METODOLOGÍA GENERAL PARA EL ESTUDIO DE MICROORGANISMOS

MEDIOS DE CULTIVO DEFINICIÓN

Es una preparación artificial, sólida, semisólida o líquida que suministra los requerimientos nutricionales y energéticos a los microorganismos para su crecimiento y multiplicación, y se debe aproximar lo más posible a su habitat natural o nicho ecológico.

REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES Y ENERGÉTICOS DE LOS MICROORGANISMOS FUENTE ENERGÍA: ATP y poder reductor (NADH, NADPH) Fototrofos: luz Quimiotrofos: reacciones de oxido-reducción de compuestos orgánicos e inorgánicos

FUENTE DE CARBONO: moléculas con destino a estructuras, multiplicación, etc Autotrofos: CO2 Heterotrofos: moléculas orgánicas (azúcares, ác. grasos, aminoácidos, etc)

ELECTRONES: para reducir la fuente de carbono Litotrofos: compuestos inorgánicos reducidos Organotrofos: compuestos orgánicos reducidos

Microorganismos

Fuente de

Fuente de

Ejemplos de

energía

carbono

microorganismos

________________________________________________________________________

Fotolitotrofos o

luz

CO2

Fotoautotrofos

Algas, bacterias verdes y azules cianobacterias

Fotoorganotrofos o

luz

Fotoheterotrofos

Quimiolitotrofos o

comp orgánicos simples

redox

CO2

redox

comp orgánicos

Bacterias verdes y rojas

Bacterias y Archeae

Quimioautotrofos

Quimioorganotrofos o quimioheterottrofos

Hongos, Bacterias protozoos, Archeae

complejos

COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 1.- ELEMENTOS ENERGÉTICOS Y CONSTITUTIVOS 1.1.- MACRONUTRIENTES (carbono, nitrógeno, P, S, Ca, Mg, K, Na) 1.2.- MICRONUTRIENTES

-Frecuentemente esenciales: Mn, Fe, Co y Cu -Esenciales en casos especiales: B, Al, Si, V, Ni, Se - Inhibidores de crecimiento: As, Au, Pb, Cr, Ag

1.3.- FACTORES DE CRECIMIENTO 2.- AGENTES SOLIDIFICANTES: agar, silicagel, agarosa, gelatina, albúmina de huevo, suero

3.- AGUA DESTILADA 4.- CONDICIONES FÍSICAS: temperatura, oxígeno, pH, presión osmótica, humedad, luz

Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 10ª ed.

Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 10ª ed.

FACTORES DE CRECIMIENTO Compuestos orgánicos específicos requeridos en muy bajas concentraciones La célula no los puede sintetizar La causa del problema: mutaciones afectan las vías de síntesis del compuesto. INDISPENSABLES: deben ser adicionados al medio de cultivo Ej. * vitaminas del grupo B * algunos aminoácidos * purinas y pirimidinas Gen1 S1

Gen2 S2

S3

MEDIOS DE CULTIVO: CLASIFICACIÓN A. BACTERIAS 1.- SEGÚN SU CONSISTENCIA a.- Líquidos: ej. caldo nutritivo, caldo tioglicolato, agua peptonada b.- Sólidos agar ej. agar nutritivo sílicagel

colonia

albumosos: huevo ej. Lowestein Jensen suero c.- Semisólidos ej. agar blando agar SIM Hugh y Leifson

COLONIA: población de bacterias que provienen de una única célula madre, todas con el mismo genotipo y fenotipo. Cada colonia tiene morfología específica.

