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UNIVERSIDAD DE COLIMA
EFECTO DEL INMUNOMODULADOR T-ACTIVINA SOBRE LA RESPUESTA INMUNE CELULAR DE RATONES INMUNOSUPRIMIDOS CON EL LINFOMA L-5178-Y
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS CON ESPECIALIDAD EN FISIOLOGÍA PRESENTA M en C. ANA GABRIELA RAMÍREZ FLORES
ASESOR: DR. ALEJANDRO MANUEL ELIZALDE LOZANO
COLIMA, COL. MARZO DE 2004
AGRADECIMIENTOS Hay mucha gente con la que me siento en deuda y quiero, de manera muy breve, agradecerles su colaboración en este trabajo. Primero quiero agradecer a las personas que participaron en la realización de este trabajo de manera directa, que estuvieron trabajando en alguna parte de este proyecto, a Héctor Barajas que participó desde el inicio en todas las etapas del trabajo, siendo no únicamente una ayuda importante sino también un apoyo incondicional. A Adriana Ramírez León que además de recibir su ayuda técnica me reiteró su amistad en los momentos críticos. A Ana Margarita Rodríguez que se entregó al trabajo como una muestra de lealtad y responsabilidad con las que todavía me siento en deuda. A Reyna Aydé Herrera que siempre tuvo la disposición de aprender ayudando cuando hacía falta una mano más. Al Dr. Adrián Daneri y a la M en C. Lily del Toro que me asesoraron pacientemente con la parte técnica de una de las fases experimentales. A Pedro Sánchez por su asesoría en la interpretación de los resultados y por su amistad. Gracias a todos por su ayuda. También le agradezco al Dr. Alejandro M. Elizalde el darme nuevamente la oportunidad de trabajar a su lado, respaldando esta idea que sin ser propia la adoptó para permitirme desarrollarla y de la cual tuvimos que aprender y equivocarnos juntos. A la Dra. Iris Estrada que no dudó en brindarme su apoyo y complicidad para la terminación de este trabajo. Un agradecimiento muy especial a la Peque con quien quedaré en deuda para siempre por su apoyo, cariño y ayuda en los momentos en que debió ser ella quien los recibiera.
A mis papás Lidia y José Luis, a mis hermanos Jo y Robe, a mi cuñada Betty y a mis sobrinos Ximena y Diego por apoyarme durante tantos años en esto que parecía interminable. A Tania, Gela y Myrian que saben lo que hemos pasado para que esto pudiera ser posible. Este trabajo se realizó gracias al apoyo económico del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) y del Fondo Juan García Ramos de la Universidad de Colima.
DEDICATORIA Quiero dedicarle este trabajo a Fernando Alfaro Bustamante, quien como maestro me enseñó que la investigación puede ser además de interesante, divertida. Que nunca dudó en apoyarme cuando todo parecía ir en contra. Que estoy segura que se hubiera sentido orgulloso de ver terminado este proyecto que iniciamos juntos como parte de un proyecto todavía mayor que no logramos ver terminado. Gracias Falfarito por todo esto y por tu amistad durante años.
INDICE Tablas y figuras …………………………………………………………………………………….….…
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Resumen en español…………………………………………………………………………….………
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Resumen en inglés (abstract)………………………………………………………………….…….
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Introducción…………………………………………………………………………………………….….
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Inmunología tumoral……………………………………………………………………….….
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Linfocitos T…………………………………………………………………………………….….
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Citocinas……………………………………………………………………………………….…..
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Inmunoterapia…………………………………………………………………………….…....
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Hormonas tímicas…………………………………………………………………………….…
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T-activina………………………………………………………………………………………….
27
Hormonas tímicas y cáncer…………………………………………………………….…...
31
T-activina y cáncer………………………………………………………………………….….
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Justificación………………………………………………………………………………………….……..
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Hipótesis……………………………………………………………………………………………………..
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Objetivo general…………………………………………………………………………………………..
36
Objetivos particulares……………………………………………………………………………….….
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Material y métodos……………………………………………………………………………………...
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Animales…………………………………………………………………………………………..
37
Conservación del linfoma…………………………………………………………………...
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Reacción de hipersensibilidad por contacto al dinitrofluorobenceno (DNFB) ………………………………………………………....
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Obtención de las células mononucleares…………………………………………..…
41
Linfoproliferación……………………………………………………………………….……...
41
Obtención de los sobrenadantes de cultivo para la cuantificación de IFN-γ, IL-2 e IL-4………………………………………...… 43 Análisis cuantitativo de las citocinas por la técnica de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)……………………..... 43 Identificación de células CD4+ y CD8+ por citometría de flujo……………....… 43 Tiempo de vida ………………………………………………………………………….……… 44
Resultados ………………………………………………………………………………………….………
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Caracterización del modelo experimental …………………………………………….
47
Elección de la dosis de T-activina………………………………………………………..
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Efecto de la T-activina…………………………………………………………………….....
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Efecto de la T-activina sobre el peso corporal…………………………....
59
Efecto de la T-activina sobre la prueba de hipersensibilidad por contacto al DNFB……………………………………….
61
Efecto de la T-activina sobre la proliferación de linfocitos…………....
63
Efecto de la T-activina sobre la producción y liberación de citocinas …………………………………………….……….……. 65 Efecto de la T-activina sobre la proporción de células T CD8+/ CD4+ ………………………………………………............. 69 Efecto de la T-activina sobre el tiempo de vida…………………………...
71
Discusión…………………………………………………………………………………………………...
72
Conclusiones………………………………………………………………………………………….…...
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Perspectivas…………………………………………………………………………………………….....
85
Apéndice ………………………………………………………………………………………………..…
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Interleucina 2 (IL-2)…………………………………………………………………………..
87
Interferón gamma (IFN-γ)………………………………………………………….……….
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Interleucina 4 (IL-4)………………………………………………………………..……..….
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Bibliografía………………………………………………………………………………………………....
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TABLAS Y FIGURAS TABLAS Tabla 1. Efecto del tratamiento con T-activina a diferentes dosis y con diferentes esquemas de tratamiento sobre la prueba de hipersensibilidad por contacto al DNFB y el tiempo de vida. Tabla 2. Efecto del tratamiento con T-activina sobre el volumen de líquido ascítico y el número de células tumorales. Tabla 3. Efecto del tratamiento con T-activina sobre la proporción de células T CD8+/CD4+. FIGURAS Figura 1. Respuesta inmune antitumoral. Figura 2. Modelo de la selección positiva y negativa de las células T en el timo. Figura 3. Respuesta inmune antitumoral mediada por linfocitos T. Figura 4. Vías de muerte celular inducidas por LTc. Figura 5. Funciones de las células Th1. Figura 6. Funciones de las células Th2. Figura 7. Balance funcional entre Th1 y Th2. Figura 8. Organización del timo. Figura 9. Prueba de hipersensibilidad por contacto al DNFB. Figura 10. Activación y proliferación de linfocitos T. Figura 11. Pruebas realizadas in vivo. Figura 12. Pruebas realizadas in vitro. Figura 13. Curso temporal del incremento en el peso corporal de los ratones portadores del linfoma L-5178-Y. Figura 14. Curso temporal del efecto del linfoma L-5178-Y sobre la prueba de hipersensibilidad por contacto al DNFB. Figura 15. Curva dosis-respuesta a ConA. Figura 16. Curso temporal del efecto del linfoma L-5178-Y sobre la proliferación de linfocitos T esplénicos estimulados con ConA. 1
Figura 17. Efecto del linfoma L-5178-Y sobre la probabilidad de sobrevivencia. Figura
18.
Curva
Dosis-Respuesta
a
la
T-activina
sobre
la
prueba
de
hipersensibilidad por contacto al DNFB. Figura 19. Efecto de la T-activina a diferentes concentraciones sobre la probabilidad de sobrevivencia y el tiempo de vida de los ratones portadores del linfoma L-5178-Y. Figura 20. Efecto del tratamiento con T-activina sobre el índice de incremento en el peso corporal. Figura 21. Efecto del tratamiento con T-activina sobre la prueba in vivo de hipersensibilidad por contacto al DNFB. Figura 22. Efecto del tratamiento con T-activina sobre la proliferación in vitro de células T estimuladas con ConA. Figura 23. Efecto del tratamiento con T-activina sobre los niveles de IL-2 en sobrenadantes de cultivo. Figura 24. Efecto del tratamiento con T-activina sobre los niveles de IFN-γ en sobrenadantes de cultivo. Figura 25.
Efecto del tratamiento con T-activina sobre los niveles de IL-4 en
sobrenadantes de cultivo. Figura 26. Identificación y cuantificación de las subpoblaciones de linfocitos T, CD4+ y CD8+. Figura 27. Efecto del tratamiento con T-activina sobre la probabilidad de sobrevivencia y el tiempo de vida. Figura 28. Mecanismo de acción del IFN-γ.
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RESUMEN En este trabajo estudiamos el efecto de la T-activina sobre la respuesta inmune celular
mediada
por
células
T
en
un
modelo
de
linfoma.
Los
ratones
inmunosuprimidos con el linfoma L-5178-Y (1X107 células, i.p.) fueron tratados con T activina (10 µg/ratón) por vía subcutánea. Los datos representan media ± SEM. El tiempo de vida de los ratones con linfoma que recibieron tratamiento fue mayor que aquellos que no lo recibieron (26.33 ± 0.66 vs 18.79 ± 0.48 días). El tratamiento con T-activina produjo una reducción significativa en el índice de incremento en el peso corporal en ratones portadores de linfoma (31.52 ± 3.96 % vs 16.21 ± 1.62 %). El efecto de la T-activina sobre la respuesta inmune celular se evaluó con la prueba in vivo de hipersensibilidad por contacto al DNFB y la respuesta linfoproliferativa in vitro. La disminuida respuesta al DNFB (medida como el índice de incremento en el grosor de la oreja) observada en ratones con linfoma (25 ± 4.1 %) se revirtió totalmente con el tratamiento, comparados con ratones sanos tratados con T-activina (64.44 ± 2.88 % vs 65.47 ± 3.79 %). La disminuida respuesta proliferativa (medida como índice de estimulación) observada en ratones con linfoma (4.17 ± 1.36) fue totalmente revertida en presencia de T-activina (13.22 ± 3.24), comparada con ratones sanos tratados (20.73 ± 4.58). Las concentraciones de IL-2, IFN-γ e IL-4 se determinaron a partir de sobrenadantes de cultivo por la técnica de ELISA. No se observó recuperación de los niveles de IL-2 e IL-4 pero se observó recuperación de los niveles de IFN-γ. Los ratones portadores de linfoma que recibieron tratamiento recuperaron la relación de células T citotóxicas:cooperadoras. Estos hallazgos sugieren que la Tactivina podría ser un inmunomodulador potencial en el tratamiento de pacientes con cáncer que cursen con una supresión de la respuesta inmune celular.
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ABSTRACT We studied the effect of T-activin on the T cell mediated cellular immune response in a lymphoma model. Immunosuppressed mice with L-5178-Y lymphoma (1X107 cells, i.p.) were treated with subcutaneous T-activin (10 µg/mouse). Data show mean ± SEM. Span life of lymphoma bearing mice with treatment was greater than lymphoma bearing mice without treatment (26.33 ± 0.66 vs 18.79 ±
0.48 days). T-activin
treatment produced a significative reduction of increment index in corporal weight in lymphoma bearing mice (31.52 ± 3.96 % vs 16.21 ± 1.62 %). Effect of T-activin on cellular immune response was evaluated with contact hypersensitivity test to DNFB in vivo and lymphoproliferative response in vitro. Depressed immune response to DNFB (swelling increment index) observed in lymphoma bearing mice (25 ± 4.1 %) was totally reverted in treated mice compared with healthy treated mice (64.44 ± 2.88 % vs 65.47 ± 3.79 %). The depressed proliferative response (stimulation index) observed in lymphoma bearing mice (4.17 ± 1.36) was totally reverted in presence of T-activin (13.22 ± 3.24), compared with healthy treated mice (20.73 ± 4.58). Concentrations of IFN-γ, IL-2 and IL-4 in culture supernatants were determinate by ELISA. We did not observe a recovery in IL-2 and IL-4 levels but we observed recovery in IFN-γ levels. Lymphoma bearing mice treated with T-activin recovered citotoxic:helper T cells ratio. These findings suggest that T-activin could be a potential immunomodulator in the treatment of cancer patients with suppressed cellular immune response.
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INTRODUCCION INMUNOLOGIA TUMORAL La respuesta inmune tumoral es una red compleja formada por células y mensajeros químicos que actúan de manera colectiva para destruir o eliminar células dañadas o no propias (Greenfield, 1999) (figura 1). La capacidad del sistema inmune de discriminar entre células tumorales y tejido normal es crítica para permitir la destrucción efectiva de un tumor (Kenneth, 1998): si las células tumorales expresan moléculas que actúan como antígenos no propios para el hospedero, antígenos nuevos que surgen durante el proceso de transformación maligna, es posible que el sistema inmune sea capaz de reconocer y destruir esas células anormales (Abbas et al., 1997; Drake y Pardoll, 2002). Este y otros hechos condujeron a Burnet y Thomas a proponer y desarrollar la teoría de la vigilancia inmunológica para describir el concepto de una resistencia inmunológica natural del hospedero en contra del desarrollo del cáncer
(Barrera-Rodríguez et al., 1995; Schreiber, 1999; Drake y
Pardoll, 2002). A pesar de que esta teoría ha sido demostrada en diferentes modelos experimentales (Barrera-Rodríguez et al., 1995), en algunos modelos se ha observado ausencia de respuesta inmune tanto en cánceres espontáneos como en aquellos inducidos por carcinógenos químicos o físicos, lo cual no implica que esos tumores
sean
insensibles
a
la
destrucción
inmunológica.
Las
evidencias
experimentales y clínicas sugieren que los tumores pueden ejercer efectos locales que previenen el desarrollo de la respuesta inmune celular (Shu et al., 1997) pero que ésta usualmente falla en prevenir el desarrollo del cáncer como indica el hecho de que en sujetos inmunocompetentes pueden surgir cánceres letales (Abbas et al., 1997). Se han podido identificar algunos de los mecanismos que utilizan los tumores para evadir la vigilancia inmunológica: 1) escasa inmunogenicidad de los antígenos tumorales, 2) acelerado crecimiento tumoral que rebasa la velocidad de la respuesta inmune, 3) ausencia o enmascaramiento de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad clase I, y 4) la secreción de factores que inhiben la activación de la respuesta inmune, entre otras (Barrera-Rodríguez et al., 1995).
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Figura 1. Respuesta inmune antitumoral. En el reconocimiento y eliminación de las células tumorales participan las subpoblaciones de linfocitos T, cooperadores (CD4) y citotóxicos (CD8), linfocitos B, células asesinas naturales (NK) y macrófagos, además de factores solubles como citocinas y anticuerpos, receptores y moléculas accesorias que pueden tener efecto directo sobre la célula tumoral o producir un aumento en la respuesta inmune por medio de las interleucinas (IL). Estas interacciones permiten que se lleve a cabo una eficiente respuesta inmune en contra del tumor (Modificado de Barrera-Rodríguez et al., 1995).
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LINFOCITOS T Los linfocitos T son las células encargadas de la respuesta inmune celular específica, se originan a partir de células precursoras encontradas en el hígado fetal y en la médula ósea de los adultos, posteriormente migran hacia el timo (timocitos) donde maduran y se diferencian. Los linfocitos que finalmente emergen del timo hacia la circulación son células maduras que han adquirido competencia inmunológica (Lamberts, 1999). En la etapa final del proceso de maduración, la mayoría de los timocitos que se encuentran en la médula del timo expresan altos niveles del receptor de células T (TCR) asociado a un complejo molecular denominado CD3 (TCR/CD3). Si el TCR interactúa con la clase I o con la clase II del complejo mayor de histocompatibilidad
(MHC)
expresado
por
las
células
del
epitelio
tímico,
presumiblemente conteniendo antígenos endógenos (Picker y Siegelman, 1999), los timocitos se diferenciarán en dos grandes grupos de células T: si interaccionan con la clase I se diferenciarán como células CD4+CD8- (células cooperadoras) y si interaccionan con la clase II se diferenciarán hacia CD4-CD8+ (células citotóxicas) (figura 2). En ambos casos se generarán linfocitos T inmunocompetentes que aún no han tenido contacto con un antígeno no propio y con un amplio repertorio de receptores capaces de reconocer y responder a antígenos asociados al complejo mayor de histocompatibilidad propio (Abbas, 1997; Benoist y Mathis, 1999). Los linfocitos T recorren el cuerpo reconociendo antígenos, esto les permite activarse, proliferar y secretar citocinas, mensajeros químicos que controlan los niveles de intensidad de la respuesta inmune ya sea suprimiendo, activando o incrementando los procesos involucrados en esa respuesta (Greenfield, 1999).
