1

1. INTRODUCCIÓN

Los protoplastos son células de plantas, bacterias u hongos que han perdido totalmente su pared celular, lo cual se logra a través del uso de enzimas que la degraden. El uso de protoplastos permite estudiar la transformación genética en bacteria o células vegetales, ya que es más fácil introducir ADN en ausencia de la pared celular. A partir de protoplastos también es posible llevar a cabo el método de micropropagación y realizar la técnica de fusión de protoplastos, útil en mejoramiento genético vegetal debido a la obtención de tejidos híbridos. Los antecedentes más relevantes entregados por la literatura, hacen referencia a la naturaleza del explante utilizado, a la utilización de estabilizadores osmóticos y a una incubación en oscuridad previa a la acción enzimática. El principal objetivo, es desarrollar una metodología para el aislamiento de protoplastos, además de diseñar un protocolo que haga referencia al cultivo de estos y a las enzimas apropiadas para la degradación de la pared celular, también definir los parámetros involucrados en todo el proceso

2

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

Altamn, A., Krr-Sawhney, R., and Galston A. V. 1977. Stabilization of oat leaf protoplasts through polyamine mediated inhibition of senescence. Plant Physiol., no.60, p 570-574. Andreu P., Arbeloa A., Terren N., and Marín J.A. (2008). Aislamiento y cultivo de protoplastos del patrón ciruelo ‘Mariana 2624’. Revista De La Asociación Interprofesional Para El Desarrollo Agrario (AIDA), ISSN 1699-6887, Nº 4. Estación Experimental de Aula Dei (CSIC). Zaragoza, España. 482-492 p. Bracho M., García M., Marcano L., Rodriguez S., Guiñez J., and Del Campo A. (2008). Obtención y aislamiento de protoplastos de tejido radicular de Allium cepa, L. Ciencia, jun. 2008, vol.16, no.2, p.141-147. Maracaibo, Venezuela. Echenique V., Rubinstein C., and Mroginski L. 2004. Biotecnología y mejoramiento vegetal. Editorial INTA. Consejo Argentino para la Información y el Desarrollo de la Biotecnología. Argentina. 448 p. Nagata T., and Takebe H. 1970. Cell Wall Regeneration and Cell Division in Isolated Tobacco Mesophyl Protoplasts. Planta 92:301-308. Orozco-Castano, F.J., and Schider O. 1982. Aislamiento y cultivo de protoplastos a partir de hojas de café. Centro Nacional de Investigaciones de Café (CENICAFÉ), Colombia. Oct/Dec 1982. v. 33 (4) p. 129-136. Rivera R., and Perea M. 2004. Aislamiento Y Cultivo De Protoplastos En Maracuyá. Acta Biológica Colombiana Vol. 9., Nº 2. Colombia. 35-46 p. Roca W., and Mroginski L. 1993. Cultivo de Tejidos en la Agricultura, Fundamentos y Aplicaciones. Editorial Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cali, Colombia. 969 p.

3. PROBLEMÁTICA

3

La problemática principal en el uso de esta técnica es la falta del establecimiento de un protocolo para la obtención de protoplastos y la compleja metodología que le sigue. La falta de investigación y publicaciones con respecto a aislamiento de protoplastos en plantas frutales de interés agronómico ha dificultado la utilización y perfeccionamiento de esta técnica. La regeneración de plantas a partir de protoplastos es difícil, a causa de factores como la manipulación y desinfección de explantes. Desde el punto de vista genético, la problemática está dirigida a que no se puede predecir la ploidía de los híbridos y no se puede recobrar la ploidía normal. En la etapa de propagación de los híbridos, existen problemas a causa de que éstos generalmente son estériles.

4. OBJETIVOS

4

1. Establecer un método de aislamiento de protoplastos 2. Definir un protocolo de cultivo de protoplastos 3. Determinar las enzimas apropiadas para la digestión de la pared celular

