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UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA 2007

TESIS DOCTORAL

SERGIO DAMIÁN PAREDES ROYANO

“Efecto de la administración de melatonina y triptófano sobre los ritmos de actividadreposo, función fagocítica y metabolismo oxidativo en Streptopelia risoria. Modificaciones con la edad”

UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA

“EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN DE MELATONINA Y TRIPTÓFANO SOBRE LOS RITMOS DE ACTIVIDAD-REPOSO, FUNCIÓN FAGOCÍTICA Y METABOLISMO OXIDATIVO EN STREPTOPELIA RISORIA. MODIFICACIONES CON LA EDAD” Memoria presentada por Sergio Damián Paredes Royano para optar al Grado de Doctor Europeo por la Universidad de Extremadura

Badajoz, abril de 2007

D.ª

ANA

BEATRIZ

RODRÍGUEZ

MORATINOS,

Profesora

Titular

del

Departamento de Fisiología de la Universidad de Extremadura y D.ª CARMEN BARRIGA IBARS, Catedrática del Departamento de Fisiología de la Universidad de Extremadura

CERTIFICAN:

Que la presente Tesis Doctoral, presentada por D. Sergio Damián Paredes Royano, con el título: “Efecto de la administración de melatonina y triptófano sobre los ritmos de actividad-reposo, función fagocítica y metabolismo oxidativo en Streptopelia risoria. Modificaciones con la edad”, ha sido realizada bajo nuestra dirección, en el Departamento de Fisiología de la Universidad de Extremadura, y entendiendo que reúne todos los requisitos establecidos, autorizamos su presentación para ser juzgada por el tribunal correspondiente.

Y para que así conste a los efectos oportunos, firmamos el presente certificado en Badajoz, a 02 de abril de 2007.

Fdo.: Ana Beatriz Rodríguez Moratinos

Fdo: Carmen Barriga Ibars

Quisiera expresar mi más sincera gratitud y estima a las siguientes personas que con su trabajo y apoyo desinteresado han hecho posible la realización de esta Tesis Doctoral:

En primer lugar, mi más profundo agradecimiento a las Dras. Ana Beatriz Rodríguez Moratinos y Carmen Barriga Ibars, quienes me brindaron la gran oportunidad de iniciarme en el mundo de la Ciencia, y que han guiado la consecución de esta Tesis Doctoral de manera excepcional. Quisiera destacar de las mismas, no sólo su altísima cualificación académica y científica, traducida a lo largo de sus extensas carreras investigadoras en numerosísimos artículos científicos publicados en revistas de gran prestigio, sino lo que es mucho más importante, sus excelentes cualidades humanas. Así, su paciencia y valioso apoyo han sido imprescindibles a lo largo de todos estos años de estudio e investigación en el Departamento de Fisiología.

Al Profesor Russel J. Reiter, Catedrático de Neuroendocrinología de la Universidad de Texas (Health Science Center) en San Antonio, por haber revisado todos los trabajos de la presente Tesis Doctoral de modo excelente. Sus sugerencias y comentarios han contribuido sin duda de manera extraordinaria a la mejora de todos los artículos publicados.

Al Dr. José Antonio Pariente Llanos, Profesor Titular de Fisiología de la Universidad de Extremadura por sus consejos y diligencia a la hora de resolver los problemas burocráticos que plantea todo trabajo de este calibre y sus conocimientos científicos, gracias a los cuales se pudieron diseñar los experimentos de viabilidad celular frente a estrés oxidativo inducido, incluidos en los trabajos cuarto y quinto de esta Tesis Doctoral.

A los Dres. Mª Pilar Terrón Sánchez, Javier Cubero Juánez y Vicente Valero Cumplido, y la técnico Ana Mª Marchena López, por su asesoramiento e incalculable ayuda a la hora de completar toda la parte experimental de los diferentes estudios realizados, sin la cual no hubiera sido posible la consecución de ninguno de los objetivos planteados.

A los Ldos. Soledad Sánchez Mateos, David Narciso Repilado, Iñaki Bejarano Hernando, Cristina Sánchez López, y Belén Chanclón García, y los alumnos internos Javier Espino Palma, Lourdes Franco Hernández y Matías Mediero Muñoz, a los que les deseo que afronten con ilusión los años de investigación que les quedan por delante; y a Elena Circujano Vadillo, por su ayuda, ánimos y asesoramiento.

Al Departamento de Fisiología de la Facultad de Ciencias, en especial al Dr. Eduardo Ortega Rincón, las Ldas. Esther Giraldo Reboloso y María Dolores Hinchado Sánchez-Moro y el Dr. Juan José García García, y de la Facultad de Medicina, en especial a las Dras. Mª Ángeles Tormo García y Mª Dolores Torres Asensio, por su amabilidad y facilidades a la hora de permitirnos el acceso al contador de centelleo necesario para realizar las mediciones de melatonina.

Al Departamento de Microbiología de la Facultad de Medicina, en especial al Dr. Ciro Pérez Giraldo, por su amabilidad y el interés mostrados al dejarnos utilizar el contador de ELISA necesario para la cuantificación de serotonina.

Al Dr. Rubén Rial Planas, y las Dras. Susana Esteban Valdés, Celia Garau García y Sara Aparicio Martínez, del Departamento de Biología Fundamental y Ciencias de la Salud, de la Universitat de les Illes Balears, y al Dr. Juan Antonio Madrid Pérez, del Departamento de Fisiología de la Universidad de Murcia, por el gran interés mostrado para resolver las muchas consultas que se presentaban sobre Cronobiología.

A los Dres. Manuel Molina Fernández y Manuel Mota Medina, del Departamento de Matemáticas de la Universidad de Extremadura, por sus consejos y colaboración en los estudios estadísticos.

Al Dr. Robert A. Chatwin, por sus sugerencias y asesoramiento en las numerosas dudas surgidas sobre la lengua inglesa y hacer todas las revisiones lingüísticas de los artículos de la presente Tesis Doctoral con gran rigor y la mayor de las prestezas.

A la Dra. Valérie Simonneaux, del Departamento de Neurobiología de los Ritmos del Instituto de Ciencias Celulares de Integrativas de la Universidad Louis Pasteur (Estrasburgo, Francia), y al Dr. Robert W. Lea, del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Central Lancashire (Preston, Inglaterra), que me dieron la oportunidad de realizar en sus respectivos laboratorios dos estancias breves de tres meses cada una, para conocer de primera mano el trabajo de dos instituciones científicas europeas de primer orden y poder de este modo completar mi Doctorado Europeo.

A mis padres, Manuel de los Reyes Paredes Coello y Ana Royano Sánchez, mi abuela Mercedes Coello Díaz y mi abuelo, José Royano Sánchez, y a toda mi familia en general, por haberme transmitido sus mejores valores.

A Clara Trejo Núñez, Mercedes Gallego Herrezuelo, Gema Méndez Bazaga, Francisco José Nieto García, Beatriz Jaramillo Sayago, Teresa Tena Merino, María del Carmen Portela Soto, José Manuel Portela Soto, Montserrat Megías Cebrino y Antonia Megías Cebrino por sus constantes ánimos y apoyo.

A Ricardo Megías Cebrino, por la inmensa colaboración que me ha prestado ya sea cuando se trataba de resolver cualquier duda informática o cuando necesitaba ayuda dentro del laboratorio, mostrando siempre la mejor de las disposiciones, sin poner nunca ningún reparo, sus constantes ánimos y su enorme apoyo.

Por último y muy especialmente, mi mayor consideración a los animales utilizados en la presente Tesis, a los que siempre hemos intentado manejar con el mayor de los cuidados y respeto, mimándolos en todo momento.

Y en general, a todos los que han contribuido de manera directa e indirecta a que esta Tesis Doctoral sea una realidad.

Los resultados incluidos en la presente tesis doctoral han sido presentados a los siguientes Congresos: ¾

XXXIII Congress of The Spanish Society of Physiological Sciences. A

Sponsored Symposia in Association with The Physiological Society (UK and Eire) and the Dutch Society of Physiology. Sevilla, España. Febrero de 2005 (4 comunicaciones). ¾

5º Congreso de la Asociación Ibérica de Endocrinología Comparada. Faro,

Portugal. Septiembre de 2005 (2 comunicaciones). ¾

23rd Conference of the European Comparative Endocrinologists. Manchester,

Inglaterra. Agosto-Septiembre de 2006 (2 comunicaciones). ¾

1st Joint Meeting of European National Societies of Immunology – 16th

European Congress of Immunology. París, Francia. Septiembre de 2006 (2 comunicaciones). ¾

2nd Iberoamerican Congress on Neuroimmunomodulation. Madrid, España.

Abril de 2007 (1 comunicación).

Publicados en forma de “abstracts”: ¾

Effect of oral administration of tryptophan on the activity/rest rhythms of

young and old ring dove. Paredes, S.D., Barriga, C., Rodríguez, A.B. J. Physiol. Biochem. 61:226, 2005. ¾

Orally administered melatonin and motor activity in young and old ring dove.

Paredes, S.D., Barriga, C., Rodríguez, A.B. J. Physiol. Biochem. 61:227, 2005. ¾

Melatonin and activity/rest rhythms in young and old ring dove. Paredes, S.D.,

Terrón, M.P., Cubero, J., Valero, V., Barriga, C., Rodríguez, A.B. 61:227-228, 2005. ¾

Phagocytosis and superoxide anion levels in young and old ringdove:

Correlation with melatonin levels. Paredes, S.D., Terrón, M.P., Barriga, C., Rodríguez, A.B. 61:228, 2005. ¾

Protective effect of melatonin and tryptophan on cell viability under H2O2-

induced oxidative stress in ringdove (Streptopelia risoria) heterophils. Paredes, S.D.,

Marchena, A.M., Barriga, C., Pariente, J.A., Rodríguez, A.B. Neuroimmunomodulation, 2007 (en prensa).

Publicados como artículos:

1. -

Comparative study of the activity/rest rhythms in young and old ringdove

(Streptopelia risoria): Correlation with serum levels of melatonin and serotonin. Paredes, S.D., Terrón, M.P., Cubero, J., Valero, V., Barriga, C., Reiter, R.J., Rodríguez, A.B. Chronobiol. Int. 23:779-93, 2006. 2. -

Orally administered melatonin improves nocturnal rest in young and old

ringdoves (Streptopelia risoria). Paredes, S.D., Terrón, M.P., Valero, V., Barriga, C., Reiter, R.J., Rodríguez, A.B. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 100:258-268, 2007. 3. -

Tryptophan increases nocturnal rest and affects melatonin and serotonin serum

levels in old ringdove. Paredes S.D., Terrón, M.P., Valero, V., Cubero, J., Barriga, C., Reiter, R.J, Rodríguez, A.B. Physiol. Behav. 90:576-582, 2007. 4. -

Effect of exogenous melatonin on viability, ingestion capacity, and free radical

scavenging in heterophils from young and old ringdoves (Streptopelia risoria). Paredes, S.D., Terrón, M.P., Marchena, A.M., Barriga, C., Pariente, J.A., Reiter, R.J., Rodríguez, A.B. Mol. Cell. Biochem., 2007 (aceptado). 5. -

Tryptophan modulates cell viability, phagocytosis, and oxidative metabolism in

old ringdove. Paredes S.D., Terrón, M.P., Marchena, A.M., Barriga, C., Pariente, J.A., Reiter, R.J., Rodríguez, A.B. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol., 2007 (en prensa).

Publicados como capítulos de libro:

1. -

Efecto de la edad sobre el ritmo circadiano del neurotransmisor serotonina en

la tórtola collariza (Streptopelia roseogrisea). Paredes, S.D., Terrón, M.P., Valero, V., Barriga, C., Rodríguez, A.B. Advances de Endocrinologia Comparativa, Vol. III. Servicio de Publicaciones de la Universidade do Algarve, 2007 (en prensa).

2. -

Correlaciones entre los ritmos circadianos de melatonina, serotonina y

actividad/reposo en tórtolas collarizas (Streptopelia roseogrisea) jóvenes y viejas. Paredes, S.D., Terrón, M.P., Valero, V., Barriga, C., Rodríguez, A.B. Advances de Endocrinologia Comparativa, Vol. III. Servicio de Publicaciones de la Universidade do Algarve, 2007 (en prensa).

ABREVIATURAS

AADA: Aminoácido aromático descarboxilasa AA-NAT: Arilalquilamina N-acetiltransferasa AMPc: Adenosín monofosfato cíclico ATP: Adenosín trifosfato FO: Órgano frontal H2O2: Peróxido de hidrógeno HC: Comisura habenular HIOMT: Hidroxindol-O-metiltransferasa IIIv: Tercer ventrículo MESOR: Media ajustada al ritmo (Midline-Estimating Statistic Of Rhythm) NK: Célula citotóxica natural (natural killer) NO: Óxido nítrico NSQ: Núcleo supraquiasmático 1

O2: Singlete de oxígeno

O2.-: Anión superóxido OSC: Oscilador circadiano PaO: Órgano parapineal PC: Comisura posterior PE: Ojo parietal PO: Órgano pineal RH: Tracto retinohipotalámico ROI: Productos intermedios reactivos de oxigeno (reactive oxygen intermediates) TPH: Triptófano hidroxilasa

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................1 1.1. INMUNIDAD INNATA EN AVES ..............................................................................2 1.1.1. VISIÓN GENERAL DEL SISTEMA INMUNE AVIAR .......................................2 1.1.2. ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS HETERÓFILOS AVIARES .................... 4 1.1.3. EL PROCESO FAGOCÍTICO: FAGOCITOSIS Y DESGRANULACIÓN ...........5 1.1.4. MECANISMOS MICROBICIDAS DE DESTRUCCIÓN DEL MATERIAL INGERIDO Y FACTORES QUE AFECTAN AL “ESTALLIDO RESPIRATORIO” .... 6 1.2. ESTRUCTURA GENERAL DE LOS RITMOS CIRCADIANOS EN AVES: SUEÑO Y FUNCIÓN INMUNE .......................................................................................10 1.2.1. CARACTERÍSTICAS Y COMPONENTES DE LOS RITMOS BIOLÓGICOS Y CIRCADIANOS............................................................................................................... 10 1.2.2. ORGANIZACIÓN Y ESTRUCTURA DEL SISTEMA CIRCADIANO AVIAR 11 1.2.3. RITMOS CIRCADIANOS DE SUEÑO ................................................................ 13 1.2.4. RITMOS CIRCADIANOS DE FUNCIÓN INMUNE...........................................14 1.3. GLÁNDULA PINEAL Y MELATONINA: ASPECTOS GENERALES Y PARTICULARIDADES EN AVES ..................................................................................16 1.3.1. PERSPECTIVA HISTÓRICA ...............................................................................16 1.3.2.

ASPECTOS

EVOLUTIVOS

DE

LA

GLÁNDULA

PINEAL

Y

LA

MELATONINA ............................................................................................................... 18 1.3.3. ANATOMÍA DE LA GLÁNDULA PINEAL EN AVES...................................... 19 1.3.4. FOTOTRANSDUCCIÓN EN AVES.....................................................................21 1.3.5. BIOSÍNTESIS Y METABOLISMO DE LA SECRECIÓN DE MELATONINA 25 1.3.6. REGULACIÓN DE LA SECRECIÓN DE MELATONINA ................................28 1.3.7. FUENTES EXTRAPINEALES DE MELATONINA ........................................... 29

1.3.8.

CLASIFICACIÓN

Y

MECANISMOS

REGULADORES

DE

LOS

RECEPTORES DE MELATONINA............................................................................... 31 1.4. PAPEL FISIOLÓGICO DE LA GLÁNDULA PINEAL Y LA MELATONINA: ASPECTOS GENERALES Y PARTICULARIDADES EN AVES .............................. 34 1.4.1. GLÁNDULA PINEAL Y MELATONINA Y SU RELACIÓN CON EL SISTEMA CIRCADIANO Y LA ACTIVIDAD LOCOMOTORA................................ 34 1.4.2. MELATONINA Y RITMOS DE SUEÑO-VIGILIA............................................ 36 1.4.3. GLÁNDULA PINEAL, MELATONINA Y SISTEMA INMUNE ...................... 38 1.4.4. EFECTOS IN VIVO DE MELATONINA SOBRE EL SISTEMA INMUNE ...... 41 1.4.5. EFECTOS IN VITRO DE MELATONINA SOBRE EL SISTEMA INMUNE .... 42 1.4.6. MELATONINA, ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO Y CÉLULAS FAGOCÍTICAS: PAPEL ANTIOXIDANTE.................................................................. 43 1.4.7. MODULACIÓN DE LA FUNCIÓN PINEAL POR FACTORES INMUNES .... 45 1.5. PAPEL FISIOLÓGICO DEL TRIPTÓFANO Y LA SEROTONINA.................. 47 1.5.1. BIOSÍNTESIS Y METABOLISMO DEL AMINOÁCIDO TRIPTÓFANO........ 48 1.5.2. SISTEMA SEROTONINÉRGICO, BIOSÍNTESIS Y METABOLISMO DE LA SECRECIÓN SEROTONINA......................................................................................... 49 1.5.3. RELACIÓN ENTRE TRIPTÓFANO Y SEROTONINA Y LOS RITMOS DE ACTIVIDAD-REPOSO Y SUEÑO-VIGILIA ................................................................ 51 1.5.4. RELACIÓN ENTRE TRIPTÓFANO, SEROTONINA Y SISTEMA INMUNE . 53 1.6. ENVEJECIMIENTO: CAMBIOS EN LOS RITMOS CIRCADIANOS Y EN EL SISTEMA INMUNE .......................................................................................................... 55 1.6.1. CAUSAS RESPONSABLES DEL PROCESO DE ENVEJECIMIENTO ........... 55 1.6.2. SISTEMA NEUROLÓGICO Y EDAD................................................................. 58 1.6.3. SECRECIÓN DE SEROTONINA Y EDAD......................................................... 59 1.6.4. SECRECIÓN DE MELATONINA Y EDAD ....................................................... 60 1.6.5. RITMOS DE SUEÑO-VIGILIA Y EDAD ........................................................... 61

1.6.6. ENVEJECIMIENTO DEL SISTEMA INMUNE (INMUNOSENESCENCIA)...62 1.6.7. CONEXIONES POTENCIALES ENTRE LA GLÁNDULA PINEAL, LA MELATONINA Y EL ENVEJECIMIENTO ..................................................................64

2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS................................................................................... 67 3. MATERIALES, MÉTODOS, RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE CADA UNO DE LOS OBJETIVOS .................................................................................................................. 73

3.1. Estudio comparativo de los ritmos de actividad-reposo en tórtolas collarizas jóvenes y viejas (Streptopelia risoria): Correlaciones con los niveles séricos de melatonina y serotonina ......................................................................................................................... 75

3.2. Efecto de la administración oral de melatonina sobre los ritmos de actividad-reposo, niveles circulantes y parámetros cronobiológicos de los ritmos de melatonina y serotonina de tórtolas collarizas (Streptopelia risoria) jóvenes y viejas.......................... 91

3.3. Efecto de la administración oral de triptófano sobre los ritmos de actividad-reposo de tórtolas collarizas (Streptopelia risoria) jóvenes y viejas y sobre los niveles circulantes y parámetros cronobiológicos de los ritmos de melatonina y serotonina de animales viejos ............................................................................................................... 103

3.4. Evaluación del efecto de la administración de melatonina sobre la viabilidad celular, la resistencia a estrés oxidativo inducido así como sobre la capacidad de ingestión y metabolismo oxidativo de heterófilos de tórtolas collarizas (Streptopelia risoria) jóvenes y viejas............................................................................................................................ 111

3.5. Evaluación del efecto de la administración de triptófano sobre la viabilidad celular, la resistencia a estrés oxidativo inducido, así como sobre la capacidad de ingestión y

secuestro de radicales libres en heterófilos de tórtolas collarizas (Streptopelia risoria) viejas .............................................................................................................................. 138 4. DISCUSIÓN ..................................................................................................................... 161 5. CONCLUSIONES............................................................................................................ 167 6. BIBLIOGRAFÍA.............................................................................................................. 171

A la memoria de mi abuelo Reyes Paredes Bas, mi abuela, Matilde Sánchez Domínguez y mis bisabuelas Mercedes Díaz Del Barco y Antolina Domínguez Martínez

Sergio D. Paredes Royano

1. INTRODUCCIÓN

1

Introducción

1.1. INMUNIDAD INNATA EN AVES. La defensa frente a los microorganismos está mediada por las reacciones precoces de la inmunidad innata y por las reacciones tardías de la inmunidad adaptativa. La inmunidad innata (también denominada inmunidad natural o nativa) está constituida por mecanismos existentes antes de que se desarrolle la infección, capaces de establecer respuestas rápidas a los microorganismos y que reaccionan básicamente de la misma manera a infecciones repetidas. Tales mecanismos son estimulados por estructuras comunes a grupos de microorganismos relacionados y pueden no distinguir diferencias sutiles entre las sustancias extrañas. La inmunidad innata representa la primera línea defensiva contra los microorganismos. La patogenicidad de éstos está relacionada en parte con su capacidad para resistir a los mecanismos de la inmunidad innata (Abbas y cols., 2002).