2.- Según su composición a.- Medios comunes b.- Medios enriquecidos

3.- Según su origen a.- Medios sintéticos ( o definidos) b.- Medios complejos (o naturales)

4.- Según su función

► Medios de conservación y transporte ► Medios de enriquecimiento ► Medios selectivos ► Medios diferenciales

EJEMPLOS DE MEDIOS DE CULTIVO PARA MICROORGANISMOS CON REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES SIMPLES Y COMPLEJOS

Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ª ed. 2009

MEDIOS DE CULTIVO

B.- Para RICKETSIAS Y CLAMIDIAS a.- Cultivo celular (células animales) b.- Cultivo en embrión de pollo

C.- PARA VIRUS a.- Cultivo celular b.- Cultivo en embrión de pollo c.- Cultivo en bacterias (bacteriófagos) D.- MEDIOS DE CULTIVO PARA HONGOS E.- MEDIOS DE CULTIVO PARA PROTOZOOS F.- MEDIOS DE CULTIVO PARA ALGAS

MEDIOS DE CULTIVO PARA HONGOS:

-Agar Sabouraud glucosa - Agar oxitetraciclina glucosa extracto de levadura (OGY) - Agar Czapek Dox - Agar-patata-glucosa

Agar OGY

Agar Sabouraud Glucosa

QUÉ ES UNA BACTERIA ANAEROBIA? ANAEROBIA? Es una bacteria que carece de sistema respiratorio aerobio, no puede utilizar oxígeno como aceptor final de electrones.

Zona óxica

Zona anóxica

Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ª ed. 2009

POR QUÉ EL O2 ES LETAL PARA LOS ANAEROBIOS ? Reducción del oxígeno hasta agua mediante la incorporación secuencial de electrones

Todos los compuestos intermediarios que se forman son altamente reactivos y tóxicos para la célula.

ENZIMAS QUE DESTRUYEN FORMAS TÓXICAS DERIVADAS DEL OXÍGENO: sólo presentes en microorganismos aerobios

LOS MICROORGANISMOS ANAEROBIOS CARECEN DE ESTAS ENZIMAS.

MEDIOS DE CULTIVO PARA BACTERIAS ANAEROBIAS

No selectivos Sólidos: Agar sangre (AS) Agar infusión cerebro corazón (BHI) Agar tripticase soja (TSA)

Líquidos:

Caldo Tioglicolato Carne picada (para aislar Clostridium, conservar cultivos)

Recomendación: trabajar con medios de cultivo frescos, recién preparados.

Selectivos

► agar sulfito-polimixina-sulfadiacina (SPS) ► agar sangre paramomicina-vancomicina desarrollan anaerobios obligados Gram – inhibe Gram + (vancomicina) - Inhibe facultativos Gram – ► agar sangre vancomicina-canamicina desarrollan anaerobios obligados Gram – inhibe Gram + (vancomicina) – Inhibe facultativos Gram – ► agar yema de huevo neomicina ayuda al aislamiento de especies de Clostridium por las reacciones : lipasa y lecitinasa – inhibe algunas bacterias facultativas Gram -

SI NO DISPONE DE UN MEDIO DE CULTIVO PRAS, QUE PRECAUCIÓN DEBE TENER EN CUENTA ANTES DE SEMBRAR UN ANAEROBIO?

Hervir a Baño María durante 15 minutos antes de sembrar para eliminar el oxígeno disuelto en el medio de cultivo y enfriar rápidamente bajo canilla para evitar que se reoxigene. Sembrar inmediatamente.

TÉCNICAS PARA GENERAR ANAEROBIOSIS (o condiciones anóxicas)

● Jarra anóxica con generador de Gas Pak ● Evacuación y reemplazo (ER) ● Sistema de Bio Bag (sobre generador de CO2) ● Medios prepre-reducidos anaeróbicamente esterilizados (PRAS) ● Cámara anóxica ● Capa de vaselina – parafina (3:2) ● Sistemas comerciales: Anaerocult A Anaerocult P Anaerocult C

Vas-Par

JARRA ANÓXICA (TÉCNICA DE GAS PAK) TABLETA 1: BH4Na+ H2O

H2

TABLETA 2: C6H8O7 + HCOO3Na + H2O

CO2

¿Cómo consume el O2? H2 + O2

Paladio

H2O

JARRA ANÓXICA

JARRA ANÓXICA

POR QUÉ PUEDE FRACASAR GAS PAK?

