Oxidasas y oxigenasas Especies reactivas y radicales libres Antioxidantes

1

2 Fe2+ + ½ O2 → 2 Fe3+ + O2Fe3+ + 3H2O → Fe(OH)3 + 3H+

• Hace aproximadamente 2.700 millones de • •

•

años, surgió el oxígeno en la atmósfera gracias a la fotosíntesis generadora de oxígeno de las cianobacterias. Actualmente hay 21 % de O2 en la atmósfera. El oxígeno le permite a los organismos aerobios la obtención eficiente de energía, actuando como aceptor final en las cadenas de transporte de electrones, permite obtener más energía que otros aceptores (como por ejemplo azufre). El oxígeno permitió también la formación de la capa de ozono (O3) que, filtrando la radiación solar, posibilitó el desarrollo de la vida terrestre. 3

Tabla de potenciales de reducción estándar

4







La oxidación es el efecto primario de la respiración en el cuerpo, es un proceso natural que implica que el oxígeno se reduce a agua mientras que diferentes moléculas se oxidan, dando como resultado la liberación de energía que se acumula bajo la forma de ATP. Por ej. la oxidación de glucosa (C6H12O6) a CO2 y la reducción de oxígeno a agua. C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O Nuestro cuerpo también usa la oxidación como defensa contra microorganismos, porque las moléculas oxidantes atacan a las células patógenas y éstas son expulsadas de cuerpo a través del proceso normal de eliminación.

Orbitales moleculares del dioxígeno 



La molécula de dioxígeno (O2) presenta dos electrones desapareados y tiene naturaleza de birradical. En general, las reacciones del dioxígeno con las moléculas orgánicas son lentas debido a restricciones de espín.

6

Para poder utilizar al oxígeno, se necesitan enzimas que lo utilizan como sustrato: Oxidasas y oxigenasas Todas (casi) tienen cofactores: metales de transición o coenzimas orgánicas capaces de formar radicales estables

7



El O2 acepta los electrones que le cede el sustrato, pero sus átomos no aparecen en el producto sino que son reducidos a superóxido (O2.-), peróxido de hidrógeno (H2O2) o agua (H2O).



ejemplo: citocromo c oxidasa 4 cyt c (red) + O2 + 4 H+ → 4 cyt c (ox) + 2 H2O

8

9

Mecanismo de la citocromo c oxidasa

10

Catalizan la desaminación oxidativa de aminoácidos generando al mismo tiempo peróxido de hidrógeno Aminoácido + FAD + H20  -ceto ácido + NH3 + FADH2 FADH2 + O2  FAD + H202

11

Existe incorporación de átomos del O2 al sustrato. Se pueden dividir en dioxigenasas y monooxigenasas.

1) Dioxigenasas los dos átomos del O2 se incorporan al sustrato X + O2 → XO2 Ej. triptofano 2,3 dioxigenasa

12

2) Monooxigenasas También llamadas hidroxilasas, oxidasas u oxigenasas de función mixta. Un átomo de oxígeno se incorpora al sustrato y el otro se reduce a agua. X + O2 + BH2 → XO + H2O + B los cosustratos dadores de electrones pueden ser flavinas (FADH2 o FMNH2), NAD(P)H, tetrahidrobiopterina o ácido ascórbico. Ej. enzimas con citocromo P450 13

14

Ciclo catalítico del citocromo P450

15

Descubrimiento del oxígeno y las oxidaciones Joseph Priestley (1733-1804) "este aire tiene una naturaleza exaltada"

Carl Wilhelm Scheele (1742-1786) "aire fuego"

Antonie Laurent Lavoisier (1743-1794) "oxígeno" (del griego oxys, filoso)

Comparten el mérito de haber descubierto el oxígeno y la oxidación. Lavoisier, antes de ser ejecutado durante la revolución francesa ("La república no precisa científicos!"), demostró que el aire estaba formado por un quinto de oxígeno, que, por oposición al nitrógeno, mantenía la combustión de una vela así como la vida de un ratón. Ya Scheele y Priestley observaron que el oxígeno podía tener efectos nocivos16

El oxígeno es tóxico • A pesar de que es necesario para los organismos aerobios, el oxígeno es tóxico.

• Un ratón sometido a oxígeno 100 %, hiperbárico, se muere en 40 minutos.

