee en la escala de la derecha.

METODO DEL CAPILAR ( MICROHEMATOCRITO ). 1.- Con la muestra de sangre bien mezclada se procede a llenar 3/4 partes del capilar. 2.- Se sella el extremo colorido del capilar con plastilina o calentando. 3.- Centrifugar durante 5 min. a 10.000 r.p.m. ó 10 min a 7 500r.p.m. 4.- Leer el Por ciento de volumen de los eritrocitos. Esto se simplifica con una plantilla de lectura. Si no se tiene plantilla, con escala milimetrica medir en mm la longitud de la columna de los eritrocitos y sangre total, con la que:

CALCULOS LONGITUD DE LA COLUMA DE G.R. HEMATOCRITO % =------------------------------------------------------------- X 100 LONGITUD DE LA COLUMNA DE SANGRE

VALORES DE REFERENCIA: NEONATO 1 SEMANA 1 MES 3 MESES 1 AÑO 10 AÑOS VARON ADULTO MUJER ADULTA

55 - 68 % 47 - 65 % 37 - 49 % 30 - 36 % 29 - 45 % 36 - 40 % 42 - 54 % 38 - 46 %

NOTAS: Dra en Ciencias Consuelo Chang Rueda

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1.- Las normales estan basados en la técnica macro de Wintrobe, lo que requiere 30 min. de centrifugación a 2 500 r.p.m., dejando más espacios entre las células entonces los valores son un poco más altos en 1 a 2 %. 2.- El error es de 1 a 2 %, lo que lo hace la mejor prueba para determinar las anemias, policitemia o hemoconcentración. 3.- La sangre obtenida por punción capilar da resultados menos consistentes que la sangre venosa. 4.- Es muy conveniente observar en la interfase plasma-eritrocitos, la capa blanca cremosa de los leucocitos. Aproximadamente 1 mm = 10 000 leucocitos.

RESULTADOS: a). Macrométodo

b).- Micrométodo

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BIBLIOGRAFIA: R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno

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PRACTICA 8 RECUENTO DE ERITROCITOS FUNDAMENTO: La sangre se diluye 1:200 veces (Por el gran número de eritrocitos) con un disolvente isotónico que impide la coagulación y agrupamiento de las células. El número de ellas, en un volumen conocido de esta dilución, se cuenta bajo el microscopio en un hematocímetro (cámara de Newbauer).

OBJETIVOS: Al terminar la práctica, el alumno será capaz de: A). Identificar la importancia y utilidad clínica del recuento de eritrocitos B). Ejecutar correctamente el recuento de glóbulos rojos en muestras de sangre C). Describir el funcamento del método EQUIPO: Agitador electrónico para pipeta de thoma Reloj de laboratorio Microscopio Contador de células

MATERIAL : A) Biológico Sangre obtenida con EDTA B) De laboratorio Pipeta de Thoma para glóbulos rojos con boquilla Camara de Neubauer

C) Reactivos: Diluyente de Dacie: Citrato de sodio al 3 % en agua destilada: 990 ml. Formol al 40 % 10 ml. Solución estable, conserva los eritrocitos por varias horas. Anticoagulante EDTA AL 10 %.

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PROCEDIMIENTO: 1.- Homogenizar suavemente la sangre. 2.- Preparar una dilución 1:200 con la solución de Dacie usando la pipeta de Thoma para glóbulos rojos: a) Cargar la sangre bien mezclada hasta la marca 0.5 b) Limpiar perfectamente la pipeta por fuera. c) Absorber líquido de Dacie hasta 101. 3.- Cargar otra pipeta de igual forma. 4.- Agitar las pipetas 3 minutos para mezclar 5.- Tirar las primeras 3 ó 4 gotas de cada pipeta y cargar cada lado de la cámara con una pipeta. 6.- Dejar sedimentar por 3 a 5 min. 7.- Con aumento de 400x (seco fuerte), contar los cuadros que se encuentran en la cuadricula E como se índica a continuación: las células en los 4 cuadros de las esquinas y el cuadro central de la retícula central de 400 cuadritos (0.02 mm3). Ver el esquema de la pagina siguiente, y realizar los calculos como a continuación se desdcriben

CALCULO: N x 200 x 10 x 400 # de G. R. = --------------------------- = N x 10,000 80

Donde: N 200 10 400 80

= # de eritrocitos contados. = Título de la dilución = Corrección de la proofundidad de la cámara. = Total de cuadritos de la cámara. = Total de cuadritos contados.