► Catalizador no activo ► Generador de gas defectuoso ► Mal mecanismo de cierre de la tapa de la jarra ► Que el agua no llegue a las tabletas del sobre generador de gas pak

Evacuación – Reemplazo (ER) Desecador

Cámara anóxica

Anaerocult

Cámara anóxica

VAS-PAR

Sistema Bio-Bag

(3:2)

Vaselina-parafina

ANAEROCULT COMPOSICIÓN

Polvo de hierro Ácido cítrico Sodio carbonato Tierra silícea

La adición de agua en el interior de la plancha inicia la reacción: Fe 2+

O2

Fe 3+ ANAEROCULT

CONSERVACIÓN DE CEPAS MICROBIANAS

LOS TRES OBJETIVOS PARA UNA CORRECTA CONSERVACIÓN:

1.- Que el cultivo se mantenga puro (PUREZA)

2.- Que el cultivo se mantenga viable (VIABILIDAD)

3.- Que el cultivo este genéticamente estable (ESTABILIDAD)

MÉTODOS DE CONSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

A.- Métodos de conservación a largo plazo - congelación - liofilización

B.- Métodos alternativos - Conservación por transferencia periódica - Conservación por suspensión en agua destilada estéril

Conservación de los microorganismos por congelación Las células se congelan en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y, se almacenan a temperaturas inferiores a cero grados centígrados (de – 70 a 196º C).

Los factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las células: □ Edad de las células □ Velocidad en la congelación y descongelación □ Temperatura de almacenamiento □ Acondicionamiento de los microorganismos □ Empleo de crioprotectores

AGENTES CRIOPROTECTORES Estos solutos penetran dentro de las células y las protegen de los efectos de la deshidratación (el agua disponible esta congelada), a la vez que evitan la formación de cristales de hielo.

Características

Ejemplos

- No tóxico para la célula

-Glicerol (10-20%) -Leche descremada

-Penetrar fácilmente en la membrana celular

- Dimetilsulfóxido (DMSO) -Inositol

-Unirse a los electrolitos o a las moléculas de agua

-Glucosa -Lactosa -Sacarosa

Tubos crioprotectores por duplicado

CONSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS POR LIOFILIZACIÓN

- Es un método de conservación a largo plazo. -Se basa en la paralización del metabolismo celular por falta de agua: congelación y deshidratación (al vacío).

Congelar el agua libre de las células

Eliminación del agua por vacío

Agua congelada

Vapor de agua

SUBLIMACIÓN

1ra.fase de la desecación

2da. fase de la desecación

Apto para envío de cepas

Tema: Cultivo celular. Cultivo Cultivo de ricketsias,, clamidias y virus. ricketsias Inoculación en embrión de pollo. Animales de experimentación.

Objetivos Definir y caracterizar cada tipo de cultivo celular, obtención, requerimientos y aplicaciones. Caracterizar el uso de células de embrión de pollo para el cultivo de Clamidias, Clamidias, Rikettsias y virus. Establecer los conceptos básicos del uso de animales de experimentación en el laboratorio.

CULTIVO DE RICKETSIAS, CLAMIDIAS y VIRUS Debido a que estos microorganismos son parásitos intracelulares obligados, es necesario cultivarlos en células vivas.

Rickettsias - cocos o bacilos Gram – -Fiebre Moteada y del tifus (Artrópodos)

Rickettsias creciendo dentro de las células hospedadoras

Clamidias -Cocos Gram -Patógenos del aparato respiratorio y de transmisión sexual

PAP al microscopio mostrando Chlamydia en vacuolas.

CULTIVO PRIMARIO: cultivo celular establecido a partir de un tejido u órgano animal o humano. Se obtienen por separación quirúrgica aséptica y disgregación enzimática Las células se lavan, se cuentan en cámaras cuenta glóbulos (tipo Neubauer) y se siembran

Cultivos primarios

- Se siembran en tubos, botellas , placas o policubetas de vidrio o de plástico estériles -Se cubren con medio de cultivo nutritivo con antibióticos a 37°C en cámara de cultivo celular

Incubadoras para cultivo celular

Monocapa epitelial del embrión o de riñón de mono verde africano.

