Regulación en Eucariotas

Algunos niveles de regulación de la expresión génica • Expresión o no expresión de un gen • Nivel de expresión • Splicing alternativo

• Estabilidad del ARN • Modificaciones a proteínas

Niveles generales de regulación • Transcripcional

• Posttranscripcional

Dolly, el primer mamífero en ser clonado

5 July 1996 – 14 February 2003

Diferencias con procariotas • Genomas más complejos, más elementos involucrados en regulación • ADN eucariótico está empacado en nucleosomas. La estructura de cromatina es dinámica. • Estado “basal” de los genes en procariotas es “encendido”, en eucariotas es “apagado”. Usualmente la estructura de la cromatina se debe cambiar para poder activar la transcripción.

Regulación transcripcional en procariotas vs eucariotas

Diferencias con procariotas • Procariotas: una sola ARN polimerasa. Eucariotas: 3 • Splicing en eucariotas • ARN polimerasa II (la que transcribe ARNm) es mucho más grande y compleja que la de procariotas • Regulación en eucariotas es más fina y tiene muchos más elementos

Regulación en eucariotas debe : • Asegurar que la expresión de la mayoría de los genes del genoma esté apagada en un momento dado, mientras que activa un subconjunto de los genes • Generar miles de patrones de expresión génica

Regulación en eucariotas: • Dos grupos importantes de proteínas: • Complejo de ARN polimerasa II y factores generales de transcripción (interactúan con elementos proximales del promotor)

• Factores de transcripción que se unen a “enhancers” (amplificadores, potenciadores o activadores de la expresión génica)

Elementos proximales al promotor

Unión ARNpol II al promotor no es suficiente para transcripción FGT deben unirse a elementos proximales

Importancia de elementos proximales en la transcripción

Factores generales de transcripción afectan la expresión de muchos genes ARN polimerasa II

y Factores generales de transcripción

Enhancers, más específicos

ARN pol II

Unidos a elementos proximales

Procesamiento cotranscripcional de ARN

Fosforilación de CTD (dominio de extremo carboxilo) de ARNpol II es reversible y crea sitios de unión para enzimas y factores requeridos para: -Agregar cap (guanina modificada) -Splicing -Cortar y poliadenilar el ARN (para estabilidad)

Enhancer y promotor

• Al promotor se unen FT que afectan transcripción en muchos genes • A los enhancers se unen FT que regulan la expresión de un número menor de genes • A menudo un enhancer actúa en sólo uno o unos pocos tipos celulares en un eucariota multicelular

Proteínas reguladoras • Tienen al menos uno de estos dominios funcionales: 1. Reconoce la secuencia reguladora en el ADN 2. Interactúa con una o más proteínas del aparato transcripcional (ARNpol o una proteína asociada) 3. Interactúa con proteínas unidas a secuencias reguladoras cercanas en el ADN, para que puedan cooperar en la regulación de la transcripción 4. Influye directa o indirectamente sobre la condensación de cromatina 5. Actúa como sensor de condiciones fisiológicas en la célula

Organismo modelo: Saccharomyces cerevisiae

Metabolismo de galactosa en levadura • También altamente regulado • Varios genes codifican para enzimas que catalizan pasos de la vía bioquímica que convierte a galactosa en glucosa • Como en bacterias, la expresión de los genes depende de la presencia de galactosa en el medio

Otros genes involucrados • GAL3, GAL4 y GAL80 codifican para proteínas que regulan la expresión de los genes que codifican para las enzimas de la vía bioquímica • El principal regulador es la proteína Gal4 (proteína de unión al ADN)

Regulación por Gal4 • En presencia de galactosa, los niveles de expresión de los genes GAL1, GAL2, GAL7 y GAL10 son 1000x más altos que en su ausencia • Pero en mutantes GAL4, todos permanecen inactivos • Cada uno de estos genes tiene dos o más sitios de unión a Gal 4 en dirección 5’ del promotor (corriente arriba). • Dímeros de Gal4 se unen a secuencias específicas de ADN de 17pb corriente arriba de los genes regulados

Unión de Gal4 a elementos UAS (upstream activation sequences)

Si hay deleción de sitios de unión los genes no se expresan, aún en presencia de galactosa