• Si fuera una droga, no estaría aprobada para el consumo humano.

En 1954, Rebeca Gerschman (bioquímica argentina, candidata al Nóbel en la década del 80) publica en Science pruebas sobre el daño por hiperoxia y su relación con el daño por radiación ionizante.

17

18

El oxígeno es tóxico

O2

e

O .2

e, + 2 H+

H2O2

-

e, - OH

.OH

e, + H+

H2O

Como subproducto del metabolismo aerobio, se forman especies oxidantes y radicales libres que, en principio, pueden reaccionar con prácticamente todos los componentes de la célula, ácidos nucleicos, proteínas, carbohidratos y lípidos.

19

20

Potenciales de reducción de las especies derivadas del oxígeno

Eº’ (V) O2 + 4 H+ + 4 e- → 2 H20

+ 0.815

O2 + 2 H+ + 2 e- → H202

+ 0.281

H202 + 2 H+ + 2 e- → 2 H20

+ 1.349

O2 + e- → O2.-

- 0.33

O2.- + 2 H+ + e- → H202

+ 0.89

H202 + H+ + e- → H20 + .OH

+ 0.38

.OH

+ H+ + e- → H20

+ 2.31

21

•

•

Desde la aparición de una atmósfera rica en oxígeno hace más de 2.000 millones de años, los seres vivos han tenido que “aprender” a convivir con ella y en el caso de los organismos aeróbicos, a utilizarla para aprovechar la energía de multitud de compuestos químicos. Sin embargo, al igual que un motor de combustión, las reacciones de estos procesos no son perfectas y producen fugas en forma de especies reactivas del oxígeno (ERO) capaces de alterar enormemente el status quo celular.

• La evolución ha brindado herramientas a los animales para protegerse, ya sea optimizando la utilización del oxígeno en la mitocondria, generando antioxidantes que los capture, o rediseñando proteínas para eliminarlas. • Como consecuencia, los animales que mejor han sabido adaptarse a esta situación son también los que poseen esperanzas de vida más largas y menor probabilidad de sufrir un amplio espectro de enfermedades. 23

. 2

O

. 2

O

H 2O2 O2

En 1969, McCord y Fridovich proponen que, a pesar de que el radical superóxido (O2.-) es capaz de dismutar espontáneamente en forma rápida, existe una enzima capaz de catalizar este proceso. Si existe una enzima que reacciona con el superóxido, es porque el superóxido efectivamente se forma en sistemas biológicos.

24

Es más, la superóxido dismutasa (SOD) sería esencial para la vida aerobia.

25

¿Qué son los radicales libres? Un radical libre es un átomo o grupo de átomos que tiene uno o más electrones desapareados (la palabra “libre” es innecesaria) Por ejemplo: Cu2+, H3C•, HO•, GS•, •NO, O2-•

-

26

¿De qué hablamos cuando hablamos de radicales libres o especies reactivas del oxígeno en bioquímica?

27

 El O2 en estado basal (triplete) puede pasar al estado singulete, donde sus electrones están apareados.

 Muy reactivo.  Se puede formar por mecanismos fotoquímicos y no fotoquímicos.  En los mecanismos fotoquímicos, la formación de oxígeno singulete depende de absorción de luz por moléculas fotosensibles como porfirinas.  También ocurre por exposición a luz UV.  Uno de los principales mecanismos no fotoquímicos depende de la reacción entre peróxido de hidrógeno e hipoclorito, que puede ocurrir en neutrófilos activados que tienen mieloperoxidasa. 28

• Es el producto de reducción monoelectrónica del dioxígeno O2 + 1e- → O2.-

• Se forma a nivel de la cadena respiratoria mitocondrial, por autooxidación de moléculas pequeñas y por enzimas específicas como la xantina oxidasa y la NAD(P)H oxidasa.

• Es aniónico a pH neutro (pKa del ácido conjugado HO2 es 4.7) y por lo tanto no puede atravesar membranas.

29

- Puede actuar tanto como oxidante como reductor E ’(O2/O2.-) = -0.33 V E ’(O2.-,2 H+/H2O2) = 0.89 V - Su toxicidad es limitada. - Puede dismutar espontánea o enzimáticamente (con la superóxido dismutasa) a dioxígeno y peróxido de hidrógeno.