CULTIVOS PRIMARIOS Cultivos en monocapa

-Las células sedimentan, se adhieren y se multiplican formando islotes que van cubriendo toda la superficie: monocapa

Epitelial (poligonales)

-Cuando dos islotes se unen se inhibe su crecimiento: inhibición por contacto Los medios de cultivo se deben cambiar 2 o 3 veces por semana. Fibroblastico (irregular)

Infección con virus

Obtener nuevos cultivos: pasaje o subcultivo

CULTIVO PRIMARIO:

Crecimiento limitado: al cabo pocos pasajes (cultivos secundarios) las células mueren y se debe obtener un nuevo cultivo primario (costoso)

Fibroblastos de riñón de mono, células embrionarias de pollo o de riñon humano o células amnióticas.

Fibroblastos de riñón de mono

CULTIVO CELULAR PRIMARIO:

CEPA DE CÉLULAS DIPLIODES : Seleccionar células con morfología intacta, numero diploide de cromosoma y capacidad de crecimiento limitado

Pasajes: 50 a 100 Sin perder la sensibilidad Envejecen y mueren Vacunas Sin virus latentes

MRC-5: riñon de mono Rhesus Wi 38 (Winster Institute) de humano Aislamiento de citomegalovirus, varicela y rinovirus

CULTIVO CELULAR PRIMARIO: adaptar célula a crecer in vitro durante un numero ilimitado de pasajes

LINEAS CELULARES:

Características similares: tipo epitelial Numero de cromosomas es variable (aneuploídia) Se repican un numero ilimitado, por múltiples pasajes: líneas inmortales

Origen normal: Vero, fibroblastos de riñón de mono africano, LLC-MK 2 de riñón de mono, BHK de riñón de hamster o las RK de riñón de conejo Origen neoplásico: Hela, carcinoma de cervix , las HEP-2 de un carcinoma de laringe.

Aislamiento del virus sinsitial respiratorio, herpes, rubeola, poliovirus, adenovirus etc.

Una de las primeras líneas celulares humanas, obtenida de Henrietta Lacks, quien falleció de cancer de útero a partir del cual se obtuvieron estas células. El cultivo de célulasHeLa que se muestra en la imagen fue teñido con Hoeschtque se une al ADN coloreando de azul el núcleo.

LÍNEAS CELULARES continuas inmortales neoplasicas Inmortales

Características de las células transformadas • Independencia de sustrato • Pérdida de inhibición por contacto (multicapas) •Alta eficiencia de plaqueo: capacidad de formar clones • Bajo requerimiento de suero •Corta tasa de duplicación •Aneuploidía y heteroploidía • Tumorigenicidad

Pierden funciones

Patología

Transformación : cambio en el genotipo celular: -Virus transfomante -Sust cancerigena -Espontanea

ABAC - Asociación Banco Argentino de Células Línea Celular Descripción

Especie

Tipo celular

Origen

Monocapa de fibroblastos

ATCC

BHK-21

Riñón de hamster dorado Hamster

CHO-K1

Ovario de hamster chino

Hamster chino

Monocapa epitelial

ATCC

MRC-5

Pulmón fetal humano(diploide)

Hombre

Monocapa de fibroblastos

ATCC

Wish

Amnion humano

Hombre

Monocapa epitelial

Hep-2

Carcinoma humano(órgano)