1.1.1. VISIÓN GENERAL DEL SISTEMA INMUNE AVIAR. Los principales órganos linfáticos del sistema inmune de las aves los forman la bolsa de Fabricio y el timo. La bolsa de Fabricio es un saco que se encuentra por encima de la cloaca que tiene una función muy importante durante la etapa embrionaria y las primeras semanas de vida del ave, pues en ella maduran los linfocitos B, células productoras de anticuerpos que tienen su origen en el hígado del embrión, el saco vitelino y la médula espinal. Este órgano se atrofia y deja de ser funcional aproximadamente en el momento de alcanzar el animal la madurez sexual, al involucionar por el infiltrado de tejido fibroso en el mismo. Por su parte, el timo aviar se localiza a lo largo de la vena yugular y produce hormonas que programan a los linfocitos T contra determinados antígenos, siendo su funcionamiento máximo en individuos jóvenes. El bazo, en donde residen los linfocitos T, y se produce el filtrado y limpieza de la sangre y se destruyen los glóbulos rojos envejecidos o dañados; la médula espinal, en donde se generan linfocitos y macrófagos; los nódulos linfoides, filtradores de linfa; los agregados linfáticos murales; y el sistema circulatorio linfático de vasos y capilares, que transporta la linfa por todo el cuerpo aviar, constituyen los órganos linfáticos secundarios. A diferencia de los mamíferos, las aves no poseen nódulos 2

Sergio D. Paredes Royano

linfáticos organizados, a excepción de algunas de vida principalmente acuática (Jeltsch y cols., 2003; Sharma, 2003). La primera línea de defensa innata aviar frente a los patógenos la forman las plumas y la piel, que proporcionan una barrera física que algunos organismos infecciosos no pueden penetrar; la microflora normal de las membranas mucosas, estómago e intestino, que constituye una población microbiana densa y estable que impide el asentamiento de los organismos patógenos; los cilios del tracto respiratorio, que recogen las bacterias y desechos, volviéndolos a empujar hacia el pico, frenando así la entrada de los mismos hacia las vías respiratorias inferiores; y la alta temperatura del cuerpo aviar, que evita la aparición de enfermedades como el carbunco sintomático, pudiéndose manifestar éste cuando la misma disminuye. Cuando los patógenos atraviesan esta primera línea de defensa e invaden tejidos más profundos entra en acción la segunda línea de defensa innata. Ésta está constituida por los granulocitos aviares (heterófilos, basófilos y eosinófilos), leucocitos con abundantes gránulos citoplasmáticos que también participan en los mecanismos de la inmunidad específica cuando son estimulados por citocinas; las células citotóxicas naturales (NK, del inglés natural killer), que atacan mediante sustancias químicas la membrana de células que han perdido determinados marcadores, causando la desintegración de su membrana y núcleo; diferentes proteínas sanguíneas, entre las que se incluyen miembros del sistema del complemento y otros mediadores de la inflamación, un complejo grupo de proteínas que, entre otras funciones, reclutan células fagocíticas a los sitios de infección y se unen a las mismas, aumentando así su capacidad fagocítica, además de perforar la pared celular bacteriana; y las citocinas, que son mediadores solubles polipeptídicos que regulan y coordinan muchas de las acciones de las células. A pesar de que los mecanismos de la inmunidad innata para la defensa del huésped frente a invasores se hallan presentes de algún modo en todos los organismos pluricelulares (Ulevitch, 2000), los mecanismos de defensa más específicos y especializados que constituyen la inmunidad adaptativa se encuentran únicamente en los vertebrados. La inmunidad adaptativa, que se desarrolla cuando el cuerpo está expuesto a varios antígenos y constituye una defensa que es específica para dichos antígenos, es llevada a cabo en las aves 3

Introducción

mediante linfocitos e inmunoglobulinas, al igual que en peces mandibulados, anfibios, reptiles y mamíferos.

1.1.2. ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS HETERÓFILOS AVIARES. Los heterófilos son los leucocitos granulares aviares más numerosos. Su nombre se debe al hecho de que, entre los vertebrados, células homólogas de este linaje contienen gránulos con varias afinidades de tinción. Así, bajo el microscopio óptico se observa que estas células en las aves (y los conejos) se tiñen con el colorante eosina (Olson, 1937), siendo en algunos textos designados por esta razón como granulocitos polimorfonucleares pseudoeosinófilos. En un frotis de sangre teñida los heterófilos se aprecian como células redondas con un diámetro aproximado de 10 a 15 µm, núcleo polimórfico constituido por varios lóbulos asociados mediante estrechos puentes y cromatina organizada dentro de unas masas teñidas de oscuro asociadas a la membrana nuclear. Su principal característica es la presencia de gránulos cristalinos acidófilos fusiformes o espiralados de 1,5, 0,5 o 0,1 µm de diámetro (Maxwell, 1984a) que poseen afinidad por la eosina, la cual los tiñe de un color rosa brillante, de ahí la característica de tinción antes mencionada. En principio, únicamente se podrían considerar lisosomas los gránulos más grandes, ya que la actividad fosfatasa ácida sólo está presente en los mismos (Daimon y Caxton-Martins, 1977), así como la actividad arilsulfatasa (Osculati, 1970). Sin embargo, otros estudios han detectado actividad fosfatasa ácida no sólo en los gránulos grandes espiralados, sino también en los de tamaño medio y forma redonda, por lo que ambos tipos parecen representar diferentes estados de maduración del mismo orgánulo (Maxwell, 1984b). Los heterófilos aviares probablemente funcionan de manera similar a sus homólogos en mamíferos, los neutrófilos, y reciben, junto a monocitos y macrófagos, la denominación general de “fagocitos”, precisamente por presentar una gran capacidad de ingerir. Así, son capaces de buscar, reconocer, ingerir y destruir intracelularmente partículas extrañas o gérmenes por la acción de enzimas liberadas durante el proceso de desgranulación.

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Sergio D. Paredes Royano

Particularmente son las proteínas catiónicas y la lisozima las que confieren a este tipo celular su capacidad bactericida.

1.1.3. EL PROCESO FAGOCÍTICO: FAGOCITOSIS Y DESGRANULACIÓN. El proceso fagocítico se desencadena cuando un agente agresor sobrepasa las barreras naturales del organismo, tales como el tegumento o las mucosas y se puede resumir como una serie de etapas en el que se reconocen y engloban microorganismos o tejidos de desecho que se acumulan durante la infección, inflamación o reparación de una herida (Brown, 1995). Para poder llevar a cabo la función fagocítica, el fagocito necesita salir del capilar sanguíneo, para lo que se adhiere al endotelio vascular, liberándose del vaso sanguíneo mediante un proceso denominado diapédesis. Fuera del capilar, se adhiere a sustratos tisulares y migra mediante movimientos que pueden ser espontáneos o dirigidos a favor de gradiente hacia el foco de la infección atraído mediante sustancias quimiotácticas (quimiotaxis). Cuando la célula fagocítica, gracias a sus receptores de membrana, establece contacto con la membrana del germen que debe ser fagocitado o con moléculas de anticuerpos o fragmentos del factor C3b del complemento que se encuentran adheridos a ella, emite unas prolongaciones citoplasmáticas a modo de pseudópodos en la zona de unión con el germen, rodeándolo. El mecanismo móvil para el movimiento de los pseudópodos viene dado por la concentración de microfilamentos, por un sistema de proteínas contráctiles, la actina y la miosina, así como por las proteínas que unen actina (Root y Cohen, 1981). La unión de los receptores presentes en los pseudópodos con los ligandos específicos de la partícula a fagocitar provoca señales fagocíticas que producen un mayor desarrollo de los pseudópodos, proceso que se repite muchas veces en el tiempo hasta que el fagocito engloba totalmente la partícula (Murphy, 1990). Las interacciones ligando-receptor no sólo determinan la unión de las partículas y generan señales de transmisión, sino también juegan un papel importante en el proceso de ingestión. Es posible que la interacción inicial ligando-receptor sea la responsable de activar la maquinaria intracelular, a través de interacciones repetidas que provocan señales fagocíticas, produciéndose de este modo la extensión de los pseudópodos, los que, generados de forma continua, darían lugar a la ingestión de la partícula unida, mientras que el resto de 5

Introducción

ligandos situados sobre la misma actuarían tan sólo como sitios de unión “pasivos” a los receptores de membrana, permitiendo así el avance de los pseudópodos hasta completar la ingestión (Brown, 1995), proceso dependiente de cationes bivalentes, como el Ca2+ o el Mg2+, y de nucleótidos cíclicos intracelulares, como el guanosín monofosfato cíclico (GMPc), que estimula la ingestión, o el adenosín monofosfato cíclico (AMPc), que la inhibe, cuya rapidez va a depender de la existencia o no de la opsonización previa de las partículas (Murphy, 1990). Una vez fagocitada la partícula, por un proceso de fagocitosis tipo “cremallera”, el fagosoma o vacuola digestiva formado se separa de la membrana celular, dirigiéndose al interior celular mediante movimientos centrípetos. Al estar la membrana de la célula en continuo proceso de renovación, rápidamente se sintetizan las porciones que van a reemplazar a las internalizadas durante la fagocitosis. A partir de aquí tienen lugar una serie de acontecimientos morfológicos y bioquímicos consistentes en la activación y arrastre de flavoproteínas oxidorreductasas al interior de la vacuola fagocítica, con la finalidad de que reduzcan parcial o totalmente aniones superóxido (O2.-), y en la aproximación mediante movimientos citoplasmáticos en los que interactúan microtúbulos y microfilamentos (Babior, 1984) de los gránulos a la membrana de la vacuola fagocítica, que vierten su contenido al interior, proceso conocido como desgranulación, en el que es necesario la presencia de Ca2+ intracelular (Styrt y cols., 1988), el metabolismo de fosfolípidos y la proteína quinasa C (Tauber, 1987), así como el adenosín trifosfato (ATP) generado a partir de la glucolisis, ya que no existe desgranulación en presencia de inhibidores de la misma. De este modo queda constituido el fagolisosoma, en donde se producirán diferentes acontecimientos encaminados a la destrucción y digestión del germen o partícula fagocitada (Figura 1).

1.1.4. MECANISMOS MICROBICIDAS DE DESTRUCCIÓN DEL MATERIAL INGERIDO Y FACTORES QUE AFECTAN AL “ESTALLIDO RESPIRATORIO”. Los procesos químicos que constituyen los mecanismos microbicidas y que conllevan la destrucción del material ingerido pueden ser categorizados en dos grandes grupos: procesos microbicidas independientes de oxígeno y procesos microbicidas oxígeno-dependientes. 6

Sergio D. Paredes Royano

Figura 1: Formación de fagolisosomas y destrucción de los microorganismos fagocitados durante el proceso fagocítico. ROI: productos intermedios reactivos de oxígeno; NO: óxido nítrico (Tomada de Abbas y Lichtman, 2002). Los procesos microbicidas independientes de oxígeno engloban una serie de compuestos heterofílicos con actividad microbiana que intervienen en reacciones producidas en medios anaerobios o en fagocitos con capacidad fagocítica deficiente o inexistente (Weiss y cols., 1982), entre los que cabe destacar la lisozina, cuya liberación por parte de las células fagocíticas provoca la ruptura de la unión entre el ácido murámico y la N-acetilglucosamina de la pared celular de muchas bacterias Gram-positivas, causando la lisis de las mismas; la lactoferrina, cuya avidez por el Fe2+ tiene efecto bacteriostático, al privar a las bacterias de este microelemento necesario para el funcionamiento normal de su metabolismo; y las proteínas catiónicas, que presentan actividad bacteriostática o bactericida, ya que sus grupos acídicos interfieren en el metabolismo de muchas bacterias (Shafer y cols., 1984). Los cambios de pH por la producción de ácido láctico y ácido ascórbico, consecuencia del metabolismo anaerobio que tiene lugar dentro del fagosoma, también podrían encuadrarse dentro de estos mecanismos, ya que acidifican el medio hasta valores que fluctúan entre 6 y 4, 7

Introducción

lo que es suficiente para matar a determinados microorganismos o detener el crecimiento de otros. En los mecanismos microbicidas dependientes de oxígeno se van a dar diferentes reacciones de oxidorreducción para destruir y digerir las partículas fagocitadas, produciéndose un gran consumo de oxígeno que conduce al denominado “estallido respiratorio” que acompaña a la fagocitosis. Así durante el proceso fagocítico, la mayoría del oxígeno consumido se transforma en anión superóxido, intermediario en la formación de agua oxigenada, cuyo poder bactericida es grande cuando alcanza determinadas concentraciones. Al ser este compuesto además altamente tóxico, es rápidamente eliminado por la acción de la enzima superóxido dismutasa (Makino y cols., 1986), dando lugar a la formación de peróxido de hidrógeno o agua oxigenada, que difunde al citoplasma, donde es degradado por el sistema glutatión peroxidasa-glutatión reductasa a agua, evitándose así el efecto nocivo que este compuesto podría tener sobre el citoplasma de las células fagocíticas, o bien se une a la enzima mieloperoxidasa para formar un complejo enzima-sustrato que va a oxidar a diferentes haluros como el Br-, y especialmente el Cl- y el I- transformándolos en haluros activados, que representan agentes tóxicos que van a provocar que la superficie bacteriana pierda su integridad. Asimismo, la enzima mieloperoxidasa controla en parte reacciones de descarboxilación de los aminoácidos que forman la membrana bacteriana, cuya degradación da lugar a la muerte del germen. Como consecuencia del consumo de oxígeno durante la fagocitosis, además de producirse aniones superóxido también se van a formar singletes de oxígeno (1O2), que son formas de oxígeno electrónicamente excitadas y muy inestables que tratan constantemente de revertir su forma a la de triplete o estado normal del oxígeno atmosférico. La alteración electrónica confiere a los singletes de oxígeno una gran actividad química, especialmente sobre compuestos que tienen un doble enlace, interfiriendo y alterando consecuentemente muchos de los sistemas biológicos (Klebanoff, 1980). Por otro lado también se ha observado la formación de radicales hidroxilos durante el proceso de fagocitosis, iones inestables que reaccionan rápidamente con cualquier material orgánico, cumpliendo de este modo un papel bactericida importante (Cohen y cols., 1980).

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La activación de la respiración y producción de metabolitos tóxicos de oxígeno o “estallido respiratorio”, es una respuesta producida no sólo por el proceso fagocítico sino también por la interacción de los fagocitos con un gran número de factores estimulantes solubles, entre los que destacan los componentes del complemento, lectinas, péptidos quimiotácticos, ionóforos de Ca2+, leucotrienos y factores de activación de plaquetas (Rossi y cols., 1985), además del factor estimulador de colonias producido por los granulocitos (Nathan, 1989). Precisamente tras la estimulación de receptores de fagocitos con anticuerpos frente al factor C3 se ha encontrado un incremento dosis-dependiente del Ca2+ libre intracelular que no depende de los niveles extracelulares de este ión, además de la existencia de una relación entre movilización de Ca2+ y estallido respiratorio (Hartiala y cols., 1987). Otros investigadores han visto que bajas concentraciones de prostaglandina 2 e isopropanolol inhiben el estallido respiratorio inducido por péptidos formilados o ionóforos de Ca2+, posiblemente al aumentar los niveles de AMPc, lo que pone de manifiesto la posible modulación β-adrenérgica del estallido respiratorio en fagocitos (Nielson, 1987). Por otro lado, se ha observado que la unión de anticuerpos monoclonales específicos a los receptores para la fracción Fc de las inmunoglobulinas G en fagocitos provoca no sólo un aumento en la desgranulación y liberación de enzimas, sino también un incremento en la producción de anión superóxido (Willis y cols., 1988).

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Introducción

1.2. ESTRUCTURA GENERAL DE LOS RITMOS CIRCADIANOS EN AVES: SUEÑO Y FUNCIÓN INMUNE. A pesar de la trascendencia que tiene el tiempo en la vida de los seres vivos, la Biología ha tardado mucho tiempo en abordar los cambios diarios de las funciones fisiológicas. Así, no fue hasta la década de los años sesenta, gracias a la actividad científica de los profesores Franz Halberg, Colin Pittendrigh, Jürgen Aschoff y Alain Reinberg, que se establece la Cronobiología como disciplina formal. Se define la Cronobiología como la Ciencia encargada del estudio de la organización temporal de los procesos que ocurren en los seres vivos, los mecanismos que la originan y la regulan y sus alteraciones, entendiéndose como “organización temporal” la capacidad de los seres vivos de expresar sus comportamientos y controlar su fisiología de forma recurrente y periódica. A esa recurrencia periódica se le da el nombre de “ritmo biológico”, por lo que también se puede definir la Cronobiología como la rama de la Biología que estudia los ritmos biológicos.