30

• Se forma a partir de la dismutación del superóxido y por acción de diferentes enzimas como xantina oxidasa y glucosa oxidasa.

• •

No es un radical libre, no tiene electrones desapareados. Es un agente reductor y oxidante débil E ’(O2.-, 2H+/H2O2) = 0.89 V

• •

•

E ’(H2O2, H+/H2O, .OH) = 0.38 V

Es neutro y puede atravesar membranas biológicas. Puede reaccionar directamente con tioles o metioninas, inactivando enzimas.

O puede reaccionar con metales reducidos generando una especie más reactiva, el radical hidroxilo, .OH. 31

Se genera, entre otros procesos, por radiaciones ionizantes y por la reacción de Fenton

Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + .OH + OH- Es la biomolécula más oxidante que existe - E ’(.OH/OH-)= + 2.31 V - Es tan reactivo que reacciona inmediatamente después de su formación, con lo primero que encuentre.

32

Se forma por acción de la mieloperoxidasa de los neutrófilos. (3)

H2O2

+

+

H

+

Cl

HOCl + H2O

- No es un radical libre - Parcialmente aniónico (como hipoclorito) a pH neutro (pKa = 7.5). - Especie altamente oxidante E (2HOCl, 2H+/2H2O, Cl2) = 1.63 V E (OCl-, H2O/ Cl-, 2OH-) = 0.89 V

- Participa en reacciones de oxidación y cloración.

33

- Se forma enzimáticamente con las óxido nítrico sintasas, a partir de arginina, NADPH y oxígeno.

- Gas hidrofóbico y poco reactivo, es capaz de difundir y atravesar membranas. - Es un radical libre.

- Es un importante mensajero celular.

34

- Reacciona con el hierro ferroso de la guanilato ciclasa formando un complejo hemo-nitrosilo importante en la transducción de señales. - Reacciona con la oxihemoglobina formando nitrato.

- Puede reaccionar con el radical superóxido para formar peroxinitrito, un oxidante muy potente.

35

Peroxinitrito (ONOO-) - Se forma de la reacción, limitada por difusión, de los dos radicales libres óxido nítrico y superóxido. (6)

.

NO +

.O2

ONOO -

- Es una molécula oxidante E ’(ONOO-, 2H+/.NO2, H2O) = 1.65 V E ’(ONOO-, 2H+/NO2-, H2O) = 1.35 V. - A pH fisiológico, 80 % está ionizado, pues el pKa del ONOOH es 6.8. - Difunde, atravesando membranas biológicas en forma de ONOOH. - Puede reaccionar con tioles y centros metálicos. 36

- Puede reaccionar con dióxido de carbono formando carbonato radical (CO3·-) y dióxido de nitrógeno (·NO2).

- Puede formar nitrotirosina.

O O NH3+

HO NO2

37

38

Los ERO se forman constantemente en las células. - Aproximadamente 2 % del oxígeno consumido se convierte en especies reactivas en lugar de agua. - Algunas especies se forman como subproductos minoritarios de los procesos enzimáticos.

- Otros se forman deliberadamente. Por ejemplo, se forma superóxido gracias a la NAD(P)H oxidasa de los macrófagos en procesos inflamatorios. - Algunos factores ambientales (drogas, radiaciones, humo de tabaco) pueden aumentar la formación de radicales libres.

 NADPH oxidasas de células fagocíticas y no fagocíticas.  Mieloperoxidasa.  Cadena de transporte de electrones mitocondrial  complejo I (NADH deshidrogenasa)  complejo III (coenzima Q).

 Oxidasas como monoamino oxidasa, xantina oxidasa.  Radiación ionizante.  Óxido nítrico sintasa.  NOS constitutiva, bajas concentraciones, efectos señalizadores.  NOS inducible, altas concentraciones, efectos potencialmente tóxicos.

 Enzimas con citocromo P450

 Lipoxigenasa

40

41







La función biológica de estas enzimas está relacionada con la generación de ERO. La NADPH-oxidasa cataliza la transferencia de un electrón desde el NADPH hacia el O2 con la formación de radical superóxido (O2.-). 2 O2 + NADPH 2 O2.- + NADP+ + H+ Durante la transferencia de electrones, estos pasan desde el NADPH hacia el FAD, de este a los grupos hemo y de estos al O2.