Por lo tanto la cantidad de glóbulos rojos leída en los cinco cuadros y adicionada de cuatro ceros, dá la cifra correspondiente al total de eritrocitos en 1 mm3 de sangre.

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POSIBLES FUENTES DE ERROR: a) Inherente (distribución campo) b) Personal (buen operador) c) Aparatos (certificados) TOTAL

en

el

4.4 % 3.3 % 2.3 % 10.0 %

Es decir una cuenta de 5 000 000 puede dar de 4 500 000 - 5 500 000 por mm3.

NOTA: Se puede realizar la dilución en tubo usando una pipeta de shali, y se lava en 4 ml de diluyente de Dacié Mezclar 3 min. en tubo bien tapados de 10 x 75 mm. La cámara se carga con capilar. Se prefiere esta técnica ya que las pipetas de hemoglobina son más baratas y más faciles de lavar.

CIFRAS DE REFERENCIA: Dra en Ciencias Consuelo Chang Rueda

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ADULTOS: HOMBRE: 4 - 6.2 millones / mm3 MUJER: 4 - 5.5 millones / mm3 NIÑOS: Promedio de 4.5 millones / mm3.

Terminada la práctica, se obtuvieron los siguientes resultados:

BIBLIOGRAFIA: R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno

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PRACTICA 9 RECUENTO DE LEUCOCITOS FUNDAMENTO: La sangre se diluye en un líquido que lisa los eritrocitos. Las células nucleadas que no se lisan, se cuentan poniendo la dilución en un hemocitómetro.

OBJETIVOS: Al terminar la práctica, el alumno será capaz de: A). Ejecutar correctamente el recuento de leucocitos B). Identificar la utilidad clínica del recuento de leucocitos C). Describir el fundamento del método EQUIPO: Agitador electrónico para pipeta de thoma Reloj de laboratorio Microscopio Contador de células

MATERIAL A). Biológico Sangre obtenida con EDTA B) De laboratorio Pipeta de Thoma para leucocitos con boquilla Camara de Neubauer

Gradilla Tubo de ensayo de 13x 100 mm C) Reactivos: Solución diluyente de Türk Es una solución de ácido acético al 3% v/v en agua destilada, añadiendo una gota de azul de metileno hasta color azul pálido.

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PROCEDIMIENTO: 1.- Preparar una dilución de sangre con anticoagulante 1:20 en solución de Türk, usando pipeta de Thome para glóbulos blancos. Para ello: a) Cargar sangre bien mezclada hasta la marca 0.5 b) Limpiar con gasa el exterior de la pipeta. c) Cargar diluyente de Türk hasta la marca 11. 2.- Repetir lo anterior con otra pipeta. 3.- Agitar para mezclar las pipetas por 3 minutos. 4.- Descartar las primeras 3 gotas de cada pipeta, y cargar con cada una una cuadrícula del hematocitómetro. 5.- Dejar sedimentar las células por 3 a 5 minutos. 6.- Con seco debil, contar las células de los cuatro cuadros de las esquinas de la camara de Neewbauer es decir los cuadros en cada una de las retícula.indicadas en la figura a continuación (A, C, G, I) y realizar el calculo como a continuación se describe

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CALCULO: promedio de las cuentas de las 2 pipetas x 50=leucocitos/mm3 de sangre

ERROR.El error es el mismo de la cuenta de eritrocitos, más o menos 10 % en óptimas condiciones. NOTA: Ya que los glóbulos rojos nucleados no se lisan, son contados por este método. Cuando su cantidad es elevada, se hace una cuenta en un frotis sanguíneo por 100 leucocitos.