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Figura 2. Modelo de la selección positiva y negativa de las células T en el timo. Un pequeño número de células precursoras bajo la cápsula externa de la corteza proliferan y generan un gran número de timocitos corticales doble positivos (CD4+CD8+). Esas células son seleccionadas dependiendo de su interacción con péptidos propios asociados al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I y clase II del epitelio cortical. Los timocitos capaces de unirse a los complejos MHC-péptido en las células epiteliales reciben una señal de protección
que les permite sobrevivir y migrar a la médula del timo (selección positiva).
Estas células dejan de expresar la molécula CD4 o la molécula CD8 e incrementan la expresión del receptor de células T, permaneciendo como CD4+CD8- o CD4-CD8+. En la médula y en el espacio médulo-cortical, las células CD4+CD8- y CD4-CD8+ son sele ccionadas por su interacción con el complejo MHC-péptido expresado en la células dendríticas, macrófagos y células epiteliales de la médula, una fuerte interacción con estas células produce la muerte de los linfocitos T por apoptosis. Las células que sobreviven a esta selección negativ a son exportadas a la periferia (Modificado de Sprent et al., 2001).
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Para que un tumor sea inmunogénico, es decir, active la respuesta inmune mediada por células T, éste necesita presentar antígenos procesados como péptidos unidos a las moléculas clase I o II del complejo mayor de histocompatibilidad, y estos antígenos deben ser reconocidos por las células T en presencia de otras señales coestimulatorias (Shu et al., 1997; Drake y Pardoll, 2002). La inmunidad mediada por linfocitos T es de importancia crítica para el rechazo de tumores tanto inducidos por virus como inducidos químicamente (Shu et al., 1997; Schreiber, 1999) y las evidencias experimentales han demostrado que sí existen antígenos específicos de las células tumorales que no se encuentran en las células normales, y que las células T sí pueden detectar esos antígenos como moléculas blanco que estimulan a clonas específicas de células T (Schreiber, 1999). La respuesta inmune antitumoral mediada por linfocitos T es un proceso complejo (figura 3) que involucra la activación de los linfocitos T CD8+CD4- en presencia de antígenos tumorales acoplados a una molécula de la clase I del MHC, la cual está presente en prácticamente todas las células del organismo (Abbas et al., 1997; Lillehei et al., 1999). Este complejo antígeno-MHC se une al receptor de las células T expresado en la membrana de los linfocitos T CD8+CD4-. La activación total de los linfocitos T CD8+CD4- para diferenciarse en linfocitos T citotóxicos (LTc), capaces de lisar células tumorales, requiere además la presencia de algunas citocinas secretadas por las células T CD4+CD8- (Lillehei et al., 1999). La activación de los linfocitos T CD4+ es un proceso más complejo que la activación de los linfocitos CD8+ y contribuye a la eliminación de las células tumorales de manera indirecta. Para la activación de los linfocitos T CD4+, el antígeno tumoral debe ser presentado asociado a las moléculas del MHC clase II, esta clase está expresada únicamente en células especializadas llamadas células presentadoras de antígenos (APC) (Abbas et al., 1997). Las APCs profesionales expresan una molécula co-estimulatoria (B7) que se une a una parte del receptor de células T (CD28) durante la presentación del antígeno. La presentación de un antígeno en ausencia de la señal coestimulatoria puede originar anergia (no respuesta) de las células T, un mecanismo potencialmente responsable de la inducción de tolerancia a antígenos propios y posiblemente 9
antígenos tumorales (Abbas et al., 1997; Lillehei et al., 1999). La presentación del antígeno en presencia de la señal coestimulatoria resulta en la activación de los linfocitos T cooperadores (LTh), estas células producen una variedad de mediadores solubles que van a amplificar la respuesta inmune y van a permitir la activación total de los LTc (Abbas et al., 1997; Lillehei et al., 1999) y además van a participar en la activación de las células presentadoras de antígenos (Unanue, 2001).
Figura 3. Respuesta inmune antitumoral mediada por ilnfocitos T. En la respuesta inmune tumoral dependiente de linfocitos T participan tanto los linfocitos T CD8+ como los linfocitos T CD4+ (ver texto para detalles) (Modificado de Lillehei et al., 1999).
Una vez activados, los LTc son programados para matar células que compartan el mismo antígeno asociado a la clase I del complejo mayor de histocompatibilidad que generó la pre-activación de los linfocitos T CD8+. Los LTc requieren contacto
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directo con la célula tumoral y la lisis puede ocurrir por 2 vías (figura 4) (Lillehei et al., 1999; Seaman, 2000).
Figura 4. Vías de muerte celular inducidas por LTc. La vía secretora está señalada por las flechas verdes sólidas y la vía de Fas y su ligando (FasL) por las flechas rosas discontinuas. Ambas vías inician por el reconocimiento de un antígeno (Ag) por el receptor de células T (TCR), lo cual hace posible la unión entre las células. La vía de FasL/Fas requiere la transcripción de novo del ligando Fas y su subsecuente expresión en la membrana del LTc. La vía secretora es un proceso de exocitosis regulada por receptor resultando en la secreción de gránulos de perforina y granzimas en el sitio de contacto entre el LTc y su célula blanco. La perforina forma canales
en la membrana plasmática de la célula blanco produciendo
choque osmótico y con esto la lisis de la célula y además permite la entrada de las granzimas. Ambas vías convergen en la activación de caspasas, proteasas que activan el daño nuclear (Modificado de Henkart, 1999). 11
La primera vía es una vía secretora dependiente de calcio, donde se secretan gránulos que contienen perforina, una proteína formadora de poros. La perforina es secretada al medio extracelular y al ponerse en contacto con el calcio se polimeriza, lo cual sucede preferentemente en la bicapa lipídica de la membrana de la célula blanco. Esta proteína polimerizada actúa como canal iónico que conduce a un choque osmótico y a la lisis de la célula blanco, con un daño adicional pero no estrictamente necesario producido por la liberación de las granzimas A y B, proteinasas que entran a la célula blanco y producen por distintas vías la fragmentación del ADN. La segunda vía es una vía no secretora, involucra la activación de enzimas dentro de la célula blanco para digerir su propio ADN. Esto ocurre a través de la activación del receptor Fas/APO-1 en la superficie de la célula blanco, guiando a un proceso de fragmentación del ADN y muerte celular por el proceso de apoptosis (Lillehei et al., 1999; Seaman, 2000). Así, la inducción de la inmunidad antitumoral sistémica involucra el reconocimiento específico de antígenos asociados al tumor por parte tanto de las células CD4+CD8- como de las CD8+CD4- (Kenneth et al., 1998; Lillehei et al., 1999). Las células CD8+CD4- han recibido una mayor atención debido a 2 hechos: primero, la mayoría de los tumores de origen no hematopoyético expresan moléculas de la clase I del complejo mayor de histocompatibilidad, elemento restrictivo para ser reconocidos por los linfocitos T CD8+CD4-, y no expresan la clase II, requeridas para el reconocimiento por las células T CD4+CD8- (Pardoll y Topalian, 1998; Kenneth et al., 1998); y segundo, las células T citotóxicas son capaces de inducir la muerte de las células tumorales por el reconocimiento directo de péptidos tumorales (Pardoll y Topalian, 1998), un papel que las células T cooperadoras no pueden realizar.
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CITOCINAS Las citocinas son una gran familia de proteínas solubles secretadas principalmente por las células del sistema inmune, linfocitos o monocitos, las cuales ejercen su función mediando la interacción entre las células, regulando así las funciones celulares y tisulares (Dunlop y Campbell, 2000). En 1986, Mosmann y Coffman identificaron clonas de células T cooperadoras murinas, con distintos patrones de secreción de citocinas
denominadas Th1 (células T cooperadoras tipo 1) y Th2
(células T cooperadoras tipo 2) (Mosmann et al., 1986). Las células Th1 murinas se caracterizan por producir interferón gamma (IFN-γ) pero también producen interleucina-2 (IL-2) y factor de necrosis tumoral beta (TNFβ) que son los principales efectores de la respuesta inmune celular en contra de parásitos intracelulares (bacterias y virus principalmente) y en las respuestas de hipersensibilidad tardía (Mosmann et al., 1986) (figura 5). El IFN-γ tiene múltiples funciones, por ejemplo: promueve la fagocitosis e incrementa la actividad microbicida al inducir la producción de anticuerpos de la clase IgG2a (en ratón) los cuales actúan como opsoninas, induce la expresión de receptores FcγRI en los fagocitos e incrementa la disponibilidad de óxido nítrico, peróxido de hidrógeno y superóxido en células que participan activamente en la fagocitosis. Para garantizar que los monocitos/macrófagos y las células T lleguen al sitio de infección, el IFN-γ trabaja en concierto con el TNF-β /LT-α (factor de necrosis tumoral-β/linfotoxina-α) para inducir la expresión de moléculas de adhesión específicas para monocitos y células T sobre las células endotelialies, y promover la expresión de quimiocinas que atraen específicamente a células mononucleares. Mientras que la IL-2 es el factor de activación y crecimiento de las células Th1, además estimula la citoxicidad de LTc y de células NK y participa en la activación de células B y en la función fagocítica de los macrófagos (Gómez et al., 1998).
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Figura 5. Funciones de las células Th1. Las células T CD4+CD8- que se diferencian en Th1 secretan principalmente IFN-γ, IL-2 y linfotoxina. El IFN-γ actúa sobre linfocitos B para producir anticuerpos que opsonizan microbios para la fagocitosis y actúa sobre macrófagos para incrementar la fagocitosis y la destrucción del microbio. IL-2 es el factor de crecimiento autocrino predominante y junto con el IFN-γ pueden contribuir a la diferenciación de los linfocitos T CD8+ en LTc. La linfotoxina activa neutrófilos incrementando la actividad microbicida (Modificado de Abbas et al., 1997).
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La subpoblación Th2 murina se caracteriza por producir interleucina-4 (IL-4) pero también produce interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL10) e interleucina 13 (IL-13) y coopera en la producción de anticuerpos, especialmente IgG1 e IgE en la respuesta inmune humoral contra alergenos y helmintos principalmente (Mosmann et al., 1986; Mosmann, 1996) (figura 6). La IL-4, es el factor de crecimiento autocrino (Abehsira-Amar et al., 1992; Abbas et al., 1996), promueve la producción de anticuerpos neutralizantes (IgG) y anticuerpos que producen la degranulación de las células cebada/eosinófilos (IgE), al mismo tiempo que promueve la expresión de receptores para IgE sobre las células cebada, eosinófilos y macrófagos. La IL-5 activa eosinófilos en contra de parásitos presentes en los tejidos. La IL-6 es un factor de diferenciación que induce la maduración final de las células B en células productoras de anticuerpos (Kishimoto et al., 1994). La IL10 suprime la inmunidad mediada por células al bloquear las respuestas de los macrófagos como la presentación de antígenos y la síntesis de IL-1, IL-6 y factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) e inhibe la síntesis de IFN-γ por las células Th1. Además participa en la respuesta inmune humoral regulando a la IgE (Cruse y Lewis, 1999). La IL-13 puede considerarse como un modulador de la respuesta de las células B y tiene actividades biológicas similares a la IL-4, estimula la proliferación de los linfocitos B y promueve la síntesis de IgE (Cruse y Lewis, 1999).
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Figura 6. Funciones de las células Th2. Las células T CD4+CD8- que se diferencian en Th2 secretan principalm ente IL-4 e IL-5. La IL-4 actúa sobre los linfocitos B para producir anticuerpos que se unen a las células cebada (como los IgE) y promueve su desarrollo. La IL5 activa eosinófilos. Las citocinas producidas por las Th2 antagonizan los efectos de activación de macrófagos producido por las citocinas liberadas por las Th1 (Modificado de Abbas et al., 1997).
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Además de estas citocinas, ambas subpoblaciones producen interleucina-3 (IL3), TNF-α y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) (Mosmann y Sad, 1996). Los distintos patrones de secreción de citocinas antes descritos corresponden a fenotipos generados durante una respuesta inmune (Mosmann y Sad, 1996) pero no existen en células T vírgenes (células que no han reconocido un antígeno). Se ha descrito un precursor común para estas 2 subpoblaciones: las células Thp. Estas representan un grupo de células que salieron recientemente del timo y que no han encontrado un antígeno o no han respondido a él, producen altos niveles de IL-2 pero bajos niveles de IL-4 e IFN-γ (Röcken et al., 1992) y que una vez que una célula Thp tiene contacto con un antígeno y responde a él, se diferencia hacia Th1 o Th2. Se ha propuesto otra subpoblación que se diferencia a partir de las Thp, previo a la diferenciación en Th1 y Th2, y que produce tanto citocinas Th1 como Th2, las Th0 (Abehsira-Amar et al., 1992; Mosmann y Sad, 1996). Todavía no se conocen con precisión los factores que determinan que una célula T se diferencie hacia Th1 o hacia Th2. Existen evidencias de que la temprana exposición a ciertas citocinas influencia el desarrollo hacia una u otra subpoblación. Las citocinas que juegan un papel predominante en la diferenciación de Th1 y Th2 son la IL-12 e IL-4, respectivamente (Seder et al., 1993; Paul y Seder, 1994; Abbas et al., 1996). Además de las citocinas, también hay evidencias de que la intensidad y duración del estímulo que recibe el receptor de células T produce vías de señalización diferentes para cada subpoblación (Noble, 2000; Fanger et al., 2000). Las citocinas producidas por Th1 y Th2 son mutuamente inhibitorias no sólo para su diferenciación sino también para su funcionamiento, estableciendo así un balance funcional entre ellas (figura 7): la producción de IL-4 además de favorecer la diferenciación de las células T hacia Th2 regulando a la baja la producción de IL-2 y de IFN-γ, evita la disminución de la secreción de la misma IL-4, factor de crecimiento autocrino de las células Th2 (Abehsira-Amar et al., 1992; Abbas et al., 1996). Mientras que el IFN-γ producido por las células Th1 inhibe la proliferación de células
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Th2, las cuales también producen su propio factor de crecimiento, la IL-2 (Abbas et al., 1996).
Figura 7. Balance funcional entre Th1 y Th2. Las citocinas producidas por Th1 y Th2 determinan sus funciones efectoras e inhibitorias produciendo un balance funcional entre ellas. Cada subpoblación controla un grupo de respuestas inmunes, producen su propio factor de crecimiento (la IL-2 para las células Th1 y la IL-4 para las células Th2) y suprimen la expansión y/o funciones efectoras de la otra subpoblación: IFN-γ producido por las células Th1 inhibe a las células Th2 y la IL-4 producida por las células Th2 inhibe a las células Th1 (Modificado de Abbas et al., 1996).
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También las células T citotóxicas pueden diferenciarse en 2 fenotipos efectores, Tc1 y Tc2, que secretan diferente patrón de citocinas similares a los de las células Th (Li et al., 1997; Cerwenka et al., 1998; Seder y Mosmann, 1999). Las células CD8+ vírgenes (que no han reconocido algún antígeno) que se encuentran en la periferia, son células precursoras que no sintetizan citocinas de manera diferencial. Después de la activación por un antígeno, las células proliferan y se diferencian, normalmente hacia Tc1. A diferencia de las Th, las Tc parecen tener una fuerte predisposición a diferenciarse a Tc1, que es apoyada por el efecto del IFN-γ o de la IL-12. La diferenciación de las células Tc2 requiere la presencia de IL-4 y normalmente también requiere un ambiente en donde se vean bloqueados los efectos del IFN-γ (Seder y Mosmann, 1999). Tanto Tc1 como Tc2 son citotóxicas, ambas usan la vía perforina-granzima para eliminar células y existen evidencias de que las Tc1 son más efectivas que las Tc2 para eliminar células por la vía mediada por el ligando Fas. Además, tanto Tc1 como Tc2 eliminan células B activadas en ausencia de perforinas (Seder y Mosmann, 1999). Las células Tc2 pueden incrementar la síntesis de anticuerpos por células B, lo que podría representar un efecto cooperador poco común para estas células (Seder y Mosmann, 1999). Tanto Tc1 como Tc2 inducen reacciones inflamatorias con cinética, infiltrado celular y extensión del edema similares. Sin embargo, la expresión de citocinas in vivo durante la reacción son muy diferentes: el IFN-γ sólo está expresado en reacciones donde participan células Tc1, mientras que IL-4 e IL-5 están presentes en reacciones por Tc2 (Li et al., 1997; Seder y Mosmann, 1999). La clasificación de las células T en tipos 1 y 2 ha sido útil debido a que un gran número de estados fisiológicos y patológicos están relacionados con las citocinas liberadas y el tipo de respuesta generada (Leonard, 1999). Es decir, las citocinas producidas durante una respuesta inmune determinará los tipos celulares que serán reclutados y la identificación de estas citocinas permite conocer qué tipo de respuesta inmune, tipo 1 o tipo 2, está prevaleciendo.