Hombre

Monocapa epitelial

ATCC

Vero C-76

Riñón de mono verde africano

Mono

Monocapa de fibroblastos

ATCC

Vero E-6

Riñón de mono verde africano

Mono

Monocapa de fibroblastos

ATCC

L-929

Tejido conectivo de ratón Ratón

Monocapa de fibroblastos

MDBK

Riñón bovino

Vaca

Monocapa epitelial

RK13

Riñón de conejo

Conejo

Monocapa epitelial

CRFK

Riñón de gato

Gato

Monocapa de fibroblastos

ATCC

HeLa

Carcinoma de cervix humano

Hombre

Monocapa epitelial

ATCC

Raji

Linfoma de Burkitt humano

Hombre

Linfoblastos en suspensión

ATCC

IIBMel J

Melanoma humano

Hombre

T24

Carcinoma de vejiga humano

Hombre

Monocapa epitelial

ATCC

E. Derm

Dermis de caballo

Caballo

Monocapa de ATCC fibroblastos

ATCC

3T3 L1

Embrión de ratón

Ratón

Monocapa de fibroblastos

ATCC

ATCC

ATCC ATCC ATCC

ARGENTINA

Requerimientos del crecimiento celular - Medios de cultivo frescos y de composición adecuada. - Permitir el intercambio gaseoso -Cantidad de suero en el medio, pH, temperatura optima, cantidad de células sembradas, etc.

Requerimientos nutricionales

Requerimientos fisiológicos

-Aminoácidos -Carbohidratos -Vitaminas -Iones inorgánicos -Antibióticos -Suero -Indicador de pH

-Temperatura: 37°C - pH: 7,2-7,4. Buffer -Tensión de dióxido de carbono: > 5% Presión osmótica: 7.6 atmosferas. ClNa Humedad del incubador Ejm: MEM: medio esencial mínimo Dubelco’s MEM

MEDIOS DE CULTIVO CELULARES

Cuando es necesario de un cambio en el medio de cultivo?

-Caída del pH: < 6,5, pierden viabilidad -Alta concentración celular -Característica celular : las células transformadas deben ser subcultivadas con mayor frecuencia -Morfología celular: deterioro celular, granulación perinuclear, vacuolas citoplasmaticas etc .

Como se conservan las líneas celulares? - En glicerol y dimetil sulfóxido en ampollas cerradas herméticamente en estado de congelación . Pueden mantenerse en nitrógeno liquido durante años

DETECCIÓN DE LA REPLICACIÓN DE LOS VIRUS

1.- Por su acción citopática (ECP): o acción citopatogénica (ACP):

redondeamiento celular, con desprendimiento de la monocapa y liberación de las células alteradas al medio

EFECTO CITOPÁTICO

Herpes virus y polovirus

Tinciones histológicas o métodos inmuno histoquímicas Virus sincitial respiratorio : proteínas de fusión

DETECCIÓN DE LA REPLICACIÓN DE LOS VIRUS

2.- Por la aparición de componentes del virus en el medio de cultivo, en especial de hemaglutininas o de antígenos fijadores de complemento.

3.- Por inmunofluorescencia, detectando la presencia de virus o sus antígenos en las células mediante el empleo de un suero inmune marcado con sustancias fluorescentes.

Aplicaciones Productos biotecnológicos 1-Producción de virus

Tecnología del ADN recombinante en cultivo celular

Vacunas Antígenos virales para diagnostico Virus entomopatógenos para plagas 2- Produccion de moléculas bioactivas Terapéutica y en el diagnostico Anticuerpos monoclonales Fármacos naturales (Interferon alfa) Fármacos recombinantes Evaluaciones toxicológicas infecciosas y nutricionales

enzimas, hormonas, anticuerpos mononoclonales, interleucinas, linfoquinas y agen tes anticancerígenos. Eritropoyetina Activador tisular del plasminogeno

Otras aplicaciones : Generación de hibridomas linfocito aislados del bazo o médula ósea de un ratón inmunizado

Se fusionan células normales con una línea celular inmortalizada. anticuerpos monoclonales.

Los hibridomas productores del anticuerpo deseado se seleccionan a partir de grupos hasta llegar a colonias individuales. una línea celular de mieloma inmortalizada (células del linaje B)

solo las células fusionadas sobreviven

HUEVOS EMBRIONADOS -Fuente de tejido vivo fácil de manipular y económica, estéril, posee escasos virus latentes y no posee respuesta inmunitaria. -Mayor susceptibilidad para aislamiento y propagación de ciertos virus. Ejm: virus de la gripe -Detección y cuantificación de anticuerpos neutralizantes y producción de vacunas y antígenos de diagnostico.

