UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA

PRACTICAS DE LABORATORIO IDENTIFICACION BACTERIANA II Maye Bernal Rivera

PARTE II. LECTURA E INTERPRETACION DE LOS CULTIVOS Para la lectura, interpretación e identificación del crecimiento bacteriano, primero que todo se sigue un estudio cualitativo que comprende los siguientes parámetros: 1. Características Macroscópicas de las colonias a. Medios Líquidos i. ii. iii. iv.

Enturbiamiento: parejo, en ondas, cordones suspendidos. Capas superficiales. Precipitados: polvoriento, granuloso, viscoso. Pigmentos di fusibles.

b. Medios Sólidos. Estudio de Colonias: i. Tamaño : puntiforme, pequeño, mediano, grande, extendidas en velo, invadiendo toda la superficie del medio. ii. Forma: circular, alargada, irregular, filamentosa, rizoide, fusiforme. iii. Bordes: enteros, dentados, lobulados, rizoides. iv. Superficie: lisa, rugosa. v. Levantamiento: plana, convexa, acuminada, umbilical vi. Consistencia: mucoide, friable, seca, viscosa vii. Transparencia: transparente, traslucida, opaca viii. Color: blanco, amarillo, gris, verde, rojo, etc. 2. Cambios Producidos en el medio a. Pigmentos difusibles (bacterias pancromóforas) que cambian el color del medio: verde, amarillo, rojo, marrón, etc. b. Olor: algunas bacterias emiten olores característicos, como a frutas, chocolate, queso, etc. c. Hemólisis: alfa, beta, beta prima y gamma o no hemolíticas. d. Metabolismo 3. Características Microscópicas de la Colonia

Las características microscópicas de las colonias se estudian mediante la coloración de Gram, una coloración compuesta, que permite clasificar las bacterias en dos grandes grupos: Gram Positivas y Gram Negativas. La coloración fue desarrollada en 1884 por Hans Christian Joachim Gram, farmacólogo, patólogo y eminente profesor de Medicina Interna. Esta coloración posiblemente es el procedimiento más trascendental para el diagnóstico bacteriológico jamás desarrollado. Además de la afinidad, esta coloración permite establecer:

Hans Christian Joachim Gram. 1853 - 1938

a. Morfología (cocos, bacilos, espirilos, cocobacilos, vibrios, etc.) b. Agrupación (en pares, cadenas, tétradas, racimo, sarcina, empalizada, caracteres, etc.) c. Afinidad: Gram positiva o Gram negativa d. Otras estructuras: A veces la coloración de Gram permite observar cápsulas, pero hay coloraciones específicas para determinar la presencia de otras estructuras bacterianas, como por ejemplo: i. ii. iii. iv.

Cápsula ( Tinta China, Hiss ) Esporos ( Shaeffer Fulton ) Flagelos ( Leiffson ) Gránulos metacromáticos ( Van Stoltemberg, Loeffler )

Coloración de Gram Procedimiento: 1. Cristal Violeta -

Lavar con agua corriente

2. Lugol -

5 segundos

Lavar con agua corriente

4. Safranina -

1 minuto

Lavar con agua corriente

3. Alcohol Acetona -

1 minuto

30 segundos

Lavar con agua corriente

4. Pruebas bioquímicas 5. Pruebas Biológicas El uso de animales para el aislamiento y la identificación de agentes patógenos está limitado a laboratorios de experimentación, ya que hoy en día se cuenta con equipos automatizados y pruebas inmunológicas y moleculares para llegar al diagnóstico etiológico del agente infeccioso. 6. Pruebas Inmunológicas

Se basan en la utilización de anticuerpos específicos para la detección de antígenos presentes en las bacterias (polisacáridos capsulares, proteínas flagelares y otros varios componentes de la pared celular). La detección puede hacerse en la bacteria completa o libre, en antígenos solubles 7. Pruebas de Biología Molecular Estas pruebas se han convertido hoy en día en el criterio principal para la clasificación taxonómica, la identificación bacteriana, el diagnóstico etiológico en enfermedades infecciosas y estudios epidemiológicos; basadas en el grado de relación entre las secuencias de los ácidos nucleicos, mediante análisis bien sea del DNA o RNA de los microorganismos.

