Trabajo Practico N N°3 3 Cultivo de microorganismos en el laboratorio

¿Para qué cultivar microorganismos? Para estudiarlos

¿Por P qué? é? Porque es un microorganismo nuevo no caracterizado. Porque tienen i importancia t i

ecológica, ló i

i d ti l industrial

( li (alimentos: t

lá t lácteos,

cerveza,

etc.), t )

biotecnológica (producción de compuestos, obtención de genes de interés) y porque p q causan enfermedades.

¿ ¿Cómo? Imitando en el laboratorio las condiciones del ambiente natural del microorganismo, utilizando medios de cultivos y condiciones que sustenten el crecimiento.

¿Qué factores influencian el crecimiento bacteriano en la naturaleza? Factores nutricionales Factores ambientales (físicos)

Factores nutricionales: Carbono: CO2, compuestos orgánicos. Nitrógeno: NH3, NO3-, N2, compuestos orgánicos nitrogenados (aminoacidos, bases nitrogenadas) Fósforo: PO3Azufre: H2S, SO4-, compuestos orgánicos azufrados. Potasio, magnesio, sodio, calcio, hierro. El Elementos t traza: t C M Cu, Mo, M Mn, Ni Ni, Z Zn, etc t Factores de crecimiento: vitaminas, aminoacidos, purinas y pirimidinas

¿Qué factores influencian el crecimiento bacteriano en la naturaleza? Factores ambientales Temperatura

Disponibilidad de agua (osmolaridad)

T Termófilos: ófil 50 60 °C 50-60

Halófilos discretos 1-6 % NaCl

Mesófilos: 20-40 °C

Halófilos moderados 6-15 % NaCl

Psicrófilos: 10-20 °C

Halófilos extremos 15-30 15 30 % NaCl Halotolerantes

Oxígeno Aerobios estrictos

pH

A Anaerobios bi ffacultativos lt ti

Acidófilos 1.0 - 5.0

Microaerófilos

Neutrófilos 5.5 - 8.5

Anaerobios aerotolrenates

Alcalófilos 9.0 9 0 - 10.0 10 0

Anaerobios estrictos

Varias preguntas al cultivar un microorganismo:

¿Es aerobio, anaerobio facultativo, microaerófilo, anaerobio? ¿Qué sustratos puede utilizar como fuente de carbono y energía? ¿ g ¿Qué formas de nitrógeno puede utilizar? ¿Requiere suplementos nutricionales? ¿Requiere luz como fuente de energía? ¿Puede crecer sobre un sustrato inorgánico? ¿Cuál es su temperatura óptima de crecimiento? ¿Tolera concentraciones altas de sal?

¿Cómo sustentamos el crecimiento en el laboratorio? M di de Medios d cultivos lti Los medios de cultivo son una mezcla equilibrada de nutrientes que en concentraciones adecuadas y con condiciones físicas óptimas permiten un buen crecimiento de los microorganismos.

9 Fuente de carbono y energía (glucosa o cualquier otro compuesto carbonado) 9 Fuente de nitrógeno, nitrógeno azufre azufre, fósforo 9 NaCl 9 Buffer 9 Agua Según la consistencia

Líquidos q ((caldos)) Sólidos (agar 1,5 %) Semisólidos (agar 0,6 %)

Obtención de cultivos puros – Breve historia ƒ 1876 Koch Æ Cultivo de MO en medio solido (gelatina y rodajas de papa) para asegurar cultivos puros.

Postulados de Koch: 1. 2. 3. 4.

El microorganismo debe estar presente en todos los individuos con la misma enfermedad. enfermedad El microorganismo debe ser recuperado del individuo enfermo y poder ser aislado en medio de cultivo. El microorganismo proveniente de ese cultivo debe causar la misma enfermedad cuando se lo inocula a otro huésped. huésped El individuo experimentalmente infectado debe contener el micoorganismo. Robert Koch

ƒ1882 Walter Hesse Æ remplaza la gelatina por Agar-Agar, lo que permitió el cultivo de microorganismo aislados a mayores temperaturas. ƒ1887 Julius Richard Petri Æ uno de los ayudantes de Koch ideo una caja o capsula de vidrio para el cutivo de los microorganismo.

Obtención de cultivos puros

Medio Sólido: permite el crecimiento en superficie de los microorganismos como poblaciones discretas COLONIAS Cultivos puros

Medio líquido: Permite la obtención de gran masa celular. Posibilidad de utilizar tili grandes d volúmenes lú ((estudios t di bi bioquímicos, í i ffermentaciones). t i ) Medio semisólido: Se utiliza para estudios de movilidad, fermentación.

Tipos de Medios de cultivos Medio definido o sintético: son los medios que contienen una composición química definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para el estudio de requerimientos nutricionales y para obtener resultados reproducibles.

