Agronomia Costarricense 20(2): 187-204. 1996

Actualizaci6n

EL CULTIVO

DE PROTOPLASTOS EN CITRICOS YSU PARA EL MEJORAMIENTO GENETICO1

POTENCIAL

VIctor M. Jimenez *

ABSTRACT Protoplast culture in citrus and its potential for genetic improvement. Techniques that involve isolation, culture and regeneration of citrus protoplasts for genetic improvement are reviewed. The species and cultivars from which viable protoplasts were obtained are listed. Also, plants regenerated through fusion experiments, cybrid formation and genetic transformation of protoplasts are described. Potential uses of these techniques and their applications are discussed, emphasizing protoplast fusion, which has evolved to a higher degree.

INTRODUCCI6N Los cftricos constituyen el principal producto frutfcola en el comercio mundial. A pesar de su alta capacidad para hibridarse en forma interespecffica e incluso intergenerica, la aplicacion efectiva de programas de mejoramiento genetico tradicional se ha visto limitada por una serie de factores biologicos propios del grupo, dentro de los cuales se incluyen una biologfa reproductiva muy compleja y perfodos de juvenilidad prolongados (Grosser y Gmitter, 1990a; Grosser, 1992). Algunas de estas limitantes pueden obviarse en gran medida mediante la utilizacion de tecnicas biotecnologicas, que involucran entre otras: el cultivo in vitro, el aislamiento, cultivo, regeneracion, fusion y transformacion de protoplastos, y la formacion de cfbridos. Estas tecnicas permiten la incorporacion de caracterfsticas geneticas que son de gran utilidad para conferir resistencia 0 tolerancia contra enfermedades, plagas y condiciones adversas (edaficas, climaticas, etc.), que afectan el rendimiento, asf como para mejorar la calidad del fruto.

II *

Recibidoparapublicaci6n ell dediciembre de 1995. Cen~ro paraInvestig.aciones enGranosy ~emillas,Universldad de Costa RIca, San Jose, Costa RIca.

La diversidad genetica que existe entre las especies de Citrus y los generos emparentados es muy grande y ha sido poco estudiada. En el Cuadro 1 se observa que la Subtribu Citrinae (Subtribu 2 de la Tribu Citreae, Subfamilia Aurantiodiae, Familia Rutaceae) a la cual pertenece Citrus, ha sido dividida en tres grupos subtribales, que contienen en total 28 generos y 125 especies (Swingle y Reece, 1967). En el presente trabajo se hace una descripcion actualizada sobre el uso del cultivo de protoplastos como metodo para el mejoramiento genetico de cftricos, con enfasis en la fusion de protoplastos, que es la metodologfa que ha tenido mayor desarrollo.

AISLAMffiNTO DE PROTOPLASTOS Y REGENERACI6N DE PLANTAS La manipulacion de protoplastos y la regeneracion de plantas a partir de ellos es una herramienta innovadora en programas de mejoramiento genetico. Estos protoplastos provienen de celulas alas cuales se les ha eliminado la pared celular, ya

seapor mediosmecanicos0 mediantedigestion enzimatica. La unica barrera entonces entre el pro-

188

AGRONOMIA

COST ARRlCENSE

Cuadro I. Generos pertenecientes a la familia Rutaceae y la subfarnilia Aqrantiodeae (Swingle y Reece, 1967). Entre parentesis se indica el nurnero de especies en el genero; y en negrita, aquellos en los que se ha tenido cierto exito al hibridarlos somaticarnente con Citrus (modificado de Grosser y Grnitter, 199Oc).

TRIBU I.

Clauseneae

Subtribu I. Subtribu2. Subtribu3.

Micromelinae Clauseninae Merrillinae

TRIBU II.

Citreae

Subtribu I.

Triphasiinae

Subtribu2.

Subtribu3.