PRACTICA DE LABORATORIO PARTE II. LECTURA E INTERPRETACION DE LOS CULTIVOS Objetivos específicos -

Observar el desarrollo bacteriano en los diferentes medios de cultivo Estudiar las características macroscópicas de una bacteria en un medio de cultivo Estudiar los cambios producidos en los diferentes medios Preparar frotis en láminas portaobjetos, a partir de cultivos bacterianos en medio líquido y en medio sólido Aprender a realizar la coloración de Gram Conocer las diferentes características morfológicas bacterianas Conocer los diferentes tipos de agrupación bacteriano Diferenciar las bacterias Gram positivas de las Gram negativas. Conocer cultivos mixtos Aprender a distinguir los tipos de hemólisis

Materiales - Cultivos bacterianos - Láminas, asas, mecheros, marcador de vidrio, papel absorbente - Colorantes para Gram - Microscopio y aceite de inmersión - Faringocultivo Procedimiento 1. Estudio Macroscópico Observar cada uno de los seis medios de cultivo sembrados: a. Caldo: Estudiar las características, de acuerdo a las especificaciones de arriba b. Agar Nutritivo inclinado: Observar si hubo o no crecimiento en la superficie c. Agar semisólido: Especificar si hubo o no crecimiento y si creció, determinar si es móvil o inmóvil d. Agar Nutritivo: Observar si hubo crecimiento y si se produjo cambios en el medio. e. Agar Sangre: Observar si el cultivo está puro (un solo tipo de colonias) o mixto (más de un tipo de colonias). Escoger una colonia aislada y estudiar sus 8 características macroscópicas, cambios producidos en el medio (hemólisis), aspecto, olor, etc. f. Agar Mac Conkey: Establecer si hubo o no crecimiento bacteriano. Si hubo crecimiento, especificar si se trata de una bacteria lactosa positiva o lactosa negativa. 2. Estudio Microscópico Hacer frotis a partir del caldo y a partir de una colonia del agar sangre.

Procedimiento 1. Identificar la lámina: Destinar un tercio de la lámina para identificarla, utilizando marcador de vidrio o cinta de enmascarar (si la lámina es esmerilada, usar lápiz)

Solución salina + colonia del agar sangre

Caldo Pedro López 170305001 Gram

2. Hacer el frotis: A partir de caldo: esterilizar el asa, enfriarla dentro del caldo, sacudirla contra la pared del tubo, sacar una “asada” y distribuirla en forma circular, cerca al sitio de identificación de la lámina. A partir de agar: colocar una gota de solución salina estéril en el costado distal de la identificación, esterilizar el asa, enfriarla en el borde del agar, tocar la superficie central de la colonia y homogenizar con la gota de solución salina, en forma circular. 3. Dejar secar a temperatura ambiente 4. Fijar al calor: flamear unas dos o tres veces, controlando la temperatura de la lámina en el dorso de la mano para evitar que se quemen las células bacterianas 5. Colorear con Gram (ver técnica arriba) 6. Secar con papel absorbente: secar el reverso de la lámina, colocar el papel sobre la mesa de trabajo, voltear la lámina y hacerle una ligera presión 7. Dejar secar completamente: colocar en posición vertical hasta que esté completamente seca. 8. Adicionar aceite de inmersión: dejar caer una gota sobre el área de la preparación. 9. Observar al microscopio: enfocar en 10X y observar en 100X 10. Dibujar e Informar la morfología, afinidad y agrupación en caso de ser específica y predominante. 3. Conocer y dibujar las diferentes morfologías, agrupaciones y diferenciar gram positivos de gran negativos; para ello debe revisar las preparaciones coloreadas de sus compañeros de mesa. 4. Faringocultivo: Lectura e interpretación. Mirar la superficie del agar sangre para determinar si es un cultivo mixto o puro. Observar a trasluz para buscar colonias beta hemolíticas

Discutir con su profesor los hallazgos Informar el resultado. Actividad 1. Dibuje las diferentes morfologías, tipo de agrupación y afinidad con respecto al Gram, de las bacterias 2. Investigue por qué algunas bacterias no crecieron en Agar Mac Conkey y las que crecen, por qué se diferencian en lactosa positivas y lactosa negativas? 3. Escriba 5 medios de cultivo utilizados en el Laboratorio de Microbiología para el aislamiento bacteriano en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y, la utilidad de cada uno de ellos. 4. Defina qué es un “portador sano”