1.2.1. CARACTERÍSTICAS Y COMPONENTES DE LOS RITMOS BIOLÓGICOS Y CIRCADIANOS. Los ritmos biológicos se definen como variaciones regulares de una función biológica en el curso del tiempo (Berger, 2004a). Su presencia en los organismos es un hecho tan cotidiano que no ha llamado la atención de los científicos hasta hace relativamente poco tiempo. Sin embargo, al observarlos con un poco de atención rápidamente se detecta que no son un hecho casual ni suponen un seguimiento pasivo de las condiciones del entorno externo, sino que, por el contrario, son el resultado de la existencia de mecanismos endógenos de medición del tiempo, que operan incluso cuando las condiciones ambientales son constantes, lo que indica la presencia de un reloj endógeno interno o marcapasos que controla la periodicidad de ciertas variables. Así, estudiados en el ámbito de la Cronobiología, los ritmos biológicos forman parte de una adaptación al entorno que es fundamental para la supervivencia de las especies (Aschoff, 1981), siendo la caracterización y cuantificación de 10

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los mismos un aspecto fundamental de esta disciplina, lo que se consigue ajustándolos a una función cosenoidal. Este ajuste permite definir las características más importantes de los ritmos biológicos, entre las que destacan la acrofase y el nadir o puntos más alto y bajo, respectivamente, de la función en relación a un punto de referencia escogido por el investigador, la amplitud o mitad de la diferencia entre el punto más alto y el más bajo de la curva, y el MESOR (acrónimo de la expresión inglesa Midline-Estimating Statistic Of Rhythm) o media ajustada al ritmo que representa el valor intermedio entre el valor más alto y el más bajo del ritmo ajustado a la función cosenoidal. Se conoce por “ciclo” la sucesión de acontecimientos que tienen lugar de forma repetitiva siempre en el mismo orden sin tener en cuenta el tiempo en que tienen lugar y por “frecuencia” el número de ciclos que tienen lugar por unidad de tiempo. Los ritmos biológicos que poseen una frecuencia próxima a la diaria, es decir, de entre 24±4 horas, se conocen como “ritmos circadianos”. La mayor parte de las variables fisiológicas de los organismos, como el sueño-vigilia, la actividad-reposo, la temperatura corporal, la alimentación, la depuración y excreción, la secreción hormonal, la respuesta a fármacos o la función inmune, presentan ritmos circadianos.

1.2.2. ORGANIZACIÓN Y ESTRUCTURA DEL SISTEMA CIRCADIANO AVIAR. El sistema circadiano de las aves está constituido por el órgano pineal, el núcleo supraquiasmático (NSQ) del hipotálamo y los ojos, elementos que se encuentran unidos entre sí mediante vías neurales y conexiones hormonales, lo que permite la actuación conjunta de los mismos de manera coherente, de tal forma que los marcapasos centrales controlan y coordinan jerárquicamente el comportamiento de los múltiples osciladores o relojes periféricos, existiendo además múltiples entradas fóticas (Underwood y cols., 2001). Así, el modelo general de organización circadiana en las aves queda establecido por osciladores circadianos (OSC) centrales, localizados probablemente en el área supraquiasmática, y periféricos, situados en la pineal y los ojos, cuyo encarrilamiento se produce directamente mediante la luz en dichas estructuras. Además, la luz puede encarrilar el sistema central a través de receptores extrarretinales del cerebro y fotorreceptores ubicados en la pineal y los 11

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ojos, siendo las uniones al sistema de estos últimos órganos vía la hormona melatonina, o alternativamente en el caso de los ojos vía el tracto retinohipotalámico (RH) (Figura 2). Así, la ritmicidad de algunos elementos del sistema (como por ejemplo el NSQ o la pineal) se iría reduciendo al ir fallando los elementos del resto del sistema, lo que sería consecuencia de la reducción de los osciladores que componen los marcapasos del mismo o del desacoplamiento de los múltiples osciladores que constituyen los marcapasos.

LUZ

Receptores extrarretinales

Ojo

Ojo Melatonina

Melatonina

Melatonina

NSQ

NSQ Hormonas reproductivas OSCILADORES SUBORDINADOS

RITMOS NOTORIOS Figura

2:

Representación

del

sistema

circadiano

aviar.

NSQ:

núcleo

supraquiasmático; OSC: osciladores circadianos; RH: tracto retinohipotalámico (Tomada de Underwood y cols., 2001). 12

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Aunque el modelo general parece estar bien descrito, el papel relativo que juega cada uno de los elementos que integra el sistema circadiano aviar puede tener diferencias significativas entre las distintas especies. Por ejemplo, los marcapasos de la pineal pueden tener un papel preponderante en algunas especies mientras que en otras serían los situados en los ojos los que tendrían una importancia igual o superior a los de otras regiones. Por otro lado, en el caso de algunas aves como la codorniz japonesa (Coturnix coturnix japonica) o el estornino (Sturnus vulgaris), las hormonas reproductivas también pueden afectar a los marcapasos hipotalámicos, causando alteraciones de fase o periodo. A nivel del organismo, se dice que el sistema circadiano de las aves es de naturaleza “multiosciladora”, siendo a su vez multioscilador a nivel de los marcapasos individuales. La razón por la que este sistema exhibe tal complejidad es aún desconocida, aunque indudablemente refleja la historia evolutiva de las aves.

1.2.3. RITMOS CIRCADIANOS DE SUEÑO. Se entiende como sueño el espacio periódico de tiempo de reducida actividad que se observa en el hombre y en la mayoría de los animales, caracterizado por cambios motores (reducción de movimientos y estereotipia de los mismos), reducción de sensibilidad a estímulos sensoriales como consecuencia de cambios en el funcionamiento de algunas sinapsis cerebrales y rápida reversibilidad de las reducciones mencionadas hacia el estado de vigilia, junto con la cual el sueño forma un ciclo más o menos acoplado al ciclo de luzoscuridad. La función que cumple este importante ritmo circadiano aún no es conocida, siendo algunas de las teorías barajadas la conservación de energía frente al agotamiento energético (Chagoya de Sánchez y cols., 1993; Berger y Phillips, 1995), la contribución a la plasticidad neural y los procesos de memoria (Tononi y Cirelli, 2001), o el mantenimiento estacionario del animal cuando el cerebro se encuentra en un estado disfuncional (Krueger y Obal, 2003). En las aves, el ritmo circadiano sueño-vigilia se encuentra influido por la luz y la alimentación como sincronizadores del mismo (Berger y Phillips, 1994). El sueño de las aves presenta unas características similares a las de los mamíferos, ya que muestra las dos fases 13

Introducción

típicas de NREM (sueño de ondas lentas con fase 1 de sueño superficial, 2 de iniciación sueño verdadero, y 3/4 de sueño profundo) y REM (aparición de movimientos oculares rápidos, disminución del tono muscular y aparición de fase onírica o de los sueños en humanos) si bien esta última sólo aparece en periodos de apenas unos pocos segundos (Amlaner y Ball, 1994). Además, las aves se caracterizan por presentar un estado particular de sueño al que se conoce como sueño unihemisférico o sueño asimétrico, durante el cual uno de los hemisferios se va a encontrar totalmente despierto mientras que el otro va a permanecer en estado de sueño, lo que hace a este grupo taxonómico único dentro del reino animal, aunque algunos mamíferos marinos entre los que se encuetran los delfines parecen tener un sueño de similares características. Se cree que el sueño unihemisférico es de menor calidad que el bihemisférico, lo que explica por qué ha surgido solamente en algunas especies y no en aquéllas en las que la presión ambiental es menor de modo que pueden permitirse dormir con el cerebro completo, y que está relacionado con la necesidad de mantenimiento de la natación, la postura corporal o la respiración. Particularmente en las aves, el sueño unihemisférico parece relacionarse con la predación, observándose que los animales expuestos a riesgos altos incrementan la cantidad de este tipo de sueño (Rattenborg y cols., 1999). Del mismo modo, bajo condiciones seguras las aves duermen simultáneamente con los dos hemisféricos, lo que les confiere un sueño de tipo bihemisférico. A este respecto cabe señalar que cuando se produce el cerrado bilateral de los ojos se produce el denominado sueño bihemisférico o sueño normal (Amlaner y Ball, 1994), como normalmente ocurre en los seres humanos. En cuanto a los mecanismos reguladores del sueño, al presentar las aves una mayor dependencia frente a las condiciones ambientales, parece ser que en este grupo la regulación homeostática del mismo es poco eficaz, siendo por tanto mucho más importante la regulación circadiana (Phillips y Berger, 1992).

1.2.4. RITMOS CIRCADIANOS DE FUNCIÓN INMUNE. En el sistema inmune pueden encontrarse ritmos biológicos de múltiples frecuencias, lo que tiene importantes consecuencias clínicas y aplicaciones dentro de la práctica médica, siendo los de periodicidad circadiana los más profusamente estudiados (Berger, 2004b; 2006). 14

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Así, se observa la existencia de ritmicidad en todos los niveles que constituyen el sistema inmune, entre los que se incluyen la entrada e intercambio de información a través de mensajeros humorales procedentes de células inmunocompetentes periféricas presentes en todo el organismo, a la que van a contribuir las interacciones neuroendocrinas que el sistema inmune crea con el endocrino mediante mecanismos neurales y neuroendocrinos, estableciéndose entre ambos relaciones autocrinas, paracrinas y endocrinas (Haus y Smolensky, 1999). Entre los ritmos que se pueden encontrar en la regulación neurohormonal del sistema inmune, va a haber algunos genéticamente programados, los denominados endógenos, mientras que otros, los sincronizados, van a presentar frecuencias de coordinación ajustada de manera continua o alteradas en determinados parámetros rítmicos, como por ejemplo la extensión de la variación rítmica, la amplitud o los factores ambientales tanto periódicos como no periódicos, siendo algunos de los elementos del sistema inmune con periodicidades circadianas los ritmos biológicos de células sanguíneas circulantes, como neutrófilos, monocitos, eosinófilos y células NK, además de las plaquetas (Haus, 1996). En el caso particular de la inmunidad innata, se ha encontrado que ésta está sujeta a ritmicidad circadiana. Concretamente, la fagocitosis y digestión de antígenos, probablemente los mecanismos de defensa más extendidos en todos los animales, parecen presentar máxima actividad durante la fase oscura, tanto en mamíferos de hábitos nocturnos como en aves de actividad diurna (Rodríguez y cols., 1999a; Barriga y cols., 2001). Como se dijo en el apartado anterior referente a la inmunidad innata, una vez que los antígenos han sido ingeridos, las células fagocíticas a fin de poder destruirlos ponen en marcha el estallido respiratorio formando especies reactivas de oxígeno, empezando la cadena de eventos con la producción de O2.-, cuyos niveles son fácilmente cuatificables mediante el test de reducción del nitroazul de tetrazolio o NBT. En este sentido se ha observado un ritmo circadiano de producción de este anión, siendo sus valores máximos durante el periodo diurno (Terrón y cols., 2004).

15

Introducción

1.3. GLÁNDULA PINEAL Y MELATONINA: ASPECTOS GENERALES Y PARTICULARIDADES EN AVES. La glándula pineal es un órgano de secreción interna en el que una señal neural procedente del sistema nervioso simpático regula la producción y liberación rítmica de muchos compuestos bioactivos, de los que el más extensamente estudiado es la hormona melatonina. A pesar de haber sido considerada durante mucho tiempo un órgano vestigial y consecuentemente de escasa importancia fisiológica, debido a que puede calcificarse a edades tempranas, se trata de una estructura endocrina activa y que, debido a su capacidad para transmitir al organismo una información ambiental precisa, participa en la sincronización de diversas funciones corporales. La glándula pineal presenta como propiedad característica la capacidad de transformar las oscilaciones de la duración e intensidad de la luz ambiental en cambios en la tasa de síntesis y secreción de melatonina. Como consecuencia de ello su actividad presenta un ritmo circadiano, es decir, con un periodo de 24 horas, observable en relación con modificaciones tanto morfológicas como moleculares, y que se traduce, en términos sistémicos, en la secreción nocturna de melatonina en forma de señal cronológica circulante (Alonso, 1999).

1.3.1. PERSPECTIVA HISTÓRICA. El conocimiento de la glándula pineal o epífisis cerebral se remonta a hace más de 2.000 años. Ya las culturas orientales clásicas se referían a ella como un órgano de clarividencia y meditación que permitía al hombre recordar su vida pasada, siendo abundantes las representaciones de la misma en forma de tercer ojo. Sin embargo, no es hasta el siglo XVI, con la aparición de la obra “De humani corporis fabrica” de Andrés Vesalio, que se describe la situación anatómica del órgano pineal. Unos años más tarde, el filósofo francés René Descartes (1596-1650) en su tratado “Las Pasiones del Alma” se refiere a la glándula pineal como un elemento que desempeña un papel crucial en la interacción entre el alma y el cuerpo, controlando mediante estímulos provenientes de la retina el flujo del espíritu animal a través de los nervios motores, influenciando así los movimientos corporales. Este concepto 16

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cartesiano del siglo XVII que consideraba a la glándula pineal como “el lugar donde se asentaba el alma humana” probablemente se desarrolló a partir de las autopsias realizadas mucho antes por el anatomista alejandrino Herófilo (325-280 a.C.), que según las crónicas de Galeno (130-200) se refería a la glándula pineal como la válvula que regulaba los “flujos espirituales” entre el tercer y el cuarto ventrículo del cerebro. A finales del siglo XIX, Ahlborn (1884) señala la notable semejanza de la pineal de mamíferos y aves con el órgano pariental de algunos vertebrados inferiores como los lagartos, una observación crucial que hizo que se dirigiera el interés durante los últimos siglos hacia el estudio de la evolución filogenética del órgano pineal en vertebrados. A principios del siglo XX, Holgrem apunta que las células con actividad secretora de la pineal o pinealocitos de un determinado tipo de elasmobranquio eran de naturaleza sensorial, puesto que éstos se asemejaban a las células sensoriales de la retina (Hadley, 1997). Esta característica anatómico-fisiológica hizo que la glándula pineal, incluida la humana, se considerara como un vestigio del órgano visual primitivo existente en algunos peces, anfibios y reptiles lacértidos, en los que la epífisis tiene naturaleza parietal extracraneal, con estructuras que se asemejan al cristalino o a la retina que pueden actuar como fotorreceptores o “tercer ojo” (Urbanski, 2000). A lo largo del siglo XX, se publican diferentes estudios que hablan sobre la capacidad que tenían los extractos de pineal de hacer que la piel de determinados anfibios perdiera el color. Aaron Lerner y colaboradores en 1958 descubren el causante de este fenómeno tras el procesado cromatográfico de miles de glándulas pineales bovinas, el compuesto bioactivo Nacetil-5-metoxitriptamina, al que dieron el nombre de melatonina al tener efectos sobre la pigmentación cutánea en la rana y porque estaba químicamente relacionado con la serotonina (5-hidroxitriptamina; 5-HT), contribuyendo a la historia de la investigación de la pineal de forma extraordinaria. Observaron así que la melatonina tenía efectos muy potentes sobre la pigmentación de la piel de muchos animales, aunque los descubrimientos más importantes fueron los relacionados con los efectos antigonadales que producía en el sistema reproductor de los mamíferos (Lerner y Nordlund, 1975). En los últimos años, han aparecido numerosísimas investigaciones sobre el producto pineal encaminadas a esclarecer su posible uso como agente de vacunación (Regodón y cols., 2005) o fármaco contra la edad (Turek y cols., 2000; Reiter, 2000a,b), el insomnio y síndrome de desfase horario (Caspi, 2004), el 17

Introducción

estrés (Reiter, 2003), las disfunciones inmunes (Guerrero y Reiter, 2002), el cáncer (SkwarloSonta y cols., 2003), o incluso herbicidas como el paraquat (García-Rubio y cols., 2005) aunque todavía queda por entender el exacto papel fisiológico de la melatonina y sus posibles cambios durante la evolución.

1.3.2.

ASPECTOS

EVOLUTIVOS

DE

LA

GLÁNDULA

PINEAL

Y

LA

MELATONINA. La existencia del foramen pariental en cráneos fósiles de ciertos vertebrados del Silúrico y el Devónico, ancestros hoy en día de peces, anfibios y reptiles, sugiere que el órgano pineal ya existía en esos periodos, lo que confiere a la glándula pineal una antigüedad filogenética extraordinaria (Roth y Roth, 1980). Sin embargo, a pesar de la pronta aparición de la pineal en vertebrados, la extensa presencia de melatonina en organismos unicelulares, como moneras (Rodospirillum rubrum), protistas (Gonyaulax polyedra) (Poeggeler y cols., 1991; Hardeland, 1999) y levaduras (Saccharomyces cerevisiae) (Hardeland, 1999), invertebrados, como la langosta migratoria (Locusta migratoria), el cangrejo (Carcinus maenas) o la sepia (Sepia officinalis) (Vivien-Roels y Pevet, 1993), o incluso plantas (Dubbels y cols., 1995; Hattori y cols., 1995) muestra una mayor edad evolutiva y un grado de conservación muy alto para esta molécula, pudiéndose considerar como un compuesto omnipresente en los reinos biológicos, puesto que mediante métodos de extracción y detección apropiados ha sido posible su identificación en gran cantidad de grupos zoológicos y botánicos. Sin embargo, es totalmente inexistente o su presencia se encuentra muy restringida en taxones especialmente importantes como arqueas, musgos, helechos, gimnospermas, esponjas, anélidos, quelicerados y equinodermos (Hardeland y Poeggeler, 2003). La mencionada ubicuidad y conservación de una molécula como la melatonina ha atraído la atención de algunos investigadores que han tratado de dilucidar cómo sus funciones podrían haberse desarrollado a escala evolutiva. Parece claro que al encontrarse presente en organismos tan distantes desde el punto de vista filogenético, el papel fisiológico que ejerce no puede ser el mismo, al menos en términos de señalización. Así, aunque concentraciones 18

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altas de melatonina se asocian con la oscuridad en algunos organismos unicelulares eucariotas (Poeggeler y cols., 1991; Hardeland y cols., 1995; Balzer y cols., 1996; Hardeland, 1999) y bacterias (Tilden y cols., 1997), pudiendo incluso transmitir la información de la oscuridad (Balzer y Hardeland, 1991, 1992; Hardeland y Balzer, 1993; Hardeland y cols., 1995), millones de años de evolución deberían haber permitido a los organismos usar la melatonina para diferentes propósitos fisiológicos. Aun así, a pesar de la potencial diversidad en cuanto a su funcionalidad, no existen variaciones respecto a las propiedades físicas y químicas de la molécula. El hecho de que la melatonina actúe como un potente antioxidante, refleja una propiedad de potencial importancia para comprender su papel como mediador químico de la oscuridad. En este sentido, la melatonina habría sido originariamente usada como parte del sistema protector antioxidante, al haberse encontrado que las concentraciones de especies reactivas de oxígeno están sujetas a fuertes alternancias rítmicas cuando se exponen a la luz. Además, la existencia de oscilaciones del indol coincidentes con el ciclo de luz-oscuridad podría ser la razón primaria por la cual la melatonina fue adoptada como mediador de la información en la oscuridad. En el último periodo evolutivo, la síntesis de melatonina podría haberse acoplado a un oscilador circadiano, una conexión que tendría la ventaja de que el ritmo de melatonina sería indicador de los niveles tanto de luz como de radicales libres de oxígeno (Hardeland, 1993; Haderland y cols., 1995). Para los animales, la oscilación de los niveles de melatonina serviría para determinar con gran precisión la hora del día (el reloj de la melatonina) y la estación del año (el calendario de la melatonina), permitiendo hacer cambios fisiológicos y comportamentales necesarios para anticiparse con ventaja a las fluctuaciones ambientales bruscas (Reiter, 1993).