5

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 Materiales

5.1.1 Materiales de vidrio, quirúrgico y otros.

•

Pipetas Pasteur

•

Placas Petri de 60 x 15

•

Tubos de ensayo

•

Matraz de Erlenmeyer

•

Bisturí

•

Pinzas

•

Parafilm

•

Papel filtro

•

Micropipetas

•

Puntas para micropipetas

•

Mecheros

•

Material vegetal

•

Toalla de papel

5.1.2 Equipos.

6 •

Cámara de flujo laminar

•

Pesa analítica

•

Cámara de incubación

•

Autoclave

•

Centrífuga

•

pHmetro

•

Espectrofotómetro

•

Agitador magnético

•

Horno Pasteur

5.1.3 Reactivos.

•

Medio de cultivo Kao & Michayluk

•

Medio de cultivo Murashige & Skoog

•

Sucrosa

•

Celulasa y Pectinasa

•

Manitol

•

Alcohol 70%

•

Hipoclorito de sodio %

•

Agua destilada estéril

5.1.4 Fuentes para la obtención de protoplastos.

7

Se pueden obtener protoplastos a partir de cualquier órgano o tejido de una planta, principalmente se usa el mesófilo foliar, tejidos cultivados in vitro como células en suspensión, callos, y ápices de plantas generadas in vitro. Preferentemente, es recomendable usar hojas abiertas de plantas jóvenes o brotes nuevos (4 a 6 semanas de edad.), de cultivos in vitro, ya que, en células jóvenes es posible manejar fácilmente la inducción y el mantenimiento de la actividad mitótica que en las células altamente especializadas. Los protoplastos que proceden de hojas y cotiledones jóvenes, presentan cloroplastos grandes con distribución uniforme en el citoplasma, mientras que el empleo de tejido foliar mayor de siete semanas y cotiledones senescentes, produce menor cantidad de protoplastos, con cloroplastos que se condensan en algunos sitios del citoplasma y con viabilidad menor al 70%. El uso de tejido foliar requiere condiciones controladas para liberar protoplastos de buena calidad, tales como la optimización de luz, temperatura, fertilidad del suelo y humedad. La luz utilizada debe ser de 10000 a 30000 lux y el fotoperiodo de 18 a 16h.

5.1.5 Aislamiento de Protoplastos

8

Actualmente, el aislamiento de protoplastos se realiza gracias a un método enzimático, el cual consiste en incubar células en una mezcla de enzimas que degraden la pared celular. Los principales factores a considerar son: los tipos de enzimas que se usarán, la composición del medio en que ellas actuarán y el material de origen de los protoplastos.

5.1.6 Enzimas para el aislamiento de protoplastos

Para aislar protoplastos es necesario usar mezclas de enzimas, en lugar de usarlas individualmente. En la investigación realizada por Bracho M. et al (2008) se pudo comprobar que la combinación de celulasa 1% + pectinasa 0,5% fue la que proporcionó una adecuada digestión de la pared celular y por otra parte, la combinación de estas enzimas es aplicable a otras especies de plantas (Pan Z. G. et al, 2006). El medio de incubación para aislar protoplastos consta de enzimas disueltas en una solución que contenga sales (como CaCl2, KH2PO4, MGCl2), un medio de cultivo, un amortiguador y un estabilizador o regulador osmótico. También, el calcio y el fosfato son esenciales para conservar la viabilidad de los protoplastos. A menudo el amortiguador corresponde a fosfato o MES [ácido 2(N-morfolino)etanosulfónico] a una concentración de 3mM. Los estabilizadores osmóticos más comunes son el manitol, sorbitol, glucosa y sacarosa. El potencial osmótico debe ser ajustado para que las células sean levemente plasmolizadas durante la digestión celular. El pH optimo acido fluctúa entre 5 y 6.

5.2 Métodos

9

5.2.1 Purificación de enzimas

Para optimizar la viabilidad de los protoplastos se deben purificar las enzimas de las sales e impurezas (Roca W. et al 1993), de la siguiente manera: 1) Disolver 5g de preparación enzimática en 20 ml de amortiguador fosfato

1 mM (pH 6) 2) Esperar una hora, centrifugar solución a 12000 g por 10 minutos, para

remover impurezas insolubles. 3) Llevar el sobrenadante a una columna de Sephadex G 50 (4 x 20 cm) y

recoja fracciones de elusión 20 x 10 ml. Se deja reposar durante 280 minutos, para posteriormente, realizar pruebas para medir la actividad enzimática y concentración proteíca. Reunir las fracciones que contienen proteína y almacénarlas a 4 º C