Las NOX son una familia de proteínas transmembrana que transfieren electrones a través de las membranas biológicas. Es una familia de enzimas, constituidas por ◦ la NADPH oxidasa fagocitaria (NOX2/gp91phox) ◦ No fagocitaria: NOX1, NOX3, NOX4, NOX5, DUOX1 and DUOX2.



Los mecanismos de activación y la distribución tisular de los diferentes miembros de la familia son marcadamente diferentes.

(a) Generación de oxidantes en el fagosoma de neutrófilos luego de la ingestión de una bacteria. La NOX2 se activa en la membrana fagosomal y los electrones se transfieren desde el NADPH a través de la membrana al oxígeno , generando superóxido, que dismuta a peróxido de hidrógeno. La degranulación libera (junto con otras proteínas) mieloperoxidasa (MPO), que genera ácido hipocloroso. (b) Mecanismo propuesto para la generación de oxidantes por la NOX1. Esta enzima se activa por unión de ligando al receptor de membrana AT1R que se encuentra en el músculo liso vascular. La activación del receptor (AT1R) por angiotensin II (Ang II), causa el ensamblaje de los componentes de la NOX1 en la membrana, generándose superóxido a expensas de oxígeno y los electrones del NADPH.

44



Las funciones fisiológicas de las NOX incluyen: ◦ ◦ ◦ ◦ ◦



defensa contra las infecciones procesamiento postraduccional de proteínas mecanismos de señalización celular regulación de la expresión génica diferenciación celular.

Las NOX también contribuyen a un gran rango de procesos patológicos ◦ La deficiencia de la NOX puede llevar a inmunosupresión (enfermedad granulomatosa crónica). ◦ La actividad aumentada contribuye a un gran número de patologías, en particular a enfermedades cardiovasculares y neurológicas.





Los leucocitos humanos, son movilizados a los sitios de inflamación donde destruyen a los agentes invasores a través de la liberación de especies reactivas del oxígeno (ERO) y enzimas proteolíticas. Una vez en el sitio de infección los monocitos/macrófagos se “activan”, adquiriendo la capacidad de producir ERO







Frecuentemente la activación leucocitaria se desencadena por el contacto y/o fagocitosis de un micoorganismo Se caracteriza por un aumento del consumo de O2, proceso denominado "estallido respiratorio", Este estallido, se debe al consumo de O2 por la NADPH-oxidasa.







La actividad de la NADPH-oxidasa fagocítica constituye una de las fuentes endógenas más importantes de especies reactivas del oxígeno en el organismo. Este sistema enzimático está constituido por varias proteínas, que se encuentran distribuidas en diferentes compartimentos celulares cuando el leucocito está en reposo. Durante la activación leucocitaria, los diferentes componentes son traslocados hacia la membrana plasmática o fagocítica donde experimentan un proceso de ensamblaje que conforma el sistema enzimático activo.

   

 

Flavocitocromo b558 (gp91phox + p22phox) p47-phox p67-phox p40-phox Rap1A Rac2

49



  

 

Es un heterodímero que se localiza en la membrana de gránulos específicos ( 90 %) y la membrana plasmática ( 10 %) cuando la célula está en reposo. Después de la activación es transferido a la membrana plasmática o la de los fagosomas. Es una flavoproteína que contiene 2 grupos hemo. Está compuesto por 2 subunidades diferentes: una glicoproteína de 91 kDa (gp91-phox) y otra proteína no glicosilada de 22 kDa (p22-phox). La subunidad gp91-phox posee los sitios de unión para el FAD y el NADPH. Es el componente central de la NADPH-oxidasa, pues contiene todos los elementos que le permiten transportar los electrones desde el NADPH hasta el O2.







p47-phox: Se localiza en el citosol en forma libre y

formando parte de un complejo de 240 kDa con p67phox y p40-phox. Parece ser el primer componente citosólico que interactúa con el flavocitocromo b558 durante el ensamblaje. Posee una región catiónica con múltiples sitios de fosforilación de Ser/Thr quinasa relacionado con su función reguladora. p67-phox: Se encuentra en el citosol unido al complejo de 240 kDa cuando el leucocito está en reposo. Comparte la unión al NADPH con gp91-phox. p40-phox: Es el tercer componente del complejo citosólico. Puede regular negativamente la actividad del complejo y se ha demostrado que en la activación sufre varias fosforilaciones. 51