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Una característica de los pacientes con cáncer que refleja el estado de su sistema inmune es el desbalance en las concentraciones de diferentes citocinas. Niveles elevados o disminuidos de distintas citocinas han sido descritos en sangre, líquido ascítico, líquido pleural y orina de pacientes con cáncer (Dunlop y Campbell, 2000). Los efectos de altos niveles sostenidos de distintas citocinas han sido estudiados
utilizando células tumorales transfectadas para producir grandes
cantidades de cierta citocina (Schreiber, 1999). Algunas citocinas como el factor estimulante de colonias de granulocitos, la IL-2 y la IL-4, cuando son secretadas en cantidades suficientemente grandes por las células tumorales transfectadas pueden producir una significativa inhibición de su crecimiento, aún en ausencia de células T (Schreiber, 1999), lo que indica que en gran medida la inmunología antitumoral depende de las citocinas producidas. Otras citocinas como la IL-1, IL-7 y el IFN-γ inhiben el crecimiento tumoral pero esta inhibición es dependiente de la presencia de células T (Schreiber, 1999). Las citocinas presentan diferentes mecanismos de acción a través de los cuales pueden producir la destrucción de un tumor, ya sea actuando directamente sobre las células tumorales (citolisis), aumentando la expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad, de moléculas de adhesión o de antígenos tumorales y reclutando, expandiendo y estimulando células efectoras contra el tumor (Barrera-Rodríguez et al., 1995). Por otro lado, no siempre la presencia de altos niveles de cierta citocina es favorable para un paciente con cáncer, puesto que las citocinas también pueden contribuir al crecimiento tumoral. Las células cancerosas son capaces de producir algunas citocinas que pueden actuar de manera autocrina o sobre los tejidos de soporte del tumor tales como fibroblastos y vasos sanguíneos para producir un medio favorable para el crecimiento tumoral, o bien pueden inducir a las células normales a producir citocinas que ayuden al crecimiento tumoral (Dunlop y Campbell, 2000) y muchos de los efectos tóxicos de las citocinas son similares a los síntomas experimentados por pacientes con cáncer avanzado lo que parece indicar que las citocinas producidas durante el desarrollo de un tumor juegan un papel importante en los síntomas experimentados por estos pacientes como la anorexia, astenia 20
(debilidad), dolor, nauseas, sedación y desórdenes del sueño, entre otros (Dunlop y Campbell, 2000). Por lo tanto, la terapia antitumoral basada en la producción de citocinas que actúen como modificadores de la respuesta biológica, deberá evaluar el efecto en la respuesta inmune en general que favorezca la remisión del tumor y las expectativas de vida del paciente. De manera general el cáncer se ha asociado a un desbalance entre las citocinas tipo 1 y tipo 2: las citocinas tipo 1 inducen una respuesta inmune celular que en el cáncer ofrecen un efecto protector mientras que las citocinas tipo 2 promueven la respuesta inmune humoral la cual favorece la progresión del tumor (Kovacs, 2000; Lauerova et al., 2002).
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INMUNOTERAPIA El tratamiento actual de los pacientes con cáncer está basado principalmente en la eliminación del tumor por medio de cirugía y/o en la destrucción de las células cancerosas por medio de quimioterapia o radioterapia. Sin embargo, los linfocitos son células altamente sensibles a la destrucción por fármacos y radiación, lo que hace que estos tratamientos produzcan una inmunosupresión independiente de la inmunosupresión que puede ejercer el mismo tumor que frecuentemente guía a una alta susceptibilidad a infecciones. Además, muchos agentes anticáncer como la ciclofosfamida son mutagénicos y carcinogénicos lo que hace frecuente la aparición de cánceres secundarios durante el tratamiento de un paciente (Schreiber, 1999). La idea de utilizar al sistema inmune para erradicar un tumor no es nueva. Hace más de 100 años, William Coley reportó la capacidad para inducir la regresión de un tumor por medio de la activación no específica del sistema inmune en respuesta a toxinas bacterianas (Lillehei et al., 1999). Actualmente, el conocimiento del funcionamiento del sistema inmune y la identificación y disponibilidad de numerosas citocinas que promueven o suprimen el crecimiento celular está siendo aplicado para diseñar formas de modularlo que promuevan la erradicación de los tumores (Shu et al., 1997; Lillehei et al., 1999). En términos generales la inmunoterapia se clasifica en pasiva y activa. En la inmunoterapia pasiva el organismo actúa como un recipiente pasivo de algunos componentes del sistema inmune previamente formados, los cuales van a participar en la eliminación de las células cancerosas. La inmunoterapia activa se basa en la estimulación del sistema inmune del paciente para que produzca una respuesta inmune favorable para la erradicación del tumor (Powles, 1979; Davis, 2000). La inmunoterapia para el cáncer puede considerarse parte de la terapia biológica en la cual se utilizan modificadores de la respuesta biológica, sustancias producidas por el organismo que van a ayudar en la erradicación del tumor a través de uno o más mecanismos dentro de los cuales se encuentran: 1) mejorar la tolerancia del hospedero a fármacos citotóxicos o a la radioterapia, 2) disminuir los mecanismos de supresión, 3) alterar a las células tumorales para incrementar su inmunogenicidad y/o 22
para hacerlas más susceptibles al daño por procesos inmunes, o 4) estimular la respuesta inmune antitumoral del paciente, incrementando el número de células efectoras o produciendo uno o más mediadores solubles (citocinas) (Beers y Berkow, 1999). Durante el desarrollo de la inmunoterapia en contra del cáncer han surgido muchas estrategias algunas de las cuales ya se encuentran en evaluación clínica (Bremers et al., 2000). Actualmente existe interés en desarrollar y evaluar agentes inmunomoduladores capaces de interactuar con el sistema inmune para restaurar o incrementar las funciones inmunológicas del organismo (Panico et al., 1997). Entre los inmunomoduladores evaluados en diferentes condiciones de supresión inmune asociadas al cáncer que estimulan la producción de modificadores de la respuesta biológica se encuentran las hormonas tímicas (Garaci et al., 2000).
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HORMONAS TIMICAS El timo es un órgano linfoide triangular bilobulado localizado en la parte superior del tórax de los vertebrados. Este órgano participa en el desarrollo del sistema inmune, es el sitio primario de linfopoyesis de células T y entre sus funciones inmunológicas más importantes están la de recibir a los progenitores de las células T, servir como centro de maduración y selección durante el desarrollo de los timocitos y coordinar la liberación de células T inmunocompetentes a la periferia (Picker y Siegelman, 1999). La maduración de los timocitos involucra una serie de complejas interacciones entre progenitores linfoides con elementos celulares no linfoides, éstas suceden en el microambiente del timo, una red celular tridimensional formada de células epiteliales, macrófagos, células dendríticas y fibroblastos (Lamberts, 1999) (figura 8).
Figura 8. Organización del timo. Se muestra una sección de un solo lóbulo. Se indican las diferentes células del estroma: células epiteliales medulares y corticales, células dendríticas, macrófagos y fibroblastos (Modificado de Benoist y Mathis , 1999).
El epitelio es el principal componente del microambiente tímico y tiene diferentes efectos sobre la diferenciación de las células T (Dardenne y Savino, 1994; Dardenne, 1999) mediante al menos 2 mecanismos: 1) mediante el contacto célula-célula como 24
ocurre a través de las moléculas clásicas de adhesión, por la interacción entre el complejo mayor de histocompatibilidad expresado en las células del epitelio tímico y el receptor de células T y a través de ligandos y receptores en la matriz extracelular que modulan la migración y maduración de las células T dentro del timo (Dardenne y Savino, 1994) y 2) por medio de la secreción de polipéptidos, incluyendo citocinas y hormonas o factores tímicos (Dardenne y Savino, 1994; Savino et al., 1998). Como se mencionó anteriormente, las células linfoides atraviesan los diversos microambientes y a lo largo de esta vía, las células sobrevivientes sufren una ordenada secuencia de eventos que las guían a la expresión de un grupo de genes propios del linaje celular, particularmente la expresión de marcadores de membrana, así como el rearreglo y expresión en su superficie de los productos de los genes del receptor de células T (Dardenne y Savino, 1994). El resultado es una célula madura, virgen, que tiene un receptor específico para un antígeno, preparada para reconocer ese antígeno no propio una vez que sea presentado unido a los productos del complejo mayor de histocompatibilidad propio (Picker y Siegelman, 1999). Existen reportes de algunas enfermedades en humanos asociadas a una deficiencia funcional del timo, en las cuales el transplante de timo o fragmentos de él, produce un efecto benéfico en estos pacientes inmunodeficientes (Arion, 1989). Además, en animales timectomizados al nacer se ha observado que su sistema inmune recobra su actividad después de que al animal se le ha transplantado un timo o células del timo colocadas en una cámara impermeable a las células (Arion, 1989), lo que confirma que el timo secreta uno o varios factores que tienen efecto sobre diferentes etapas en el desarrollo de las células T. Actualmente se tiene evidencias del efecto de las hormonas tímicas sobre la maduración de las células T (Dardenne, 1999). Se han descrito diversas hormonas tímicas pero no se conoce cómo estas moléculas intervienen fisiológicamente como mediadores de la función humoral tímica (Dardenne, 1999) y sólo aquellas con propiedades inmunomoduladoras se han introducido a la práctica clínica (Dardenne y Savino, 1994; Lempereur et al., 1999). 25
Se han propuesto algunas funciones como la diferenciación de células progenitoras a protimocitos, la inducción de marcadores de superficie, la activación y un incremento en la función efectora de las células T (Picker y Siegelman, 1999). Algunas observaciones han sacado a la luz un papel potencial de algunos de estos péptidos en el desarrollo de células T extratímicas (Picker y Siegelman, 1999). Por otro lado, existen trabajos que reportan que péptidos sintéticos con secuencias derivadas de productos tímicos, pueden conducir al mejoramiento de la respuesta inmune cuando son administrados a ratones, monos o humanos de edad avanzada (Miller, 1999).
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T-ACTIVINA Entre los polipéptidos aislados del timo con propiedades inmunomoduladoras, los mejor caracterizados son las timosinas-α1 y β4, timopoyetina, timulina, factor humoral tímico-γ2 y la T-activina (Arion, 1989; Dardenne y Savino, 1994; Dardenne, 1999). La T-activina es un grupo de polipéptidos obtenidos inicialmente del timo de bovinos y posteriormente de distintas especies animales como renos, cerdos, ovejas y animales marinos, con pesos moleculares entre 1.2 y 6 kD. Su actividad biológica no se ve afectada por el tratamiento con ribonucleasas y desoxirribonucleasas, pero puede ser inactivada si se hierve durante 3 a 5 minutos o si se encuentra en presencia de enzimas proteolíticas y produce resultados negativos si se tiñe con tinciones específicas para glicoproteínas y mucopolisacáridos, lo que confirma su naturaleza proteica (Arion, 1989). Los efectos inmunomoduladores de la T-activina sobre ratones y humanos tanto inmunodeficientes como sanos, han sido documentados. En ratones inmunodeficientes, la T-activina normaliza los efectos de la timectomía: el desarreglo estructural de los órganos linfoides periféricos, la desestabilizada producción y maduración de los linfocitos T, su disminuida migración y su reducida capacidad para reconocer antígenos y cooperar. Además, incrementa la actividad mitótica de los linfocitos (Mamontov et al., 1985; Arion, 1989). Por otro lado, la T -activina suprime la involución del timo tanto fisiológica como experimental, acelera la maduración de los linfocitos, su migración y su posterior abandono del timo (Arion et al., 1984; Koval’skaia et al., 1990). En ratones timectomizados e irradiados pero con una región de la médula ósea protegida, la T-activina restaura la migración de células progenitoras hacia el bazo. Además incrementa la migración de células pre-T hacia el timo, acelera su entrada al ciclo mitótico y puede promover la maduración post-tímica de los linfocitos T. La T-activina in vitro es capaz de eliminar el antígeno SC-1 y de inducir la expresión del antígeno Thy-1 en células de la médula ósea en sistemas murinos, lo que indica que puede dirigir su diferenciación hacia la vía de las células T (Mikhna et al., 1988), esto sugiere que la T-activina puede utilizarse para el 27
tratamiento de
deficiencias inmunes con defectos en la diferenciación y
funcionamiento de células T. En tiroiditis autoinmune experimental en cobayos, que se caracteriza por una deficiencia de células T y por la hipersecreción de hormonas tiroideas, la T-activina produce una prolongada estimulación de la respuesta inmune celular mediada por linfocitos T e incrementa la secreción de otras hormonas tímicas (Artemova y Nugmanova, 1991). La T-activina se ha utilizado en la clínica en casos de inmunodeficiencias con disfunción predominante de la inmunidad mediada por células T como en inmunodeficiencias primarias (congénitas) e inmunodeficiencias secundarias que cursan con procesos inflamatorios, autoinmunidad y enfermedades infecciosas entre otras (Arion, 1989). Existen reportes que indican que la T-activina normaliza los valores de diferentes parámetros inmunológicos. En pacientes tanto pediátricos como adultos, restaura algunos parámetros de la respuesta inmune celular como la relación CD4+/CD8+, la relación T/B, el número de células formadoras de rosetas y la transformación blastoide de linfocitos T inducida por el mitógeno fitohemaglutinina. Además normaliza el número de células T CD4+ de pacientes con algunas enfermedades asociadas con la disfunción de las células T como psoriasis, lupus eritematoso sistémico, linfosarcoma y ataxia-talangiectasis (Arion, 1989) y en pacientes con complicaciones supurativas sépticas postoperatorias (Bulava y Nikulina, 1996; Wilson, 1999). Los efectos de la T-activina en algunos casos clínicos fueron revisados de manera extensa por Wilson (1999): en pacientes con tuberculosis pulmonar, la T-activina, además de incrementar el número de linfocitos y la síntesis de IL-2, incrementa la actividad de células asesinas naturales y la síntesis de IL-1 por parte de los macrófagos. Es decir, tiene efecto tanto en la respuesta inmune específica como inespecífica, y clínicamente se observa una mejoría (Adambekov et al., 1998; Wilson, 1999). Además, la T-activina tuvo un efecto positivo sobre pacientes que padecían de manera combinada tuberculosis pulmonar y diabetes mellitus. Estos pacientes mostraron una mayor depresión de la respuesta inmune celular indicada por un decremento en el número de linfocitos T y en su 28
transformación
blastoide,
que
los
pacientes
que
únicamente
presentaban
tuberculosis. Cuando la T-activina se incluyó en la terapia, los parámetros inmunológicos se normalizaron y hubo una recuperación más rápida (Adambekov et al., 1998; Wilson, 1999). Enfermedades como la hepatitis colestática crónica y la cirrosis biliar primaria han sido exitosamente tratadas con T-activina. Los pacientes con cirrosis tuvieron un incremento en el número de linfocitos T, en la actividad funcional de células mononucleares (incremento en la quimiotaxis) y una disminución en los niveles de inmunoglobulinas, lo cual favorece el control de los procesos inflamatorios en el hígado y la normalización de las manifestaciones clínicas de la enfermedad (Wilson, 1999). En pacientes con enfermedades autoinmunes, la T-activina produce efectos positivos. En pacientes con artritis reumatoide que recibieron metotrexato como tratamiento, su combinación con T-activina no modificó los efectos (reducción del dolor en las articulaciones, disminución del número de articulaciones inflamadas, reducción en los niveles de proteína C reactiva, y de la velocidad de sedimentación de los eritrocitos) y sí produjo una reducción en la rigidez de las articulaciones y en el dolor durante la palpación. En pacientes con lupus eritematoso sistémico, la Tactivina incrementó los niveles de factores tímicos en el suero y la diferenciación de los linfocitos T. En pacientes que presentaban infecciones secundarias, el incremento en el número total de linfocitos, en la fagocitosis y en la actividad bactericida sérica resultó en la eliminación y prevención del desarrollo de otras infecciones (Wilson, 1999). La T-activina en combinación con nucleinato de sodio y lidocaína restauró la función de linfocitos de sangre periférica e incrementó la inmunidad humoral en animales severamente quemados. Además el tratamiento disminuyó la colonización por pseudomonas y cándida lo cual disminuyó la tasa de mortandad (Wilson, 1999). Una
característica
importante
cuando
se
trabaja
con
una
sustancia
inmunomoduladora es que no altere los parámetros cuando se encuentran dentro de los rangos normales. En sujetos sanos y en pacientes donde las relaciones T/B y 29
CD4+/CD8+ se encontraban dentro del rango considerado como normal, la T-activina no tuvo ningún efecto, lo que sugiere que la T-activina es un inmunomodulador real (Arion, 1989).