*

Micromelum(9) Murraya (11)

Clausena(23)

Wenzelia(9) Oxanthera(4)

Triphasia (3) Luvunga(12)

Monanthocitrus Merope

Pamburus Paramignya(15)

Citrinae

Severinia (6) Burkillanthils Hesperathusa Atalantia (II)

Fortunella (4) Poncirus (2) Microcitrus (6)*

Pleiospennium(5) Limnocitrus Citropsis (11)

Eremocitrus Clymenia Citrus (16)

Balsarnocitrinae

Swinglea

Balsamocitrus

Aegle

Feronia

Afraegle (4)

Feroniella (3)

Aeglopsis

Glycosmis(35) Merrillia

Utilizado para la fonnaci6nde hfbridos.

toplasl,nacelular y el medioexternoes la membrana plasmatica(Bengocheay Dodds, 1986). Los protoplastosde cftricos puedenaislarse de varios tejidos, incluyendohojas,callos no embriogenicos,tetradasflorales (protoplastoshaploides), callos embriogenicosy cultivos embriogenicos en suspension,(Grosser y Chandler, 1987; Grossery Gmitter, 1990a),siendolos dos ultimos las fuentesmas apropiadasparaobtenerprotoplastos con capacidadembriogenica. Aislamiento de protoplastos a partir de callo Se puedeaislar protoplastosdirectamentede callos embriogenicosfriables, derivadosde nucelas u 6vulos mantenidosen un medio de cultivo desprovisto de reguladoresde crecimiento, y de callos friables no embriogenicos,obtenidosa partir de 6rganosde plantulasen medioscon altos nivelesde auxina(Grosseret al., 1988b).A partir de los primeros es posible obtenerprotoplastosembriogenicos con capacidadde regenerarplantas normales.Sin embargo,ha sido muy diffcil iniciar y mantenerestaslfneasde callo, 10que ha constituido la etapalimitante para la aplicacionen gran escala,de metodologfasque involucren el cultivo de protoplastos(Grossery Gmitter, 199Oc).Si bien la utilizaci6n de caIlo se ha relacionadocon tasas

elevadasde variacion somaclonalen varios cultivos, en cftricos los embrionesobtenidosconservan la identidadgeneticacon la plantamadrey expresanpoca variabilidad.Los mejoresresultadospara el aislamientode protoplastossebanobtenidoutilizandotejido friable con bajo contenidode aImidon. Los cultivosembriogenicosen cftricosgeneraImente requierende subcultivoscontinuos,a intervalos de 1-2 meses,por largosperfodosde tiempo(generalmentemayoresde un afio), antesde que alcancen un gradode friabilidad adecuado,asf como nivelesapropiadosde aImidon(Grosser,1994b). Kochba et al. (1972) obtuvieron callos embriogenicosde C. sinensiscv. 'Shamouti' a partir del tejido nucelar de 6vulos de frutos inmaduros cultivados in vitro. La metodologfa descrita por ellos, asf como modificaciones posteriores ban permitido incrementarel numerode lfneasnucelares de callo friable capacesde producir suspensiones celularesy protoplastoscapacesde regenerar plantas.El Cuadro2 presentauna lista de las especies y cultivaresde cftricos en los cualesse ha informadola obtenci6nde callo friable. El primer aislamiento de protoplastostotipotentesen cftricos rue realizadopor Vardi et al. (1975), utilizando como explanteel caIlo embriogenicode naranjadulce(C. sinensis)cv. 'Shamouii' obtenidopor Kochbaet al. (1972).El cultivo de

JIMENEZ: EI cultivo de protopla...tos en citricos y su potencialparael mejoramientogenetico

189

Cuadro2. Generos,especiesy cultivaresde citricos de los cualesseha obtenidocallo friable embriogenicoa partir de 6vulos cultivadosin vitro. E...pecie

Cultivar

Referencia...

C. aurantif()/ia Swing.

--

Mitra y Chatuverdi(1972;citadospor Button et al., ]974), Hidaka y Omura (1989), Ollitrault et al. (1992;citadospor Engelmannet al., 1994),Grosser(comunicaci6n personal)

C. aurantium L.

-

Vardi etal. (1982b),Galianaetal. (1993),Jimenezy Guevara(1995)

hfbrido

Grosser(comunicaci6npersonal)

-

Ollitrault et al. (1992;citadospor Engelmannet al., 1994)

C. delicio.~aTen. C.jambhiri Lush. C. limon (L.) Burm.

C.meyeriY.Tan.