Rap1A: Es una proteína de la superfamilia Ras de

proteínas de unión al GTP. Se asocia estrechamente con el flavocitocromo b en la activación. Puede activar a la proteína quinasa C y participar así en la regulación del complejo. Rac2: Es una proteína de unión al GTP que se encuentra en el citosol durante el reposo, unida a un factor de intercambio de nucleótidos de guanina (Rho-GDI). Con la activación intercambia GDP por GTP, se disocia del factor y es translocada a la membrana plasmática simultánea e independientemente del complejo de 240 kDa. 52





En el reposo, el complejo citosólico se mantiene estabilizado a través de diferentes interacciones En la activación: ◦ p47-phox es fosforilada. ◦ El complejo es translocado a la membrana donde la p47-phox se libera de su unión a p67-phox que establece un enlace de alta afinidad con el flavocitocromo b558.





El O2.- es rápidamente convertido en peróxido de hidrógeno, radical hidroxilo y ácido hipocloroso (por acción de la MPO). Estos, junto a los derivados reactivos del nitrógeno y al contenido de los gránulos constituyen el mecanismo fundamental de defensa inmune innata.

54

(3)   



H2O2

+

+

H

+

Cl

HOCl + H2O

Es una hemoproteína Es parte del sistema de defensa de los PMN. Es responsable de la actividad anti microbiana contra un amplio espectro de organismos. En los PMN estimulados, la MPO cataliza la producción ácidos hipohalogenosos, principalmente ácido hipocloroso, y otros intermediarios tóxicos que aumentan poderosamente la actividad microbicida. 55

También el medio ambiente

Humo de tabaco - Tanto la fase gaseosa como la fracción particulada contienen oxidantes y radicales libres (O2.-, H2O2, .NO, .NO , ONOO-, aldehídos reactivos y CO). 2 - 1017 moléculas oxidantes por cigarrillo, presentes en el humo o generadas a partir de él (por ejemplo, por autooxidación de hidroquinonas). - El humo de tabaco, además, ocasiona una respuesta inflamatoria en el pulmón en la cual los leucocitos forman aún más radicales libres. 57

Qué nos mantiene vivos y “sanos” (por algunos años) a pesar de la generación continua de ER?

58



De alto peso molecular ◦ Enzimáticas ◦ Proteínas capaces de transporte e inactivación de metales de transición (ceruloplasmina, ferredoxina, transferrina, etc.)



No enzimáticas

59

•Catalasa, es una hemoproteína 2 H2O2

O 2 + 2 H 2O

•Superoxido dismutasa 2 O2•- + 2 H+

O2 + H2O2

Tres Isoformas: SOD1 o Cu/Zn-SOD,

SOD2 o Mn-SOD SOD3 o Fe-SOD

•Glutatión peroxidasa (GP) H2O2 + 2 GSH

H2O + GSSG

Selenoproteína, actúa junto a la

• Glutatión reductasa (GR) GSSG + NADPH

H2O2

NADP+

2GSH GP

H2O

2 GSH + NADP+

GR GSSG

NADPH+H+

61

•Peroxirredoxina

(Prx)

H2O2 + Trx(SH)2

H2O + Trx(S)2

Con tiol reactivo, actúa con

•Tiorredoxina reductasa (TrxR) Trx(S)2 + NADPH H2O2

Trx(SH)2 Prx

H2O

Trx(SH)2 + NADP+ NADP+ TrxR

Trx(S)2

NADPH+H+ 62

vitamina E ácido ascórbico coenzima Q ácido úrico carotenoides flavonoides

63

CH3 CH3

O

CH3

(CH2)3CH(CH2)3CH(CH2)3CH(CH3)2 CH3

O

CH3

CH3

Reacción con peróxidos lipídicos: LOO + TOH

LOOH + TO

Reciclaje con ascorbato OH O

HO

OH O

HO

O

O

+ TO OH

O AscH

+ TOH O

O Asc

64

Concepto clásico de estrés oxidativo Sies, 1985

Desbalance entre la producción de especies reactivas y las defensas antioxidantes 65

66

1. Oxidación de lípidos

67

L-H + X

L + XH

Iniciación

3 x 108 M-1 s-1 L + O2

LOO 40 M-1 s-1

LOO + L-H

L + LOOH

LOO + “R

LOOR

”

Ciclo de Propagación

Terminación

68

El oxidante abstrae un átomo de hidrógeno de un metileno bis-alílico. Energía de disociación de: C-H alquílico: 104 kcal/mol C-H bis-alílico: 80 kcal/mol Se forma un radical estabilizado por resonancia.