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HORMONAS TIMICAS Y CANCER Los avances hechos en la inmunología están siendo aplicados para diseñar nuevas formas de modular al sistema inmune en pacientes con cáncer, que promuevan la erradicación del tumor (Shu et al., 1997). Como se mencionó, el cáncer es típicamente tratado con quimioterapia, radioterapia y/o cirugía (Schreiber, 1999). Una dificultad con esos tratamientos es que todos decrecen la capacidad del sistema inmune para funcionar correctamente cuando un adecuado funcionamiento es necesario para cualquier mejoría duradera (Wilson, 1999). Hay evidencias que indican que los factores de origen tímico podrían ser candidatos para el tratamiento de pacientes con cáncer. Aunque no se ha descrito un efecto antitumoral bien definido, existen reportes que indican que las hormonas tímicas son agentes que pueden controlar el crecimiento tumoral (Lempereur et al., 1999), sus niveles séricos disminuyen durante el desarrollo de diferentes tipos de cánceres, lo que parece evidenciar la supresión de la función endocrina del timo en procesos neoplásicos, ya que la eliminación del tumor normaliza esta función (Nikol’ski et al., 1990). En algunos estudios, los extractos tímicos fueron utilizados como única terapia, sin embargo, en la mayoría de los casos fueron utilizados asociados a la terapia convencional en un esfuerzo de ayudar a restaurar al sistema inmune o prevenir su profunda depresión y las complicaciones inmunes asociadas a los tratamientos convencionales (Bodey et al., 2000). En la mayoría de los casos los factores tímicos ayudaron a restaurar la función inmune o a decrecer su daño, y en algunos casos prolongaron la vida de los pacientes (Wilson, 1999). El uso de factores tímicos en combinación con la radioterapia, permitió reestablecer la función inmune (radioprotección) al reducir el daño tisular en médula ósea y sistema nervioso central (Lempereur et al., 1999). Los factores tímicos han sido utilizados en el tratamiento de diferentes tipos de cánceres, como cáncer pulmonar, carcinomas de laringe, cabeza y cuello, linfomas no Hodgkin, cáncer de mama, cáncer gástrico y colorectal, cáncer hepatocelular y melanoma. En un modelo de carcinoma pulmonar metastásico en ratones C57Bl/6, se observó que el tratamiento con el factor tímico timopentina, prolongó la vida de los 31
ratones comparados con los controles y aquellos tratados únicamente con ciclofosfamida. Además, el tratamiento disminuyó la metástasis e incrementó el número de linfocitos. En animales afectados con cáncer, el tratamiento con hormonas tímicas normalizó el comportamiento espontáneo (acicalamiento, locomoción) y la capacidad para responder a estímulos estresantes: la locomoción que se vio significativamente reducida, parece mejorar después de la administración de timopentina y el incrementado acicalamiento observado en animales afectados por cáncer, disminuyó después del tratamiento. Este mejoramiento en el bienestar general se vio indicado por el incremento de la actividad física, la disminución en la ansiedad y un incremento en la resistencia al estrés (Lempereur et al., 1999). En pacientes con carcinoma celular indiferenciado o carcinoma celular escamoso que recibieron como único tratamiento el extracto tímico TFX, se observó una inhibición del crecimiento local del tumor y decreció la metástasis hacia nódulos linfáticos del mediastino u otros órganos. Los efectos de timoestimulina-1 sobre la toxicidad inducida por la quimioterapia en pacientes con cáncer de pulmón de células pequeñas demostró que el tratamiento con el extracto tímico después de la quimioterapia aumenta la sobrevida de los pacientes de manera significativa (de 5.5 a 14.5 meses en promedio), la severa neutropenia observada con el tratamiento convencional disminuyó en los pacientes que recibieron la hormona tímica timoestimulina-1, aunque la duración de la neutropenia no cambió; y hubo menos efectos
colaterales
de
la
quimioterapia,
especialmente
la
duración
de
la
mielosupresión (supresión de las células de la médula ósea), así como los episodios febriles e infecciosos. Además, el tratamiento con timoestimulina-1 mejoró la calidad de vida de los pacientes y la capacidad para soportar la quimioterapia a dosis más altas y con mayor frecuencia (Wilson, 1999). Estos mismos pacientes fueron también tratados con la fracción V de la hormona tímica timosina en conjunción con la quimioterapia y se observó un aumento en el tiempo de sobrevida (263 a 434 días en promedio).
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En pacientes con carcinoma de laringe, tratados con timoestimulina después de la cirugía, se observó un aumento significativo en la respuesta inmune comparados con aquellos que únicamente se sometieron a la cirugía (Wilson, 1999). La terapia combinada de carboplatina, radiación y timoestimulina en pacientes con carcinoma avanzado de cabeza y cuello provocó un menor decremento en los niveles de linfocitos y una fase de remisión de la enfermedad ligeramente mayor que los pacientes que no recibieron el extracto tímico, pero presentaron una frecuencia mayor de recurrencias y metástasis. Mediante estudios histopatológicos de los tumores, utilizando un sistema de análisis de imágenes para determinar las concentraciones de células T, macrófagos, monocitos y células dendríticas, se demostró la base inmunohistoquímica del uso de extractos tímicos en el tratamiento de carcinoma de cabeza y cuello. Se descubrió que los tumores extraídos después del tratamiento presentaban una mayor infiltración de linfocitos T, encontrándose una correlación positiva entre la infiltración de células T y la capacidad de las células dendríticas de formar agrupaciones con las células T de sangre periférica mientras que la infiltración de los otros tipos celulares no incrementó significativamente (Wilson, 1999).
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T-ACTIVINA Y CANCER Existen trabajos clínicos que reportan que la T-activina mejora las condiciones de pacientes con diferentes tipos de cánceres: en pacientes con tumores testiculares malignos diseminados, con cáncer extenso de riñón y leucemia mieloide crónica, la Tactivina presentó un efecto inmunomodulador (Geveling y Zhogoleva, 1986; Guseva y Fed’ko, 1991; Abdulkadyrov y Guseva, 1994), mientras que en pacientes con leucemia linfoide crónica la T-activina incrementó el número de células T (Chuvirov y Markova, 1986) y la producción de linfocinas (Guseva y Fed’ko, 1991). En pacientes con melanoma a los cuales se les escindió el tumor mediante cirugía, el tratamiento con T-activina produjo un incremento en el tiempo de vida comparado con los pacientes que únicamente se sometieron a la cirugía, además el tratamiento incrementó el número de células asesinas naturales y la respuesta linfoproliferativa (Stanojevic-Bakic et al., 1996). Los pacientes con linfogranulomatosis que no reciben tratamiento poseen, de manera característica, defectos en la inmunidad de tipo celular. La T-activina mejoró los parámetros inmunológicos y se obtuvo una tasa de sobrevivencia de 5 años en el 93.8% de los casos comparado con el 70-80% de los casos que recibieron radiación y quimioterapia (Wilson, 1999). En un trabajo realizado en nuestro laboratorio se demostró que el tratamiento con T-activina de ratones portadores de linfoma L-5178-Y recupera los niveles de ARN mensajero para el IFN-γ, mientras que no se observaron efectos sobre los niveles de ARN para IL-2 e IL-4 (Barajas et al., 2003). Estos datos indican que la Tactivina tiene efecto sobre la expresión de genes que expresan citocinas y sugieren que la T-activina puede tener actividad inmunomoduladora a través de la regulación en la producción y liberación de citocinas que tienen efecto sobre la respuesta inmune mediada por células T, lo que pudiera explicar sus efectos en los diferentes modelos tumorales.
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JUSTIFICACION En condiciones fisiológicas, las hormonas tímicas son necesarias para el desarrollo y funcionamiento de los linfocitos T. Los linfocitos T son las células encargadas de la respuesta inmune celular específica y el funcionamiento de estas células está regulado por medio de las citocinas liberadas por los mismos linfocitos y/o por otras células. La erradicación de un tumor requiere de una adecuada respuesta inmune mediada por linfocitos T, sin embargo, está bien documentado que la respuesta inmune celular de los pacientes y los animales experimentales portadores de tumores se encuentra disminuida (Ardestani et al., 1999; Finke et al., 1999). Algunos de los mecanismos de evasión inmune por parte de las células tumorales están asociados a fallas en el funcionamiento de los linfocitos T tanto cooperadores como citotóxicos, como son la disfunción de linfocitos T que infiltran los tumores, fallas en la expresión del receptor de células T, baja proliferación de linfocitos T y un desbalance en la producción de citocinas, entre otros (Kovacs, 2000). Las propiedades inmunomoduladoras de las hormonas tímicas y en particular de la T-activina han dado evidencias de que ésta puede ser utilizada como parte de la inmunoterapia activa en contra del cáncer. No obstante estas evidencias, no se sabe si el efecto de la T-activina sobre los sujetos portadores de tumores se deba a una regulación de las citocinas producidas por las subpoblaciones tipo 1 y tipo 2 de células T, lo que da por resultado un adecuado funcionamiento de la respuesta inmune celular. Es por esto que en este trabajo nos propusimos estudiar el efecto de la T-activina sobre el funcionamiento de los linfocitos T y su relación con las citocinas que estos producen, en ratones portadores del linfoma L-5178-Y. Por otro lado, la disminuida respuesta inmune celular observada en pacientes y animales experimentales portadores de tumores muestra características diferentes a las de los modelos donde se utiliza la quimioterapia para provocar la inmunosupresión (Ardestani et al., 1999; Finke et al., 1999). Esta disfunción inmune ha sido muy poco estudiada, debido en parte a la falta de modelos experimentales que reproduzcan esta situación (Finke et al., 1999). Por esto y con la finalidad de entender la progresión de la disfunción inmune y su correlación con los cambios moleculares y 35
fisiológicos encontrados, se caracterizó la respuesta inmune celular mediada por linfocitos T en ratones portadores del linfoma L-5178-Y.
HIPOTESIS El tratamiento con el inmunomodulador T-activina, de los ratones inmunosuprimidos por el linfoma L-5178-Y, normaliza su respuesta inmune celular específica al modular la producción de citocinas.
OBJETIVO GENERAL Caracterizar el efecto del tratamiento con el inmunomodulador T-activina sobre la respuesta inmune mediada por células T, en ratones inmunosuprimidos con el linfoma L-5178-Y y correlacionarlo con las citocinas tipo 1 y 2 producidas.
OBJETIVOS PARTICULARES •
Caracterizar el modelo de ratones Balb/c inmunosuprimidos con el linfoma L-5178Y como un modelo de cáncer que cursa con una supresión de la respuesta inmune celular
•
Cuantificar la proliferación celular de los linfocitos T de ratones sanos e inmunosuprimidos, con y sin tratamiento con el inmunomodulador T-activina.
•
Evaluar la respuesta de hipersensibilidad por contacto al dinitrofluorobenceno en ratones sanos e inmunosuprimidos, con y sin tratamiento con el inmunomodulador T-activina.
•
Identificar y cuantificar las citocinas producidas por los linfocitos T de ratones sanos e inmunosuprimidos, tratados o no con el inmunomodulador T-activina.
•
Identificar y cuantificar las subpoblaciones de células T CD4+ y CD8+ obtenidas de ratones sanos e inmunosuprimidos, tratados o no con el inmunomodulador Tactivina.
•
Evaluar el tiempo de vida de los ratones inmunosuprimidos con el linfoma L-5178Y, con o sin tratamiento con el inmunomodulador T-activina. 36
MATERIAL Y METODOS Todas las pruebas, in vivo e in vitro (figuras 11 y 12, respectivamente) se realizaron en el Laboratorio de Inmunología del Departamento de Biología Celular y Molecular del Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Guadalajara, con excepción de la identificación y cuantificación de las subpoblaciones CD4+ y CD8+ que se realizaron en el Laboratorio de Inmunología del Departamento de Fisiología del Centro Universitario de Ciencias de la Salud de la Universidad de Guadalajara. Animales. Se utilizaron ratones machos de la cepa Balb/c de 8 a 12 semanas de edad que se obtuvieron en el bioterio del Centro de Investigaciones Biomédicas de Occidente (CIBO) del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) y se mantuvieron durante los experimentos en el bioterio del Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias (CUCBA) de la Universidad de Guadalajara, a temperatura ambiente, con ciclos de luz-oscuridad de 12 horas y con alimento y agua ad libitum. Para los experimentos se formaron 4 grupos: 1) Ratones sanos que sirvieron como grupo control (C). 2) Ratones sanos tratados con el inmunomodulador T-activina (CT). 3) Ratones inmunosuprimidos con el linfoma L-5178-Y (L). 4) Ratones inmunosuprimidos con el linfoma L-5178-Y tratados con T-activina (LT). Para inmunosuprimir a los ratones se les inocularon por vía intraperitoneal 1 x 107 células del linfoma L-5178-Y resuspendidas en 100 µl de solución salina fisiológica y se dejó evolucionar el tumor durante 10 días, tiempo al cual ya hay una inmunosupresión observada en las pruebas de hipersensibilidad por contacto al DNFB y de linfoproliferación (ver figuras 14 y 16) pero todavía no hay metástasis de las células tumorales al bazo (datos no mostrados), lo que permite medir la proliferación celular con la seguridad de que es una medida de linfoproliferación y no de la proliferación de las células tumorales. 37
Los ratones que fueron tratados con el inmunomodulador T-activina recibieron una dosis diaria de 10 µg/ratón durante 10 días por vía subcutánea (0.45 µg/g de peso corporal promedio, ver en resultados la elección de la dosis de T-activina). La Tactivina liofilizada se disolvió en solución salina fisiológica y se filtró con una membrana con poros de 0.22 micras de diámetro (Nalgene). A los ratones sanos y a los ratones con linfoma que no recibieron tratamiento con T-activina se les aplicó el mismo volumen de solución salina fisiológica por la misma vía. Cada ratón se pesó diariamente a partir del día en que se le inocularon las células del linfoma y se utilizó la prueba estadística t de Student para determinar si existía diferencia significativa entre los grupos estudiados. Conservación del Linfoma. En este trabajo se utilizó la línea celular murina L-5178-Y, un tumor de origen tímico que se indujo con metilcolantreno en ratones DBA/2 (Beer et al., 1983). El linfoma se mantuvo en forma ascítica inoculando los linfoblastos en ratones Balb/c de la siguiente manera: a cada ratón sano se le inoculó 1 x 107 células tumorales en 100 µl de solución salina fisiológica por vía intraperitoneal. Después de 12 días se sacrificó el ratón por dislocación cervical y se cosechó el líquido ascítico de la cavidad abdominal, se contaron las células tumorales vivas utilizando la prueba de exclusión de azul de tripano y se inocularon ratones sanos con estas mismas células. Colecta de líquido ascítico y conteo de células tumorales. Los ratones con 10 días de evolución del linfoma, con y sin tratamiento, se sacrificaron por dislocación cervical, se les hizo una incisión en la cavidad peritoneal y por medio de una punta de micropipeta se obtuvo la mayor cantidad posible de líquido ascítico a partir del cual se obtuvo la medida del volumen de líquido ascítico. Posteriormente se tomó una muestra y utilizando la cámara de Neubauer se contaron las células tumorales. Se utilizó la prueba estadística t de Student para determinar si existía diferencia significativa entre los grupos estudiados.
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Reacción de Hipersensibilidad por Contacto al Dinitrofluorobenceno (DNFB). La prueba de hipersensibilidad por contacto es una reacción inflamatoria cutánea mediada por células T utilizada por muchos laboratorios como un modelo para examinar la respuesta de células T a haptenos simples presentados en asociación con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (Xu et al., 1996; Kehren et al., 1999) (figura 9). Esta prueba consta de una fase de sensibilización o fase aferente, que ocurre después del primer contacto de la piel con el hapteno, el cual se une a proteínas extracelulares o asociada a las células. Las proteínas modificadas por el hapteno son captadas por las células de Langerhans y los queratinocitos de la epidermis los cuales actúan como células presentadoras de antígenos asociados al MHC clase I y II, respectivamente (Xu et al., 1996; Kehren et al., 1999). Posteriormente estas células migran a los nódulos linfáticos y/o al bazo, donde se lleva a cabo el reconocimiento por parte de los linfocitos T CD8+ y CD4+ (Xu et al., 1996; Black, 1999; Kehren et al., 1999). La fase de elucidación o fase eferente que se desarrolla pocas horas después de un segundo contacto con el hapteno (reto) está mediada por las células T previamente activadas que infiltran la piel (Xu et al., 1996; Kehren et al., 1999). Las células CD8+ tipo 1 (Tc1) tienen un papel efector en esta respuesta por medio del IFN-γ que producen, citocina que se ha descrito como una de los mediadores principales de la hipersensibilidad por contacto. Mientras que las células CD4+ tipo 2 (Th2) participan como reguladoras de esta respuesta, al producir tanto IL-4 como IL-10, las cuales inhiben la respuesta (Xu et al., 1996).
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Figura 9. Prueba de hipersensibilidad por contacto al DNFB (ver detalles en el texto).