1.3.3. ANATOMÍA DE LA GLÁNDULA PINEAL EN AVES. El órgano pineal de aves, a diferencia del de peces, anfibios y reptiles, tiene una estructura bipartida consistente en un órgano pineal primario y uno secundario o tejido pineal accesorio. Por esta razón, algunos autores hablan de un sistema pineal propio de aves. El

19

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órgano pineal primario puede aparecer como una estructura que se extiende desde la región intercomisural del techo del tercer ventrículo en el cerebro (Figura 3).

Figura 3: El cerebro aviar. A) Vista dorsal. B) Sección medio-sagital mostrando la posición de la glándula pineal entre las comisuras anterior y posterior (Tomada de Barriga y cols., 2004). El parénquima del órgano pineal aviar presenta varios tipos de células, siendo los más claramente definidos los pinealocitos, que constituyen un grupo de células similares a las células fotorreceptoras pineales de poiquilotermos (Figura 4). La principal característica de este tipo de células fotorreceptoras que las distingue de otros tipos de células pineales es la presencia de un corto segmento externo con laminaciones concéntricas. Estas estructuras fueron descritas por primera vez por González y Valladolid (1996) en la gallina (Gallus gallus 20

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domesticus). El microscopio de transmisión electrónica muestra un grupo de estructuras rudimentarias en forma de zonas concéntricas que se corresponden con los segmentos externos de las células fotorreceptoras. Otros estudios mediante microscopía electrónica en el capuchino bengalí o isabelita del Japón (Lonchura domestica) han mostrado diferencias morfológicas en estos segmentos externos, con formas bulbosas, en forma de copa o alargadas. Las zonas concéntricas podrían estar desordenadas en apariencia como consecuencia de procesos degenerativos (Figura 5). La presencia de gránulos de secreción en los pinealocitos de tipo receptor de pájaros sería un signo de que existe un proceso secretor en estas células. Estos gránulos de secreción han sido descritos en los pinealocitos de gallina y paloma (Columba livia), se forman en el aparato de Golgi y se acumulan en las prolongaciones basales y distales, en el caso de la gallina, la paloma o el gorrión (Passer domesticus), o en el pericarion, en el caso del periquito (Melopsittacus undulatus) y el ánade real (Anas platyrhynchos). La cantidad de estos gránulos de secreción es bastante variable, aunque se han observado con abundancia en la urraca (Pica pica) y el periquito. Posiblemente estos gránulos tengan una función serotoninérgica (González y Valladolid, 1996). Con respecto a la presencia de capas sinápticas en este tipo celular, parece que no existe razón para pensar que jueguen un papel relevante en la actividad de la transmisión nerviosa, puesto que todavía no se ha observado inervación aferente en estas células. Estas capas aparecen de manera frecuente en la avefría europea (Vanellus vanellus), la codorniz japonesa y la gallina, pero se encuentran ausentes en la urraca (González y Valladolid, 1996).

1.3.4. FOTOTRANSDUCCIÓN EN AVES. Aunque se podría decir que la recepción de la información del fotoperiodo ambiental por el órgano pineal muestra un patrón de evolución continua desde la fotorrecepción directa de la pineal de peces a la recepción indirecta de la retina de mamíferos a través del NSQ, es posible establecer diferentes modelos de fototransducción según el tipo principal de pinealocito presente en la pineal: fotorreceptores pineales verdaderos, pinealocitos sin capacidad fotorreceptora y fotorreceptores modificados. Estos últimos son los que 21

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generalmente aparecen en las aves, y en menor grado, en quelonios y saurios, y se caracterizan por presentar un segmento externo que es menos regular que el presente en los fotorreceptores verdaderos.

Figura 4: Evolución de la epífisis en varias clases de vertebrados (A) lampreas; (B) teleósteos; (C) anuros; (D) lagartos; (E) aves; y (F) mamíferos, correlacionado con la evolución de cambios ultraestructurales en los receptores. Excepto en mamíferos, la pineal de los diferentes grupos de vertebrados recibe la información de la luz a través de la piel y los huesos del cráneo. El órgano pineal (PO) esta situado en el techo del diencéfalo, dorsalmente al tercer ventrículo (IIIv) y entre la comisura habenular (HC) y la comisura posterior (PC). En 22

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poiquilotermos esta asociado con otra estructura fotosensible – el órgano parapineal en peces (PaO), el órgano frontal en anfibios (FO) y el ojo parietal de reptiles (PE) (Tomada de Barriga y cols., 2004).

Figura 5: Representación esquemática de una célula fotorreceptora de la pineal aviar. SE: segmento externo, SI: segmento interno, ZN: zona del núcleo, PB: prolongación basal, S: sinapsis (Tomada de González y Valladolid, 1994). A diferencia de lo que ocurre en peces, anfibios y reptiles, la respuesta electrofisiológica de la pineal de las aves es más dependiente de la información procedente de la retina y del NSQ (Simpson y Follett, 1981), no encontrándose indicios in vivo de que la 23

Introducción

pineal sea directamente fotosensible en palomas, codornices y gorriones (Ralph y Dawson, 1968; Herbute y Bayle, 1974; Herbute y Bayle, 1977), aunque otras investigaciones parecen apuntar a que la pineal aviar sí que se comporta como un órgano fotorreceptor (Oishi y Kato, 1968; Oishi y Lauber, 1973; Binkley y Geller, 1975; Nyce y Binkley, 1977). Estas discrepancias podrían explicarse en parte por la existencia de fotorreceptores diferentes del ojo o la pineal, probablemente localizados en el hipotálamo, que podrían producir respuestas indirectas a la luz en la pineal. Tales fotorreceptores no retinales ni pineales han sido descritos en la codorniz japonesa, asignándoles un papel en la respuesta gonadal fotoperiódica (Oishi y Obara, 1994). A pesar de la disparidad encontrada en los estudios sobre fotosensibilidad pineal in vivo, la situación en los estudios in vitro es mucho más coherente, pues en todas las especies aviares estudiadas en estas condiciones, el fotoperiodo es capaz de sincronizar la producción pineal de melatonina (Deguchi, 1981; Yoshikawa y Oishi, 1998). En el caso de la pineal de pollo, esta propiedad se mantiene incluso cuando las células se disgregan y se ponen en placas como cultivos disociados (Deguchi, 1979; Robertson y Takahashi, 1988; Zatz y cols., 1988). La presencia de canales catiónicos activados por GMPc en células aisladas de pineal de pollo (Dryer y Henderson, 1991, 1993; D’Souza y Dryer, 1995) y de un compuesto semejante a la opsina en el órgano pineal de varias especies de aves (Vigh y Vigh-Teichmann, 1981; Araki y cols., 1992), sugiere la existencia de un mecanismo de fototransducción similar al de la retina. Sin embargo, en estos animales se ha descrito también un segundo pigmento de tipo opsina, denominado pinopsina, que no se encuentra presente en la retina (Okano y cols., 1994; Max y cols., 1995; Kawamura y Yokoyama, 1996), aunque su secuencia posee un 45% de semejanza con las opsinas de la retina, cuya sensibilidad máxima se encuentra entre 500 y 470 nm, por lo que en presencia de 11-cis-retinal, un cromóforo presente en la pineal de pollo, muestra sensibilidad hacia el color azul (Sun y cols., 1993; Okano y cols., 1994; Max y cols., 1995). Recientemente se ha descubierto también en la pineal de pollo una nuevo fotopigmento, denominado melanopsina, implicado en la agregación de los melanosomas, que probablemente se exprese junto a otros fotopigmentos conocidos y exista en todos los vertebrados (Bellingham y cols., 2002).

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Otros componentes de la cascada de fototransducción presentes en la glándula pineal aviar son la subunidad alfa de la transducina (Okano y cols., 1997), la arrestina, cuya inmunoreactividad aparece de manera transitoria durante el desarrollo, encontrándose ausente en pollos recién nacidos, y la recoverina (Mirshahi y cols., 1984; Korf y cols., 1992; Bastianelli y Pochet, 1994).

1.3.5. BIOSÍNTESIS Y METABOLISMO DE LA SECRECIÓN DE MELATONINA. La biosíntesis pineal de melatonina comienza con la captación de su precursor, el aminoácido esencial L-triptófano (L-TRP), que es tomado de la sangre por los pinealocitos, a través de un mecanismo de transporte activo que está bajo control adrenérgico (Alonso, 1999), y convertido en serotonina mediante una hidroxilación y una descarboxilación. Este proceso de dos pasos implica respectivamente a las enzimas triptófano hidroxilasa (TPH) y Laminoácido aromático descarboxilasa (AADA). Las concentraciones de serotonina en la glándula pineal, que son de manera general mucho mayores que en el resto del cerebro, son especialmente elevadas durante el día, pero caen marcadamente durante la noche como consecuencia de su conversión a melatonina. Esta conversión nocturna implica un proceso enzimático de dos pasos. Inicialmente, la enzima arilalquilamina N-acetiltransferasa (AANAT), que muestra un incremento de actividad de 30 a 70 veces mayor durante la noche, convierte la serotonina en N-acetilserotonina. La N-acetilserotonina incrementa así su concentración a valores entre 10 y 30 veces mayores de los que existen durante el día. Después, la enzima hidroxindol-O-metiltransferasa (HIOMT), que también incrementa su actividad durante la noche, metila la N-acetilserotonina para producir N-acetil-5metoxitriptamina, más comúnmente conocida como melatonina (Figura 6). Alternativamente a la formación de N-acetilserotonina, en la pineal puede producirse la desaminación de la serotonina por monoamino oxidasas, siendo el producto resultante oxidado a ácido 5-hidroxindolacético o reducido a 5-hidroxitriptofol, ambos susceptibles de transformación por la HIOMT para dar lugar a ácido 5-metoxindolacético y 5-metoxitriptofol, respectivamente.

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Introducción

Triptófano

TPH

5-Hidroxitriptófano MAO + AldDH

5-HIAA

5-HTL

MAO + ADH

5-Metoxitriptamina

HIOMT

AADA

Serotonina

AA-NAT HIOMT N-ac-Serotonina

DeAc

5-MIAA

HIOMT

MELATONINA

5-Metoxitriptofol CH 3 O

HN

CH

N

C

H

O

3

Figura 6: Vías del metabolismo de los indoles en las células fotosensibles pineales. Enzimas: AADA, descarboxilasa de aminoácidos aromáticos; AA-NAT, arilalquilamina Nacetiltransferasa; DeAc, desacetilasa; HIOMT, hidroxindol-O-metiltransferasa; MAO, monoamino

oxidasa;

TPH,

triptófano

hidroxilasa.

Indoles:

N-Ac-serotonina,

N-

acetilserotonina; 5-HIAA, ácido 5-hidroxindol acético; 5-HTL, 5-hidroxitriptofol; 5-MIAA, ácido 5-metoxindol acético. La estructura química de la melatonina se muestra en la parte inferior de la figura (Tomada de Barriga y cols., 2004). La síntesis y liberación pineal de melatonina a la circulación está bajo la influencia del ciclo luz/oscuridad (Liebmann y cols., 1997), ya que la luz deprime rápidamente la actividad de las enzimas pineales (Figura 7). Si se invierten las condiciones de luz exterior se invierten de modo paralelo las actividades enzimáticas y la biosíntesis pineal de indolaminas. Así, el ritmo diario de actividad biosintética pineal está controlado por los cambios naturales diarios 26

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en la duración de la iluminación. Este ritmo se pierde en condiciones de iluminación continua mientras que se mantiene, aunque disminuido, si los animales se mantienen en la oscuridad. Debido a su alto grado de solubilidad en lípidos, una gran cantidad de melatonina se libera a la circulación a medida que se sintetiza, probablemente a través de un mecanismo de difusión, aunque existen pruebas de la existencia de secreción pulsátil en alguna especie.

Figura 7: Producción y secreción de melatonina a través del sistema neuronal activado por la oscuridad e inhibido por la luz (Tomada de Brzezinski, 1997).

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Introducción

La melatonina circulante, cuya vida media es aproximadamente de 10 minutos (Illnerova y cols., 1978; Yellon, 1996), es transportada en el plasma en parte unida a la albúmina (70%) y en parte en forma libre (30%). La mayor parte de la melatonina circulante es inactivada mediante la conversión hepática en 6-hidroximelatonina y es excretada en la orina en forma de sulfatos (75%) o glucurónidos (5%); otra fracción es transformada en el cerebro en compuestos derivados de la quineurenamina (15%), quizás relacionados con alguna acción central de la melatonina; finalmente, una pequeña fracción es excretada en forma libre (0,5%) (Alonso, 1999).

1.3.6. REGULACIÓN DE LA SECRECIÓN DE MELATONINA. Aunque los pinealocitos aviares son directamente fotosensibles, la producción de melatonina en los mismos esta sometida a un ritmo circadiano similar al de mamíferos (Collin y cols., 1989; Cassone y Natesan, 1997). No obstante, existen importantes características que los hacen muy diferentes a los pinealocitos de la glándula pineal mamífera. Así, en las aves la activación pinealocítica ocurre en la fase de luz a través de receptores α1, α2 y β-adrenérgicos, lo que causa un descenso en el contenido de AMPc, inhibición de la actividad AA-NAT y disminución de la liberación de melatonina (Zatz y Mullen, 1988; Collin y cols., 1989), mientras que en mamíferos la estimulación noradrenérgica se va a realizar vía receptores α1 y β-adrenérgicos durante el periodo de oscuridad, lo que produce el aumento de los niveles de AMPc dentro de la célula y la consecuente activación de la enzima AA-NAT, aumentando así la producción de la hormona pineal (Vacas y cols., 1985; Takahashi y cols., 1989) (Figura 8). A pesar de las diferencias mencionadas, tanto en mamíferos como en aves, y en el resto de vertebrados, la magnitud y duración del incremento nocturno de la síntesis de melatonina va a depender de la longitud de la fase oscura del ciclo fotoperiódico, actuando como “reloj” y “calendario” para la regulación de otras actividades biológicas, independientemente de que la actividad del animal sea diurna o nocturna, considerándose de este modo como mensaje de la oscuridad y no del descanso o periodo de sueño (Illnerova y cols., 2000).

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MAMÍFERO

Terminales nerviosas adrenérgicas Estimulación en la OSCURIDAD

NA NA

AVE

+ AA-NAT AMPc α2 + + β1 + ATP Melatonina

AA-NAT AMPc

-

-

ATP

α2

NA

Melatonina

Terminales nerviosas adrenérgicas Estimulación en la LUZ

Figura 8: Regulación adrenérgica de la síntesis de melatonina en pinealocitos de mamíferos y aves. AA-NAT: arilalquilamina N-acetiltransferasa; AMPc: adenosín monofosfato cíclico; ATP: adenosín trifosfato.

1.3.7. FUENTES EXTRAPINEALES DE MELATONINA. Aunque la glándula pineal parece ser la principal fuente de melatonina plasmática en los vertebrados no anfibios estudiados hasta la fecha, en la retina de las aves también se ha observado la existencia de producción de este indol (Cogburn y cols., 1987), lo que explica que la melatonina circulante en sangre es el resultado de la secreción llevada a cabo tanto en la glándula pineal como en los ojos (Underwood y cols., 1984). Así, se ha comprobado la presencia de la hormona en la circulación de aves pinealectomizadas como el pollo (Osol y cols., 1985) o la paloma (Vakkuri y cols., 1985), como resultado del incremento del contenido retinal de melatonina, lo que sugiere que la retina actuaría como órgano compensatorio cuando la pineal no existe (Falcon, 1999). Sin embargo, otros autores consideran este hecho improbable, puesto que en el caso de aves como la codorniz japonesa no se han encontrado cambios compensatorios obvios en los niveles de melatonina de los ojos, tras la realización de una pinealectomía, ni del cuerpo pineal, después de cegar los ojos (Underwood y cols., 1984). Además, estos no son los únicos órganos secretores de melatonina. Así, tanto en la codorniz como en la paloma los niveles de melatonina no son totalmente nulos en animales 29

Introducción

pinealectomizados a los que se les ha practicado la ablación de las retinas, lo que apunta a que deben de existir fuentes extrapineales (y extrarretinales) de melatonina. Debería haber, por consiguiente, otras células en el organismo, además de las pineales y las de la retina, capaces de formar y secretar melatonina. Este es el caso de la glándula de Harder o el hipotálamo en pollos y palomas, respectivamente (Vakkuri y cols., 1985; Cogburn y cols., 1987). En el tracto gastrointestinal, las células enterocromafines de la membrana mucosa también aparecen como una fuente muy rica de melatonina extrapineal (Huether y cols., 1992), donde se sintetiza a través de una ruta análoga a la que sigue la melatonina epifisiaria (Lee y Pang, 1993), aunque a diferencia de la producción de melatonina de la pineal, que está regulada por el fotoperiodo, la liberación de melatonina gastrointestinal parece estar relacionada con la periodicidad de la ingesta alimenticia (Huether, 1994), observándose de este modo que la concentración de melatonina en el tejido gastrointestinal sobrepasa por un factor de 10 a 100 la de los niveles sanguíneos, existiendo además al menos 400 veces más melatonina en el tracto gastrointestinal que en la glándula pineal. Así, el tracto gastrointestinal forma una parte significativa de la concentración circulante de melatonina, especialmente durante el periodo diurno. En este sentido, la melatonina actuaría como una hormona endocrina, paracrina o autocrina que influenciaría la función y regeneración del epitelio, potenciando el sistema inmune del intestino y reduciendo el tono muscular de los músculos gastrointestinales. También se ha observado síntesis de melatonina en plaquetas sanguíneas (Launay y cols., 1982), células mononucleares de sangre periférica (Finocchiaro y cols., 1988, 1991, 1995), células de médula ósea (Tan y cols., 1999; Conti y cols., 2000), así como en tejido ovárico (Itoh y cols., 1997, 1999). De hecho, en diversos órganos y estructuras como el fundus del estómago, intestino, testículos, médula espinal, corteza cerebral, núcleo del rafe y núcleo estriado se han encontrado cantidades abundantes de ARNm de las enzimas AA-NAT y HIOMT, por lo que estas regiones se encuentran teóricamente equipadas para la fabricación de melatonina.