69

Reacción en cadena La lipoperoxidación lipídica es un ejemplo de una reacción en cadena, donde un iniciador comienza el proceso oxidando un lípido y formando un radical libre que es capaz de reaccionar con oxígeno formando una especie secundaria capaz, a su vez, de oxidar otro lípido. Un único evento de oxidación da lugar a la formación de múltiples oxidantes secundarios como resultado de la reacción en cadena dependiente de oxígeno.

... y la manteca se puso rancia... 70

Determinación de especies reactivas al ácido tiobarbitúrico (marcador de oxidación de lipídos) en plasma de personas fumadoras y no fumadoras. Yamaguchi, Eur J Clin Invest 35:186, 2005.

71

2. Oxidación de ácidos nucleicos

72

• El ADN es susceptible a la oxidación.

•1.5 x 105 golpes oxidativos por célula, por día. •1019 golpes oxidativos por persona.

•Importancia: mutagénesis, cáncer. • El ADN mitocondrial es más susceptible a la oxidación que el nuclear.

• Mitocondria: 125 8-hidroxiguaninas por cada 1 x 106

bases. • Núcleo: 8 8-hidroxiguaninas por cada 1 x 106 bases en núcleo.

• El ADN puede ser dañado por oxidantes fuertes como ·OH y H2O2/Fe2+

• El daño puede ocurrir inicialmente en las bases o en el azúcar.

• Simple hebra: 7% al azúcar. • Doble hebra: 20% al azúcar.

73

O

-

N7

O O P O CH 2

-O 4'

3'

4

8 9

3

NH

1 2

N

N

O

6

5

NH 2 O

1' 2'

HN3

O

2

O P O CH 2 O O O 4'

3'OH

CH 3

4

5 6

1

N

1' 2'

Abstracción de ·H del azúcar: 1 x 109 M-1 s-1 ·OH Adición a doble enlace de la base: 1 x 1010 M-1 s-1 Reacción con el fosfato: 1 x 107 M-1 s-1

74

Ataque oxidativo al azúcar Si no es reparado, lleva a la ruptura del esqueleto fosfatodesoxirribosa del ADN. Base

Base P O CH2 4'

O sugar

O

P O

.

O sugar

O sugar

O

-

O P O O CH2

P O CH2

N

Base N

N

-

O P O O CH2

O sugar

Base N

P O

•Las rupturas en una hebra del ADN pueden causar daño, aunque suelen ser reparadas.

•Las rupturas en dos hebras suelen llevar a la muerte de la célula. 75

NH2

O

N H

N N

N H

HN N OH

H2N

N

O

OH

O

N H

O

H HN

N H

O

5-hydroxymethyluracil

OH N H

H O

H

5-hydroxy-6-hydrouracil

5-hydroxyuracil

H2N

NH2

N

4,6-Diamino-5formamidopyrimidine

NH CHO

N

O

2,6-Diamino-4-hydroxyformamidopyrimidine

N

H

8,5'-cyclo-2'-deoxyadenosine

O

CH3 OH OH H

HN

N H Thymine glycol (cis and trans)

N H 5-hydroxy-6hydrothymine

N

NH2

NH

O

CH3 H H H

N H 5,6-dihydrothymine

NH2

H

HO H

H

H

HN

O

O

N N

CH3 OH H H

HN

NH2

N

NH2

HO

O

O

HN

NH CHO

OH

N H

O

N

O

OH

HN

NH2

H

H OH

5-hydroxy hydantoin

O CH2OH

HN

N H

O

HN

8-hydroxyguanine

8-hydroxyadenine

O

N

O

N

N

NH2

H

H OH

H

8,5'-cyclo-2'-deoxyguanosine

N O

OH

OH N H H Cytosine glycol

N O

O OH

N H 5-hydroxycytosine

HN

OH N H 5,6-dihydroxy uracil

O

HN

OH

O

CH3 N OH H 5-hydroxy-5methylhydantoin

O

76

La 8-hidroxiguanina es utilizada como marcador de daño oxidativo al ADN

cil

NH2

O

N

H

N

N

N H

HN N

OH

H2N

N

N

N H

OH

O

8-hydroxyguanine

8-hydroxyadenine O

O

HN

N H

H OH

5-hydroxy hydantoin

O Existen métodos adecuados de medida HN Ho HPLC/EC GC/MS H2N N N OH O N H OH H Es una de las lesiones predominantes 5-hydroxymethyluracil 5-hydroxy-6-hydrouracil 5-hydroxyuracil 8-hydroxyguanine O