5.2.2 Desinfección del explante

10

Para evitar contaminaciones y oxidaciones en el material vegetal, es necesario, previo al aislamiento del mesófilo foliar, realizar la desinfección (Roca W. et al 1993), siguiendo las instrucciones: 1) Una vez pesadas las hojas, se cortan en cuadros pequeños para aumentar

la superficie de contacto con la solución enzimática (Andreu P. et al 2008). 2) Se sumerge el tejido en una solución de etanol al 70% por 30 segundos,

transferir luego a una solución de 2% de NaClO (con una gota de Tween20 por cada 20 ml) durante 20 minutos. 3) Lavar hojas 3 veces con agua destilada estéril se recomienda que el

volumen de esta sea 10 o 20 veces mayor al explante utilizado (Mroginski y Roca, 1991) 4) Según exitosos resultados obtenidos por Rivera et al (2004), para

disminuir el choque osmótico en la digestión de la pared celular, se utilizó, una concentración del 13% manitol. El potencial osmótico debe ser ajustado para que las células sean levemente plasmolizadas durante la digestión celular. 5) El pH optimo acido fluctúa entre 5 y 6.

5.2.3 Aislamiento de protoplastos del mesófilo

11

Se debe realizar bajo una cámara de flujo laminar de la siguiente manera: 1) Remover la epidermis inferior desprendiéndola

con pinzas finas.

Algunas veces los protoplastos resultan más estables si el tejido se deja durante 1 a 2 horas en el regulador osmótico para lograr equilibrio antes del tratamiento enzimático. 2) Transferir secciones de hoja a placa petri de 15x100 mm, que contenga

10 ml de una solucion de mezcla enzima E3 y de medio A2 para el cultivo de protoplastos en una proporcion 1:1. 3) Incubar partes foliares en mezcla de enzimas durante 4 a 12 horas en

oscuridad, a 22-25 ºC. agitando suavemente cada hora. Observar la liberación de protoplastos en un microscopio invertido.

Cuadro 1. Mezcla enzimática (de 100ml) para el aislamiento de protoplastos Mezcla enzimática (de 100 ml) para el aislamiento de protoplastos Cantidad (g) según tipo de Enzimas mezcla E3 Onozuka R 10 3 Driselasa Hemicelulasa 1 Pectinasa Pectoliasa Y 23 0.3

12

Cuadro 2. Soluciones (de 100 ml) para el aislamiento de protoplastos Soluciones (de 100 ml) para el aislamiento de protoplastos Compuestos

Cantidades según de solución (mg) A2

CaCl2 (mg

100

NaH2PO4 (mg)

10

Sorbitol (mg) Manitol (mg)

7300

Tampón (buffer MES, mg)

60

PH

5,8

5.2.4 Lavado de protoplastos

13

Para el lavado de protoplastos de procede de la siguiente manera: 1)

Con pipeta Pasteur, remover de la placa la suspensión de protoplastos y pasarla por un tamiz de nylon con un diámetro de poro (30-100 mm) que permita el paso de los protoplastos y retenga los restos de tejido y grupos de células no digeridas (Echenique V. et al 2004).

2)

Transfiera la solución tamizada a un tubo de ensayo y centrifugar a 100g durante 3 minutos.

3)

Remueva el sobrenadante y vuelva a suspender los protoplastos en 9 ml de solución A4. Añadir lentamente 1 ml de solución A3, colocándola en capas sobre la suspensión de protoplastos en la solución A4. Centrifugue a 100g durante 5 minutos.

4)

Remover los protoplastos de la interfase de las soluciones A3/A4 con una pipeta Pasteur, suspéndalos de nuevo en 10 ml de medio, y centrifugue a 100g durante 3 minutos. Con la centrifugación, los protoplastos se sedimentan ya que el potencial osmótico es regulado

con

manitol

y

diferentes

sales.

La flotación, en el procedimiento de lavado da como resultado una población pura de protoplasto de mesófilos viables e intactos. 5)

Remover el sobrenadante, vuelva a suspender los protoplastos en el medio de Cultivo, y cultive según se describe más adelante.

Cuadro 3. Soluciones (de 100 ml) para el lavado de protoplastos

Soluciones (de 100 ml) para el lavado de protoplastos Compuesto Cantidades (mg) según tipo de solución A3 A4 A5 CaCl2 (mg) 50 50 50

14

KH2PO4 Sacarosa (mg) Manitol (mg) Percoll (%) pH

10 7280 5,6

10 13,68 5,6

10 7280 30 5,6

5.2.5 Cultivo de protoplastos

Para el cultivo de protoplastos, al igual que para su aislamiento, todas las operaciones se deben hacer asépticamente, sea que se trabaje con medios líquidos ó medios sólidos.