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1.3.8. CLASIFICACIÓN Y MECANISMOS REGULADORES DE LOS RECEPTORES DE MELATONINA. Inicialmente los receptores de melatonina fueron clasificados atendiendo a diferencias farmacológicas y cinéticas a la hora de unir 2-[125 I] iodomelatonina en dos grupos: receptores de alta afinidad o ML1 y receptores de baja afinidad o ML2. Hasta la fecha se han clonado y caracterizado tres subtipos de receptores ML1, denominados MT1, MT2 y Mel1c, y uno de baja afinidad purificado a partir de cerebro y riñón de hámster (Dubocovich, 1995; Molinari y cols., 1996; Nosjean y cols., 2000), cuyo nombre es MT3, en el que se ha encontrado un 95% de homología con la enzima quinona reductasa humana, que interviene en procesos de destoxificación (Nosjean y cols., 2000). Los receptores MT1, que corresponden al subtipo al que anteriormente se conocía como ML1A o Mel1a (Chan y cols., 2002) y son codificados por el gen Mel1a, son miembros de una superfamilia de receptores constituidos por siete dominios transmembranales unidos a proteínas G. Cuando se produce su estimulación dan lugar a respuestas que inhiben la cascada de transducción de AMPc (Reppert y cols., 1994; Witt-Enderby y Dubocovich, 1996; Brydon y cols., 1999a,b), provocando la inhibición de la proteína quinasa A (Morgan y cols., 1994; Witt-Enderby y cols., 1998) y el consecuente decremento en la fosforilación de los sitios CREB (del inglés, cAMP response element-binding) (McNulty y cols., 1994; Witt-Enderby y cols., 1998), además de estimular a las cascadas dependientes de fosfolipasa C (Brydon y cols., 1999a; Ho y cols., 2001; MacKenzie y cols., 2002), activar a la proteína quinasa C (Witt-Enderby y cols., 2001) y conectar con canales de potasio activados por proteínas G del tipo rectificadores de entrada (Jiang y cols., 1995) y activados por calcio (Geary y cols., 1997, 1998). Los receptores MT2 poseen una localización más restringida que la de los receptores MT1. Corresponden al subtipo cuya nomenclatura anterior era ML1B o Mel1b (Clemens y cols., 2001), son codificados por el gen Mel1b y su activación induce un decremento en la cascada de AMPc (Reppert y Weaver, 1995; Brydon y cols., 1999a,b; Jones y cols., 2000; MacKenzie y cols., 2002), además de inhibir los niveles de GMPc vía la ruta de una guanilil

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Introducción

ciclasa soluble (Petit y cols., 1999) y estimular la hidrólisis de fosfatidilinositol (Ho y cols., 2001; MacKenzie y cols., 2002). Finalmente, los receptores Mel1c han sido clonados de Xenopus laevis y su gen no se expresa en mamíferos, sino en anfibios (cerebro y retina) y reptiles (cerebro) (Reppert y cols., 1996). En el caso de las aves, se ha demostrado la existencia de sitios de unión para la 2-[125 I] iodomelatonina en el cerebro, retina, intestino, bazo, timo, bolsa de Fabricio, glándula adrenal, testículos, ovarios, riñón, pulmones y corazón, siendo la unión a estos tejidos rápida, estable, saturable, reversible y específica (Pang y cols., 1996), dándose con afinidades de rango picomolar y densidades de rango femtomolar (Pang y cols., 1996). En algunos de estos tejidos la unión está muy localizada (cerebro, intestino, glándula adrenal, ovario y riñón), mientras que en otros es relativamente difusa (corazón y riñón), inhibiéndose la afinidad o densidad de la unión con concentraciones micromolares de nucleótidos de guanina, lo que sugiere el acoplamiento a proteínas G de los receptores (Song y cols., 1993; Pang y cols., 1996). Los receptores en este grupo son de tipo MT1 y Mel1c (Reppert y cols., 1996). Los receptores de melatonina se encuentran sujetos a varios procesos reguladores homólogos, entre los que cabe destacar el desacoplamiento de proteínas G: la persistencia de altos niveles de melatonina durante largos periodos de tiempo incrementa la proporción de formas inactivas de proteína G, con la consecuente pérdida de potencia de la hormona sobre su receptor (Gauer y cols., 1993; Witt-Enderby y cols., 1998); la fosforilación de proteínas quinasas A y C o de quinasas de receptores de proteínas G (Hosey y cols., 1995; Krupnick y Benovic, 1998; Witt-Enderby y cols., 2003), que impide la interacción entre las proteínas G y los receptores (Witt-Enderby y cols., 2003); la disminución de sensibilidad a los niveles nocturnos de melatonina de los receptores, pues se ha observado que durante la noche son menos sensibles a la 2-[125 I] iodomelatonina, efecto que podría explicarse por el decremento en los niveles de ARNm y por la acción de una ruta de señalización dependiente de AMPc (Barrett y cols., 1996; Schuster y cols., 2001); y la internalización de receptores, que se eliminarían a través de la formación de vesículas recubiertas de clatrina, aunque este proceso todavía no ha sido descrito para la melatonina (Witt-Enderby y cols., 2003).

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Con respecto a la regulación heteróloga, se ha puesto de manifiesto que determinados estímulos pueden cambiar la densidad de los receptores de melatonina. En el NSQ, esta densidad varía según la fase del ciclo luz-oscuridad, siendo menor durante la noche, incluso en animales pinealectomizados en los que el ciclo diario no existe (Masson-Pevet y cols., 2000), por lo que el cambio podría deberse a las condiciones lumínicas. Es posible que la acción del ciclo luz-oscuridad sobre los receptores de melatonina esté mediada por genes del reloj circadiano (NSQ), aunque todavía no se sabe si los genes que codifican para los receptores de melatonina están controlados por el mencionado reloj (Witt-Enderby y cols., 2003). Otros factores que afectan la densidad de los receptores de melatonina, aunque sólo se han descrito en mamíferos, son los niveles de estradiol circulante, ya que parece existir una correlación negativa entre los niveles de este estrógeno y la densidad de receptores MT1 en arterias cerebrales y caudales de ratas hembra (Seltzer y cols., 1992), y el despertar programado, pues se ha observado en hámsters que cuando se despiertan, al tocarlos o mediante inyecciones subcutáneas de solución salina, se sincroniza la expresión de receptores de melatonina en el NSQ (Hastings y cols., 1997). Por último decir que la naturaleza lipofilica de la melatonina y la existencia de mecanismos activos de captura de la molécula hacen que pueda actuar directamente sobre cascadas de transducción, por lo que determinadas acciones de la misma podrían llevarse a cabo sin la intermediación de sus receptores (Menéndez-Peláez y Reiter, 1993; Finocchiaro y Glikin, 1998).

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Introducción

1.4. PAPEL FISIOLÓGICO DE LA GLÁNDULA PINEAL Y LA MELATONINA: ASPECTOS GENERALES Y PARTICULARIDADES EN AVES. La interpretación del mensaje de la melatonina por parte del organismos es esencial para que las funciones fisiológicas del animal se adapten a las necesidades y condiciones ambientales del momento, lo que puede ser crítico en cuanto a su supervivencia. En el caso particular de las aves, un gran número de investigaciones han puesto de manifiesto que la glándula pineal juega un papel muy importante sobre el comportamiento de locomoción y los mecanismos inmunológicos de las mismas. Así, parece ser que las fluctuaciones circadianas de la hormona se ajustan a un oscilador amortiguador situado en alguna parte del cuerpo aviar que dirige la actividad locomotora gracias al acceso a las señales luminosas cíclicas del ambiente (Foa y Menaker, 1988; Gwinner y cols., 1997) y están en sintonía recíproca con la actividad del sistema inmune, lo que es de gran importancia para la homeostasis, aunque pueden darse alteraciones en los ritmos establecidos a causa de la enfermedad, modificándose de este modo la coordinación temporal (Levi y cols., 1992).

1.4.1. GLÁNDULA PINEAL Y MELATONINA Y SU RELACIÓN CON EL SISTEMA CIRCADIANO Y LA ACTIVIDAD LOCOMOTORA. En varias especies de aves se ha establecido que los osciladores circadianos predominantes se encuentran localizados en el ojo, la glándula pineal, el NSQ o en diferentes combinaciones de los mismos (Murakami y cols., 2001). Por ejemplo en el gorrión doméstico, una gran cantidad de indicios circunstanciales apoyan el papel del órgano pineal como marcapasos primario del sistema circadiano. Así, aunque la pinealectomía abole el ritmo locomotor del gorrión en condiciones constantes (Gaston y Menaker, 1968), la desenervación de la pineal in situ no tiene efectos sobre el ritmo. La ritmicidad puede restaurarse en aves pinealectomizadas mediante la implantación de pineales de ave donantes en la cámara anterior del ojo, portando el ritmo restaurado la fase del donante (Zimmerman y Menaker, 1979). Los gorriones tienen un ritmo circadiano de melatonina plasmática que es en parte resultado de la actividad pineal. La melatonina exógena administrada en pequeñas cantidades 34

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cambia el periodo de libre curso de los ritmos de locomoción en oscuridad constante (Turek y cols., 1976). La interpretación más simple a estos hechos es que la pineal es un oscilador que se sustenta a sí mismo, secretando melatonina rítmicamente, de tal modo que el ritmo de melatonina en sangre (o posiblemente el fluido cerebroespinal) sincroniza la porción del sistema circadiano que está a partir de la pineal. Es sabido que existen otros componentes no pineales en el sistema circadiano del gorrión ya que en gorriones pinealectomizados se puede conseguir un encarrilamiento con los ciclos de luz mientras no se encuentren en libre curso. Se desconoce si estos componentes se encuentran a partir del órgano pineal. De hecho, las lesiones provocadas en el NSQ también abolen la ritmicidad en libre curso (Takahashi y Menaker, 1980). Por otro lado, en aves gallináceas la pinealectomía no conduce a que ocurra arritmicidad (Simpson y Follett, 1981). En la codorniz japonesa, los ojos contienen osciladores que controlan la actividad locomotora (Underwood y cols., 1990). En aves columbiformes, sólo la pinealectomía o el cegado de los ojos no abole el ritmo circadiano bajo condiciones constantes, pero las dos operaciones practicadas en conjunto causan arritmicidad (Ebihara y cols., 1984). En todas las especies examinadas hasta el momento, el NSQ visual parece ser necesario para la expresión del comportamiento circadiano, pero su papel como oscilador aún no ha sido confirmado. En varias especies de aves, como el estornino o la paloma, la inyección e infusión diaria de melatonina encarrila ritmos de actividad circadiana tales como la actividad anticipatoria al tiempo de inyección (Cassone, 1990; Chabot y Menaker, 1992b). Además, la administración diaria de melatonina en el agua para beber restaura el ritmo en gorriones pinealectomizados arrítmicos (Cassone y cols., 1993). Estos efectos encarriladores de la melatonina podrían estar involucrados, al menos en parte, en el reajuste del reloj maestro. Otro posible mecanismo podría ser el de un efecto enmascarador mediante inhibición directa por melatonina de la actividad locomotora a través de un lado cerebral diferente al oscilador circadiano (McArthur y cols., 1991), puesto que está bien establecido que la melatonina afecta la termorregulación en aves tales como el pollo y el gorrión, al igual que lo hace en mamíferos (Simpson y Follett, 1981). Sin embargo, Murakami y colaboradores (2001) indican que las inyecciones diarias de melatonina en gorriones mantenidos bajo condiciones de luz tenue constante no encarrilan el ritmo de libre curso y por consiguiente el 35

Introducción

reloj circadiano no debería verse afectado. Es posible que este efecto se haya debido quizás a la persistencia del ritmo de melatonina endógeno de la pineal. Como consecuencia, parece que el efecto de inyecciones diarias de melatonina difiere entre las diferentes especies aviares. Parece probable que la inhibición del movimiento y el decremento de temperatura corporal posean una correlación positiva, puesto que ambos efectos de la melatonina muestran el mismo patrón horario. Por consiguiente, el ritmo circadiano endógeno de melatonina liberada por la glándula pineal parece controlar el ritmo circadiano de tanto la actividad locomotora como de la temperatura corporal en el gorrión, la codorniz japonesa, el estornino y la paloma (Zimmerman y Menaker, 1979; Chabot y Menaker, 1992a,b). Si esto es así, los distintos efectos de la melatonina diaria sobre el encarrilamiento de los ritmos circadianos entre aves intactas y pinealectomizadas podrían deberse a diferencias en la localización del reloj circadiano maestro. En el gorrión y la codorniz japonesa se considera que el reloj circadiano maestro se encuentra localizado en la glándula pineal o en el NSQ y el ojo, respectivamente (Simpson y Follett, 1981; Underwood y cols., 1990). Si la melatonina puede reajustar directamente el oscilador circadiano para encarrilar los ritmos circadianos, el NSQ, que contienen los receptores de melatonina, debería entonces ser el oscilador circadiano maestro (McArthur y cols., 1991; Gillette y McArthur, 1996). En el cárabo uralense (Strix uralensis), un ave nocturna, una única inyección de melatonina causa un gran decremento de la temperatura corporal, pero no inhibe el movimiento. La glándula pineal del cárabo se encuentra degenerada y los niveles sanguíneos de melatonina en esta especie se encuentran en niveles muy bajos tanto por el día como por la noche. Se ha especulado que la glándula pineal ha degenerado para evitar la inhibición de la actividad locomotora inducida por la melatonina por la noche (Taniguchi y cols., 1993). Sin embargo, Murakami y colaboradores (2001) han indicado que este no sería el caso y que por el contrario la causa sería la de evitar la caída de la temperatura corporal.

1.4.2. MELATONINA Y RITMOS DE SUEÑO-VIGILIA. Entre las diversas funciones fisiológicas en las que ha sido implicada la melatonina, su papel como regulador de los ritmos de sueño-vigilia ha sido objeto de una gran atención por 36

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parte de la comunidad científica en los últimos tiempos, lo que ha resultado en la publicación de numerosos estudios llevados a cabo tanto en animales como en seres humanos. El hecho de que se descubriera que la hormona es secretada principalmente durante el periodo nocturno (Lynch y cols., 1975), la estrecha relación entre el incremento nocturno de melatonina endógena y la coordinación existente entre el sueño y los efectos prosomnogénicos que el indol pineal parecía poseer condujo a muchos investigadores a sugerir que la melatonina estaba implicada en la regulación fisiológica del sueño. En este sentido, se ha observado que la supresión de la producción de melatonina mediante β-bloqueantes presenta correlaciones con respecto al insomnio (Brismar y cols., 1987, 1988; Van Den Heuvel y cols., 1997), mientras que el incremento de las concentraciones plasmáticas de melatonina por supresión de las enzimas que llevan a cabo su metabolización en el hígado resulta en un aumento de los estados de somnolencia (Hartter y cols., 2001). Se ha observado que en el periodo de vigilia inmediatamente anterior a la etapa de sueño, al que se conoce con el nombre de zona de mantenimiento de la vigilia o “zona prohibida” al sueño (Lavie, 1986), la propensión al sueño se reduce al mínimo y a la vez la actividad de las neuronas del sistema nervioso central se eleva (Buysse y cols., 2004; Long y cols., 2005), coincidiendo la transición de la fase de vigilia al periodo de alta propensión al sueño con la elevación nocturna del ritmo endógeno de melatonina (Dijk y Cajochen, 1997), incremento que parece estar relacionado temporalmente con la apertura de la etapa de sueño (Tzischinsky y cols., 1993; Shochat y cols, 1997). Sobre la base de la relación entre la secreción endógena de melatonina y la apertura de la entrada del sueño nocturno, se ha propuesto que el papel del indol pineal en la inducción del sueño no implicaría la inducción activa del mismo, sino que consistiría en la inhibición de los mecanismos que generan el periodo circadiano de vigilia (Lavie, 1997), presumiblemente a través de receptores MT1 (Liu y cols., 1997; Hunt y cols., 2001) y activación GABAérgica (Golombek y cols., 1996; Tenn y Niles, 1997) a nivel del sistema nervioso central. En cuanto a los efectos de la administración exógena de melatonina sobre el sueño y el reloj circadiano, son numerosos los estudios que han puesto de manifiesto que el tratamiento durante el día con la hormona produce sopor (Waldhauser y cols., 1990; Grad y Rozencwaig, 1993; Nave y cols., 1995; Hughes y Badia, 1997; Satomura y cols., 2001), además de elevar 37

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los niveles circulantes de la misma a los que se observan normalmente durante la noche (Dollins y cols., 1994). Por todo lo expuesto, parece que la melatonina a través de su actividad sobre el sistema nervioso central es un elemento crucial a la hora de coordinar el mecanismo circadiano del sueño. Sin embargo, al haberse encontrado recientemente receptores de melatonina en otras estructuras cerebrales como es el hipocampo (Savaskan y cols., 2005), se requieren más estudios para elucidar el papel exacto en cuanto al sueño de la hormona pineal sobre las diferentes áreas.