HUEVOS EMBRIONADOS Selección y cuidados de los huevos antes de la inoculación: -

Edad: huevos viables jóvenes, recogidos inmediatamente después de su postura.

-

Almacenamiento a 10 °C (estado estacionario), por no mas de una semana antes de incubar (fertilidad).

-

Huevos blancos (transiluminación (transiluminación)) y de cáscara integra, provenientes de gallinas que carecen de enfermedades y de anticuerpos con dieta equilibrada y exenta de antibióticos.

HUEVOS EMBRIONADOS Condiciones de incubación

-

Incubadores de laboratorio o incubadores automáticos de criaderos de pollos.

-

Temperatura y tiempo de incubación: 37 37°°C, 60% de humedad, O2: 21% y CO2: 0.5%.

-

Extremo abultado hacia arriba.

Examen visual de HUEVOS EMBRIONADOS: Antes de la inoculación: determinación de su desarrollo normal Luego de la inoculación: comprobar su supervivencia

Trasluz Ovoscopio

Ovoscopio industrial

HUEVOS EMBRIONADOS: examen visual Huevos fértiles, mas de 4 días: Vasos sanguíneos (telaraña) Movimiento intermitente de punto negro (ojo) Embrión: sombra móvil (a parte superior) Vena umbilical

Embriones muertos

Vías de inoculación:

-Membrana corioalantoidea -Cavidad anmiotica -Cavidad alantoidea -Saco vitelino

Selectividad de virus por determinados tejidos

Intraperitonial o intracerebral

Como se realiza la inoculación : A través de un orificio en la cascara, previa antisepsia y se inyecta el inoculo con aguja y jeringa, luego se tapa el orificio y se incuba. Uso de colorantes Cantidad y dilución del inoculo: depende del tipo de virus Con medidas de bioseguridad adecuadas y personal entrenado: mascaras, guantes, ropa protectora, gabinetes de seguridad biológica II y III, acceso restringido y corrientes de aire controladas.

Cavidad alantoidea Cavidad anmiótica

Saco vitelino

Membrana corioalantoidea

-Herpes virus o poxvirus producen pústulas (cuantificación)

-Aislamientos de virus (viruela)

-Virus de la gripe

Vademecum 2013 Influvac Antígenos inactivados del virus de la Influenza (hemaglutininas y neuraminidasas propagadas huevos fertilizados de gallina de pollos sanos.

-Virus de la Influenza y el virus de la parotiditis Se necesita una gran cantidad de virus: vacunas o antígenos

Cultivo de clamidias y ricketsias Corpúsculos y cuerpos de inclusión

El desarrollo del virus se detecta por: - Muerte del embrión: desaparecen los vasos sanguíneos y embrión inmóvil (herpes y parotiditis) -Daño de las células del embrión o lesiones focalizadas (poxvirus y herpes virus)

-Formación de típicas pústulas (herpes virus) o lesiones en las membranas del huevo.

-No inducir lesiones aparentes, con producción de antígenos virales (hemaglutininas).

ANIMALES DE EXPERIMENTACION cualquier especie animal que se mantiene bajo condiciones determinadas y se utiliza con fines científicos, con el correcto cumplimiento de los principios éticos y de

bienestar animal.

Las pruebas biológicas se deben realizar según normas éticas del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio (CICUAL-UNSL) y legislación de SENASA, ANMAT, CDC/NIH, FDA, EPA, y OMS para evitar que padezcan dolores o sufrimientos innecesarios.

EL PRINCIPIO DE LAS 3 R REEMPLAZO : sustitución de animales vivos por métodos alternativos como modelos matemáticos, simulación en computadora, tests serológicos, cultivos celulares, etc. . REDUCCIÓN : usar el mínimo número de animales necesario para obtener resultados válidos. REFINAMIENTO: incluye todos los procedimientos para minimizar y eliminar el dolor, así como todos los métodos para asegurar el bienestar animal.