En los días 1 y 2, los ratones de los 4 grupos experimentales se sensibilizaron al DNFB (Sigma) colocando en el abdomen previamente rasurado, 20 µl de una solución de DNFB al 0.7 % en una mezcla compuesta por acetona y aceite de oliva en una relación 4:1 respectivamente. En el día 5 se midió el grosor de las orejas (medida basal) utilizando un micrómetro (The L.S. Starrett Company, Athol, Mass, USA) y posteriormente se retaron los ratones aplicando en la oreja izquierda 10 µl de la solución con DNFB al 0.4 % y en la oreja derecha 10 µl de la mezcla de acetona y aceite de oliva como un control de que el vehículo no produce respuesta inflamatoria. Cuarenta y ocho horas después se midieron nuevamente las orejas (medida a las 48 horas, ver figura 11) y se calculó el índice de incremento en el grosor de la oreja en datos porcentuales, donde: Medida a las 48 h – Medida basal Índice de incremento = en el grosor de la oreja (%)
X 100 Medida basal
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Se realizaron comparaciones múltiples, previo análisis de varianza, utilizando la prueba estadística de Scheffé para determinar si existía diferencia significativa entre los grupos estudiados. Obtención de las células mononucleares. A los 10 días de evolución del tumor, los ratones de los 4 grupos se sacrificaron por dislocación cervical y se obtuvo el bazo en condiciones de esterilidad. Cada bazo fue disociado con la ayuda de agujas de acero inoxidable en 5 ml de solución salina balanceada de Hank (HBSS) y las células se separaron por gradiente de densidad en lymphoprep (Nycomed) (Böyum, 1988) centrifugándolas a 1400 rpm durante 15 minutos (figura 12). Posteriormente se recuperó el anillo rico en células mononucleares mediante aspiración con una pipeta Pasteur y se lavó 2 veces en la misma solución salina centrifugando a 1800 rpm durante 10 minutos. El botón celular se resuspendió en medio de cultivo RPMI-1640 (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) suplementado con suero fetal de ternera (SFT) al 10%, inactivado por calor. La viabilidad de las células se determinó utilizando la prueba de exclusión del colorante azul de tripano. Linfoproliferación. La proliferación de linfocitos T in vitro ante un estímulo mitogénico es un método utilizado para evaluar los eventos celulares que ocurren durante la activación de los linfocitos de manera controlada (ver figura 10). La activación policlonal como la realizada por medio de mitógenos permite estudiar la respuesta de una gran cantidad de clonas de células T y tener un panorama general del estado de la respuesta inmune celular del individuo (Abbas et al., 1997; Shanker y Singh, 2000). La proliferación de linfocitos T es una de las respuestas biológicas que ocurren cuando en condiciones fisiológicas los linfocitos reconocen un antígeno, son activados, se producen los factores de crecimiento y se expresan sus receptores necesarios para la proliferación, con la finalidad de generar una gran cantidad de linfocitos efectores de la respuesta inmune celular (Abbas et al., 1997).
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Figura 10. Activación y proliferación de linfocitos T (ver detalles en el texto).
Para los experimentos se colocaron 2 x 105 células por pozo en placas de 96 pozos (Corning) y se les adicionó por triplicado RPMI-1640 suplementado con SFT al 10 % (células no estimuladas) o concanavalina-A (ConA) a una concentración de 5 µg/ml (células estimuladas). Se incubaron a 37o C en una atmósfera húmeda con 5 % de CO2. Después de 48 horas de incubación, a cada pozo se le dio un pulso de 1 µCi de timidina tritiada (actividad específica de 6.7 Ci/µmol; New England Nuclear, Boston MA, USA) y 24 horas después se cosecharon las células utilizando un cosechador automático (Nunc). La proliferación celular se cuantificó por incorporación de timidina tritiada mediante un contador de centelleo para emisiones beta (Beckman) (AlfaroBustamante et al., 1997) (figura 12). Los datos se obtuvieron en cuentas por minuto (cpm) y se expresaron como índices de estimulación (IE), donde: IE =
cpm de células estimuladas cpm de células no estimuladas
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Se realizaron comparaciones múltiples, previo análisis de varianza, utilizando la prueba estadística de Scheffé para determinar si existía diferencia significativa entre los grupos estudiados.
Obtención de los sobrenadantes de cultivo para la cuantificación de la IL-2, IFN-γ e IL-4.
Los sobrenadantes de cultivo de los 4 grupos de ratones se cosecharon en
tubos estériles después de 48 horas de incubación y se almacenaron a – 80 o C hasta la cuantificación de las citocinas (figura 12). Análisis cuantitativo de las citocinas por la técnica de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). Se utilizaron placas comerciales para ELISA (Biotrak, Amersham Pharmacia Biotech) y se siguió el protocolo indicado por el proveedor. Brevemente, a cada pozo se le agregó 50 µl de las muestras o de los estándares con concentraciones conocidas de las citocinas y se incubó a 37
o
C durante 2 h. Se
realizaron 5 lavados y posteriormente se agregó un anticuerpo anti-citocina marcado con la enzima peroxidasa de rábano y se incubó durante 1 h a 37
o
C. Se lavó
nuevamente 5 veces y se adicionó el sustrato de la enzima. Se incubó por aproximadamente 20 minutos en la obscuridad y finalmente se adicionó una solución de ácido sulfúrico 0.18 M que detuvo la reacción. Los resultados de densidad óptica se obtuvieron utilizando un lector de ELISA (Behring) a una longitud de onda de 450 nm. Los valores de las concentraciones de las citocinas se obtuvieron interpolando los datos en la curva
realizada con los estándares. Se realizaron comparaciones
múltiples, previo análisis de varianza, utilizando la prueba estadística de Scheffé para determinar si existía diferencia significativa entre los grupos estudiados. Identificación de células CD4+ y CD8+ por citometría de flujo. A 1.5 x 106 células mononucleares obtenidas del bazo se les agregó 10 µl de anticuerpo monoclonal antiCD4 marcado con fluoresceína (FITC) + 10 µl de anti-CD8 marcado con ficoeritrina (PE) y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos en agitación constante. Finalmente se lisaron los eritrocitos y se estabilizaron las membranas de 43
las células utilizando el reactivo ImmunoPrep (Coulter). Las muestras se mantuvieron en refrigeración (4 oC) y protegidas de la luz hasta su lectura (no más de 24 horas) en un citofluorómetro EPICS II (Coulter). A los valores de cada muestra se les restó la fluorescencia inespecífica la cual se obtuvo de la siguiente manera: de cada grupo experimental se obtuvieron 1.5 x 106 células, se les agregó 10 µl de isotipo marcado con FITC y/o 10 µl de isotipo marcado con PE y posteriormente se les dio el mismo tratamiento que las muestras con anticuerpos específicos. Tiempo de vida. Para determinar el tiempo de vida, los ratones con linfoma se observaron a partir de que se les inocularon las células tumorales y hasta el día de su muerte y los ratones sanos se observaron durante 90 días. Las diferencias estadísticas entre las probabilidades de sobrevivencia se determinaron utilizando la prueba de Gehan.
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Figura 11. Pruebas realizadas in vivo (ver texto en material y métodos).
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Figura 12. Pruebas realizadas in vitro (ver texto en material y métodos).
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RESULTADOS CARACTERIZACIÓN DEL MODELO EXPERIMENTAL En este trabajo se utilizó un modelo de linfoma murino, la línea celular L-5178-Y transplantada intraperitonealmente en ratones de la cepa Balb/c. Como se mencionó anteriormente, esta línea celular se obtuvo de un tumor tímico inducido con metilcolantreno en ratones DBA/2 y fue adaptado a la forma ascítica manteniéndolo por transplantes seriados en ratones singénicos genéticamente compatibles (locus H2d del complejo mayor de histocompatibilidad) (Beer et al., 1983; Palacios-Corona et al., 1999). Aunque este modelo ha sido utilizado previamente como un modelo de inmunosupresión (Daneri et al., 1995, Oronzo-Barocio et al., 1999; Palacios-Corona et al., 1999) no existen datos de cómo esta inmunosupresión se va estableciendo en función del tiempo de desarrollo del tumor en el ratón. Por esto, primeramente se caracterizó el curso temporal del efecto de las células del linfoma L-5178-Y (1 x 107 células) sobre el peso corporal, la prueba in vivo de hipersensibilidad por contacto al DNFB, la prueba in vitro de linfoproliferación estimulada por el mitógeno ConA y el tiempo de vida de los ratones. Con esto, además de caracterizar el curso temporal de la supresión de la respuesta inmune celular, permitió decidir el tiempo de utilización de los ratones con linfoma para su tratamiento con T-activina. Mediante la observación diaria de los ratones portadores del linfoma se lograron identificar algunas características que indicaban un deterioro de su estado de salud. Una de las características más evidentes es que sufren de un aumento progresivo del peso corporal asociado a una distensión de la cavidad abdominal. En la figura 13 se muestra el incremento en el peso corporal durante la evolución del tumor. Como se puede observar, a partir del día 10 ya existe una diferencia estadísticamente significativa (p< 0.01) entre el peso corporal de los ratones sanos y los ratones portadores del linfoma (22.9 g vs 24.83 g, respectivamente). Los ratones con linfoma presentan el máximo peso al día 15 (20.51 % de incremento con
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respecto al control ese mismo día) y posteriormente comienzan a bajar de peso hasta el día de su muerte.
Figura 13. Curso temporal del incremento en el peso corporal de los ratones portadores del linfoma L-5178-Y (1 x 107 células por vía intraperitoneal). Los ratones sanos se pesaron durante 30 días. Se muestra la media ± error estándar de 3 ratones sanos (• • ) y 5 ratones con linfoma (î ). El peso máximo se obtuvo el día 15 de evolución del linfoma. *Diferencia s estadísticamente significativas con respecto a su propio control, p< 0.01.
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Como se mencionó, las células del linfoma L-5178-Y producen un estado de inmunosupresión. Para evaluar el grado de inmunosupresión en función del tiempo de evolución del tumor se realizaron las pruebas de hipersensibilidad por contacto y de linfoproliferación. La hipersensibilidad por contacto es una reacción inflamatoria cutánea, antígeno específica mediada por
células T que produce eritema e
inflamación en el sitio de aplicación del antígeno en animales y humanos que han tenido contacto previo con el antígeno y que es utilizada por muchos laboratorios como un modelo para evaluar el estado de la respuesta de células T in vivo (Xu et al., 1996; Black, 1999; Kehren et al., 1999). En la figura 14 se muestran los resultados de esta prueba en ratones sensibilizados con DNFB, donde se puede observar que el índice de incremento en el grosor de la oreja en ratones con 1x107 células del linfoma L-5178-Y disminuyó de manera significativa a partir del octavo día, comparados con los ratones sanos (día cero) y al día 16 ya no hubo respuesta al DNFB (p< 0.01). La respuesta proliferativa de los linfocitos T ante un estímulo antigénico o mitogénico evalúa la capacidad de proliferación clonal, la cual es fundamental para la generación de una respuesta inmune de tipo celular. Previo a la realización de los cultivos se determinó la dosis óptima de ConA que generara la mayor respuesta proliferativa de los linfocitos esplénicos de ratones sanos. En la figura 15 se muestra la curva dosis-respuesta de los linfocitos T ante el estímulo con ConA y se puede observar que la dosis óptima de ConA para la proliferación de linfocitos esplénicos es 5 µg/ml. Esta fue la dosis utilizada en todos los experimentos. El efecto de las células de linfoma sobre la proliferación de las células T, representada como índice de estimulación, se puede observar en la figura 16. La respuesta se suprimió en un 61.94 % a los 2 días de evolución del linfoma (45.3 ± 3.22 vs 17.44 ± 4.11), siendo ésta ya una respuesta estadísticamente diferente al control (p< 0.01). Conforme el ratón tenía más días de portar las células del linfoma, mayor fue la supresión y a partir del día 14 el índice de estimulación tuvo un valor cercano a 1, lo que indica que a partir de este día prácticamente ya no hubo respuesta proliferativa.
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Figura 14. Curso temporal del efecto del linfoma L-5178-Y sobre la prueba de hipersensibilidad por contacto al DNFB. La respuesta al DNFB se midió 48 horas después del reto. Cada barra indica la media ± error estándar de n. *Diferencia s estadísticamente significativas con respecto al control (barra negra), p< 0.01.
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Figura 15. Curva dosis -respuesta a ConA. Se utilizaron dosis de 0, 0.5, 1, 2, 5 y 10 µg/ml. Se muestra la media±error estándar de n = 3. *Diferencias estadísticamente significativas con respecto a las células no estimuladas, p< 0.01.
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Figura 16. Curso temporal del efecto del linfoma L-5178-Y (1 x107 células por vía intraperitoneal) sobre la proliferación de linfocitos T esplénicos estimulados con ConA. Cada barra representa la media ± error estándar de n. *Diferencia s estadísticamente significativas con respecto al control (barra negra), p< 0.01
Un decremento en las pruebas de hipersensibilidad tardía y linfoproliferación indican una disminuida respuesta inmune celular que en sujetos con cáncer repercute en la calidad y tiempo de vida. Con la finalidad de conocer el efecto de las células del linfoma en el tiempo de vida de los ratones, éstos se observaron durante 90 días. Como se puede observar en la figura 17, los ratones comenzaron a morir al día 15 de portar el linfoma, a los 18 días la probabilidad de sobrevivencia era del 0.5 y al los 27 días la totalidad de los ratones con linfoma habían muerto.
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Figura 17. Efecto del linfoma L-5178-Y (1 x107 células por vía intraperitoneal) sobre la probabilidad de sobrevivencia. Los ratones control ( días. Los ratones con linfoma (
, n= 40) se observaron durante 90
, n=34) comenzaron a morir a los 15 días de desarrollo
del tumor, vivieron en promedio 21 ± 2.07 días (media ± SEM) y a los 27 días ya habían muerto el 100% de los ratones.
A partir de estos datos se decidió utilizar a los ratones con 10 días de evolución del tumor para los siguientes experimentos ya que con este tiempo de evolución del linfoma la inmunosupresión está ya bien establecida y según la probabilidad de sobrevivencia, el tiempo hasta su muerte es suficiente para aplicar el tratamiento con T-activina.
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ELECCION DE LA DOSIS DE T-ACTIVINA Para determinar la dosis de T-activina y el esquema que fuera más efectivo para el tratamiento de la inmunosupresión en este modelo, los ratones con linfoma se dividieron en tres grupos: Esquema A: El tratamiento se inició 5 días antes de la inoculación de las células tumorales. Esquema M: El tratamiento inició el mismo día de la inoculación de las células tumorales. Esquema D: El tratamiento se inició 5 días después de la inoculación de las células tumorales. Los tres esquemas de aplicación de la T-activina consistieron en la administración de las diferentes dosis durante 10 días (tabla 1) y se eligieron de acuerdo a tres diferentes momentos: la aplicación de la T-activina antes de la inoculación de las células tumorales se hizo con la finalidad de ver el efecto protector sobre el sistema inmune previo a la presencia de las células tumorales. La aplicación de la T-activina que se inició al mismo tiempo en que las células del linfoma fueron inoculadas corresponde al inicio de un tratamiento en una etapa temprana del desarrollo del tumor previo a la metástasis. Y el inicio de la aplicación de la T-activina cinco días después de haber inoculado las células tumorales corresponde a una etapa avanzada del desarrollo del tumor en donde al momento de realizar las pruebas, comenzaba a haber metástasis de las células tumorales (datos no mostrados). Se probaron 3 diferentes dosis de T-activina: 0.1, 1 y 10 µg/ratón. La elección de estas dosis está basada en la revisión bibliográfica, las dosis fueron previamente utilizadas en trabajos con diferentes modelos (Korotkova et al., 1989; Arion, 1989; Koval’skaia et al., 1990). Los parámetros utilizados para la elección del tratamiento con T-activina fueron la respuesta en la prueba in vivo de hipersensibilidad por contacto al DNFB que permite evaluar el estado funcional de los linfocitos T y el tiempo de vida de los ratones (tabla 1).
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En la tabla 1 y en la figura 18 se muestran los resultados de las pruebas de hipersensibilidad por contacto utilizando los 3 esquemas de tratamiento y las 3 diferentes dosis de T-activina. Se puede observar que el índice de incremento en el grosor de la oreja de los ratones control (sanos) fue de 72.34 ± 3.6 %, mientras que los ratones que tenían linfoma tuvieron un índice de incremento del 25 ± 4.1 %. En el caso de los grupos que iniciaron el tratamiento antes y al mismo tiempo de la inoculación de las células tumorales, el efecto de la T-activina es dependiente de la dosis. En todos los casos la respuesta presentó una diferencia estadísticamente significativa con respecto al ratón con linfoma que no recibió tratamiento (p< 0.01). Sin embargo, la dosis de 10 µg de T-activina/ratón en el grupo que inició el tratamiento 5 días antes de que se le inocularon las células tumorales y las dosis de 1 y 10 µg/ratón en el grupo que inició el tratamiento el mismo día que se les inocularon
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las células tumorales, son los que presentaron una mayor respuesta al DNFB, no habiendo diferencias estadísticamente significativas al compararlas con el grupo control.
Figura 18. Curva Dosis -Respuesta a la T-activina sobre la prueba de hipersensibilidad por contacto al DNFB. Los ratones iniciaron el tratamiento A: antes (5 días), M: el mismo día, y D: después (5 días) de la inoculación de las células del linfoma. Los ratones que recibieron la dosis de 10 µg/ratón antes de inocularles las células tumorales y de 1 y 10 µg/ml al mismo tiempo de inocularles el tumor, no mostraron diferencia estadísticamente significativa con respecto al control (barra negra). Cada barra representa la media ± error estándar de n=4. *Diferencia s estadísticamente significativas con respecto al ratón con linfoma, p< 0.01.