Medio complejo: complejo medios que q e contienen nutrientes n trientes de composición química q ímica variable o no establecida. Son mezclas complejas y poco definidas de nutrientes. Contienen extractos animales, vegetales g e hidrolizados de proteínas. Se utilizan cuando se necesita obtener una amplia gama de microorganismos

Medios complejos Extracto de carne: Se obtiene a partir de la proteólisis de carne magra sin tendones. Es de alto valor nutritivo. Fuente de carbono

Extracto E t t de d levadura: l d S obtiene Se bti d de lla extracción t ió acuosa d de levadura de cerveza. Es rico en vitaminas. Extracto de malta: Se obtiene a partir de la cebada de malta malta. Rica en carbohidratos y maltosa. Peptona p de carne: Digestión g de carne bovina con tripsina p o pepsina

Fuente de nitrógeno

Peptona de caseína (tripteína): Tratamiento de caseína con tripsina. Altos contenidos en triptofano. Peptona de soja: Digestión de soja con papaína.

Medio definido

Gl Glucosa, sacarosa o cualquier l i otro t compuesto t carbonado b d NH4Cl, (NH4)2SO4, aa, bases nitrogenadas

Medio mínimo definido para Bacillus megaterium

Medio definido para Thiobacillus thiooxidans, un quimiolitoautótrofo del azufre

Medio definido para un quimilitoautotrofo que oxida amonio (Nitrosomas)

Medio definido para un quimiorganoheterótrofo

Medio complejo p j para p quimiorganoheterótrofo (agar nutritivo)

Medio definido para el crecimiento de bacterias quimioorganoheterótrofas fastidiosas como Neisseria gonorreae

Medio complejo para bacterias fastidiosas

Medio complejo para halófilos extremos

Efecto del oxígeno sobre el crecimiento

Atmósferas de incubación Crecimiento en anaerobiosis Estufas E t f y jarras j de anaerobiosis (generadores de gases)

Creciemiento en aerobiosis bi i Medios líquidos: Agitación. Sólidos: en atmósfera normal (78 % N2, 21 % O2, 0,03 % CO2) Temperatura de incubación

Otros medios de cultivo Medios enriquecidos: medio que tiene un gran exceso de nutrientes y se utiliza para microorganismos que tienen grandes exigencias nutricionales. Medios diferenciales: medio que permite revelar características fisiológicas de los microorganismos. Medios selectivos: medio que sólo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos e inhibe el de otros. Permite seleccionar y aislar microorganismos a partir de poblaciones mixtas.

Medios de enriquecimiento: Es un medio que permite el desarrollo de un grupo de microorganismos a partir de una muestra que contiene una gran variedad de microorganismos. Se utiliza un medio selectivo líquido y se incuba bajo determinadas condiciones.

Agar columbia CNA Medio muy nutritivo

Medio selectivo

Contiene peptonas, extractos de levadura y corazón, almidón. colistin y ácido nalidíxico

Inhiben G S. epidermidis en agar Columbia CNA

Agar MRS (Man, Rogosa y sharpe) Medio enriquecido para Lactobacillus. Poca selectividad Contiene Extratos, peptonas, glucosa, factores de crecimiento (tween 80, Mn, Mg), citrato (inhibición G -) Lactobacillus lacticus en MRS agar

Levine EMB Agar Medio para enterobacterias diferencial y selectivo Contiene: Peptona Permite diferenciar entre los microorganismo capaces de fermentar la lactosa de los que no.

Lactosa Eosina Azul de metileno

No fermentador de lactosa

Fermentador de lactosa

Fermentador de lactosa, con brillo verde brillante (E. coli )

Mac Conkey Agar Medio para diferenciar enterobacterias Selectivo y diferencial Contiene: P t Peptonas Lactosa Sales Biliares y cristal violeta

E coli E.

Purpura de bromocresol

Lactosa (+) Lactosa ( - )

colonias Amarillas colonias transparentes o blancas E. coli

Proteus

Agar sangre Medio enriquecido y diferencial Se adiciona al medio sangre. Permite el crecimiento de bacterias con requerimientos nutricionales exigentes . Permite distinguir tres patrones de hemólisis: α β γ

Agar chocolate Medio enriquecido Agar con el agregado de sangre, calentado suave. Suministra factores de para bacterias exigentes. g crecimiento p (Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrheae) Haemophilus influenzae

Agar manitol salado Medio para aislar Staphylococcus Selectivo y diferencial Contiene: Peptonas Manitol Cl Cloruro d de sodio di 7 7,5 5 % (vs ( 0 0,5 5 %) Rojo fenol

Fermentación manitol

No fermentación manitol

acidez

Colonias amarillas

Colonias rosadas

S.aureus

S epidermidis

Baird-Parker Medio para distinguir Staphyloccocus aureus. Selectivo y diferencial Contiene: Peptonas Extractos