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CALCULOS: Leucocitos contados por mm3 x 100 --------------------------------------------------------------- = Cuenta corregida de leucocitos por mm3 100 + No. eritrocitos nucleados x 100 leucitos

1.- Si el resultado es menor de 5000 o sea 4000 se emplea una dilución 1:10 se aspira sangre hasta la marca 1 y diluyendo hasta la marca 11. 1/0.4  =  2.5  x  10  =  25

LEUCOCITOS. VALORES DE REFERENCIA EDAD

SEXO f/m

VALORES (Leucocitos/uL) 9000 – 30,000

f/m f/m

6000 - 18,000 4000 - 13,500

f/m

5000 - 10,000

Recien Nacido 1 – 2 Años 3 - 10 Años 11 Años a más

Terminada la práctica se obtuvieron los siguientes resultados:

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BIBLIOGRAFIA: R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno

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PRACTICA 10 RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS INTRODUCCION Consiste en reconocer y diferenciar las variedades de leucocitos que se encuentran en la observación de 100 glóbulos blancos que se estudian en frotis teñidos de sangre periférica, por lo que se conoce también como recuento diferencial o porcentual o fórmula leucocitaria. El colorante empleado es el de Wright el cual es una combinación de colorantes ácidos (eosina) que se une a los componentes básicos de las células (citoplasma). Inversamente, los colorantes básicos (azul de metileno) son atraídos por los compuestos ácidos de las células y se combinan con ellos (ácidos nucleicos y proteínas del núcleo, así como el citoplasma primitivo). Las tinciones tipo Romanowsky son mezclas de colorante Azur B y eosina Y. La tinción de wrigth ( es una solución alcohólica de eosina y ua mezcla compleja de Azúl de ,etileno (50-75%), Azur B (10-25%) y otros derivados. Con un amortiguador. Las tinciones bien realizadas producen el efecto Romanowsky que en parte se logra por la acción combinada de los colorantes a pH 6.4 a 7.0 FUNDAMENTO: Las estructuras ácidas se tiñen con los colorantes básicos y se denominan basófilas; Las estructuras básicas se tiñen con los colorantes ácidos y se denominan ácidofiloso eosinófilos; las que captan ambos colorantes son neutrófilos. El efecto Romanowsky consiste en la aparición de otros colorantes además del azúl y el rojo naranja y característicamente es el morado del que se tiñen los núcleos (METACROMASIA). El frotis se observa al microscopio con objetivo de inmersión y mucha luz, iniciandose el recuento diferencial haciéndose un examen detallado de cada leucocito observado, hasta contar 100 glóbulos blancos clasificandose sus variedades. Así en un frotis se debe tener el habito de verificar los puntos siguientes: 1).-Eritrocitos: Observar tamaño, forma y concentración de Hb. Investigar si existe y en que grado, anisocitosis, poiquilocitosis, hipocromia, policromatofilia, eritocitos nucleados, esferocitosis, punteado basófilo, etc. 2).- Glóbulos blancos: Verificar si los leucocitos son maduros, inmaduros o típicos. Debe hacerse un cálculo mental del número promedio de lobulos nucleados de los neutrófilos, así como observar si existen granulaciones tóxicas, mononucleares vacuoladas, células plasmáticas o cualquier otra anormalidad y en tal caso reportar refiriendose el número de leucocitos anormales por 100 globulos estudiados. 3).- Plaquetas: Observar si se encuentra en cantidades aproximadamente normales (de 3 a 8 plaquetas por 100 leucocitos). Verificar que las plaquetas que se encuentran parezcan normales o si existen formas gigantes o extrañas.

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OBJETIVOS: Al terminar la práctica, el alumno será capaz de: A). Justificar la utilidad clínica del recuento diferencial B). Realizar el recuento diferencial porcentual de leucocitos C). Calcular las cifras absolutas por uL de sangre de cada tipo de leucocito EQUIPO Microscopio Contador de células MATERIAL A). Biológico Frotis de sangre periférica, preparados y teñidos en la practica 9 B). De laboratorio - Portaobjetos de 25x75 mm y 1 mm de grosor ( Nuevos) - Soportes o rejillas para tinción - Torundas alcoholadas C). REACTIVOS: 1.- Amortiguador de fosfatos pH 6.4 -

KH2PO4 Anhidro ----------------3.31 g KH2PO4 J.T.BAKER No. 3246-01

-

Na2HPO4 Anhidro -------------- 1.28 g NaHPO4 J.T. BAKER No. 3828-01 Agua destilada c.b.p.