HN N

HN

O

N

CH2OH

O

O

H

HN

N H

O

OH

N H

OH

HN

H

O

H

N H

5-hydroxy hydantoin

NH2

O

ON N

HN

HN

NH CHO

H

NH CHO

O

H2N

NH2

NH2

N

OH 4,6-Diamino-5-

OH

HN

2,6-Diamino-4-hydroxyEjemplo: la 8formamidopyrimidine formamidopyrimidine HEn fumadores, O N N H H H hidroxiguanina estáO aumentada, en 5-hydroxy-6-hydrouracil plasma y orina. 5-hydroxyuracil NH2

N

O

N

N

HO H

O

N H

OH

2

N

H

H H

O

8,5'-cyclo-2'-deoxyadenosine HN

NH CHO NH2

amino-5-

H2N

NH

HO

N

O

N

N

NH2

H

H OH

H

8,5'-cyclo-2'-deoxyguanosine NH CHO

NH2

2,6-Diamino-4-hydroxy-

Yamaguchi, Eur J Clin Invest 35:186,

77

Mutagénesis Una lesión oxidativa puede causar una mutación cuando la ADN polimerasa “lee mal” durante la replicación . Por ejemplo, la 8-hidroxiguanina 8-h ydr oxygu an in e lleva a una transversión G-T.O O HN N

N

HN N

Basepair s

NH

A T H2N

N

N H

OH

H2N

8 OH-Gu a (en ol)

H N

H2N

N H

O

8 oxo-Gu a (k et o)

O

N

H H N

G C 8 OHdG A

H

NH N

N

N

H N

N H

8 OH-Gu a

N

H

Aden in e

O 78

3. Oxidación de proteínas

79



Esqueleto - abstracción primaria de átomo de hidrógeno a nivel del carbono alfa. O

R

R N H H O

H N

HO. R

Puede resultar en fragmentación 

R

O N H

H N

. O

Cadenas laterales - 20 tipos diferentes

◦ Abstracción de hidrógeno (con aminoácidos alifáticos) ◦ Adición (con aminoácidos aromáticos) Puede resultar en la alteración de las cadenas laterales 80

◦ Se forma un radical proteico a nivel del carbono alfa. ◦ En presencia de oxígeno se puede formar un radical peroxilo. ◦ Si un radical reacciona con otro se puede formar un agregado covalente. ◦ Puede llegar a fragmentarse la cadena R H O R H O- R. RH N N polipeptídica. N N O R

.

OO

H O R OOH

H

reduction

-HO 2.

R

O N O

R N H

R

H N

O

.

O R

O

N H

H 2O R NH2 O

+

O

O R

R N H

H N O

O R

+

.

O N H

81

 Los veinte aminoácidos pueden ser eventualmente oxidados por diferentes especies reactivas.  Los más reactivos son los azufrados y los aromáticos.

 A partir de los aminoácidos alifáticos suelen obtenerse peróxidos, alcoholes y carbonilos.  El daño inicial a nivel de un sitio de la proteína puede ser transferido a otro sitio.

82

Modificaciones de aminoácidos alifáticos Glutamato

Lisina hidroperóxidos 4-hidroxiglutamato

Leucina

hidroperóxidos Prolina alcoholes -cetoisocaproato isovalerato isovaleraldehído Arginina carbonilos

Valina

hidroperóxidos alcoholes carbonilos

Isoleucine

hidroperóxidos alcoholes carbonilos hidroperóxidos alcoholes carbonilos

hydroperoxidos 5-hidroxi-2-aminovalerico hidroperóxidos alcoholes carbonilos

83

Oxidación de cisteína y metionina 

 

Los aminoácidos azufrados son blancos importantes, reaccionan rápido con muchos oxidantes y son fácilmente oxidables. La metionina se convierte en metionina sulfóxido. -SCH3 -S(=O)CH3 La cisteína puede oxidarse al disulfuro cistina u oxiácidos.