1.4.3. GLÁNDULA PINEAL, MELATONINA Y SISTEMA INMUNE. Varios candidatos parecen estar involucrados en la regulación del ritmo circadiano de la función inmune, siendo uno de los principales la glándula pineal y su secreción de melatonina. Las razones que argumentan esta afirmación están en el hecho de que las funciones de esta glándula presentan periodicidad estacional y circadiana, en la fuerte dependencia de la síntesis del ritmo circadiano de melatonina a las condiciones de luz y en la participación del indol pineal en el control de diferentes ritmos biológicos, entre los que se incluyen los asociados con el incremento en la incidencia de infecciones y desórdenes inmunitarios (Skwarlo-Sonta, 1996). El embrión aviar se muestra como un excelente modelo para el estudio de la interdependencia recíproca entre la glándula pineal y el sistema inmune debido a que el timo y la pineal comienzan su desarrollo al mismo tiempo (Skwarlo-Sonta, 2002). Así, en embriones de pollo pinealectomizados se ha observado un retraso en el desarrollo de los órganos linfoides primarios (timo y bolsa de Fabricio) y secundarios (bazo), una disminución de la tasa de supervivencia y número de los linfocitos presentes en tales estructuras, y un descenso de la respuesta inmune humoral y de las actividades de los diferentes tipos de inmunidad mediada por células (Jankovic y cols., 1994), lo que claramente indica la necesidad de que la glándula pineal se encuentre intacta para el desarrollo normal del sistema inmune y sugiere la influencia directa o indirecta de la misma sobre los órganos linfoides a través de secreciones neuroendocrinas (Skwarlo-Sonta, 2002). En individuos jóvenes de pollo, gallina o tórtola 38

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collariza (Streptopelia risoria), la pinealectomía conduce al deterioro de un gran número de parámetros inmunes, observándose un aumento del nivel de proteínas totales, un descenso en el porcentaje de linfocitos y un incremento del número de heterófilos, cuya actividad fagocítica y metabolismo oxidativo se encuentran alterados (Rodríguez y Lea, 1994), hechos que probablemente tengan relación con la reducción de la melatonina circulante (Rodríguez y cols., 1999a). Por otro lado, el ritmo circadiano de la función de la glándula pineal se ve influenciado por la eliminación de la bolsa de Fabricio (bursectomía) durante el estado embrionario, que provoca, al igual que la pinealectomía, la disminución de la respuesta inmune en los pollos, además de reducir el pico nocturno de la actividad de la AA-NAT y los niveles séricos de melatonina (Youbicier-Simo y cols., 1996). Son abundantes los estudios que apoyan el papel inmunomodulador de la melatonina en las aves y que consideran a la glándula pineal como la primera fuente de esta regulación inmune mediada por la melatonina. Así, se ha visto que la hormona pineal modula varias funciones inmunes aviares, como la producción de anticuerpos, la proliferación de linfocitos, la citotoxicidad de las células NK y la celular dependiente de anticuerpos o la síntesis y liberación de citocinas (Skwarlo-Sonta, 1996), encontrándose además correlaciones positivas entre los picos nocturnos de melatonina y la actividad fagocítica (Rodríguez y cols., 1999a; Terrón y cols., 2004), lo que sugiere una relación estrecha entre la melatonina y la inmunidad innata. Se tiene conocimiento de que la acción de la melatonina sobre el sistema inmune se lleva a cabo mediante diversas vías y que los efectos de la misma son dependientes de la especie, edad, sexo o incluso del protocolo experimental, como por ejemplo la estación del año en que se lleve a cabo el estudio (Maestroni y cols., 1987; Skwarlo-Sonta, 2002). En este sentido, se han observado cambios en la inmunidad de animales de vida salvaje, tanto en su entorno natural como bajo condiciones de laboratorio caracterizadas por el empleo de diferentes regímenes de iluminación, dependientes de la época estacional (Markowska y cols., 2000). El hecho de que se hayan encontrado sitios de unión específicos para la melatonina en diferentes células inmunes de vertebrados superiores permite asumir la existencia de vías directas entre las posibles de acción de la hormona pineal sobre el sistema inmune (Calvo y cols., 1995), aunque casi toda la literatura se refiere en este caso a mamíferos. Justamente se 39

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han caracterizado receptores de melatonina en linfocitos T de sangre periférica humanos, que en contacto con el indol pineal modularían su respuesta proliferativa (Maestroni y Conti, 1990), incrementándose la unión del mismo tras la activación celular (Konakchieva y cols., 1995). También los monocitos humanos expresan receptores de melatonina dependiendo del estado de maduración en el que se encuentren, afectando su diferenciación de manera negativa a la expresión del receptor para la melatonina, al menos in vitro (Barjavel y cols., 1998). Los receptores de melatonina no sólo se sitúan en la membrana celular, sino también en su núcleo, al cual la melatonina parece tener fácil acceso, debido a su naturaleza lipofílica, estando implicados principalmente en la producción de citocinas de sangre periférica (GarcíaMauriño y cols., 1998), aunque se desconoce si la acción de la hormona es sobre la expresión de los genes de estos elementos o sólo se produce a nivel postranscripcional (Maestroni y cols., 1999). Además de actuar vía receptores específicos, la melatonina puede influenciar la actividad de proteínas intracelulares implicadas en la activación de células inmunes. La melatonina podría influenciar la actividad fosfodiesterasa intracelular dependiente de calmodulina, estando la vía de transducción mediada a través de proteínas G acopladas a receptores específicos (Reppert y Weaver, 1995). Finalmente, se pueden añadir a los efectos inmunomoduladores de la melatonina su capacidad para estimular la linfopoyesis de las células B y la producción de monocitos y células NK (Currier y cols., 2000) como procedimiento preventivo para reforzar la reactividad inmune. En vista de la variedad de posibles efectos directos como señal intracelular, la existencia de diferentes tipos de receptores de melatonina y el hecho de que los propios linfocitos produzcan melatonina en respuesta a ciertos estímulos (Conti y cols., 2000), apunta hacia un papel fisiológico de la melatonina, como un modulador dentro del sistema inmune paracrino, autocrino o incluso intracelular, que estaría asimismo implicada en la regulación de las variaciones estacionales y circadianas de la inmunidad innata y adquirida (Nelson y Drazen, 1999).

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1.4.4. EFECTOS IN VIVO DE MELATONINA SOBRE EL SISTEMA INMUNE. Muchos estudios han demostrado la influencia que sobre distintos parámetros del sistema inmune de aves y mamíferos ejerce la administración de melatonina. Así, se ha observado que la hormona suministrada exógenamente induce un incremento en el crecimiento de las poblaciones de células de varios tejidos inmunes y de los tejidos mismos (Haldar y cols., 2001), la respuesta mitogénica de esplenocitos de ratón (Sze y cols., 1993; Demas y Nelson, 1998), la proliferación de linfocitos en ratas afectadas por tumores (Liebmann y cols., 1996), la actividad de células NK de mamíferos (Lissoni y cols., 1986; Angeli y cols., 1988), la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos de ratones Balb/c (Giordano y Palermo, 1991; Giordano y cols., 1993), los niveles plasmáticos de interleucina 2 (Mocchegiani y cols., 1996), la presentación de antígeno por macrófagos de bazo a células T a través de un incremento de la expresión del complejo principal de histocompatibilidad de clase II, producción de interleucina 1 y factor de necrosis tumoral (Pioli y cols., 1993), y la producción de péptidos tímicos, timosín α1 y timulina (Molinero y cols., 2000). La inyección de la hormona por la tarde incrementa además los niveles de interferón γ (Champney y cols., 1998), además de incrementar el peso del timo del jerbo (Vaughan y cols., 1976) e hipertrofiar el bazo del hámster sirio (Vaughan y cols., 1987). Igualmente posee acciones antiinflamatorias sobre macrófagos (Mayo y cols., 2005a), además de participar en la regulación de la expresión génica de citocinas y otros inmunomoduladores en el bazo, timo, nódulos linfáticos y médula ósea (Liu y cols., 2001) y la apoptosis de linfocitos B y T: el mecanismo normal de eliminación de células T y B se produce en la médula espinal y el timo a través de procesos apoptóticos en concordancia con los procesos de estimulación proliferativa, lo que ayuda a controlar los niveles de producción de nuevos linfocitos; la melatonina en este caso desempeñaría un papel de activador antiapoptótico en los mismos (Yu y cols., 2000). En el caso concreto de las aves, se ha visto que la administración de melatonina aumenta tanto la capacidad quimioatrayente como la capacidad para fagocitar partículas antigénicas (Rodríguez y cols., 1997; Terrón y cols., 2005a), aumenta las respuestas inmunes humoral y celular, tanto en aves previamente pinelectomizadas (Moore y cols., 2002), como 41

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en aquellas no sometidas a debilitamiento previo del sistema inmune (Moore y Siopes, 2002a), contribuye al desarrollo de la bolsa de Fabricio y a que los pollos alcancen el estado de inmunocompetencia más tempranamente (Moore y Siopes, 2002b), refuerza las células blancas de la sangre y aumenta la proliferación de linfocitos T y B (Skwarlo-Sonta, 1990), además de tener importantes efectos inmunoconstitutivos sobre los fagocitos (Barriga y cols., 1998) Asimismo ha sido estudiado el efecto de la hormona sobre estados inmunodeprimidos causados por enfermedades infecciosas o la administración de fármacos inmunosupresores, encontrándose que la administración de melatonina protege significativamente contra el descenso del peso corporal y la atrofia del timo y las glándulas adrenales causada por dexometasona en ratas en crecimiento (Mori y cols., 1984; Aoyama y cols., 1987), y la depresión de la respuesta primaria de anticuerpos en ratas tratadas con propanolol y corticosterona (Maestroni y cols., 1986; Pierpaoli y Maestroni, 1987), previene la parálisis y muerte de ratones inoculados con dosis letales del virus de la encefalomiocarditis, reduce la viremia y pospone la muerte de ratones infectados con el virus letal Semliki Forest o el de la encefalomielitis equina venezolana (Ben-Nathan y cols., 1995; Bonilla y cols., 1997, 2001), además de aumentar la respuesta de anticuerpos a antígenos T-dependientes en ratones inmunodeprimidos con ciclofosfamida (Caroleo y cols., 1990, 1992).

1.4.5. EFECTOS IN VITRO DE MELATONINA SOBRE EL SISTEMA INMUNE. Aunque parece existir un acuerdo unánime a la hora de considerar a la melatonina como un compuesto fisiológico inmunoestimulador en modelos in vivo, la adición de la hormona pineal a cultivos de células inmunes, es decir, la experimentación in vitro, muestra resultados contradictorios. En este sentido, se ha descrito que el cultivo con melatonina produce un incremento marcado de la proporción de células portadoras de receptores T citotóxicos y de receptores para la interleucina 2 en presencia de fitohemoaglutinina y restaura la proliferación de linfocitos B (López-González y cols., 1992), y por otro lado que inhibe la actividad proliferativa de células linfoides en humanos (Persengiev y Kyurkchiev, 1993; Konakchieva y cols., 1995; Wolfler y cols., 1998), ratas (Pahlavani y Harris, 1997) o pollos 42

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(Markowska y cols., 2000), acompañándose en algunas ocasiones de decremento de la actividad NK y de la producción de interferón o factor necrótico tumoral α (Di Stefano y Paulesu, 1994), lo que difiere completamente de los resultados obtenidos en experimentos in vivo, en los que el indol pineal se comporta como un modulador positivo de la proliferación de linfocitos y la producción de citocinas. Existen varios argumentos que pueden explicar el por qué de resultados tan contradictorios. Por un lado, el efecto de la melatonina sobre las células inmunes estaría mediado a través de tejidos, células, hormonas o citocinas que no están presentes en el medio de cultivo; por otro lado, la presencia en el medio de cultivo de melatonina liberada por las células inmunes podría interferir con la melatonina exógena añadida a los estudios in vitro, enmascarando el efecto de la misma. Independientemente de esta divergencia, gran cantidad de estudios in vitro siguen concluyendo que la melatonina actúa como estimulante de diferentes aspectos de la función inmune. Así por ejemplo, se ha mostrado que la melatonina incrementa la producción de interferón γ en esplenocitos de ratón, siendo la estimulación significativamente mayor en células aisladas durante el periodo nocturno que durante el diurno (Colombo y cols., 1992), aumenta, en combinación con lipopolisacárido, la producción de interleucina 1 y la citotoxicidad de monocitos humanos (Morrey y cols., 1994), activa la producción de interleucinas 6 y 12 en linfocitos humanos (García-Mauriño y cols., 1999), incrementa la producción de factor necrótico tumoral y disminuye la liberación de factor tisular (Fjaerly y cols., 1999), reduce la producción de óxido nítrico en macrófagos inmunoestimulados (Gilad y cols., 1998), e influencia el sistema de formación sanguínea en ratones a través de receptores opioides situados en la médula espinal, macrófagos e interleucina 1 (Maestroni y cols., 1999).

1.4.6. MELATONINA, ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO Y CÉLULAS FAGOCÍTICAS: PAPEL ANTIOXIDANTE. La formación de radicales libres durante el proceso fagocítico constituye claramente una sólida defensa adoptada por el organismo en su hábitat natural, gracias a la cual los microorganismos patógenos pueden ser destruidos. Sin embargo, aunque en las células

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fagocíticas existen sistemas para la eliminación de estas moléculas, muchas veces algunas escapan al control celular, afectando así a la integridad del fagocito. En los últimos años, se ha identificado a la melatonina como un potente antioxidante, debido a su habilidad para secuestrar radicales libres, estimular enzimas antioxidantes (Tan y cols., 2000; Mayo y cols., 2002) y proteger frente a especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, reduciendo el estrés oxidativo tanto in vitro como in vivo (Reiter y cols., 2000a; Mayo y cols., 2003a; Reiter y cols., 2003). Específicamente se han descrito acciones directas del indol pineal en la neutralización de la alta toxicidad del radical hidroxilo (Tan y cols., 1993; Poeggeler y cols., 1994; Hardeland y cols., 1995; Matuszak y cols., 1997; Li y cols., 2002), del 1O2 (Poeggeler y cols., 1996; Zang y cols., 1998; Roberts y cols., 2000) y del H2O2 producido por los sistemas enzimáticos y la dismutación del radical O2.- (Tan y cols., 2000), aunque esto último no está del todo claro (Fowler y cols., 2003). También se han observado acciones indirectas en la estimulación de enzimas antioxidantes, como la superóxido dismutasa,

catalasa,

glutatión

peroxidasa,

glutatión

reductasa

y

glucosa-6-fosfato

deshidrogenasa (Reiter y cols., 2000c; Mayo y cols., 2003b; Rodríguez y cols., 2005); incremento de síntesis de glutatión, un secuestrador de radicales libres y antioxidante muy abundante, a través de la estimulación de la enzima limitante γ-glutamilcisteína sintasa (Urata y cols., 1999); acción sinérgica junto con las vitaminas C y E y el propio glutatión contra la oxidación de grasas poliinsaturadas (Gitto y cols., 2001), siendo superior la reducción del daño oxidativo producida por la melatonina que por las vitaminas antioxidantes cuando se estudian sus efectos por separado (Tan y cols., 2002). Además, se han encontrado acciones a nivel de las mitocondrias, como sugiere el hecho de que estos orgánulos produzcan abundantemente especies reactivas de oxígeno y nitrógeno y la melatonina sea un eficiente secuestrador de las mismas, que posean las enzimas glutatión peroxidasa y glutatión reductasa, estimuladas ambas por la melatonina, y que la concentración de la hormona en la mitocondria pueda ser mayor que en cualquier otra parte de la célula, e incluso superior a la concentración sérica (Acuña y cols., 2002). Pese a que todos los mecanismos de los efectos de la melatonina como secuestrador de radicales libres y productos afines no han sido aún identificados, no hay duda sobre su capacidad para moderar el daño celular producido por el oxígeno tóxico (Acuña y cols., 2002; 44

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Reiter y cols., 2002), algo de lo que existen bastantes evidencias en el caso particular de las aves. Así, por ejemplo, se ha observado que la incubación con dosis farmacológicas de melatonina aumenta la actividad de la enzima superóxido dismutasa (Rodríguez y cols., 1998), al mismo tiempo que incrementa la concentración de mieloperoxidasa (Barriga y cols., 1998), encontrándose correlaciones negativas de la hormona con el estrés oxidativo (Rodríguez y cols., 1999a), ya que reduce la intensidad del estallido respiratorio (Rodríguez y cols., 1997). A dosis fisiológicas se ha observado que disminuye la producción de malonaldehído, indicador del daño oxidativo inducido a las membranas lipídicas (Rodríguez y cols., 1999b; Terrón y cols., 2005b), además de correlacionar negativamente con los niveles de anión superóxido, cuyos máximos y mínimos coinciden con las oscilaciones a lo largo del día de la hormona (Rodríguez y cols., 1999a). Con respecto a los niveles normales de hormona en plasma, se ha encontrado una potenciación de su papel como secuestrador de radicales durante el periodo nocturno, momento en que los niveles circulantes de hormona se hacen máximos (Terrón y cols., 2004). Sintéticamente podría decirse que la melatonina es un potente antioxidante endógeno en heterófilos de aves, a concentraciones fisiológicas y farmacológicas, además de un efectivo secuestrador de radicales libres que protege a las células del estrés oxidativo que acompaña a la fagocitosis.

1.4.7. MODULACIÓN DE LA FUNCIÓN PINEAL POR FACTORES INMUNES. Al ser la comunicación entre la glándula pineal y el sistema inmune bidireccional, diferentes elementos circulantes, como mensajeros procedentes de células inmunes activadas, mediadores inflamatorios y hormonas, van a ejercer una acción sobre la glándula pineal que va a ser recíproca (Fabris, 1994). Particularmente se ha comprobado que los opioides (Govitrapong y cols., 1992), las prostaglandinas (Voisin y cols., 1993), el tratamiento con citocinas (Mucha y cols., 1994), la histamina (Zawilska y cols., 1997), la estimulación antigénica (Markowska y cols., 2000), o la inflamación (Skwarlo-Sonta, 2002), modifican la función de la glándula pineal, medida bien como actividad AA-NAT o como concentración de melatonina. Por ejemplo, en pollos de 7 semanas inmunizados a intervalos de 9 días con 45

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antígenos de cerdo T-dependientes se observa un incremento de la concentración de melatonina sérica diurna después de la inmunización (Youbicier-Simo y cols., 1996). Si bien no hay constancia segura de receptores para estos factores circulantes en los pinealocitos, su presencia puede deducirse, como es el caso de estudios in vivo con receptores ligandos de citocinas (Mucha y cols., 1994), las cuales tienen fácil acceso a la glándula pineal. En el caso de la interleucina 1β, se ha demostrado que los niveles de ARNm de este factor correlacionan con el ritmo diario de melatonina, siendo los mismos mayores durante el periodo diurno que durante el nocturno (Tsai y McNulty, 1999), ejerciendo así un papel potencialmente importante en el eje sistema inmune-glándula pineal, ya que se ha visto que el interferón o el lipopolisacárido incrementan el número de células pineales positivas para esta interleucina, además de estimular la inflamación sistemática inducida por inyección de lipopolisacárido la expresión génica de este factor. Aparte de la acción directa que los mediadores inflamatorios ejercen sobre los pinealocitos, las citocinas y demás factores inmunes podrían regular la función pineal mediante acciones indirectas en las células gliales del sistema nervioso central (Brzezinski, 1997). De hecho, estudios recientes han hallado que, al menos in vitro, la acción sobre la funcionalidad pineal de algunas citocinas como el interferón γ o la propia interleucina 1β está mediada por la microglía (Tsai y McNulty, 1999; Tsai y cols., 2001).

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1.5. PAPEL FISIOLÓGICO DEL TRIPTÓFANO Y LA SEROTONINA. Los aminoácidos son sustancias compuestas por carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrógeno que se caracterizan por contener un grupo ácido débil llamado carboxilo (-COOH) y un grupo básico débil llamado amina (-NH2), existiendo unos que pueden ser sintentizados por el propio organismo, por lo que se les da el nombre de “aminoácidos no esenciales”, y otros que no, por lo que deben ser ingeridos en la dieta, recibiendo así la denominación de “aminoácidos esenciales”. Dentro de este último grupo se encuentra el triptófano, aminoácido no polar e hidrófobo, imprescindible para la síntesis de proteínas y precursor de importantes metabolitos como la serotonina, amina biógena de bajo peso molecular perteneciente al grupo de los indoles o compuestos aromáticos que presentan un anillo de cinco átomos condensado con un anillo bencénico. Tanto el triptófano como la serotonina van a influenciar el comportamiento del organismo, ejerciendo importantes funciones en el mismo, entre las que destacan la percepción del dolor, el periodo de sueño, el estado de ánimo o la ingesta (Schloss y Williams, 1998).