------- 500 ml

Comprobar el pH con un potenciómetro

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2.- Colorante de Wrigth Marca Sigma México No. 912 Colorante de Wrigth en polvo...... 0.3 g Metanol ...................................... 150 ml Preparación del colorante: En un mortero colocar el colorante y agregar metanol en pequeñas porciones triturando el polvo con el metanol; vaciar poco a poco en un recipiente hasta acabar el metanol. Dejar madurar durante 10 dias, agitandolo diariamente. PROCEDIMIENTO: METODO DEL ANGULO: a).- Antes de 2 horas de realizada la toma de la muestra, se cubre el frotis con un volúmen de colorante sin diluir, utilizando una pipeta Pasteur o una pizeta. b).- Se agregan dos o tres volúmenes de amortiguador cuidadosamente, sin derramar el colorante y mezclar con gentileza soplando aire con una pipeta. c).- Se deja de 5 – 10 minutos. La proporción en tiempo de colorante-amortiguador usualmente es 1:3 d).- Se elimina el amortiguador de la laminilla totalmente y se lava con agua corriente. Se limpia la parte inferior con una torunda para remover el colorante acumulado. Dejar secar al aire. e).- Diferenciar y contar cada una de las células observadas hasta llegar a contar 100 células. Utilizando uno de los métodos de léctura que a continuación se ilustran. Método de lectura: (Como se ilustra) Dirección del extendido

(a)

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origen

(b)

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Causas de error: a).- Distribución marginal de las células b).- Homogeinización insuficiente ( deben ser dos minutos en rotador mecánico o 60 inversiones manuales mínimo. c).- Retardo en la realización del frotis ( Debe hacerse antes de 2 o 3 hrs) d).- Proporción inadecuada de anticoagulante (1-2 mg/ml de sangre; EDTA). e).- Precipitados: Laminillas sucias, secado durante el período de tinción, falla en la posición de la laminilla, inclinada, durante el lavado inicial; filtración inadecuada y presencia de polvo. f).- Tinción excesivamente azúl: Frotis grueso, tiempo prolongado de tinción, lavado inadecuado, alcalinidad excesiva. g).- Tinción muy rosa: Insuficienciente tinción; lavado prolongado, exceso de ácidez. h).- Error de identificación: El frotis debe marcarse a lápiz con el nombre del paciente. i).- Lectura en zonas gruesas: Dificultad para distinguir leucocitos en áreas donde aparecen muy pequeños. J).- La zona de lectura debe ser aquella donde los eritrocitos no deben estar superpuestos: Grosor del frotis. VALORES DE REFERENCIA Diferencial de leucocitos Tipo de Leucocito Linfocito Monocito Eosinófilo Basófilo Neutrófilo Neutrófilo en banda

Valores porcentuales 20 - 40 4 - 9 1 - 4 0 - 1 40 – 65 0 -7

Valores absolutos/uL 2000 – 4000 200 - 800 40 - 400 0 - 100 2 500 – 7000 0 - 700

Terminada la práctica se obtuvieron los siguientes resultados:

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BIBLIOGRAFIA: R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno

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PRACTICA 11

EOSINOFILOS EN MOCO NASAL. En el asma, los esputos y las secresiones bronquiales recogidas durante el ataque contienen muchos leucocitos eosinófilos. En forma semejante, abundan los eosinófilos en el moco nasal en la fiebre de heno y la rinitis alergica. FUNDAMENTO: En particular, el recuento diferencial de las extensiones de secresión nasal en busca de eosinófilos es útil para diagnosticar la rinitis alergica.

OBJETIVOS: Al terminar la práctica, el alumno será capaz de: A). Justificar la utilidad clínica del recuento de eosinófilos en moco nasal B). Realizar el recuento porcentual de eosinófilos en cada narina MATERIAL Y REACTIVOS: Hisopos estériles. Portaobjetos. Microscópio. Colorante de Wright. Solución buffer.