Se suplementa con yema de huevo emulsionada con telurito de potasio

Cloruro de litio Glicina Piruvato de sodio

Glicina + piruvato promueven el crecimiento de Staphyloccocus S. aureus

S. aureus reducción telurito a telurio, lecitinasa (-) S. Epidermidis reducción de telurito, lecitinasa (+)

Colonias negro-grisáceo rodeada por zona clara Colonias negro-grisáceas, sin zona clara

Agar cetrimida

Medio para Pseudomonas Selectivo, parcialmente dif diferencial i l

Contiene: Peptona Cloruro de magnesio Sulfato de potasio Cetrimida (detergente catiónico catiónico, bromuro de cetiltrimetil amonio) Adición de ácido nalidíxico Producción de pigmentos pioverdina

P. aeruginosa en agar cetrimida

Colonias amarillo verdosas

piocianina, piorrubina

pioverdina

Agar Mossel Medio para aislar Bacillus cereus selectivo y diferencial C ti Contiene: Peptonas Extractos t actos Manitol

Adición de yema de huevo y polimixina B

Rojo fenol Bacillus cereus: no es capaz de utilizar el manitol (M -), produce la exoenzima e a lecitinasa ec asa ((L+)) Saphilococcus aureus: es capas de utilizar manitol (M +), no produce l exoenzima la i llecitinasa ii (L (L-))

Colonias rosadas con precipitado blanco

Colonias amarillas con precipitado p p blanco

Salmonella y Shigella Agar M di selectivo Medio l ti y dif diferencial i l para Salmonellas S l ll y Shi Shigellas ll Contiene

Salmonella typhimurium

Peptonas p Extractos Lactosa Sales biliares y verde brillante Citrato férrico Tiolsulfato sódico Rojo neutro Salmonella, producción de ác. sulfìdrico, lactosa (-) Shi ll lactosa Shigella, l t ((-)) E. coli, lactosa (+)

Shigella flexneri

Colonias transparentes con centro negro C l i ttransparentes Colonias t Colonias rosadas a rojas

Indicadores de pH ROJO NEUTRO Rango de pH: 6.8-8.0 (rojo a amarillo) AZUL DE BROMOTIMOL Rango de pH: 6-7.6 (amarillo a azul). ROJO DE FENOL Rango de pH: 6.8-8.2 (amarillo a rojo) AZUL DE TIMOL R Rango d de pH: H 1 1.2-2.8 2 2 8 ((rojo j a amarillo) ill ) y 8 8.0-9.6: 0 9 6 ((amarillo ill a azul). l) PURPURA DE BROMOCRESOL Rango de pH: 5.2-6.8 5.2 6.8 (amarillo a púrpura) ROJO DE CRESOL Rango de pH: 7.2-8.8 (amarillo a rojo).

Técnicas básicas de microbiología i bi l í

Siembra en placa: Agotamiento por estría

Obtención de colonias aisladas

Siembra en agar g inclinado

Inoculaciones en medio solido en tubos

Pasaje de cultivos líquidos

Siembra por extensión y por vertido de placa

Siembra por extensión con espátula de Drigalsky

Medida del crecimiento

Por masa celular 1) Determinación del peso seco /húmedo

2) Determinación del N total : proteico o no proteico

3) Determinación de componentes celulares: ADN, ARN, proteínas

4) Métodos turbidimétricos (densidad óptica)

Medición de la turbidez: métodos espectofotométricos

λ = 600 nm

Curva de calibración

Medida del crecimiento

Por medida del número de individuos 1) Recuento directo Cámara de Petroff Petroff-Hauser Hauser (para bacterias) Cámara de Thomas (para levaduras)

2) Contadores electrónicos de partículas (Contador Coulter)

3) Recuento de viables en placa 4) Recuento de viables sobre filtro en placa

Recuento directo de microorganismos al microscopio Cámara de Petroff-Hausser

muestra

Área total: 1 mm2 Altura: 0,02 mm Volumen: 0,02 mm3 = 0,00002 cm3 Nº cél/ml = promedio cél x 25 x 5 104

Recuento de células viables: método de recuento en placa

UFC/ml= N/ ((vol x dil))

Problemas de Diluciones •

DO600= 0,35 0 35 0,1 DO = 5x108 bact/ml V final de cada dilución será de 0,1 ml

•

Un cultivo de E. coli crece en fase logarítmica g y tiene una DO de 0,6 , unidades. Se sabe que cuando el cultivo tiene una DO de 0,4 unidades, la concentración bacteriana es de 1x108 bacterias/ml. ¿Qué dilución haría y qué volumen sembraría para realizar el recuento de viables cuando la DO es 0.6 U?.

Conservación de cultivos puros (axénicos) Preservar la viabilidad y estabilidad genética. Evitar la contaminación En estría sobre agar g inclinado en heladera (5ºC) Congelados a -20 ºC, –70 ºC ó 196 ºC en caldo con 20 % glicerol u otro crio persevante (por ejemplo leche) Liofilizados

Solo unos meses

De meses a años

Tiempos largos

Los repiques sucesivos NO son un método de conservación de microorganismos