O H2N

CH

C

OH

CH2

HN

Figura 9: Estructura molecular del aminoácido triptófano (Tomada de Gómez y Llorca, 2000). 47

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1.5.1. BIOSÍNTESIS Y METABOLISMO DEL AMINOÁCIDO TRIPTÓFANO. Una vez que el triptófano es ingerido con la dieta, éste se absorbe a través de las paredes del intestino, pasando a las membranas celulares. Una pequeña cantidad del mismo queda en forma libre mientras que el resto, en torno a un 80-90%, es transportado unido a la albúmina a través de la sangre hacia el cerebro. Este transporte puede verse alterado por la competencia ejercida por otros aminoácidos libres neutros de alto peso molecular, aminoácidos ramificados, como la valina, la leucina y la isoleucina, así como por la fenilalanina y la tirosina, que se unen a los mismos transportadores (Steinberg y cols., 1992; Jansman y cols., 2000). El metabolismo del aminoácido triptófano es complejo y comprende muchos procesos, requiriendo de una cantidad adecuada de biopterina, magnesio o vitamina B6, involucrada en la conversión del aminoácido en serotonina y en el metabolismo de otros metabolitos, como es el caso de la quinurenina. Su precursor principal es el ácido antanílico o antranilato, compuesto que tras una serie de reacciones químicas se transforma en indol-3-glicerofosfato, al que la enzima triptófano sintetasa transforma en gliceraldehído-3-fosfato y triptófano, mediante una reacción que se lleva a cabo en dos pasos con el indol intermediario unido al sitio activo de la enzima y en la que interviene la serina. La contribución del triptófano al metabolismo energético es doble, ya que por una parte es cetogénico, al formar acetil coenzima A, y por otra parte es glucogénico, pues da lugar a la producción de alanina (Gómez y Llorca, 2000). Para su degradación, el aminoácido es transportado al hígado, donde la enzima triptófano-2,3-dioxigenasa lo transforma en formilquinurenina mediante una reacción de oxigenación que provoca la apertura del anillo de cinco átomos de carbono del núcleo indólico. Este compuesto se convierte posteriormente en quinurenina mediante una formilasa, que a su vez mediante una hidroxilación se transforma en 3-hidroxiquinurenina o bien pasa a ácido nicotínico y otros subproductos que quedan almacenados (Cooper y cols., 1991). La 3hidroxiquinurenina por un lado se transamina para formar ácido xanturénico y por otro se ramifica por medio de la acción de una quinurenasa para producir 3-hidroxiantranilato, que

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después de sucesivas reacciones sirve de base para algunos productos importantes como el quinolinato, el picolinato o el glutarato. El exceso de triptófano produce un aumento en la concentración de este aminoácido en el sistema nervioso central, lo que a su vez eleva los niveles de serotonina cerebrales. Las necesidades de triptófano dependen de la cantidad de aminoácidos de la dieta, ya que su consumo puede reducirse cuando el nivel de estos aminoácidos de cadena ramificada es alto. Esto podría estar relacionado con el hecho de que un déficit de triptófano en el cerebro, ligado a un exceso de aminoácidos ramificados en la dieta, resulta en una menor concentración de serotonina en el cerebro y un mayor consumo de alimento (Henry y Seve, 1993; Jansman y cols., 2000). Se ha observado que la degradación pirrolítica del triptófano da origen a la formación de compuestos mutagénicos potentes, tales como el 3-amino-1,4-dimetil-5H-pirido(4,3b)indol y el 3-amino-1-metil-5H-pirido(4,3b)-indol, además de ácido quinolínico y la anteriormente mencionada 3-hidroxiquinurenina, que pueden causar daño celular, apoptosis y muerte neural (Okuda y cols., 1998; Moroni, 1999). Asimismo, las dietas con exceso de triptófano pueden producir anormalidades en el metabolismo de este aminoácido asociadas a procesos de fibrosis e inflamación y síndromes carcinoide y de esclerosis (Bruce y cols., 1990; Gross y cols., 1999). 1.5.2. SISTEMA SEROTONINÉRGICO, BIOSÍNTESIS Y METABOLISMO DE LA SECRECIÓN SEROTONINA. El sistema serotoninérgico de los vertebrados tiene una amplísima distribución en el sistema nervioso central e influencia casi todas sus funciones fisiológicas, desde la regulación del sistema cardiovascular (Miyata y cols., 2000; Nebigil y cols., 2003), a la de la respiración o la del sistema gastrointestinal (Kato y cols., 1999), pasando por la termorregulación. Asimismo, está implicado en el mantenimiento de los ritmos circadianos y en el control del apetito, de la agresividad, del comportamiento sexual, del humor y del aprendizaje y la memoria.

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La gran variedad de funciones en las que interviene el sistema serotoninérgico se refleja en la complejidad farmacológica de los receptores de serotonina, de tal modo que, atendiendo a sus características morfológicas, estructurales y transduccionales, existen hasta el momento siete familias de receptores (Hoyer y cols., 1994), codificadas por quince genes diferentes, que se caracterizan por estar acopladas a proteínas G, excepto la clase 5-HT3, que lo está a un canal iónico. La hidroxilación del triptófano en posición 5 para formar 5-hidroxitriptófano por la enzima triptófano hidroxilasa, de la que existen dos isoformas con diversa distribución en el organismo, localizándose la isoforma TPH1 especialmente en los tejidos periféricos, en los fotorreceptores del ojo y en la glándula pineal, donde la síntesis de serotonina se correlaciona de manera funcional con la producción de melatonina (Green y Besharse, 1994; Walther y cols., 2003), mientras que la TPH2 se ubica exclusivamente en las neuronas serotoninérgicas del sistema nervioso central (Walther y cols., 2003; Patel y cols., 2004), constituye la primera etapa de la biosíntesis de la serotonina, en la que se va a producir la regulación de la producción de la amina. El 5-hidroxitriptófano es descarboxilado por la enzima 5hidroxitriptófano descarboxilasa para dar lugar a serotonina, que a su vez es catabolizada a ácido 5-hidroxi-indolacético por la acción de la enzima monoamino oxidasa. La mayor parte de las neuronas que producen serotonina se localizan en una zona restringida del encéfalo, entre el mesencéfalo y el rombencéfalo, donde se reagrupan en núcleos bien conocidos, como los núcleos del rafe, existiendo también una pequeña población de estas neuronas a nivel del núcleo dorsomedial hipotalámico. Además, la serotonina es sintetizada en los receptores de la retina, en la glándula pineal, en las células enterocromafines del intestino, en los cuerpos neuroepiteliales de los pulmones y en las células parafoliculares de la tiroides (Gaspar y cols., 2003), y se puede encontrar en las plaquetas, que la recaptan de la circulación sanguínea, para liberarla cuando son activadas. La alteración de la regulación de la transmisión serotoninérgica incide en numerosos aspectos del comportamiento y puede resultar, como se dijo anteriormente, en patologías neuropsiquiátricas como esquizofrenia, ansiedad, estrés, depresión o desórdenes alimentarios. Por esta razón, muchas sustancias que modulan el sistema serotoninérgico son la base de los tratamientos farmacológicos para estas enfermedades. Por otro lado, recientes estudios han 50

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puesto de manifiesto la implicación que podría tener el neurotransmisor serotonina sobre diferentes patologías como el síndrome de Down, el autismo, el alzhéimer o la epilepsia (Sodhi y Sanders-Bush, 2004).

1.5.3. RELACIÓN ENTRE TRIPTÓFANO Y SEROTONINA Y LOS RITMOS DE ACTIVIDAD-REPOSO Y SUEÑO-VIGILIA. Los inicios de la investigación acerca de los efectos hipnóticos que el aminoácido triptófano ejerce sobre el sueño humano se remontan a las décadas de los años setenta y ochenta (Wyatt y cols., 1970; Spinweber, 1986), al observarse que este aminoácido aumentaba la propensión al mismo, por lo que comenzó a utilizarse exitósamente como agente terapéutico para combatir el insomnio crónico (Demisch y cols., 1987). Muy recientemente se han empezado a comprobar sus propiedades consolidantes del ritmo de sueño-vigilia en recién nacidos, viéndose que la toma de leches infantiles nutricionalmente disociadas, esto es, una leche diurna con bajo contenido en triptófano y carbohidratos y alto en proteínas, a la que se han añadido los nucleótidos citidina 5-monofostato, guanosina 5monofosfato e inosina 5-monofosfato, y una nocturna con alto contenido en triptófano y carbohidratos y bajo en proteínas, con los nucleótidos adenosina 5-monofosfato y uridina 5monofosfato mejoraba todos los parámetros de sueño analizados en el estudio (horas totales de sueño, eficiencia del sueño, minutos de inmovilidad nocturna, desperatares nocturnos y latencia del sueño) lo que es de especial importancia en esta etapa de la vida, puesto que un descanso apropiado se refleja de manera directa en el desarrollo correcto de los sistemas nervioso e inmune (Cubero y cols., 2006a). Por otro lado, en tórtolas collarizas (Streptopelia risoria) sexualmente inmaduras se ha comprobado que la administración de triptófano también aumenta el descanso nocturno, lo que parece correlacionarse con el aumento en los niveles circulantes de melatonina que provoca dicho tratamiento (Cubero y cols., 2006b), además de reducir la expresión de la proteína c-fos en el sistema nervioso central de tórtolas jóvenes y viejas (Garau y cols., 2006), cuyos niveles son normalmente altos cuando se producen despertares espontáneos o se da privación de sueño, para posteriormente volver a caer tras unas horas de sueño (Cirelli y Tononi, 2000). 51

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Los primeros estudios en donde se relaciona a la serotonina con el sueño aparecieron a mediados de la década de los cincuenta cuando se observó que la reserpina era capaz de disminuir el contenido cerebral de serotonina, induciendo también un estado de sedación o con analogía al de sueño (Brodie y cols., 1955). Además, se descubrió que la inyección parenteral de L-5-hidroxitriptamina provocaba sincronización cortical y que los inhibidores de la enzima monoamino oxidasa podían suprimir de manera selectiva el sueño paradójico o REM durante largos periodos de tiempo que abarcaban de días a incluso semanas (Jouvet y cols., 1965). Así, la serotonina aparecía como una pieza clave para la comprensión de algunos de los mecanismos implicados en el ciclo de sueño-vigilia. De hecho, investigaciones posteriores pusieron de manifiesto que la destrucción por coagulación de los núcleos del rafe, una zona muy rica en neuronas con contenido en serotonina, producía insomnio por estados muy prolongados de tiempo (10-15 días), por lo que se empezaron a establecer relaciones entre la intensidad del insomnio, la magnitud de la lesión en los núcleos del rafe y la cantidad de serotonina cerebral que permanecía en el telencéfalo tras la degeneración de las terminales serotoninérgicas, encontrándose específicamente correlaciones entre la destrucción del rafe rostral y el sueño de onda lenta y la serotonina del telencéfalo, que disminuían, y entre sueño paradójico y lesiones del núcleo magno del rafe (Dahlstroem y Fuxe, 1964; Jouvet, 1969). Además, se observó que la p-clorofenilalanina podía inhibir la enzima triptófano hidroxilasa, lo que dañaba la biosíntesis de serotonina, conduciendo secundariamente a estados de insomnio total (Koe y Weissman, 1966). Todos estos experimentos llevaron a la elaboración de la llamada “teoría monoaminérgica del sueño”, que establecía que la serotonina, o somnotonina, como algún investigador de la época la bautizó (Koella, 1969), era el neurotransmisor o “neurohormona” del sueño, pues producía el mismo mediante la inhibición de la formación reticular y el locus ceruleus, los centros putativos de la vigilia, mientras que las catecolaminas se ocupaban del despertar. Sin embargo, la demostración de que la actividad eléctrica de la serotonina del pericarion y la liberación de la misma se incrementan durante la vigilia y disminuyen durante el sueño estaba en clara contradicción con la teoría antes mencionada, por lo que se descartó, pasando bastante tiempo hasta que otra vez se empezaran a relacionar los ritmos de sueñovigilia con la serotonina, en concreto hasta los últimos años de la década de los ochenta. Hoy 52

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en día las diversas investigaciones realizadas sobre el tema parecen estar de acuerdo en que la liberación de serotonina cuando se está despierto iniciaría una cascada de sucesos genómicos en determinadas neuronas hipnogénicas localizadas en el área preóptica, que conduciría a la regulación homeostática del sueño de onda lenta (Jouvet, 1999).

1.5.4. RELACIÓN ENTRE TRIPTÓFANO, SEROTONINA Y SISTEMA INMUNE. Son numerosos los estudios que han demostrado que la concentración del aminoácido triptófano disminuye en pacientes deprimidos con respecto a personas normales (Yatham y cols., 2001), produciéndose una disminución en los niveles del neurotransmisor serotonina, cuya implicación en los síndromes depresivos es patente (Maes y cols., 1997). Además, se ha observado que cuando se produce un trastorno depresivo, éste va acompañado de una respuesta inflamatoria del sistema inmune inversamente proporcional a la concentración de triptófano en plasma (Song y cols., 1998), que a su vez correlaciona negativamente con el número de leucocitos y componentes del sistema inmune como la interleucina 6 y la interleucina 8 (Maes y cols., 1998). También se ha visto que en personas con alteraciones del sueño ocurre lo mismo que en pacientes afectados de depresión, existiendo un decremento de los niveles de triptófano en plasma e incremento de interleucinas 6 y 8 respecto a personas normales (Maes y cols., 1997; Song y cols., 1998), así como niveles de interleucina 2 disminuidos (Uthgenannt y cols., 1995). Por otro lado, si se produce una interrupción del sueño de 5 horas durante el periodo nocturno, se elevan los niveles de interleucinas 1 y 2, incrementándose asimismo la interleucina 6 y el factor necrótico tumoral α cuando se da exceso de somnolencia (Vgontzas y cols., 1997), aumentando con ello el número de monocitos y neutrófilos (Dinges y cols., 1994). En cuanto al efecto que el aminoácido ejerce sobre la respuesta fagocítica, son recientes los estudios que sugieren una elevación de la misma tras la administración oral del compuesto. En concreto, estudios en tórtolas sexualmente inmaduras indican que la toma de triptófano al inicio del día eleva la capacidad fagocítica de manera dosis y tiempo dependiente (Cubero y cols., 2005), mientras que en ratas, su suministro aumenta los niveles circulantes de melatonina además de estimular la capacidad de ingestión antigénica de macrófagos 53

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peritonenales obtenidos durante el periodo nocturno, por lo que parece ser que la activación del la respuesta inmune innata observada en estos animales se realizaría a través de su conversión en el indol pineal (Esteban y cols., 2004; Sánchez y cols., 2004). No obstante, no hay que olvidar que el triptófano es el precursor del neurotransmisor serotonina, la cual también podría tener implicaciones sobre la función del sistema inmune innato. A este respecto y debido a la existencia de receptores de serotonina en los leucocitos y que se ha encontrado el transportador para esta amina en macrófagos, leucocitos mononucleares y células B, a ésta se la considera como un elemento crítico en la conexión entre los sistemas nervioso e inmune (Mossner y Lesch, 1998; Hofstetter y cols., 2005), siendo bastantes los estudios que achacan a la serotonina un papel antioxidante (Schuff-Werner y cols., 1995; Schuff-Werner y Splettstoesser, 1999; Betten y cols., 2001), aunque también se ha observado que produce inhibición de la fagocitosis leucocitaria (Nannmark y cols., 1992; SalmanTabcheh y cols., 1996), sobre todo si las concentraciones utilizadas son de rango farmacológico (Schuff-Werner y Splettstoesser, 1999).

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1.6. ENVEJECIMIENTO: CAMBIOS EN LOS RITMOS CIRCADIANOS Y EN EL SISTEMA INMUNE. Se conoce como envejecimiento al proceso biológico que se inicia con el nacimiento, que da lugar en cada especie a una serie de cambios fisiológicos característicos que tienen como consecuencia la limitación de la capacidad de adaptación del organismo al ambiente y como resultado final la muerte de ese organismo (Pérez-Llamas y Zamora, 2002). Durante el mismo, prácticamente todos los órganos y sistemas del organismo se van a ver afectados en mayor o menor medida, como es el caso del sistema inmune, que sufre una disminución de la función inmunológica, quedando afectadas las inmunidades humoral y, en mayor medida, la celular, lo que origina una mayor prevalencia de diversas enfermedades en la vejez al verse mermada la capacidad de combatir infecciones, y los ritmos circadianos, debido a que se deterioran las señales sincronizadoras, el control ejercido por el reloj central y las señales transductoras desde los marcapasos hasta los ritmos, perdiendo su funcionalidad (Madrid y Rol de Lama, 2002).

1.6.1. CAUSAS RESPONSABLES DEL PROCESO DE ENVEJECIMIENTO. No es tarea fácil diferenciar entre la causa y el efecto del envejecimiento en el sistema tan complejo e integrado del que forman parte las células vivas, por lo que aún se desconoce si este proceso deriva de una única causa o de varias (Miquel, 2006), agrupándose las teorías que intentan esclarecer sus mecanismos en aquéllas basadas en la idea de que el envejecimiento se encuentra genéticamente programado y otras que asumen que es la acumulación progresiva de daño debida a la menor eficacia de los sistemas de mantenimiento y reparación las desencadenantes del mismo. En cuanto al primer grupo, las diferencias que existen entre el modo de envejecer y morir de ciertas células y de alcanzar la “inmortalidad” de otras hizo que se apuntara hace más de un siglo que las células dejaban de ser inmortales como consecuencia de la división celular, sugiriéndose una estrecha relación entre envejecimiento y diferenciación celular (Weissman, 1891; Minot, 1908), lo que condujo muchas décadas después a que se propusiera que la capacidad de división era idéntica al 55

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envejecimiento celular (Hayflick, 1980). Posteriormente se formula que en cada división celular se produce la pérdida de una determinada cantidad de ADN telomérico, lo que da lugar al acortamiento de los telómeros, produciéndose de este modo inestabilidad en la expresión génica de las células (Harley y cols., 1990; Cutler, 1991). Las teorías del envejecimiento por acumulación de daño establecen que éste puede tener lugar en cualquier macromolécula cuya función no se cumpla con máxima eficacia, así como en cualquier nivel superior de organización (genes, células, orgánulos celulares, procesos fisiológicos), sugiriéndose como elementos causales del envejecimiento los errores debidos a la transcripción del ARN y la traducción de proteínas, lo que conllevaría la acumulación de proteínas alteradas no funcionales (Orgel, 1963), aunque estudios posteriores indican que estos cambios proteicos son posteriores a los procesos antes mencionados y no implican una pérdida de actividad de los mecanismos biosintéticos (Rothstein, 1981; Fleming y cols., 1986); la glicosilación de proteínas y ácidos nucleicos que alteraría nocivamente las actividades de ciertas enzimas y la expresión de determinados genes (Cerami, 1985); las uniones covalentes o por puentes de hidrógeno de dos o más moléculas (Bjorkstein, 1974; Kohn, 1978); o la peroxidación lipídica causante de la desorganización de las membranas celulares y subcelulares, que trae como consecuencia cambios en la permeabilidad, transporte activo y homeostasis celular de las mismas (Zs-Nagy, 1979). En la actualidad es la teoría del envejecimiento debida a la participación de radicales libres la que está recibiendo la mayor atención por parte de los gerontólogos, un postulado con un bagaje científico importante pues ya en la década de los 50 Gerschman y colaboradores expresaron que la toxicidad del oxígeno en los sistemas biológicos era debida a la generación de radicales libres, siendo el envejecimiento consecuencia de dicha toxicidad, enunciándose poco después la teoría de los radicales libres de oxígeno como explicación al envejecimiento celular (Harman, 1956). Algunos de los hechos aparecidos posteriormente que apoyan esta teoría son la relación inversa entre longevidad y tasa metabólica, la acumulación de lipofucsina (producto terminal de la peroxidación lipídica), la aparición de enfermedades en las que los radicales libres se encuentran implicados (alzhéimer, párkinson, aterosclerosis) y los beneficios de la restricción calórica sobre la longevidad. Por tanto, puesto que las células poseen compuestos antioxidantes para controlar los efectos nocivos de los radicales libres, el 56

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envejecimiento podría deberse a modificaciones en el equilibrio celular existente entre agentes prooxidantes y antioxidantes. Dentro de esta teoría, unos autores centran las causas del envejecimiento en la alteración y pérdida progresiva de las mitocondrias (orgánulos generadores de compuestos oxidantes por antonomasia) como consecuencia del ataque que los radicales libres ocasionan en su ADN, disminuyendo consecuentemente el rendimiento biológico (Miquel, 2006), mientras que otros apuntan a que serían los daños acontecidos en el ADN nuclear los que darían lugar al envejecimiento, un postulado que ha sido matizado posteriormente ya que al carecer el ADN mitocondrial de poliaminas o histonas protectoras, posee una mayor susceptibilidad al daño oxidativo respecto al ADN nuclear, por lo que parece ser que las lesiones (mutaciones e inactivaciones) se producirían fundamentalmente en el genoma mitocondrial de células diferenciadas (Miquel, 2002). Dada la importancia que tienen los sistemas neuroendocrino e inmune en la regulación de los procesos fisiológicos, han surgido diferentes teorías sobre el envejecimiento cuyos conceptos teóricos se centran en dichos sistemas (Strehler, 2000). Así, la teoría neuroendocrina del envejecimiento defiende la regulación de la mayoría de las funciones del organismo por el sistema neuroendocrino, estableciéndose una compleja red cuyo deterioro progresivo a causa de la sensibilidad de los tejidos a fallos de los factores neurohormonales y el incremento de la incidencia de tumores perjudicaría críticamente la supervivencia del individuo, debido a la importancia del sistema neuroendocrino frente a otras funciones orgánicas (Frolkis, 1982; Meites y cols., 1987). La teoría inmune del envejecimiento dispone que este sistema, que mantiene la integridad del organismo a través de su control sobre las células transformadas, experimenta un deterioro progresivo que hace que sus respuestas sean negativamente proporcionales al avance de la edad, de tal modo que los defectos de las respuestas de activación de las células T serían un elemento determinante del envejecimiento biológico (O’Leary y Hallgren, 1991). Por último, y teniendo en cuenta las interacciones existentes entre los sistemas nervioso, inmune y endocrino, se ha planteado que las alteraciones de este conjunto de elementos serían las responsables de la mayoría de las disfunciones asociadas al envejecimiento (Fabris, 1991).