PROCEDIMIENTO: Recoger la secresión nasal por medio de un hisopo y con ella hacer un frotis sobre un portaobjetos. Dejar secar y teñir con colorante de Wright, como si se tratara de un frotis sanguíneo. Observar al microscópio con objetivo de inmersión y determinar proporción de eosinófilos en un grupo de 100 a 200 células, reportando el porcentaje en que se encuentran los eosinófilos.

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VALORES DE REFERENCIA: 0 % de eosinófilos.

NOTA: Cuando oscila entre l0 y 35 % , la eosinofília constituye una indicación de alergia. Terminada la práctica se obtuvieron los siguientes resultados:

       

BIBLIOGRAFIA: R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno

   

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HEMOSTASIA RECOMENDACIONES PARA EL LABORATORIO DE HEMOSTASIA. 1.- EXTRACCION DE MUESTRAS.Es uno de los pasos básicos para muchas pruebas de coagulación. La punción debe de ser limpia para evitar la contaminación con factores hísticos que actuan como material tromboplastínico y se impedira la extasis venosa.

2.- MATERIAL DE VIDRIO.Los elementos utilizados para los estudios de coagulación deben de estar quimicamente puros lo más aconsejable es utilizar el material sólo para este tipo de determinaciones. El material siliconado se empleará sólo si el método lo requiere. El material plástico provoca resultados que pueden ser comparables con los obtenidos con el material de vidrio.

3.- TEMPERATURA.Todos los reactivos biológicos y las muestras de sangre deben de mantenerse en refrigeración hasta el momento de realizar las pruebas. Estas se efectuan a temperatura de 37°C en baño de agua.

4.- INFLUENCIA DEL TIEMPO.En general es importante realizar las determinaciones lo más pronto posible, luego de haber efectuado la extracción para evitar cambios en los componentes plsmáticos.

5.- CONTROLES NORMALES.Para cada jornada de trabajo deben de obtenerse varias muestras de sujetos normales que se encuentren en las mísmas condiciones con la muestra problema. También pueden obtenerse en el comercio controles normales liofilizados.  

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PRACTICA 12

TIEMPO DE SANGRADO FUNDAMENTO: Se efectúa una herida cútanea y se toma el tiempo necesario para que deje de sangrar. La prueba depende del número de capilares cortados, de la presion capilar y venosa y de la formación de un tapón de plaquetas; o sea trata de medir realmente la eficiencia de la fase I de la hemostasia (Factor vascular y Agregación plaquetaria ). Para impedir en lo posible, el efecto de la siguiente fase de la hemostasia (Coagulación de la sangre), la sangre se retira tan pronto como aparece en la piel.

OBJETIVOS: Al terminar la práctica, el alumno será capaz de: A). Identificar la utilidad clínica del tiempo de sangradp B). Ejecutar correctamente el tiempo de sangrado EQUIPO: Cronómetro Esfingomanómtro MATERIAL A) Biológico Ninguno B) De laboratorio Lancetas deshechables Tiras de papel filtro Torundas de algodón con alcohol

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PROCEDIMIENTO: METODO DE DUKE. 1.- Se limpia el lóbulo de la oreja o la yema de un dedo con alcohol y se practica una incisión no mayor de 4mm. con una lanceta (lanceta deshechable). 2.- Se arranca un cronómetro y a intervalos de 15 segundos, suavemente, y usando una tira de papel filtro se absorbe la sangre, hasta que no sangre más la herida. 3.- No se necesita seguir la prueba por más de 15 minutos.

VALORES DE REFERENCIA: 1 a 4 Minutos.

NOTAS: Cuando el tiempo de sangrado es de 4 a 6 minutos, se recomienda la prueba para comprobar. Al leer el punto final. No comfundir la sangre total con exudado de suero.

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Terminada la práctica se obtuvieron los siguientes resultados:

BIBLIOGRAFIA: R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno

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LABORATORIO DE HEMATOLOGÌA PRACTICA No. 13

FECHA:___________

TIEMPO DE COAGULACION. FUNDAMENTO: El tiempo que tarda la sangre total en coagularse "in vitro" Es medida de la eficacia de las 3 etapas de la coagulación, como son: 1.- Formación del activador de la protrombina. 2.- Conversión de la protrombina en trombina. 3.- Conversión del fibrinógeno en fíbrina.