Estos UAS son un tipo de “enhancer”, típicos de eucariotas, a distancia considerable del promotor

Dos dominios de Gal4, unión al ADN y activación de transcripción

Doble dominio es común también en otros factores de transcripción

lacZ: gen reportero Lex A: gen represor de E. coli (para ver efecto con otro gen)

Regulación de actividad de Gal4 •En mutantes de GAL80 todos los genes GAL activos aún cuando no hay galactosa •Sugiere que Gal80 inhibe genes GAL

•Mutantes GAL3: genes GAL inactivos aún con galactosa presente •Sugiere que Gal3 favorece expresión de genes GAL

Regulación de actividad de Gal4 Gal80 se expresa de manera continua e inhibe actividad de Gal4 Gal80 siempre reprime transcripción de genes GAL Papel de Gal3 es liberar a los genes GAL de represión cuando hay galactosa

Gal3+galactosa-cambio de conformación que hace que se una a Gal80 Gal80 libera a Gal4

¿Diferencia con regulación en procariotas?

Gal4 funciona en la mayoría de los eucariotas •Gal4 funciona como activador de transcripción en insectos, células humanas y otros eucariotas •Sugiere que la maquinaria bioquímica y los mecanismos de activación de genes son comunes a muchos eucariotas

•Gal4 y sus UAS (upstream activation sequence) han sido elementos populares en análisis genético para la manipulación de la expresión génica

Proteínas activadoras de transcripción reclutan a la maquinaria de transcripción

Activadores reclutan a la ARNpol II a los promotores de dos maneras: -interactuando con subunidades de complejos proteicos con función en iniciación de transcripción -reclutando proteínas que modifican la estructura de la cromatina

Cromatina dinámica •Segundo mecanismo de regulación: modifica estructura de cromatina alrededor de regiones reguladoras •ADN de bacterias está más accesible. Genes “encendidos” a menos de que haya represión •En eucariotas está organizado en cromatina. Genes inaccesibles y “apagados” a menos de que sean activados

Estructura de la cromatina

Estructura de la cromatina

2 de: H2A H2B H3 H4

Nucleosoma es AND alrededor de 8 histonas

Estructura de la Cromatina •Se hereda de una generación celular a otra: herencia epigenética

Mecanismo de regulación: Remodelación de cromatina

Hace accesibles regiones reguladoras

Modificaciones de histonas •Importantes en remodelación de cromatina •Ocurre en residuos de lisina y arginina en los extremos amino-terminales expuestos de las histonas (colas de las histonas)

Acetilación de histonas •Una de las modificaciones de histonas más estudiadas

La reacción es reversible 44 residuos de lisina que pueden aceptar grupos acetilo (muchas posibilidades de regulación)

Código de histonas

Relación acetilación-actividad •En general: •Genes activos: nucleosomas hiperacetilados •Genes inactivos: nucleosomas hipoacetilados •Enzima que agrega grupos acetilo: HAT

Modificación de colas de histonas causa remodelación de cromatina

Agregar y elminar grupos acetilo y metilo a colas de histonas hace que los nucleosomas se separen, exponiendo ADN a la actividad de proteínas reguladoras de transcripción

Desacetilación de histonas •HDACs desacetilan

Complejo que contiene una HDAC

En presencia de glucosa el gen GAL1 apagado

Metilación de colas de histonas

Herencia de modificaciones de histonas y estructura de cromatina • En replicación, el replisoma: •Copia ADN •Desensambla los nucleosomas en las hebras parentales y los vuelve a ensamblar en las hembras parentales y nuevas

Metilación de ADN • Se agregan grupos metilo a residuos específicos de citosina: los que están en dinucleótidos CG. Se da metilación simétrica. C*G G C*

Metilación de ADN en mamíferos • 70-80% de todos dinucleótidos CG están metilados •La mayoría de los no-metilados están en grupos cerca de promotores. Se les llama islas CpG (p=enlace fosfodiéster)

• ¿Se asocia la metilación de C con regiones activas o inactivas del genoma?