'Milam' 'Volkameriana' 'Femminello Continella' 'Villafranca' 'Meyer'

Grosser(comunicaci6npersonal) Ben-Hayyimy Neumann(1983) Geraciy Tusa(1988),Gentile et al. (1993) Kochba(no publicado,citado por Vardi et al., 1982b); Nadely Spiegel-Roy(1987) Singhetal.(1992)

C. maduren.~i.~ Lour.

--

Ling et al. (1989)

C.miti.~B]anco

-'-""'-'-

Simetal. (1988)

C.paradi.~iMacf.

C. reticulata Blanco

'Duncan' 'Marsh Seedless' 'ThompsonPink' 'Cleopatra' 'Dancy' 'Murcott' 'Ponkan'

C. .~inen.~i.~ Osb.

Vardi etal. (1982b) Hidakay Omura(1989) Grosser(comunicaci6npersonal) Galianaet al. (]993), Ollitrault et al. (1992; citadospor Engelmannet al., 1994), Grosser(comunicaci6npersonal) Vardi et al. (]982b) Vardietal.(1982b) Vardietal.(1982b)

'Acosta 6' 'Bahia' 'Hamlin'

Jimenezy Guevara(1995) Kobayashietal. (1984) Gmitter y Moore (1986),Ollitrault et al. (1992; citadospor Engelmannet al., 1994), Niedz (1994) 'Navelina ISA 315' Starrantino(no publicado,citado por Lucretti et al., 1990) 'Pineapple' Galianaet al. (1993) 'Salustiana' Galianaetal (1993) 'Shamouti' Kochbaetal. (1972),Vardi etal. (1982b), Ollitrault et al. (1992;citadospor Engelmannet al., 1994) 'ShamoutiLandau' Vardi etal. (1982b) 'Succari' Grosser(comunicaci6npersonal) 'Tarocco' Gentileetal.(]993) 'Trovita' Kobayashietal.(1984) 'Ukumori' Hidakay Omura(1989) 'Valencia' Hidakay Omura(1989),Pasqualy Ando (1990), Grosser(~omunicaci6npersonal) 'WashingtonNavel' Button y Rijkenberg(1977), Kobayashiy Ohgawara(1988), Jimenezy Guevara(1995)

C. .~udachiHort.

-

Kobayashietal. (1984)

C. tankan

--

Hidakay Omura(1989)

C. un.~hiuMarc.

'Ishizuka-wa...e' 'Kanazawa-wa...e' 'Miyagawa-wa...e' 'Miyamoto-wa...e' 'Ohura-wase' 'Okitsu-wase'

Ling et al. (1990) Ling et al. (1990) Kunitakeetal.(1991) Hidakay Omura(1989) Hidakay Omura(1989) Kunitakeetal. 1991 continua...

190

AGRONOMIA COSTARRICENSE

Cuadro2. (Continuaci6n) R.,pecie

. Cultivar

'Saruwatari' 'Sugiyama' 'Tokumori-wase'

Referencia.., Hidakay Omura(1989) Hidakay Omura(1989) Kunitakeet al. (1991)

Microcitrussp.

~

Vardietal.(1986)

C. reticulatax C

'Nova'

Grosser(comunicaci6npersonal)

'Page'

Grosser(comunicaci6npersonal)

'Murcott'

Grosser(comunicaci6npersonal)

paradi.\'i

(Tangelo)

C. .\'inen.\'i.\' xC. reticulata (Tangor)

estos protoplastos condujo a la forrnacion de callo y la posterior obtenci6n de embriones somaticos. Vardi (1981) y Vardi et al. (1982b) obtuvieTon protoplastos de los cultivaTes de naranja dulce 'Shamouti Nucelar' y 'Shamouti Landau'; de las mandarinas (C. reticutata) 'Murcott', 'Dancy' y 'Ponkan'; de grapefruit (C. paradisi) 'Duncan'; de naranja agria (C. aurantium); y de limon 'Villafranca' (C. timan). A partir de los protoplastos obtenidos lograron regenerar plantulas con caracterfsticas morfol6gicas norrnales. Kobayashi et at. (1983) aislaron de manera similar protoplastos de callos nucelares de naranja dulce cv. 'Trovita'. Posteriorrnente, Kobayashi et at. (1985) cultivaron en medio Ifquido los mismos callos anteriores, y aislaron pOTprimera vez protoplastos a partir de suspensionescelulares. Vardi et at. (1986) obtuvieron plantas a partiT de protoplastos del genero Microcitrus. Esta rue la primera vez que se logr6 todo el proceso de regeneracion a partir de protoplastos hasta la formaci6n de plantulas para una variedad monoembrionica, y dentro de las Rutaceas, de un genero diferente de Citrus. Kobayashi (1987) encontro, al observar 25 plantas regeneradas a partir de protoplastos de naranja dulce, que caracteres como morfologfa foliar y floral, aceites de la hoja, patrones de isoenzimas y numero de cromosomas, no variaban entre los individuos. Observo ademas, uniforrnidad al comparar estos resultados con los obtenidos de plantulas de origen nucelar. Este y otros estudios evidencian que las plantas de Citrus derivadas de protoplastos presentan poca 0 ninguna variacion somaclonal (Kobayashi, 1987; Vardi y Galun, 1988;