OBJETIVOS: Al terminar la práctica, el alumno será capaz de: A). Identificar la utilidad clínica del tiempo de coagulación B). Ejecutar correctamente el tiempo de coagulación PROCEDIMIENTO: TECNICA DE LEE Y WHITE 1.- Obtener limpiamente unos 4ml de sangre venosa. La venipuntura debe ser directa, ya que la contaminación con jugo tisular invalida la prueba por factores de coagulación extrínseca. 2.- Quitar la aguja y poner 1ml. de sangre a cada uno de los 3 tubos de 10x75 mm. y pasarlos a B.M. a 37°C y poner en marcha el cronómetro cuando la sangre entra en el tubo #1 3.- Cada 30 seg inclinar el tubo #3 hasta que la sangre este coagulada, hacer lo mísmo con el tubo #2 y por el fín con el #1, cuando se observa coagulación en este último se detiene el cronómetro, considerando como valor final el obtenido en el tubo # 1. 0

NOTA: La prueba hecha a temperatura ambiente pierde estabilidad.

INTERPRETACION: Dra en Ciencias Consuelo Chang Rueda

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Es un metodo grosero de evaluación, influenciada por numerosas variables, como temperatura, diámetro de los tubos empleados, volumen de la muestra, etc. sólo se prolonga cuando la deficiencia es muy grave, por ejemplo: deficiencia de fibrinógeno, de protrombina o factores V, VIII, ó IX, también en presencia de anticoagulantes o hiperheparinemia.

CIFRAS DE REFERENCIA: De 6 a 12 minutos.

Terminada la práctica se obtuvieron los siguientes resultados:

BIBLIOGRAFIA: R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno

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PRACTICA No. 14

RECUENTO DE PLAQUETAS METODO DIRECTO: FUNDAMENTO: La sangre se diluye 1:100 con un solvente que lisa los hematies; las plaquetas se encuentran en un volumen conocido de la dilución en una camara de Newbauwer empleando un proceso para contrastar visualmente (colorante, o iluminación de contraste de fases).

OBJETIVOS: Al terminar la práctica, el alumno será capaz de: A). Identificar la utilidad clínica del recuento de plaquetas B). Ejecutar correctamente el recuento de plaquetas REACTIVOS: Citrato de Sodio Formol Neutro al 40% Azul brillante de cresil Agua destilada c.b.p

3.80 gr. 0.2 ml. 0.10 gr. 100 ml.

PROCEDIMIENTO: 1.- Preparar una dilución de sangre 1:100 con pipeta de eritrocitos. Se carga sangre hasta la marca 1, limpiar la pipeta por fuera. Absorber diluyente hasta la marca 101. 2.- Mezclar suavemente por 2 minutos Descargar las primeras 6 a 8 gotas y cargar las 2 reticulas de la cámara. Dejar sedimentar por 10 minutos. 3.- Con seco fuerte, contar las plaquetas en los 5 cuadritos de la retícula central (como para eritrocitos). 4.- Promediar los datos de las 2 cuentas y multiplicar por 5000 para obtener la cifra de plaquetas por mm3.

CIFRAS DE REFERENCIA: 170,000 A 300,000 POR mm3.

CAUSAS DE ERROR: Dra en Ciencias Consuelo Chang Rueda

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Los mísmos que para la cuenta de eritrocitos y glóbulos blancos, añadiendo la fragilidad y adhesividad de las plaquetas, lo que sube a 20 %. NOTA: las plaquetas aparecen como esferas doblemente refractiles (enfocando y desenfocando) de 2 a 4 micras de diámetro. Las plaquetas son facilmente destruibles, la toma de sangre venosa debe recibirse en solución de EDTA, (no usar punción capilar), mezclar suavemente y contarse antes de 2 hrs.