El efecto del tratamiento con las 3 dosis de T-activina utilizadas sobre el tiempo de vida de los ratones se puede observar en la tabla 1 y en la figura 19. Los ratones portadores del linfoma que no recibieron tratamiento con T-activina vivieron 56
20.05 ± 0.5 días (media ± SEM). El grupo de ratones que inició el tratamiento antes de la inoculación de las células tumorales vivieron 24 ± 1.07, 22.5 ± 1.3 y 23 ± 1.2 días (media ± SEM) recibiendo las dosis de 0.1, 1 y 10 µg/ratón, respectivamente. El grupo de ratones que iniciaron el tratamiento el mismo día de la inoculación de las células tumorales vivieron 19 ± 1.3, 19.75 ± 2.09 y 26.25 ± 0.66, administrándoles las dosis de 0.1, 1 y 10 µg de T-activina/ratón, respectivamente. Y los ratones que iniciaron el tratamiento 5 días después de la inoculación de las células del linfoma vivieron 24 ±
1.2, 25.2
±
0.7 y 25
± 0.7 días, con las dosis de 0.1, 1 y 10
µg/ratón, respectivamente. En esta prueba los mejores resultados del tratamiento con T-activina sobre el tiempo de vida de los ratones se obtuvieron con 10 µg/ratón en el grupo que inició el tratamiento el mismo día de la inoculación de las células tumorales y con 1 y 10 µg/ratón del grupo que inició el tratamiento 5 días después de la inoculación de las células de linfoma.
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Figura 19. Efecto de la T-activina a diferentes concentraciones sobre la probabilidad de sobrevivencia y el tiempo de vida de los ratones portadores del linfoma L-5178-Y. Los ratones iniciaron el tratamiento A: 5 días antes, B: el mismo día y C: 5 días después de la inoculación de las células del linfoma. Se utilizaron ratones sanos ( linfoma (
) y ratones con linfoma tratados con 0.1 (
), 1 (
), ratones con ) y 10 (
)
µg/ratón de T-activina. D: Días de vida de los ratones con linfoma que recibieron tratamiento con T-activina utilizando los tres esquemas de tratamiento y las tres dosis de T activina. Cada barra representa la media ± error estándar de n=4.
*Diferencia
estadísticamente significativa p< 0.01 y ** p< 0.05 con respecto al ratón con linfoma.
A partir de los resultados en estas dos pruebas se decidió utilizar la dosis de Tactivina de 10 µg/ratón, iniciando el tratamiento el mismo día de la inoculación de las células de linfoma L-5178-Y.
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EFECTO DE LA T-ACTIVINA Efecto de la T-activina sobre el peso corporal. Como se mencionó anteriormente, una de las primeras observaciones hechas en ratones portadores del
linfoma L-5178-Y es un incremento continuo en el peso
corporal asociado a una distensión de la cavidad abdominal, que cesa días antes de la muerte del ratón. Para conocer el efecto del tratamiento con T-activina sobre el peso corporal, los ratones de los 4 grupos se pesaron al inicio y al final del tratamiento. Como se puede observar en la figura 20, el tratamiento con T-activina redujo el índice de incremento en el peso corporal de manera significativa pero no revirtió totalmente el efecto del linfoma (16.21 ± 1.62 % vs 31.52 ± 3.96 % de incremento en el peso corporal de los ratones con linfoma, con y sin tratamiento, respectivamente).
Figura 20. Efecto del tratamiento con T-activina sobre el índice de incremento en el peso corporal. Los ratones se pesaron el día de la inoculación de las células tumorales (1x107 células por vía intraperitoneal) y 10 días después. Cada barra representa la media ± SEM de n. *Diferencias estadísticamente significativas entre los grupos, con excepción de C vs CT, p< 0.05. 59
Por otro lado, no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre el grupo control y el grupo control que recibió tratamiento (6.1 ± 1.12 % vs 5.74 ± 1.61 % de incremento en el peso corporal). El incremento en el peso corporal puede deberse, al menos en parte, a la proliferación de células tumorales y/o al incremento en la producción de líquido ascítico. Para tratar de determinar si el efecto de la T-activina observado se debía a un efecto sobre el desarrollo del tumor, es decir, un efecto antiproliferativo y/o tenía algún efecto sobre la producción de líquido ascítico, se recolectó el líquido que se encontraba en la cavidad peritoneal de los 4 grupos de ratones, se midió el volumen de líquido ascítico y se contaron las células tumorales en este líquido. En la tabla 2 se pueden observar los resultados. Si bien, al comparar cada ratón que recibió tratamiento con su propio control (ratón con linfoma que no recibió tratamiento) hubo un decremento consistente en el volumen de líquido ascítico recolectado y en el número de células tumorales, no existen diferencias estadísticamente significativas entre los 2 grupos.
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Efecto de la T-activina sobre la prueba de hipersensibilidad por contacto al DNFB. Como se mencionó anteriormente, para evaluar la respuesta inmune celular in vivo se utiliza la prueba clásica de hipersensibilidad por contacto. Las pruebas de hipersensibilidad de tipo tardío que involucran la sensibilidad a un antígeno al cual el individuo ha sido previamente expuesto se han utilizado para evaluar la inmunosupresión asociada con cáncer (Shu et al., 1997). Como se puede observar en la figura 21 la respuesta al DNFB en ratones portadores del linfoma tuvo una reducción, observada por un decremento en la respuesta inflamatoria (índice de incremento en el grosor de la oreja), comparada con la respuesta observada en ratones sanos (25 ± 4.1 % vs 72.34 ± 3.62 %, media ± SE, respectivamente). El tratamiento con T-activina en ratones con linfoma produjo una recuperación en la respuesta al DNFB (64.44 ± 2.88 %, media ± SE), y no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los ratones sanos y los ratones inmunosuprimidos que recibieron tratamiento. Los ratones sanos que recibieron tratamiento mostraron una leve reducción estadísticamente no significativa en la respuesta al DNFB comparados con los ratones sanos que no recibieron tratamiento con T-activina (65.47 ± 3.79 % vs 72.34 ± 3.62 %, media ± SE, respectivamente).
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Figura 21. Efecto del tratamiento con T-activina sobre la prueba in vivo de hipersensibilidad por contacto al DNFB. Panel superior: la respuesta al DNFB se determinó 48 horas después de aplicar el reto. (o, sin T-activina y n, con T-activina). Cada barra representa la media ± error estándar de n. *Diferencia estadísticamente significativa con respecto al resto de los grupos, p< 0.01. No hay diferencias estadísticamente significativas entre C, CT y LT. Panel inferior: mecanismo de la fase de elucidación de la prueba de hipersensibilidad por contacto al DNFB (ver explicación en material y métodos). 62
Efecto de la T-activina sobre la proliferación de linfocitos T. Para generar linfocitos que inicien y mantengan una respuesta adecuada en contra de las células tumorales, es necesario que los linfocitos T reconozcan un antígeno tumoral, se activen y proliferen para generar linfocitos T efectores y de memoria. La respuesta proliferativa de los linfocitos T ante un estímulo antigénico o mitogénico se ha encontrado disminuida en otros modelos tumorales (Shanker y Singh, 2000). Para determinar si en este modelo los linfocitos T presentaban alguna falla en su respuesta proliferativa y el efecto de la T-activina sobre ésta, se midió el índice de estimulación ante un estímulo con ConA. En la figura 22 se
puede observar un decremento
significativo en la respuesta proliferativa (índice de estimulación) en ratones portadores del linfoma L-5178-Y, comparado con la respuesta de los ratones sanos (4.17 ± 0.68 vs 45.3 ± 3.22, media ± SE, respectivamente). Esta disminución en la respuesta proliferativa fue parcialmente revertida por el tratamiento con T-activina (13.22 ± 1.62, media ± SE) si se compara con los ratones sanos que no recibieron tratamiento pero totalmente revertida si se compara con los ratones sanos que sí recibieron tratamiento (13.22 ± 1.62 vs. 20.73 ± 4.58).
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Figura 22. Efecto del tratamiento con T-activina sobre la proliferación in vitro de células T estimuladas con ConA (5 µg/ml) . Panel superior: cada barra (o, sin T-activina y n, con Tactivina) representa la media ± error estándar de n=5 experimentos. *Diferencia estadísticamente signif icativa con respecto al control. Hay diferencia estadística entre CT y L pero no existe diferencia estadística entre CT y LT , p< 0.05. Panel inferior: mecanismo de activación y proliferación de linfocitos T (ver explicación en material y métodos).
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Efecto de la T-activina sobre la producción y liberación de citocinas. Las citocinas son mediadores de la respuesta inmune, permiten la comunicación entre las células del sistema inmune y como se mencionó anteriormente, estados fisiológicos y patológicos, incluido el cáncer,
están relacionados con las citocinas
liberadas y el tipo de respuesta que éstas producen (Leonard, 1999). Para determinar la correlación existente entre los resultados obtenidos en las pruebas que se utilizaron para evaluar el estado de la respuesta inmune celular mediada por linfocitos T (pruebas de hipersensibilidad por contacto al DNFB y linfoproliferación ante un estímulo mitogénico) y las citocinas producidas y liberadas al medio, se cuantificaron las concentraciones de IFN-γ, IL-2 e IL-4 en sobrenadantes de cultivo. Se eligieron estas citocinas por ser las citocinas representantes de las subpoblaciones tipo 1 (IFNγ) y tipo 2 (IL-4) y por ser los factores de crecimiento de las 2 subpoblaciones (IL-2 e IL-4). En el panel A de las figuras 23, 24 y 25 se puede observar que en todos los casos la estimulación de las células con el mitógeno aumentó significativamente las concentraciones de las citocinas. En la figura 23 se muestran las concentraciones de IL-2, donde se puede observar que las células estimuladas y no estimuladas, obtenidas de ratones con linfoma presentaron una baja producción de IL-2 que no se recuperó con el tratamiento con T-activina. En la figura 24 se muestra que las células no estimuladas obtenidas de ratones control con y sin tratamiento y de ratones con linfoma, no mostraron cambios en la producción de IFN-γ , sin embargo, las células no estimuladas provenientes de ratones con linfoma que recibieron tratamiento aumentaron significativamente los niveles de IFN-γ. Por otro lado, las células estimuladas obtenidas de ratones con linfoma presentaron una disminución significativa en los niveles de IFN-γ, efecto que se revirtió totalmente con el tratamiento con T-activina. En la figura 25 podemos observar que ni la presencia de las células tumorales ni el tratamiento con T-activina tuvieron efecto sobre los niveles de IL-4 producida por las células no estimuladas. Mientras que las células estimuladas obtenidas de 65
ratones con linfoma produjeron niveles reducidos de IL-4 que no se recuperaron con el tratamiento.
Figura 23. Efecto del tratamiento con T-activina sobre los niveles de IL-2 en sobrenadantes de cultivo. Los sobrenadantes se cosecharon a las 48 horas de incubación. A: comparación de los niveles de IL-2 ex vivo (¢, células no estimuladas), e in vitro (¨, células estimuladas con ConA, 5 µg/ml) . *Diferencia s estadísticamente significativas entre células estimuladas y no estimuladas, p< 0.05.
B: producción de IL-2 ex vivo. *Diferencia estadísticamente
significativa entre L y C y entre L y CT, p< 0.05. No hay diferencia estadística entre C y CT y entre LT y el resto de los grupos. C: producción de IL-2 in vitro (¨, sin T-activina y ¢, con T-activina).
Las barras representan la media ± SD de n= 5 ratones. *Diferencias
estadísticamente significativas entre LT y C y entre LT y CT, p< 0.05. No hay diferencia estadística entre LT y L. C: control, CT: control + T-activina, L: linfoma y LT: linfoma + Tactivina
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Figura 24. Efecto del tratamiento con T-activina sobre los niveles de IFN-γ en sobrenadantes de cultivo. Los sobrenadantes se cosecharon a las 48 horas de incubación. A: comparación de los niveles de IFN-γ ex vivo (¢, células no estimuladas), e in vitro (¨, células estimuladas con ConA, 5 µg/ml). *Diferencias estadísticamente significativas entre células estimuladas y no estimuladas, p< 0.05. B: producción de IFN-γ ex vivo. * Diferencia s estadísticamente significativas entre LT y el resto de los grupos, p< 0.05. No hay diferencias estadísticas entre C, CT y L. C: producción de IFN-γ in vitro (¨, sin T-activina y ¢, con T-activina). Las barras representan la media ± SD de n= 5 experimentos.
*Diferencia s estadísticamente
significativas entre L y el resto de los grupos, p< 0.05. No hay diferencias estadísticas entre C, CT y LT. C: control, CT: control + T-activina, L: linfoma y LT: linfoma + T-activina
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Figura 25. Efecto del tratamiento con T-activina sobre los niveles de IL-4 en sobrenadantes de cultivo. Los sobrenadantes se cosecharon a las 48 horas de incubación. A: comparación de los niveles de IL-4 ex vivo (¢, células no estimuladas), e in vitro (¨, células estimuladas con ConA, 5 µg/ml). *Diferencias estadísticamente significativas entre células estimuladas y no estimuladas, p< 0.05. B: producción de IL-4 ex vivo. No hay diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. C: producción de IL-4 in vitro (¨ sin T-activina y ¢ con Tactivina).
Las barras representan la media ± SD de n= 5 experimentos.
*Diferencias
estadísticamente significativas entre C y el resto de los grupos y entre CT y el resto de los grupos, p< 0.05. C: control, CT: control + T-activina, L: linfoma y LT: linfoma + T-activina
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Efecto de la T-activina sobre la proporción de células T CD8+/ CD4+. Los resultados obtenidos hasta ahora sugieren que el linfoma L-5178-Y produce un efecto negativo sobre algunos parámetros de la respuesta inmune celular mediada por linfocitos T, que mejoran con el tratamiento con T-activina. Para determinar si el daño ocasionado por la presencia de las células tumorales y la posterior mejora con el tratamiento involucra un cambio en la proporción de las subpoblaciones CD8+/CD4+ que participan en las respuestas, se identificaron y cuantificaron las subpoblaciones CD4+ y CD8+ por citometría de flujo (figura 26). En la tabla 3 se muestran los resultados de 2 experimentos independientes. Como se puede observar, el linfoma produce un desbalance en la proporción CD8+/CD4+ que la T-activina revierte completamente.
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Figura 26. Identificación y cuantificación de las subpoblaciones de linfocitos T, CD4+ y CD8+. Células esplénicas obtenidas de: A: ratones control, B: ratones control tratados con Tactivina, C: ratones con linfoma y D: ratones con linfoma tratados con T -activina. Cada punto representa una célula marcada con un anticuerpo monoclonal anti-CD4 y/o anti- CD8. En el eje de las abcisas se muestran las células CD4+ y en el eje de las ordenadas las células CD8+. Las células doble negativas (CD4-CD8-) se encuentran en el cuadrante inferior izquierdo y las células doble positivas (CD4+CD8+) en el cuadrante superior derecho. Resultados similares se obtuvieron en 2 experimentos independientes. 70
Efecto de la T-activina sobre el tiempo de vida. Los resultados del efecto de la T-activina sobre la respuesta inmune celular mediada por linfocitos T de los ratones portadores del linfoma L-5178-Y demuestran que este inmunomodulador produce una mejoría significativa en la mayoría de los parámetros inmunológicos estudiados. Para conocer si esta mejoría favorece el tiempo de vida de los ratones, éstos se observaron durante 90 días a partir de la inoculación de las células tumorales y el inicio del tratamiento.
En la figura 27 se muestra la
probabilidad de sobrevivencia y el tiempo de vida de los ratones portadores del linfoma que recibieron tratamiento con T-activina. Como se mencionó, los ratones inoculados con 1x107 células tumorales tienen un tiempo de vida promedio de 18.83 ± 0.47 días y como se puede observar, el tiempo de vida de los ratones que recibieron tratamiento aumentó de manera significativa (26.33 ± 0.66).
Figura 27. Efecto del tratamiento con T-activina sobre la probabilidad de sobrevivencia y el tiempo de vida. A: probabilidad de sobrevivencia de los ratones sanos ( sanos tratados con T-activina ( tratados con T-activina (
), ratones con linfoma (
), ratones
) y ratones con linfoma
). La probabilidad de sobrevivencia fue diferente entre los
grupos control y los grupos con linfoma (p< 0.05). B: Días de vida de los ratones con linfoma con y sin tratamiento con T-activina (10 µg/ratón). Cada barra representa la media ± error estándar de n=6. *Diferencia estadísticamente significativa, p< 0.05. 71
DISCUSION El crecimiento de un tumor está asociado a una disminución en la respuesta inmune del hospedero, específicamente una inmunodeficiencia de tipo celular con defectos en distintas propiedades funcionales en las células T (Finke et al., 1999; Hadden, 2003). El estudio de la inmunosupresión asociada al cáncer ha sido limitada debido principalmente a la falta de modelos experimentales en donde la supresión inmune sea provocada directamente por la presencia de las células tumorales y no inducida por fármacos o radiaciones (Ardestani et al., 1999; Finke et al., 1999). En este trabajo se utilizó un linfoma de origen tímico y adaptado a una forma ascítica (Beer et al., 1983; Palacios-Corona et al., 1999) donde la presencia de las células tumorales induce una supresión de la respuesta inmune (Daneri et al., 1995; Puebla-Pérez et al., 1998; Oronzo-Barocio et al., 1999; Palacios-Corona et al., 1999) y que ha sido previamente utilizado para el estudio del efecto de actividad antitumoral y/o citotóxica de diferentes compuestos (Puebla-Pérez et al., 1998; Oronzo-Barocio et al., 1999). La caracterización de este modelo indica que el linfoma L-5178-Y (107 células por vía intraperitoneal) es un tumor agresivo que invariablemente mata al hospedero en cuestión de días y que cursa con una supresión de la respuesta inmune celular mediada por linfocitos T, como lo indican la falla en la respuesta durante la prueba de hipersensibilidad por contacto al DNFB y en la respuesta proliferativa (ver más adelante).