Animales de experimentación: Factores que influyen en la experimentación animal: -Instalaciones y condiciones ambientales -Nutrición -Comportamiento y bienestar animal: homeostasis y estrés. - Patología y control sanitario. -Diseño experimental -Estandarización genética de la especie: Cepas endocriadas: generaciones consecutivas de cruza hermano x hermana. Estos animales se caracterizan por: - idéntico perfil genético - estables por largos periodos de tiempo; -fenotípicamente uniformes. Ejm: en ratones: BALB/c , en ratas: Wistar

BIOTERIO Alojamiento cómodo, higiénico y de dimensiones suficientes, así como agua y comida de buena calidad y en cantidad suficiente.

Propósitos generales para la utilización de animales de experimentación:

-obtención de suero, plasma, tejidos -estudio de enfermedades infecciosas y de otros tipos: metabólicas, tumorales, etc. -desarrollo de vacunas - estudios bioquímicos, farmacológicos, inmunológicos, toxicológicos, nutricionales.

ANIMALES DE LABORATORIO Animales más frecuentemente empleados: - Rata blanca - Ratón -Hámster -Cobayo -Conejo -Cabras -Aves -Artrópodos Con fines seroterápicos: - caballo - oveja - bovino

Principales vías de inoculación Vía enteral: vía oral/intragastrica Vía parenteral: -Intramuscular (IM) -Endovenosa (EV) -Subcutánea (SC) -Intraperitoneal (IP) -Intradérmica (ID) Otras vías: -Vía tópica -Vía inhalatoria --Via retroorbital

IV

VO

IP

SC

IM

Se han logrado animales sanitariamente definidos: -animales libres de gérmenes (axénicos) -con flora bacteriana o vírica conocida (gnotobióticos) -libres de gérmenes patógenos específicos

controlar y estandarizar las experiencias

Animales transgénicos 1-aislamiento del gen de interés (transgén): clonado y manipulado para que pueda ser expresado por el organismo blanco. 2-Dicho gen se inyecta en un embrión en estadio de cigoto. 3-Se implanta el embrión en un animal receptivo, que actúa como madre (fertilización in vitro). Conducen a la expresión de un nuevo gen o a la sobre-expresión de un gen ya existente.

Vacas Pampa: que producen en su leche hormona de crecimiento humano

Ratones knockout Son ratones en los que se inactiva un gen determinado en el genoma (deleción) analizando el fenotipo que resulta de la pérdida de su función. “gene targeting”:los genes modificados se introducen en las células madre embrionarias del ratón.

Ratones knockin: Un gen es reemplazado por una versión modificada del mismo, que produce una variación en su función.

Algunas publicaciones actuales donde se utilizan animales de experimentación para estudios microbiológicos: -Cerdos desafiados con Mycoplasma en vías aéreas (Wodley y col. 2013) -Hámsters inoculados por vía intrahepática con Entamoeba dispar (Guzmán-Silva y col. 2013) -Ratones para caracterización de variantes de priones (Takeuchi y col. 2013) -Conejos tratados con distintos antimicrobianos por meningitis causada experimentalmente por Staphylococcus aureus meticilino resistente (Tas y col. 2013).

NIVELES DE BIOSEGURIDAD PARA TRABAJAR CON ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN

1

Acceso restringido, ropa y guantes protectores

2

Procedimientos del NBSA-1, más señales de advertencia del riesgo. CSB de clase I o II para las actividades que producen aerosoles. Descontaminación de desechos y jaulas antes del lavado.

3

Procedimientos del NBSA-2, más acceso controlado. CSB y ropa protectora especial para todas las actividades.

4

Procedimientos del NBSA-3, más acceso estrictamente restringido. Muda de ropa antes de entrar. CSB de clase III o trajes de presión positiva. Ducha a la salida. Descontaminación de todos los desechos antes de su salida de las instalaciones.