Terminada la práctica se obtuvieron los siguientes resultados:

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PRACTICA No. 15 TIEMPO DE PROTOROMBINA ( T P ). INTRODUCION: El reactivo para realizar éste TP es una tromboplastina completa (Factor, fosfolípidos y proteínas). Generalmente ya trae incluído el calcio por lo que tambien se le llama tromboplastina cálcica activada. Se activa la coagulación a través de la VIA EXTRINSECA. Por lo tanto decimos que el TP mide en forma indirecta todos los factores involucrados en esta vía. FUNDAMENTO El ploasma anticoagulado se le induce la coagulación reponiendo el calcio que fue inactivaqdo con el anticoagulante y agregando una tromboplastina completa para activar la vía extrinseca. Se mide el tiempo transcurrido, desde la activación hasta la formación del coáguolo , es decir, hasta la formación de fibrina.

OBJETIVOS: Al terminar la práctica, el alumno será capaz de: 1. Identificará la utilidad clínica de la medición del tiempo de protrombina 2. Describirá el fundamento del método 3. Ejecutará correctamente la prueba y su calibración EQUIPO: Coagulómetro (optico o mecánico) Baño maria Centrífuga 1 Cronómetro MATERIAL A). Biológico Sangre obtenida con Citrato de sodio 0.1 M B). De laboratorio Tubos de ensayo 10x75 mm Tubos de ensayo de 13 x 100 mm 2 Pipetas de 0.2 ml Gradilla Pipeta pasteur Dra en Ciencias Consuelo Chang Rueda

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C). Reactivos Reactivo de tromboplastina calcica con indice de sensibilidad (ISI) Solujción Salina Isotónica Papel milimétrico PROCEDIMIENTO: 1 2

Todas las muestras se deben de realizar siempre por duplicado Antes de transcurridos 30 min de la extracción, centrifugaqr la sangre a 750m rpm, durante 5 min Separar el plasma y conservarlo en refrigeración hasta su proceso Procesar simultáneamente un testigo normal del día Poner en cada tubo 0.1 ml de plasma citratado. Incubar 2 min. Agregar 0.1 ml de reactivo de tromboplastina. ( Previamente el reactivo se empieza a marcar el tiempo de formación del coágulo Agitar y reposar ±8 seg. Observar la formación del coágulo. Calcular el porcentaje de actividad usando la curva de calibración realizada previamente en el mísmo laboratorio Convertir el resultado en Indice Normalizado internacional ( internacional normalizad Ratio, INR) como más adelante se explica Debido a que se calculará el porcentaje de actividad de protrombina en la muestra problema, comparada con un normal con actividad 100%, es necesario hacer previamente una curva de coagulación

3 4 5 6 7 8 9 10

CURVA DE CALIBRACIÓN 1. 2. 3. 4.

Obtener sangre en un tubo con citrato de sodio, de 5 – 6 personas normales Centrifugar las muestras a 750 rpm, durante 5 min Tomar de 1.5 a 2 ml de cada plasma y mezclarlos en un tubo de ensayo Preparar una serie de tubos de la siguiente manera

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Mezcla de Plasmas (ml) 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0,3 0.2 9.1

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Solución Salina Isotónica 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

Porcentaje de Actividad (%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

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5. Realizar a cada tubo un tiempo de protrombina por duplicado, la diferencia entre ambos tubos debe ser inferior a 0.5 seg en caso contrario se deberá repetir la prueba 6. Promediar los tiempos obtenidos por cada par de tubos y graficar en papel milimetrico o logaritmico ( %/tiempo) resultando una recta o una parábola, respectivamente. En ningun caso es valido calcular el % de actividad obteniendo un factor de calibración por regla de tres con el tiempo del testigo normal.