Hidaka y Omura, 1989). EI aislamiento y regeneracion de protoplastos obtenidos a partir de callos de origen no nuceJar se limita a 10 logrado pOTHidaka y Kajiura (1988), quienes obtuvieron callos con capacidad embriogenica de la regi6n hipocotilar de embriones de C. sinensis cv. 'Washington Navel', C. yuko y C. reticutata cv. 'Ponkan'. Tambien Ling et at. (1989) regeneraron plantas de C. madurensis Lour. a partir de protoplastos obtenidos de callo derivado de la regi6n del hipocotilo de plantulas diferenciadasPOTcultivo de anteras. Aislamiento de protoplastos a partir de suspensiones celulares A partir de callos friables embriogenicos se puede iniciar facilmente el cultivo de suspensiones celulares, ya que la composici6n misma del callo perrnite que el tejido se disgregue facilmente en medio Ifquido en agitacion. Esto se ve favorecido si se cultivan los callos en medio de cultivo desprovisto de reguladores de crecimiento pOT tiempo prolongado, ya que en los mismos se da un proceso de habituacion 0 independencia de la adici6n extema de reguladores de crecimiento (Kochba y Spiegel-Roy, 1973). Se ha obtenido mayor cantidad de protoplastos intactos a partir de suspensiones celulares que de callos cultivados en medio solido (Kobayashi et at., 1985; Citrus Research and Education Center, Universidad de Florida, Grosser, 1994, (comunicaci6n personal,), pOT10 curil a veces se han preferido las primeras como material de origen (Sim et at., 1988; Kunitake et at., 1991; Niedz, 1993).

JIMENEZ:EI cultivodeprotopla.~tos encftricosy supotencial parael mejoramiento genetico

Aislamiento de protoplastos a partir de hojas La mejor fuentede materialfoliar para aislar protoplastosha sido a partir de las plantulasnucelaresdesarrolladas in vitro, ya queseeliminalanecesidad de un procesode desinfeccionantesdel aislamiento.Tambiensepuedeutilizar hojasde plantulas en camarasde crecimiento,invemadero0 en el campo, peroes necesarioefectuaruna desinfeccionprevia. Estosprotoplastospuedenconteneren algunos casasmetabolitossecundarios que puedeninterferir con el cultivo eficientede los mismosy de los hl'bridossomaticosen eventosde fusion.A diferenciade los protoplastosobtenidosde calla friable y suspensionescelularesembriogenicos,los protoplastosde hoja no soncapacesde regeneraren mediade cultivo desprovistodereguladores decrecimiento.

191

Aislamiento de protoplastos a partir de yemasflorales Se ha logrado aislar protoplastoshaploides de las tetradasque se encuentranen las yemasflorales de grapefruit (C. paradisi) y 'pamela' (C. grandis),ya que susyemassonde mayortamafioy facilesde desinfectar(Grossery Gmitter, 1990a). Regeneracionde plantas a partir de protoplastos Seha logradola regeneracionde plantaspar medio de embriogenesissomaticaa partir de protoplastosen varios genotipos de Citrus (Cuadro 3). La naranjadulce es la especieen la cual se ha observadomejor respuesta.

Cuadro3. Generos,especiesy cultivaresde cftricosde los cualessehanregeneradoplantula.~ a partir de protopla.~tos embriogenicos. E.~pecie

Cultivar

Referencia.~

C. aurantiumL.

-

Vardi etai. (1982b),Hidakay Omura(1989)

C.jambhiri Lush.

--

Vardi et at. (1990),Li (1991,cita