5.2.5.1 Cultivo en medios sólidos. El medio sólido se usa para el cultivo de protoplastos aislados cuando se desea obtener de ellos clones celulares individuales (Nagata et al., 1971). El medio sólido contiene los mismos ingredientes que el medio líquido, pero esta complementado con 0.6% de agar ó 0.4% de agarosa; la agarosa se considera superior para solidificar el medio de cultivo de protoplastos. Para el cultivo de protoplastos en un medio solido se procede de la siguiente manera:

15 1) Suspenda en un medio líquido los protoplastos purificados; mezcle esta

suspensión con un volumen igual de un medio de agar derretido. Este medio debe contener 0.6% de agar 0.4% de agarosa y conservar a 40ºC hasta su utilización. 2) Vierta la mezcla en placas Petri (60x15 mm ó 100 x 15 mm), formando

una capa delgada que contenga de 3 a 10 ml del medio. 3) Selle las placas Petri con Parafilm e incube a unos 25°C en condiciones

de oscuridad de 5 a 7 días. El cultivo se realiza para la recuperación de la pared y la promoción de las primeras divisiones celulares de las células individuales obtenidas de los protoplastos. En esta fase se realizan los tratamientos y la selección del material frente a diversos agentes. La cuarta fase es el cultivo de los microcallos obtenidos tras la división celular, se cambia en ella la densidad poblacional, la composición del medio de cultivo, que se hace menos exigente y la incubación se hace con luz. La quinta fase es la regeneración de plántulas a partir del tejido de callo, mediante modificaciones de la composición hormonal-mineral del medio de cultivo. La sexta fase es el transplante y aclimatación de las plantas obtenidas en invernadero.

16

6. DISCUSIÓN

El protocolo anteriormente mencionado se obtuvo del libro escrito por Roca y Mroginski en el año 1993 ya que otros documentos científicos hacen alusión a este libro como referencia por su eficiencia, claridad y detalle para el aislamiento de protoplastos. Cabe destacar que además se buscó información con resultados exitosos aplicados a algunos de los pasos para aislar protoplastos de forma complementaria y anexa al protocolo establecido mediante el libro de Roca y Mronginski. En comparación con otros protocolos, Nuestro protocolo posee ciertas ventajas que serán mencionadas a continuación: •

El uso de una mezcla enzimas para degradar la pared vegetal, ya que este método permite aislar un gran número de protoplasto. El tratamiento con enzimas para degradar la pared celular implica la desdiferenciación y la

17

reorientación del proceso morfogénico, por eso se recomienda el uso de un buen estabilizador osmótico. Encontrar una combinación adecuada ha sido determinante, bien por ser capaz de digerir los variados materiales específicos de la pared celular, bien porque las concentraciones de las diferentes enzimas guarden un equilibrio que las haga funcionales, o bien por tener suficiente actividad sin llegar a tener un efecto tóxico. •

Se utilizó como estabilizador osmótico manitol al 13% en la fase de aislamiento, esta concentración es muy eficiente para disminuir el choque osmótico generado por la digestión de la pared celular.

•

El explante utilizado fueron hojas primarias ya que permitió obtener gran cantidad de protoplastos viables y contribuyó definitivamente a la proliferación celular.

•

Mesófilo joven como fuente de obtención de protoplastos, se considera adecuado para extraer protoplastos porque tienen mayor capacidad para tolerar los tratamientos traumáticos y mantener su totipotencia.

En algunos artículos científicos se observaron ciertos factores de riesgo: •

Si se utilizaran células en suspensión para el cultivo de protoplasto, el rendimiento y la obtención de estos disminuiría hasta un 40% , ya que en suspensiones celulares son heterogéneas y a menudo están compuestas de agregados de distintos tamaños y de células libres, no todas están en condiciones optimas para la liberación de protoplastos, lo que aumenta el riesgo de que al menos un 20% de los protoplastos obtenidos no sean viables.

•

Existe poco material para realizar un protocolo adecuado para especies frutales con alto valor agronómico, lo que impide conocer en su totalidad cual es el mejor explante para obtener una gran cantidad de protoplasto, por lo que se corre un riesgo elevado de que las células no sean viables, como dicen el cultivo de protoplasto es más un arte que una técnica (Eriksson, 1985).

18

En los protocolos analizados, incluyendo el de Roca se llegó a una misma conclusión, la cual es: •

La incubación en oscuridad previa a la acción enzimática aumenta la obtención de protoplastos hasta un 100%, debido a que los cambios producidos tras ese período de oscuridad pueden tener un papel importante en facilitar la digestión de la pared o en la estabilidad posterior del protoplasto, una vez aislado.