RSH radical RSH

RSSR (cystine) via thiyl

RS-X, RSOH, RSO2H, RSO3H

La formación de metionina sulfóxido, cistina o cisteínsulfínico son las únicas modificaciones proteicas que pueden ser reparadas enzimáticamente. 84

Oxidación de aminoácidos aromáticos OH

O

Fenilalanina o-, m-tirosina dimeros

O

HN

HN

Phenylalanine

ortho-Tyrosine (o-Tyr) O

HO HN

meta-Tyrosine (m-Tyr)

Tirosina DOPA ditirosina

O

HN

HO

Triptofano N-formylkinurenina kinurenina 5-hidroxitriptofano 7-hidroxitriptofano

O HO HN

HO

Tyrosine

3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) O

NH

O

OH

HN

HO

Histidina

di-Tyrosine (di-Tyr) O

O

2-oxo-histidina

N

N

Free Radic. Biol. Med., 1999, 27, 1151-1163

N H

NH

O N

NH 85

Algunas modificaciones de aminoácidos tienen utilidad como marcadores de eventos oxidativos Determinación de nitrotirosina (marcador de especies reactivas derivadas del óxido nítrico) en plasma de personas fumadoras y no fumadoras.

Yamaguchi, Eur J Clin Invest 35:186, 2005. O O NH3+

HO NO2

86

CARBONILOS La formación de carbonilos en las proteínas es muy utilizada como marcador de estrés oxidativo. Métodos: reacción de los carbonilos con dinitrofenilhidracina, reducción de los carbonilos con borhidruro tritiado, anticuerpos anti-carbonilos. Los carbonilos se forman por reacción directa de la proteína con especies oxidantes o secundariamente a la reacción de la proteína con carbohidratos o lípidos oxidados.

87

Carbonilos en homogenatos de mosca Los carbonilos en las moscas aumentan con la edad. Sohal RS, 1993, PNAS 90:7255

Carbonilos en fibroblastos cultivados de humanos.

progeria Werner’s

Los carbonilos en los humanos aumentan con la edad. Oliver CN, 1987, JBC 262:5488 88

Carbonilos en mosquitas caminadoras y voladoras Sohal RS, 1993, PNAS 90:7255

voladoras

caminadoras

caminadoras

voladoras

89

Supervivencia máxima versus tasa metabólica para diferentes especies

90

•Cardiovasculares: •Aterosclerosis •Isquemia/reperfusión •Neurológicas •Parkinson •Esclerosis lateral amiotrófica •Alzheimer •Cáncer •Diabetes •Fibrosis quística •Hiperoxia •Enfisema •Osteoartrosis •...

91







Las especies reactivas del oxígeno (ERO) juegan un rol clave en el proceso arteriosclerótico al provocar serie de cambios moleculares que llevan a la infiltración macrofágica en el endotelio y a la formación de placas. Las ERO generan LDL oxidada, activan a metalopeptidasas de la matríz extracelular (MMPs), estimulan el crecimiento del músculo liso vascular, e inducen la producción de citoquinas y moléculas de adhesión inflamatorias (ICAM-1 y VCAM-1). Las ERO están también involucradas en la disfunción endotelial debida a inactivación del óxido nítrico (NO), un potente vasodilatador y antiagregante plaquetario.







El sistema nervioso consume alrededor de un 20% del oxígeno consumido por el organismo y como resultado produce grandes cantidades de ERO. Adicionalmente, el sistema nervioso es particularmente sensible al estrés oxidativo por el alto porcentaje de ácidos grasos poliinsaturados en las membranas La generación de ERO por las NOX ha sido involucrado en una variedad de enfermedades del SNC tales como esclerosis lateral amiotrófica, infarto cerebral, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, y demencia del HIV.

94

Además de sus roles tóxicos, en los últimos años se ha recopilado mucha evidencia de que las especies reactivas tienen roles señalizadores. Esto ha llevado a una nueva definición de estrés oxidativo. En el estrés oxidativo ocurriría un desbalance a nivel de la señalización redox y su control (Hansen, 2006). Esto contrasta con el concepto clásico de estrés oxidativo como desbalance entre la producción de especies reactivas y las defensas antioxidantes

95