La supresión de la respuesta inmune celular en este modelo es
dependiente del tiempo de evolución del tumor en el hospedero: conforme evoluciona el tumor en la cavidad abdominal de los ratones, el grado de supresión de la respuesta inmune dependiente de las células T es mayor. Una de las evidencias que indican que la inmunosupresión es efecto de la presencia de las células tumorales es la cercana coincidencia que existe entre el tiempo al que comienzan a morir los ratones con linfoma (15 días de evolución del tumor), el tiempo al que alcanzan el peso corporal máximo por la acumulación de líquido ascítico y células tumorales en la cavidad abdominal, que como se discutirá más tarde está asociado a cáncer avanzado con un pronóstico negativo (15 días de evolución del tumor), ausencia de respuesta 72
en la prueba de hipersensibilidad por contacto al DNFB (16 días de evolución del tumor) y ausencia de la respuesta linfoproliferativa ante un estímulo mitogénico (14 días de evolución del tumor). Una de las estrategias terapéuticas actualmente utilizadas en el tratamiento del cáncer es la modulación de la respuesta inmune celular del hospedero por medio de diferentes compuestos (Powles, 1979; Shu et al., 1997; Lillehei et al., 1999; Beers y Berkow, 1999; Davis, 2000). En este trabajo se caracterizó el efecto del tratamiento con el inmunomodulador de origen tímico T-activina, a una dosis de 10 µg/ratón durante 10 días, iniciando el tratamiento al mismo día que se inocularon 1x107 células tumorales, sobre la respuesta inmune mediada por células T. El esquema de tratamiento con T-activina se eligió con base en los resultados de las 2 pruebas in vivo que se realizaron: la prueba de hipersensibilidad por contacto al DNFB y el tiempo de vida de los ratones, que nos dieron indicios de una mejoría general de los ratones. Uno de los primeros signos evidentes en los ratones portadores de linfoma fue un incremento en el peso corporal acompañado de distensión de la cavidad abdominal debido a una acumulación de fluido ascítico. Este fluido ha sido observado en patologías como la cirrosis del hígado, deficiencia cardiaca, invasión de la cavidad abdominal por tumores, tuberculosis, enfermedad pancreática y nefrosis, entre otras (Parsons et al., 1996). El líquido ascítico maligno, como el desarrollado en los ratones con linfoma L-5178-Y, es aquel que contiene células cancerosas y se presenta en cerca del 10% de todos los casos de ascitis (Parsons et al., 1996; Aslam y Marino, 2001). Es una manifestación de cáncer avanzado, causado principalmente por tumores en la cavidad abdominal, que puede generar un cambio en el peso corporal, que puede ser una ganancia de peso debido a la acumulación de fluido ascítico o una pérdida como resultado de fallas en distintos órganos por la evolución del tumor, y en cualquier caso está asociado con un pronóstico negativo (Parsons et al., 1996). Esto concuerda con lo encontrado en los resultados con el modelo estudiado donde los ratones con linfoma aumentaron gradualmente de peso y al día 10 de evolución del linfoma que es cuando ya existe una diferencia significativa en el peso corporal de los 73
ratones con linfoma comparados con los ratones control (figura 11), se puede considerar que el cáncer se encuentra en estado avanzado lo que puede confirmarse por el hecho de que la supresión de la respuesta inmune está ya bien establecida (figuras 12 y 14) y por otro lado, la llegada del ratón a su peso máximo y su posterior decremento, fue una indicación de que la muerte estaba próxima. Para los pacientes que presentan acumulación de líquido ascítico maligno existe un amplio rango de tratamientos disponibles, desde las medidas puramente paliativas hasta intervenciones terapéuticas muy agresivas. En la mayoría de los casos el alivio del fluido ascítico representa el principal fin terapéutico, sin embargo, la administración de diuréticos, la paracentesis de grandes volúmenes y el manejo convencional del cáncer subyacente que son las estrategias para el tratamiento de la ascitis, tienen una eficacia limitada (Aslam y Marino, 2001). En los ratones con linfoma L-5178-Y, un peso corporal de menos de 30 g y la ausencia de distensión del abdomen por la presencia de líquido ascítico y células tumorales, se consideran parámetros para evaluar a un ratón como clínicamente normal (Marsili et al., 1983). Si bien las diferencias encontradas en el volumen de líquido ascítico y el número de células tumorales entre los ratones con linfoma con y sin tratamiento no son estadísticamente significativas, el hallazgo de una disminución en ambos parámetros en cada uno de los casos que se analizaron permite deducir que al menos parte del efecto de la T-activina sobre el peso corporal podría deberse a estas disminuciones. Para que una respuesta inmune celular mediada por células T dé inicio es necesario que éstas sean estimuladas, sufran una expansión clonal (proliferación y diferenciación de los linfocitos T que poseen un receptor específico para el antígeno que está provocando la respuesta) y secreten las citocinas necesarias para mediar su funcionamiento. Una manera de evaluar el estado de esta respuesta es mediante la prueba in vivo de hipersensibilidad por contacto (Xu et al., 1996; Kehren et al., 1999), y la prueba de linfoproliferación in vitro (Abbas et al., 1997; Shanker y Singh, 2000). Como se mencionó en material y métodos, la prueba de hipersensibilidad por contacto es una reacción inflamatoria cutánea mediada por células T utilizada para 74
examinar la respuesta de estas células donde los linfocitos CD8+ tipo 1 (Tc1) tienen un papel efector por medio del IFN-γ que producen, mientras que las células CD4+ tipo 2 (Th2) participan como reguladoras, al producir tanto IL-4 como IL-10, las cuales inhiben la respuesta (Xu et al., 1996; Kehren et al., 1999). Por otro lado la proliferación de linfocitos T in vitro ante un estímulo mitogénico permite tener un panorama general del estado de la respuesta inmune celular del individuo (Abbas et al., 1997; Shanker y Singh, 2000). Los ratones portadores del linfoma L-5178-Y poseen una respuesta inmune celular disminuida como lo demostraron tanto la prueba de hipersensibilidad por contacto (figura 19) como la prueba de proliferación celular (figura 20). Este efecto de las células tumorales se ve revertido de manera total con el tratamiento con Tactivina en la prueba de hipersensibilidad por contacto. Una de las observaciones hechas tanto en la prueba de hipersensibilidad por contacto como en la de linfoproliferación, es que los ratones sanos tratados con T-activina presentaron siempre respuestas de menor magnitud que las observadas en ratones sanos sin tratamiento (figuras 19 y 20), aunque sólo en la respuesta linfoproliferativa fue estadísticamente significativa. Por lo anterior, en esta prueba se observa una recuperación parcial en ratones con linfoma que recibieron tratamiento si se comparan con los ratones sanos que no recibieron tratamiento, pero total comparada con ratones sanos que recibieron tratamiento. Esta menor respuesta en los ratones sanos
tratados
con
T-activina
puede
ser
una
evidencia
de
su
efecto
inmunomodulador ya que durante el estímulo mitogénico se produce una activación policlonal, es decir, hay activación de un gran número de células T pertenecientes a diferentes clonas;
por lo que en los ratones sanos tratados con T-activina, esta
respuesta exacerbada pudiera ser modulada. Por otro lado, existen evidencias experimentales de que las células T CD8+ requieren poseer actividad citotóxica, independientemente de si se utiliza la vía de Fas y su ligando o la vía de la perforina, para mediar la respuesta de hipersensibilidad por contacto al DNFB (Kehren et al., 1999). Así, los ratones con el linfoma L-5178-Y podrían presentar una falla en la acción citotóxica de las células CD8+ que se ve 75
recuperada por el tratamiento con T-activina, efecto que pudiera explicar el mejoramiento general de lo ratones tratados con el inmunomodulador, ya que en la resolución del cáncer es primordial la respuesta citotóxica para la eliminación de las células cancerosas (Abbas et al., 1997). Hay evidencias de que el efecto de las células tumorales en la respuesta inmune mediada por células puede darse en etapas muy tempranas del desarrollo del tumor y que la interacción con su hospedero es por medio de factores secretados por las células tumorales (Segura et al., 1997; Palacios-Corona et al., 1999). Daneri y cols. (1995) demostraron la presencia de un factor proteico de 35-66 kDa en el líquido ascítico de los ratones portadores del linfoma L-5178-Y que explica la supresión de la respuesta de hipersensibilidad al DNFB durante la fase de sensibilización. Ellos concluyen que la supresión de la respuesta inmune se da en etapas muy tempranas por lo cual es imposible activar a la respuesta inmune una vez que el factor es producido. En el presente trabajo, los ratones con linfoma L-5178-Y son sensibilizados a los 10 días de desarrollo del tumor, tiempo al cual, de acuerdo con Daneri y cols. el factor supresor ya se produjo. Sin embargo, como se mencionó, en los ratones con linfoma tratados con T-activina la recuperación de la respuesta de hipersensibilidad al DNFB es total, por lo que puede deducirse que parte del efecto de la T-activina al mejorar la respuesta inmune celular es bloqueando la producción o el efecto de este factor supresor. Un decremento en la respuesta al DNFB y en la respuesta proliferativa en ratones con linfoma indica una supresión de la actividad de las células T que puede estar asociado a una alteración en los niveles de citocinas.
Como se mencionó
anteriormente, las citocinas juegan un papel importante en la generación y mantenimiento de cualquier respuesta inmune. La concentración de citocinas en los sobrenadantes de cultivo que no fueron estimulados (ex vivo) refleja las condiciones del organismo al momento de obtener las células, es decir, la existencia de células capaces de producir cierta citocina. La estimulación de las células con un mitógeno (in vitro) refleja la capacidad de respuesta de las células ante un estímulo para sintetizar las citocinas. La comparación entre la concentración de citocinas ex vivo e 76
in vitro nos permitió comprobar que las células hubieran tenido una buena estimulación, necesaria para la síntesis y liberación de las citocinas al medio. De acuerdo con el papel de las citocinas en la fase de elucidación, un decremento en la respuesta durante la prueba de hipersensibilidad por contacto como la observada en los ratones con linfoma, podría estar indicando una disminuida producción de IFN-γ por parte de las células Tc1, un exceso de IL-4 e IL-10 por parte de las células Th2 y/o alguna falla en otros procesos que no podríamos determinar con esta prueba, como fallas en la presentación del antígeno, fallas en la migración de las células presentadoras de antígeno, fallas en la activación de linfocitos T, entre otras (Xu et al., 1996; Black, 1999; Kehren et al., 1999). Según los resultados obtenidos al medir la concentración de citocinas in vitro, la disminución en la respuesta al DNFB puede ser explicada por un decremento en la concentración de IFN-γ observado en los cultivos de linfocitos provenientes de ratones con linfoma, ya que los niveles de IL-4 fueron bajos y aunque los niveles de IL-10 no se determinaron, de haber sido altos hubieran inhibido la producción de IFN-γ (Seder y Mosmann, 1999). La total recuperación en la respuesta al DNFB con el tratamiento podría ser explicada por la recuperación, también total, en las concentraciones de IFN-γ (ver figura 22, panel C), efecto observado previamente en los niveles de ARNm (Barajas et al., 2003). La supresión de la respuesta proliferativa de linfocitos esplénicos ha sido previamente reportada no sólo en otro modelo de linfoma de células T (linfoma de Dalton) (Shanker y Singh, 2000) sino también en otros tipos de tumores (Loercher et al., 1999; Shanker y Singh, 2000). Han sido propuestos algunos mecanismos para explicar la disminuida respuesta de los linfocitos T inducida por un tumor, éstas incluyen la secreción de citocinas inmunosupresoras por las células tumorales, la disminuida producción de linfocinas y factores de crecimiento por las células del sistema inmune, la inducción de anergia de células T por fallas en la estimulación, la inducción de actividad supresora por parte de las células T, la deleción de clonas específicas para el tumor, entre otras (Shanker y Singh, 2000). Al medir las concentraciones de las 2 citocinas que sirven como factores de crecimiento de los 77
linfocitos T tipo 1 y 2, la IL-2 y la IL-4, respectivamente (Swain et al., 1990; Abehsira-Amar et al., 1992; Abbas et al., 1996; Huber et al., 1996), observamos que en los ratones portadores del linfoma ambos factores se encuentran disminuidos y que el tratamiento con T-activina no revierte este efecto lo cual coincide con lo encontrado el medir los niveles de ARNm (Barajas et al., 2003), sin embargo, sí normalizó la respuesta linfoproliferativa.
Una posible explicación es que la baja
producción de los factores de crecimiento no sea el factor que esté determinando la falla en la proliferación de las células T y que las células tumorales estén produciendo daños en otros procesos que la T-activina sí logra normalizar, o bien, que se estén activando vías alternas independientes de estas citocinas como la descrita para la proliferación de células tipo 2 que es independiente de IL-4 y que es mediada por IL1 (Huber et al., 1996). En la mayoría de los diferentes tipos de cáncer se observa un cambio de una respuesta predominante tipo 1 a una respuesta tipo 2 en presencia de las células tumorales, lo que favorece el desarrollo de un tumor (Goto et al., 1999; Uno et al., 2000). La cepa de ratones utilizada en este trabajo (Balb/c) tiene una predisposición genética al predominio de respuestas mediadas por citocinas tipo 2 (Schulte et al., 1997; Bix et al., 1998) como se ve reflejado en los bajos niveles de IFN-γ y los altos niveles de IL-4 ex vivo, en ratones control. En los ratones con linfoma L-5178-Y hay una clara supresión de la respuesta de los linfocitos T para producir tanto la citocina representativa tipo 1 (IFN-γ) como la tipo 2 (IL-4), efecto que se ha observado en otros tipos de tumores (Ramiya et al., 2002; Jones et al., 2002) y que sugiere que este linfoma provoca una desregulación de ambos tipos celulares. Uno de los efectos más significativos de la T-activina sobre la producción de citocinas en los ratones con linfoma, es la alta producción de IFN-γ que se observa en los resultados en la prueba de ELISA tanto ex vivo como in vitro, que indica un cambio en la respuesta inmune de los ratones hacia una predominancia de células tipo 1 que como se mencionó, en la mayoría de los casos ofrece un efecto protector ante el desarrollo de un tumor (Goto et al., 1999; Uno et al., 2000). Esta citocina es producida además de por las células T, por las células NK, macrófagos y células dendríticas bajo ciertas 78
condiciones (Boehm et al., 1997; Ikeda et al., 2002). No obstante la variedad de fuentes, existen evidencias experimentales utilizando ratones que no poseen células T (ratones nude), que indican que en ausencia de estas células los niveles de IFN-γ pueden no verse afectados pero que para el efecto antitumoral, son necesarias las células T (Segal et al., 2002). El efecto del IFN-γ es a través de su unión a un receptor de alta afinidad que se encuentra en prácticamente todas las células normales (figura 28) (Huang et al., 1993; Ikeda et al., 2002). Utiliza la señal de transducción llamada JAK-STAT (para detalles ver apéndice) que se inicia cuando un homodímero de IFN-γ se une al receptor y que da por resultado la formación de un factor de transcripción que se une a elementos promotores conocidos como elementos GAS (por sus siglas en inglés, gamma-interferon activated sites) que tienen efecto sobre la transcripción de distintos genes (Ikeda et al., 2002). El papel del IFN-γ en la protección y erradicación de los tumores está ampliamente documentado (Boehm et al., 1997; Kaplan et al., 1998; Dobrzanski et al., 2000; Jonasch y Haluska, 2001; Ikeda et al., 2002; Luo et al., 2003). El IFN-γ juega un papel importante en la vigilancia inmunológica y hay evidencias de que participa en contra de tumores tanto espontáneos como inducidos químicamente, sugiriendo un mecanismo generalizado para controlar el desarrollo de tumores en ratones y en humanos (Kaplan et al., 1998). Si bien hay evidencias claras de la participación del IFN-γ en la vigilancia inmunológica, las bases moleculares de estos procesos no están totalmente dilucidadas. Los mecanismos de acción más estudiados son, las funciones no inmunológicas dependientes de IFN-γ como el efecto sobre el crecimiento tumoral y la angiogénesis y las funciones inmunológicas tanto en la inmunidad innata como en la adquirida (Kaplan et al., 1998; Ikeda et al., 2002).