INDICE NORMALIZADO INTERNACIONAL Considerando que el resultado de la medición del tiempo de protrombina se expresa en % de actividad del plasma normal y que el tiempo obtenido para este depende directamente de la sensibilidad de la tromboplastina utilizada, era muy difícil comparar los resultados obntenidos en laboratorios distintos o aun en el mismo laboratoriocon lotes diferentes de reactivos . Esto dificultaba mucho la valoración de la terapia anticoagulante. Por tal motivo la Organización Mundial de la Salud adoptó un sistema de estandarización Internacional del tiempo de protrombina que faciliatará la interpretación de los tiempos de protrombina y que reportará resultados comparables en todo el mundo. Para ello, fue indispensable que los fabricantes de las tromboplastinas estandarizarán la sensibilidad del reactivo y que en cada lote se identifique ésta como Indice de Sensibilidad Internacional (ISI) Para calcular el INR es indispensable calcular primero el Indice de protrombina (IP) que es la relación que existe entre entre el tiempo de protrombina del paciente y el del plasma normal o testigo del día

IP = tiempo de protrombina del paciente tiempo de protrombina del testigo normal INR = ( Indice de prtotrombina) ISI Generalmente, para facilitar esta tarea, la mayoría de los reactivos comerciales ya incluye una tabla de conversión para obtener el INR, sin necesidad de hacer los calculos. VALORES DE REFERENCIA Normal ( No anticoagulados )

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% de Actividad 70 - 100 % INR = 1 – 2

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Se sugiere reportar de la siguiente manera: Testigo del día = X Segundos Plasma problema= X Segundos % de Actividad = x % INR = X VALOR NORMAL: Depende de la tromboplastina empleada. Se compara siempre con el testigo

Terminada la práctica se obtuvieron los siguientes resultados:

BIBLIOGRAFIA: R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno

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PRACTICA 16 TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADO. ( TTPa ) FUNDAMENTO: El reactivo para realizar éste TTPa es una tromboplastina parcial ( fosfolípidos) adicionado con un activador de contacto (caolín, celite, stc). Por lo cual se le llama activado. Se activa la coagulación a través de la VIA INTRINSECA., por lo cual decimos que el TTPa mide en forma indirecta todos los factores involucrados en la VIA INTRINSECA. OBJETIVOS: Al terminar la práctica, el alumno será capaz de: 1 Identificará la utilidad clínica de la medición del tiempo de tromboploastina parcial activada. 2 Describirá el fundamento del método 3 Ejecutará correctamente la prueba EQUIPO: Coagulómetro (optico o mecánico) Baño maria Centrífuga 1 Cronómetro MATERIAL: A). Biológico Sangre obtenida con Citrato de sodio 0.1 M B). De laboratorio Tubos de ensayo 10x75 mm Tubos de ensayo de 13 x 100 mm 2 Pipetas de 0.2 ml Gradilla Dra en Ciencias Consuelo Chang Rueda

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Pipeta pasteur C). Reactivos Reactivo de tromboplastina parcial líquida activada Cloruro de calcio 0.02 M Citrato de sodio 0.1 M PROCEDIMIENTO: 1 Todas las muestras se deben de realizar siempre por duplicado 2 Antes de transcurridos 30 min de la extracción, centrifugaqr la sangre a 750m rpm, durante 5 min 3 Separar el plasma y conservarlo en refrigeración hasta su proceso 4 Incubar a 37 o C el reativo suficiente de cloruro de calcio y tromboplastna parcial 5 Incubar 0.1 ml de plasma citratado por 1 min

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Agregar 0.1 ml de reactivo de tromboplastina parcial activado. Agitar. Incubar 2-5 min. Según el fabricante. Agregar 0.1 ml de CaCl2 0.025 M. En el momento de Agregar el calcio se empieza a marcar el tiempo de formación del coagulo. 10 Agitar y reposar ± 30 seg. Observar hasta la formación del coagulo.

VALORES DE REFERENCIA: 25 – 40 Segundos Depende de la tromboplastina empleada. Se compara siempre contra el testigo.

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Terminada la práctica se obtuvieron los siguientes resultados:

BIBLIOGRAFIA: R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno R.A. Rifkind, A. Bank, P.A. MARKS, K. L. KAPLAN.. Hematologia Clínica Ed. Interamericana. R.C. Hillman., C.A. finich.. EL ERITROCITO. Ed. El Manual Moderno. H.J. Wooddliff . R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El Manual Moderno Shirlyn B. Mckenzie HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual Moderno H.J. Woodliff, R.P. Herrmann HEMATOLOGIA CLINICA Ed. El manual moderno

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