Herencia metilación ADN • Se hereda establemente de una generación celular a la siguiente

Después de replicación hay hebras hemimetiladas, ADN metiltransferasa las metila

Activación de genes transitoriamente FT Coactivador: intermediario entre FT y polimerasa

Enhanceosoma: complejo proteico que actúa de forma sinérgica para activar transcripción Forma de hacer transcripción regulable: varios sitios de unión a ADN en un enhancer. Depende de cuáles y qué tantos FT se pegan el nivel de transcripción varía

Aisladores: impiden que enhancers afecten genes que no les corresponden

Heterocromatina vs eucromatina • Heterocromatina: altamente condensada, pocos genes •H. constitutiva: siempre condensada •H. facultativa: puede expresarse a veces •Eucromatina: menos condensada, más genes

Improntas La mayoría de los genes se expresan equitativamente de los cromosomas materno y paterno Improntas genómicas son el marcado epigenético de un gen basado en su padre de origen y resulta en expresión monoalélica

Improntas No se apega a reglas de genética clásica porque el complemento de genes improntados maternos y paternos no es equivalente El mecanismo parece involucrar metilación específica dependiente del progenitor en regiones CpG, que se borra en la formación de gametos

Si está activo o no depende de cuál progenitor se originó, no de si estaba activo en el progenitor

Improntas en enfermedades genéticas Varias enfermedades asociadas con defectos en imprinting Resultado de: Deleciones (que resultan en falta de expresión) Pérdida de impronta por mutación (que resulta en expresión dialélica en lugar de monoalélica)

Disomía uniparental (que resulta en expresión doble o no expresión del todo)

Mecanismos que generan UPD

Síndrome de Prader-Willi

•Normal: se expresa copia paterna •70% tiene deleción de 15q12 derivada del padre •25% tiene matUPD15

Características clínicas:Síndrome de Prader-Willi

1-12 000/15 000 Hiperfagia, obesidad, baja estatura, problemas de aprendizaje Recién nacidos con debilidad muscular son evaluados genéticamente Detección temprana: se prescribe hormona de crecimiento, también disminuye apetito 7 genes (o algunos de los 7) han sufrido deleción o no se expresan en el cromosoma paterno

Síndrome de Angelman

•Normal: se expresa copia materna •70% tiene deleción de 15q12 derivada de la madre •2% tiene patUPD15

Características clínicas:Síndrome de Síndrome de Angelman Retraso en desarrollo, disminución en intelecto, inestables al caminar, problemas al dormir, epilepsia, felices Boca ancha, dientes espaciados, barbilla prominente Genes en cromosoma 15 sufren deleción o no se expresan en el cromosoma materno

15q11-q13

Caracterizado por sobrecrecimiento somático, anomalías congénitas y predisposición a cáncer infantil Gigantismo, macroglosia, anomalías de orejas y otros, onfalocele (protrusión de órganos abdominales por el ombligo) Muchos con tamaño aumentado de órganos internos, tumores embrionales como tumor de Wilms, hepatoblastoma o rabdomiosarcoma Hiperplasia e hipertrofia de islotes pancreáticos: a menudo lleva a hipoglicemia neonatal

Impronta genómica de Igf2

Patrón de herencia inusual en genes improntados

Pasos en establecimiento impronta

Ciclo de Improntas

ARN Xist (rojo) cubre una de las dos copias del cromosoma X

Individuos normales: metilación generalizada excepto en islas CpG Cáncer: hipometilación generalizada (vuelve genoma inestable) y metilación específica de algunos genes (supresores de tumores) Cambios epigenéticos preceden al tumor y se podrían utilizar como marcadores Patrón similar se observa en individuos sanos con la edad

Hipometilación/ Hipermetilación ADN en cáncer

Silenciamiento post-transcripcional

Represión de la traducción por miARN

miARN regula a gen blanco Es regulación posttranscripcional

Degradación de ARN desencadenada por siARN

A diferencia de miARN no regula otro gen sino que marca el gen que se está expresando para degradación de su ARN

Epigenética

Se define como cambios heredables que ocurren en la actividad y expresión de genes sin afectar al secuencia de ADN

Mecanismos epigenéticos • Metilación de ADN • Modificaciones a histonas • ARNs no codificantes

• Remodelación de cromatina