79
Figura 28. Mecanismo de acción del IFN-γ. La unión de un homodímero de IFN-γ a su receptor genera una señal intracelular por medio de la vía JAK-STAT generando un factor que se une a la región promotora denominada GAS, reguladora de la transcripción de diversos genes (Modificado de www.rndsystems.com/asp/b_index.asp).
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El IFN-γ ejerce efectos antiproliferativos sobre las células tumorales mediante la activación de genes que codifican proteínas inhibidoras que afectan la progresión del ciclo celular (Ikeda et al., 2002). Esta misma vía ha sido implicada en la promoción de la apoptosis en las células tumorales mediante la activación de genes que codifican componentes de membrana o intracelulares como la caspasa-1 o Fas y su ligando que se sabe que promueven el mecanismo de apoptosis (Ikeda et al., 2002). Estos 2 efectos podrían explicar los hallazgos en la disminución del número de células tumorales en el líquido ascítico de los ratones con linfoma que recibieron tratamiento con T-activina y con esto la disminución en el peso corporal. Otras evidencias indican que algunos de los efectos antitumorales del IFN-γ podrían estar mediados a través de mecanismos que involucran la inhibición de la angiogénesis dentro del tumor (Ikeda et al., 2002). En el linfoma utilizado en este trabajo, este efecto únicamente se podría haber observado en etapas muy avanzadas del desarrollo del tumor, cuando ha sufrido metástasis y crece como un tumor sólido que requiere nuevos vasos sanguíneos para su crecimiento. Al tiempo en que se utilizaron los ratones para los experimentos (10 días) todavía no se observaba metástasis a sitios donde pudiera crecer de manera sólida (datos no mostrados). Dentro de los efectos sobre la respuesta inmune innata, el IFN-γ es reconocido como el principal activador de macrófagos y es capaz de inducir en ellos la capacidad de matar de manera no específica una gran variedad de células tumorales a través de la producción de grandes cantidades de intermediarios reactivos de oxígeno y nitrógeno (Boehm et al., 1997; Ikeda et al., 2002) y además induce la expresión, en estas mismas células, de ligandos citotóxicos de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF) como TNFα, el ligando de Fas, y el ligando inductor de apoptosis (TRAIL) (Ikeda et al., 2002). Palacios-Corona y cols. (1999) demostraron que las células del linfoma L-5178-Y secretan un factor soluble que inhibe la activación de macrófagos peritoneales en los ratones portadores del tumor, pero que esa inhibición puede ser reversible en presencia de IFN-γ el cual inactiva al factor inhibidor. Las altas concentraciones de IFN-γ en ratones portadores de linfoma tratados con Tactivina podrían no únicamente estar inactivando a este factor sino además activando 81
macrófagos para que, por medio de una retroalimentación positiva, produzcan más IFN-γ. La producción de IFN-γ por linfocitos T y macrófagos podría a su vez, activar a las células NK e incrementar la lisis de células tumorales por los mismos mecanismos que los LTc (Abbas et al., 1997; Kaplan et al., 1998). Por otro lado, dentro de los efectos del IFN-γ en la respuesta inmune adquirida, esta citocina incrementa la producción de IL-12 por macrófagos y neutrófilos y juntas participan en la diferenciación de los linfocitos T hacia células tipo 1 inhibiendo la diferenciación hacia células tipo 2, jugando un papel importante en dirigir el apropiado balance entre los dos tipos de respuesta durante el desarrollo de la respuesta inmune antitumoral (Boehm et al., 1997; Kaplan et al., 1998; Ikeda et al., 2002). Además, el IFN-γ participa en la regulación de genes que participan en las vías de presentación de antígenos asociados tanto a las moléculas del MHC clase I como a la clase II, necesarias para la activación de las células T (Boehm et al., 1997; Kaplan et al., 1998) y se ha especulado que podría inducir en las células tumorales la expresión de proteínas que participan en estas vías, permitiendo su reconocimiento y eliminación por el sistema inmune (Kaplan et al., 1998). Como se mencionó en la introducción, la respuesta antitumoral específica depende de la participación
tanto de la población de células T CD8+ como de la
población CD4+ (Kenneth, et al., 1998; Lillehei et al., 1999). El desbalance en la relación CD8+/CD4+ observado en los ratones portadores del linfoma L-5178-Y pudiera explicar la inmunosupresión que se presenta. Existen datos en otro modelo de linfoma de células T de crecimiento ascítico, que también produce efectos negativos sobre la respuesta inmune celular mediada por linfocitos T, que es capaz de generar una involución del timo acompañada de una alteración en la distribución de timocitos con decremento en las poblaciones CD8+ y CD4+ (Shanker et al., 2000; Shanker y Singh, 2000). Aunque no tenemos datos que sugieran que el desbalance en la relación CD8+/CD4+ observado en ratones portadores de linfoma L-5178-Y se deba a un efecto sobre la función tímica, no podemos descartar que la normalización de la relación CD8+/CD4+ con el tratamiento con T-activina (tabla 3 y figura 24) podría deberse a la capacidad de este factor tímico de suprimir la involución del timo 82
y de acelerar la maduración de los linfocitos y su migración hacia la periferia (Arion et al., 1984; Koval’skaia et al., 1990). Si bien no conocemos totalmente los mecanismos moleculares por los que la T activina ejerce sus efectos, se observa que hay una recuperación de la respuesta inmune celular en los ratones portadores de linfoma que pudiera explicar el aumento observado en el tiempo de vida (figura 25) y de acuerdo con Lempereur y cols. (1999) también podría tener efecto sobre la calidad de vida.
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CONCLUSIONES Con los datos obtenidos en este trabajo se demuestra que el crecimiento progresivo del linfoma L-5178-Y guía a un desbalance en la proporción de células T CD8+/CD4+ y a un daño en sus funciones, tanto en su respuesta proliferativa como en sus funciones efectoras, asociado a un perfil alterado de producción de citocinas tipo 1 y 2, lo que lo hacen un modelo adecuado para probar el efecto de sustancias inmunomoduladoras para el tratamiento del cáncer. El tratamiento con el inmunomodulador T-activina revierte en gran medida los efectos que el tumor tiene sobre la respuesta inmune mediada por células T y este efecto se debe a la normalización de las poblaciones CD8+/CD4+ y al incremento no únicamente en la expresión del gen para IFN-γ sino también en su producción y liberación al medio extracelular. La reversibilidad de la disfunción de células T sugiere que es posible superar los efectos nocivos del tumor sobre la respuesta inmune, a través de estrategias efectivas de inmunoterapia.
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PERSPECTIVAS En el desarrollo y erradicación de un tumor juegan un papel importante tanto las células del sistema inmune como las células tumorales. Si bien en este trabajo se exploró el efecto del inmunomodulador T-activina sobre los mecanismos básicos más generales de la respuesta inmune celular mediada por linfocitos T, se propone por un lado dilucidar mecanismos más finos del efecto de la T-activina y por otro estudiar el efecto de la T-activina sobre las células tumorales, para lo cual se proponen los siguientes experimentos: 1) Probar el efecto de la T-activina y otros factores tímicos disponibles comercialmente para comparar su efecto con lo encontrado en este trabajo donde se utilizó T-activina proporcionada por un laboratorio de investigación. 2) Estudiar el efecto del inmunomodulador sobre poblaciones de células aisladas para lo cual se propone purificar a los linfocitos T y sus subpoblaciones, para saber la participación de los linfocitos T CD8+ y CD4+ de manera individual. 3) Purificar células asesinas naturales (NK) y probar el efecto de la T-activina sobre estas células ya que juegan un papel muy importante en la resolución del cáncer en situaciones en las que los antígenos tumorales no se presentan asociados al MHC clases I y II. 4) Medir la concentración de citocinas en el líquido ascítico y en el plasma de los ratones que recibieron tratamiento para conocer de manera más directa qué citocinas se encuentran presentes en el ratón portador del linfoma en el momento de realizar las pruebas in vivo. 5) Estudiar el efecto de la T-activina sobre las células tumorales para conocer si el efecto observado con el tratamiento con T-activina se debe al menos en parte a un efecto directo sobre su capacidad proliferativa y/o producción de citocinas por parte de estas células. 6) Medir las citocinas producidas por las células cancerosas in vitro para saber si la disminuida respuesta inmune celular se debe a la producción de citocinas
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con propiedades inmunosupresoras como la IL-10 y si la T-activina modula su producción.
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APENDICE Interleucina-2 (IL-2). La IL-2, originalmente llamada factor de crecimiento de células T es una glicoproteína de 14 a 17 KD sintetizada y secretada por las células T después de su activación, que promueve el crecimiento, diferenciación y activación funcional de una variedad de células incluyendo las mismas células T productoras de esta interleucina. La cantidad de IL-2 sintetizada por las células T activadas es un factor que determina la magnitud de las respuestas inmunes dependientes de células T. Sus efectos sobre las células T están mediados por su unión al receptor de IL-2 (IL-2R). Los efectos de la IL-2 sobre sus células blanco incluyen mitogénesis en células Th1 siendo el principal factor promotor de la progresión del ciclo celular de la fase G1 a la fase S, estimulación de la citotoxicidad en linfocitos T citotóxicos y en células asesinas naturales (NK), y la generación de células asesinas activadas por linfocinas a partir de células NK, además de cooperar en la activación de las células B y en la función fagocítica de los macrófagos (Gomez et al., 1998). La IL-2 juega un papel importante en la activación de la respuesta inmune contra tumores. La aplicación de IL-2 estimula la actividad citotóxica de los linfocitos T contra células tumorales, en células tumorales transfectadas con el gen de la IL-2 se suprime marcadamente su crecimiento y el grado de supresión se correlaciona directamente con los niveles de IL-2 producidos por las células tumorales. En estudios clínicos, la administración de IL-2 recombinante en pacientes con cáncer es capaz de provocar fases de remisión, eleva la actividad de las células NK (BarreraRodríguez et al., 1995). Si bien muchos de los resultados parecen alentadores, los pacientes con algunos tipos de cánceres más comunes como
los carcinomas de
colon, pulmón y mama no se ven beneficiados con la administración de IL-2.
87
Interferón-γγ (IFN-γγ ). Los interferones son una familia de proteínas que inicialmente abarcaba 3 diferentes clases: α, β y γ, los cuales se definieron con base en sus diferencias químicas, antigénicas y biológicas resultado de la secuencia primaria de sus aminoácidos. Posteriormente se identificaron 2 clases más: ω y τ. El IFN-ω se une a los mismos receptores que los interferones IFN-α y IFN-β y tienen efectos biológicos similares. El IFN-τ se ha identificado en rumiantes pero no en humanos (Vestal et al., 2001). Los principales productores de IFN-γ son las células NK activadas, la subpoblación Th1 de células CD4+, y las células citotóxicas de la subpoblación Tc1 (Boehm et al., 1997; Ikeda et al., 2002) pero también puede ser producido por células dendríticas y macrófagos cuando se encuentran en presencia de IL-12 e IL18, aunque el papel del IFN-γ producido por estas células no es claro (Ikeda et al., 2002). En contraste con el IFN-γ humano, el IFN-γ de ratón está codificado por una sola copia del gen, generando una sola molécula de RNAm de 12 kb y un polipéptido de 166 residuos incluyendo una secuencia señal de 23 residuos. El IFN-γ biológicamente activo se encuentra en la forma de un homodímero no covalente de 34 kDa (Boehm et al., 1997). En las células T, el principal inductor de IFN-γ es el reconocimiento de una molécula por el receptor de células, sujeto a otras condiciones reguladoras impuestas por el estado de diferenciación de la célula respondedora. En células NK, la producción de IFN-γ es estimulada por citocinas derivadas de macrófagos, especialmente IL-12 y TNF-α y es autoestimulada por el mismo IFN-γ (Boehm et al., 1997). El IFN-γ interactúa con un receptor específico localizado en la superficie de todas las células nucleadas. El receptor consiste de 2 subunidades: una cadena α de 90 kDa llamada IFNGR1 que presenta la propiedad de unión de alta afinidad y una cadena β denominada IFNGR2 requerida principalmente para señalización (Boehm et al., 1997; Ikeda et al., 2002). La vía de transducción de la señal es a través de la vía JAK-STAT, vía que regula la transcripción de genes inducibles
por IFN-γ. Esta vía
requiere de 3 componentes denominados Jak1, Jak2 y Stat1 (Ikeda et al., 2002). En 88
células no estimuladas, las subunidades del receptor se asocian por medio de dominios intracelulares con formas inactivas de las cinasas Jak1 y Jak2. Jak1 se une a la porción proximal a la membrana del dominio extracelular de IFNGR1 mientras que Jak2 se asocia con el dominio intracelular de IFNGR2 (Ikeda et al., 2002). La señal de transducción se inicia cuando un homodímero de IFN-γ se une al receptor e induce la activación de Jak1 y Jak2
por mecanismos que involucran
auto y
transfosforilación. Las cinasas activadas fosforilan un residuo de tirosina en una secuencia cercana al extremo carboxilo de IFNGR1 que posteriormente es reconocida por el dominio SH2 de Stat1. Dos moléculas de Stat1 se unen al receptor activado muy cercanas a las cinasas previamente activadas y son fosforiladas en residuos específicos de tirosina en el extremo carboxilo. Las 2 proteínas Stat1 fosforiladas se disocian de IFNGR1, forman un homodímero que es fosforilado en residuos de serina durante el proceso de activación y que posteriormente es traslocado al núcleo celular. En el núcleo, los homodímeros de Stat1 se unen a elementos promotores específicos conocidos como elementos GAS o sitios activados por IFN-γ y afectan la transcripción de genes inducidos por IFN-γ (Ikeda et al., 2002). Los efectos antitumorales de los interferones pueden clasificarse en 2 amplias categorías: 1) efectos proapoptóticos o efectos antiproliferativos directos sobre las células tumorales y 2) inducción indirecta de mecanismos antitumorales del hospedero (mecanismos encaminados a incrementar la función inmune, inhibir la angiogénesis, incrementar la expresión de antígenos de superficie tumorales o una combinación de los tres) (Vestal et al., 2001; Ikeda et al., 2002). El IFN-γ incrementa la expresión de la clase II del MHC los cuales presentan antígenos a las células CD4+. Esas células responden proliferando y secretando más IFN-γ, lo que genera una retroalimentación positiva. El IFN-γ
también incrementa la
citotoxicidad no restringida al MHC. Esos tumores son capaces de ser reconocidos por macrófagos por un mecanismo pobremente entendido donde no se involucra al MHC. Esta actividad antitumoral por medio de macrófagos es también incrementada por IFN-γ que, además de aumentar la producción de moléculas oxidantes, permite que 89
los macrófagos respondan ante lipopolisacáridos bacterianos y mitógenos. Esos macrófagos totalmente activados secretan
IFN-α
y algunos compuestos
responsables de la citotoxicidad tumoral tal como el factor de necrosis tumoral-α, superóxidos, y radicales libres. El IFN-γ podría también inhibir la angiogénesis bloqueando la proliferación de células endoteliales e inhibiendo la síntesis de colágeno (Vestal et al., 2001). La actividad antitumoral del IFN-γ se ha evaluado en pacientes con linfomas Hodgkin y no-Hodgkin, leucemia mielocítica crónica, leucemia T del adulto, cáncer de ovario, melanoma y carcinoma renal. Los mejores resultados se han obtenido con tumores de origen hematológico como los linfomas, donde cerca del 50% responden al tratamiento (Barrera-Rodríguez et al., 1995).
90
Interleucina-4 (IL-4). La IL-4 es una citocina de aproximadamente 20 KDa que regula
las reacciones
inmunes mediadas por eosinófilos/células cebada e IgE. La principal fuente de IL-4 son los linfocitos T CD4+, específicamente la subpoblación Th2, pero también es producida por las células cebada (Splawski y Lipsky, 1990). El receptor de IL-4 está expresado en células hematopoyéticas y no hematopoyéticas lo que sugiere que la IL-4 tiene efecto sobre una gran variedad de tipos celulares (Splawski y Lipsky, 1990). Esta citocina fue inicialmente caracterizada por su actividad estimulatoria sobre el crecimiento de células B en sistemas murinos y posteriormente se describieron sus efectos sobre el desarrollo de células T tanto de humanos como en sistemas murinos (Splawski y Lipsky, 1990). En murinos, la IL-4 juega un papel predominante en regular la función de las células B, con efectos sobre la activación, proliferación y diferenciación. Además, incrementa la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad clase II y de la molécula CD23 (receptor de baja afinidad para IgE) (Splawski y Lipsky, 1990) Entre las acciones de la IL-4 están estimular la producción de IgE, el principal mediador de las reacciones de hipersensibilidad inmediata (alergias), promover la diferenciación y crecimiento de las células Th2, estimular la expresión de algunas moléculas de adhesión, de manera importante de la molécula 1 de adhesión celular vascular (VCAM-1) en las células endoteliales, incrementando la unión de linfocitos T, monocitos y especialmente eosinófilos. La IL-4 es capaz de producir inhibición del crecimiento tumoral y el mecanismo propuesto es a través de activar macrófagos con actividad antitumoral (BarreraRodríguez et al., 1995).
91
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