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Teniendo en cuenta todo lo expuesto, se puede decir que el envejecimiento no puede ser explicado por causas simples, pues existen numerosos factores generadores de alteraciones, errores y mutaciones. Posiblemente ninguna teoría basada en mecanismos individuales pueda dar respuesta a la degeneración molecular, celular y fisiológica que tiene lugar en los organismos con el paso del tiempo, ya que la complejidad del proceso de envejecimiento sólo puede ser entendida mediante teorías integradoras que armonicen los conceptos fisiológicos y moleculares de los sistemas.

1.6.2. SISTEMA NEUROLÓGICO Y EDAD. El envejecimiento produce la atrofia del cerebro, que disminuye de tamaño y experimenta una disminución de peso. Estos cambios se atribuyen generalmente a la pérdida de neuronas, aunque ésta se localiza en capas y regiones cerebrales específicas y muestra una considerable variación individual (Timiras, 1994). Diferentes estudios han puesto de manifiesto la existencia de pérdida de neuronas en el locus ceruleus, la principal fuente de neuronas catecolaminérgicas, y en la sustancia negra, que es parte de los ganglios basales y la fuente principal de neuronas dopaminérgicas, lo que podría constituir un factor en los cambios con la edad que se producen en la estabilidad, la manera de andar, la homeostasis y el sueño, además del funcionamiento cognitivo (Reeves y cols., 2002). En general, los cambios tienden a afectar a la materia blanca, es decir, a las neuronas mielinizadas, a un nivel mucho mayor que a la materia gris (Mrak y cols., 1997). Además, el envejecimiento también produce modificaciones en la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, pudiendo tener consecuencias todos los cambios descritos en cuanto a su sensibilidad a diferentes fármacos y moléculas. También se ha observado que tanto el flujo sanguíneo cerebral como el metabolismo cerebral muestran un declive como consecuencia del envejecimiento (Mattson, 1999), lo que se relacionaría con la pérdida de las células y masa cerebrales, además de producirse cambios en los niveles de norepinefrina y dopamina, lo que tendría efectos sobre la manera de andar, el equilibrio y las funciones cognitivas del organismo.

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1.6.3. SECRECIÓN DE SEROTONINA Y EDAD. Los sistemas de neurotransmisión de la serotonina tienen una amplia distribución en el sistema nervioso central y se relacionan con la regulación de una gran cantidad de comportamientos. Así, la serotonina parece tener implicaciones en la regulación del humor, la ansiedad, el sueño, el apetito, la función sexual, el flujo sanguíneo del cerebro y muchas otras funciones. Las neuronas serotoninérgicas se encuentran en los núcleos del rafe en el troncoencéfalo y envían sus axones a todas las áreas del cerebro, entre las que se incluyen la corteza cerebral, el tálamo, el sistema límbico y el cerebelo (Presti, 1999). En este sentido, cualquier cambio en los receptores de serotonina o en los niveles endógenos de neurotransmisor debido al proceso de envejecimiento tendría consecuencias sobre el comportamiento y la función cognitiva. Diferentes estudios han puesto de manifiesto la existencia de alteraciones en el sistema de neurotransmisión de la serotonina con la edad, observándose específicamente reducciones en la densidad del receptor tipo 2A (5HT2A) para serotonina (Meltzer y cols., 1998). En uno de estos estudios se inyectó altanserina a individuos jóvenes y viejos, un ligando con alta afinidad por los sitios de unión del receptor 5HT2A, y se encontró que, comparados con los jóvenes, los sujetos viejos tenían significativamente reducida la unión específica para este receptor, además de su número, siendo esta pérdida bastante considerable para ciertas regiones del cerebro. Puesto que muchos fármacos antidepresivos usualmente alivian los síntomas de la depresión mediante el bloqueo de la recaptación del transportador de serotonina para facilitar el aumento de la actividad de la serotonina, se especula que se podría atribuir el aumento de la incidencia de la depresión en las personas mayores a la mencionada reducción de los receptores de serotonina. Además, se ha visto que los receptores y transportadores de serotonina son menos sensibles a la regulación hormonal, lo que responde a la deficiencia asociada al envejecimiento de la regulación del sistema serotoninérgico del hipocampo por la corticosterona (Maines y cols. 1999), lo que induce a pensar que los cambios en la neuroquímica de la serotonina por la edad podrían ser la causa del incremento en la incidencia de depresión e hipercortisolemia en la tercera edad. Por otro lado, es conocido que la serotonina incrementa la proporción de sueño de onda lenta (Jouvet, 1999), además de actuar como neurotransmisor del despertar (Ursin, 59

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2002), sugiriendo la estrecha asociación entre la actividad serotoninérgica y los ajustes de fase circadiana que este neurotransmisor también juega un papel en la regulación endógena del reloj circadiano (Glass y cols., 2000). Estos hallazgos apuntan a la participación de los sistemas de neurotransmisión de la serotonina en los cambios de comportamiento observados comúnmente en individuos viejos, lo que podría tener potenciales implicaciones terapéuticas. En resumen, los estudios en los sistemas de neurotransmisión de la serotonina indican que como consecuencia del envejecimiento se produce una disminución de la densidad de receptores de serotonina y marcadas alteraciones en el índice de recambio de serotonina (5HIAA/5-HT) y en las respuestas de los receptores/transportadores a la regulación hormonal (Meltzer y cols., 1998; Maines y cols., 1999). La mayoría de estas alteraciones resultan en descensos en la unión de serotonina. De este modo, los cambios en la neuroquímica de la serotonina tienen implicaciones etiológicas en los cambios de comportamiento que se producen en los individuos viejos y podrían ser la causa subyacente de muchas alteraciones geriátricas.

1.6.4. SECRECIÓN DE MELATONINA Y EDAD. La concentración de melatonina en sangre muestra un claro ritmo circadiano, con bajos niveles durante el día y altos por la noche, llegándose a alcanzar durante este periodo valores de 10 a 15 veces mayores que los encontrados durante el periodo diurno (Arendt, 1995; Karasek, 1999). En la especie humana, el comienzo de los patrones de secreción se desarrolla en torno al tercer mes de vida, aumentando a partir de aquí su amplitud. Entre los 4 y los 7 años de edad se dan los mayores niveles de secreción, que irán disminuyendo abruptamente hasta la adolescencia y moderadamente durante la edad adulta (Turek y cols., 2000; Karasek y Reiter, 2002). En torno a la madurez se da una caída en la concentración de la hormona, que a partir de aquí irá reduciendo gradualmente sus niveles (Karasek y cols., 2002), debido a la merma de la población de pinealocitos o a cambios en su metabolismo (Waldhauser y cols., 1988), estando el ritmo día-noche en individuos de más de 65 años prácticamente ausente (Karasek y cols., 2002). Además de en el hombre, en mamíferos y aves también han sido ampliamente descritas diferencias en la secreción del indol pineal como 60

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consecuencia del envejecimiento. Así, se han observado decrementos de los niveles de melatonina al comparar individuos jóvenes y viejos de ratas, jerbos, hámsteres o tórtolas (Myers y Badia, 1995; Rodríguez y cols., 2005). Además de la disminución de la cantidad de melatonina circulante y de la perturbación de los mecanismos secretores de la misma, se han descrito adelantos de fase y decrementos de hasta un 50% en el ritmo de la indolamina como consecuencia de la edad (Van Coevorden y cols., 1991). Se cree que la amplitud de la secreción de la melatonina nocturna está genéticamente determinada, ya que muestra una diferencia interindividual grande (Bergiannaki y cols., 1995), aunque dentro del mismo individuo exhibe un alto grado de consistencia entre los diferentes días (Arendt, 1988). Así, algunos individuos producen significativamente menos melatonina durante su vida que otros, lo que puede tener trascendencia en términos de envejecimiento (Karasek y Reiter, 2002).

1.6.5. RITMOS DE SUEÑO-VIGILIA Y EDAD. El envejecimiento es un determinante crucial de las características del sueño, cuya estructura, profundidad y continuidad tienen tendencia a cambiar a lo largo de la vida (PandiPerumal y cols., 2002). Así, varios estudios informan de que más de un tercio de las personas mayores tienen dificultades recurrentes a la hora de mantener el sueño (Foley y cols., 1995), pues tanto la calidad como la cantidad del mismo se encuentran alteradas (Pandi-Perumal y cols., 2005), exhibiendo de manera frecuente incrementos en su latencia de inicio, alteraciones en su consolidación y menor estabilidad, siendo abundantes en número y duración los despertares producidos durante el sueño nocturno (Pandi-Perumal y cols., 2002). También se ha descrito disminución general del porcentaje total de sueño activo, incremento de los porcentajes de los estados de alerta y somnolencia, reducción en la continuidad del sueño, declive característico en la eficiencia y tiempo total de sueño, una marcada fragmentación del ciclo sueño-vigilia (Bixler y cols., 1984), y decremento del componente homeostático de la regulación del sueño (Daan y cols., 1984). Teniendo en cuenta todos estos factores, no es sorprendente que los estudios epidemiológicos revelen que hasta un 40% de individuos de más de 65 años se quejen de problemas de sueño y que entre un 12 y un 25% lo 61

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hagan de insomnio persistente (Blanco y cols., 2004), estando en torno al 14% el número de ancianos a los que se les han prescrito fármacos para dormir o que utilizan ayudas para facilitar el descanso nocturno (Blanco y cols., 2003). También existen cambios relacionados con el envejecimiento en la amplitud del ritmo circadiano de sueño-vigilia (Duffy y Czeisler, 2002), dándose alteraciones significativas en la organización temporal del mismo y atenuación en los mecanismos reguladores de la arquitectura general del proceso de sueño (Daan y cols., 1984). Entre las posibles razones que podrían dar respuesta a la disrupción de los ritmos de sueño-vigilia observados en la vejez se ha sugerido la disminución del número de pinealocitos, cambios en la retina y NSQ o alteraciones en la secreción de melatonina (Swaab y cols., 2002).

1.6.6. ENVEJECIMIENTO DEL SISTEMA INMUNE (INMUNOSENESCENCIA). Como consecuencia del envejecimiento del sistema inmunitario se produce la pérdida de efectividad del mismo, lo que conlleva una mayor incidencia de infecciones, enfermedades autoinmunes y cáncer (Ginaldi y cols., 1999a), ya que se van a ir perdiendo los tejidos linfoides del bazo, ganglios, médula ósea y timo, teniendo este último órgano un papel central en los cambios del sistema inmunitario, por lo que ha llegado incluso a definirse como el reloj biológico del envejecimiento. Se han observado múltiples modificaciones en las células del sistema inmunitario de individuos envejecidos, tanto a nivel molecular como en relación a su estructura y función celular. De entre todas ellas, los linfocitos T son las que experimentan los mayores cambios a medida que la edad avanza (Pawelec, 1999), pues disminuye el número absoluto de los mismos y de sus diversas subpoblaciones (Rea y cols., 1996) y se reduce su capacidad proliferativa en respuesta a la estimulación por mitógenos (Ginaldi y cols., 1999b), aumentando la apoptosis de las mismas (McLeod, 2000). Por otra parte, también se ha observado que la producción de ciertas citocinas como la interleucina 2, de considerable importancia en la respuesta proliferativa de las células T, disminuye con la edad, lo que ocurre tanto en animales de experimentación como en humanos (Wakikawa y cols., 1999). En cuanto a los linfocitos B, los estudios realizados sobre los cambios funcionales que el proceso de 62

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envejecimiento produce sobre estas células son más limitados de los existentes para las células T. A pesar de esto, los cambios cualitativos y cuantitativos que se aprecian en la producción de anticuerpos son fiel reflejo de que estas células sufren también alteraciones, lo que no es sorprendente teniendo en cuenta la estrecha regulación sobre su funcionalidad que los linfocitos T ejercen (Ginaldi y cols., 1999c), observándose en ellas un retardo en la síntesis y secreción de inmunoglobulinas, que parece deberse a la falta de niveles apropiados de citocinas (Richter y Jodouin, 1993), de tal modo que disminuye la habilidad de respuesta de los anticuerpos en la inmunización contra agentes infecciosos (Song y cols., 1997). Las células accesorias, fagocíticas y presentadoras de antígeno también sufren cambios debidos a la edad, caracterizados por aumentos del estado oxidativo (McArthur, 1998), lo que hace que se reduzca su hablidad para adaptarse al estrés ambiental, y disminución de los parámetros fagocíticos (Rodríguez y cols., 2005). Dado que el estado funcional del sistema inmunitario no sólo afecta a la salud sino que contribuye a la longevidad del individuo (Wayne y cols., 1990), se ha propuesto la valoración de dicho estado como un excelente marcador de la edad biológica. Sin embargo, conviene indicar que considerar un único parámetro de medida no permite determinar una buena o mala función inmunitaria. Son cuantiosos los trabajos que señalan el sumplemento con vitaminas antioxidantes como una vía para contrarrestar los efectos hasta ahora mencionados. En este sentido, se ha visto que la administración de vitamina C aumenta las respuestas mitogénicas de linfocitos procedentes de poblaciones ancianas, constatándose además un descenso en el acortamiento de los telómeros asociado a la división celular (Furomoto y cols., 1998). Asimismo, el suplemento de vitamina E afecta positivamente a la proliferación de linfocitos y a la producción de interleucina 2, al menos in vitro (Meydani y cols., 1997). Otros suplementos importantes parecen ser el de vitamina D, cuyo déficit parece asociarse con descensos de la inmunidad innata de animales y humanos in vitro, y el de betacarotenos.

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Introducción

1.6.7. CONEXIONES POTENCIALES ENTRE LA GLÁNDULA PINEAL, LA MELATONINA Y EL ENVEJECIMIENTO. Es sabido que la glándula pineal tiene influencias sobre la función del sistema neuroendocrino y sobre la habilidad del sistema inmune para reconocer y reaccionar contra cualquier factor endógeno o exógeno (Pierpaoli y Lesnikov, 1997), por lo que se ha sugerido que el envejecimiento es resultado del deterioro de este papel central de la glándula pineal, ya que la secreción de melatonina se hace deficiente y disminuye la proporción de melatonina/5HT, lo que perjudicaría diferentes aspectos de la neurofisiología del individuo (Grad y Rozencwaig, 1993). A este respecto, se ha comprobado que la extirpación temprana de la glándula causa acumulaciones sustanciales de los productos de peroxidación lipídica, oxidación del ADN, menor fluidez de las membranas celulares y daños en las proteínas de muchos órganos (Reiter y cols., 1999), como consecuencia de privar al organismo del ritmo endógeno de melatonina, hormona cuyo papel en el proceso de envejecimiento es probable al participar en muchos procesos vitales, entre los que destacan su habilidad como antioxidante y secuestradora de radicales libres, con resultados semejantes a los inducidos por el glutatión o el manitol (Reiter, 2000a,b), y su participación en el sueño, viéndose la eficacia del mismo reducida como resultado de la baja concentración circulante del indol pineal, fenómenos que típicamente acaecen en edades avanzadas. Asimismo, se ha puesto de manifiesto que otra capacidad de la melatonina es la de proteger de manera potente los daños oxidativos en el ADN (Tan y cols., 1994), que son altamente significativos en los organismos envejecidos (Rao y Loeb, 1992), actuar contra desórdenes neurodegenerativos asociados al deterioro producido por los radicales libres en determinadas áreas del cerebro (Strong y cols., 1993), presentando efectos potencialmente beneficiosos sobre el párkinson o el alzhéimer (AcuñaCastroviejo y cols., 1997; Mayo y cols., 2005b). Parece ser que la pinealectomía también acelera el proceso de envejecimiento, dando lugar a estados de hipertensión y diabetes, inducción del movimiento rápido de los ojos durante el sueño, aumento del colesterol en sangre, actividad fosfatasa alcalina elevada y modificación en la síntesis de prostaglandinas, perturbaciones que pueden ser contrarrestadas por la administración de melatonina (van Rensburg y cols., 2000), por lo que son muchos los estudios que hoy en día consideran al 64

Sergio D. Paredes Royano

producto pineal como una hormona antienvejecimiento y rejuvenecedora, justificando los datos acumulados hasta la fecha la hipótesis de que el tratamiento suplementario de melatonina podría ser beneficioso durante el envejecimiento (Ferrari, 2004; Bondy y Sharman, 2007).

65

Sergio D. Paredes Royano

2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS

67

Justificación y objetivos

Está ampliamente aceptado que todas las funciones fisiológicas se encuentran bajo control circadiano, pero entre ellas se pueden señalar como especialmente importantes el ritmo de sueño-vigilia y el de las funciones del sistema inmunológico. Se sabe que la hormona melatonina es uno de los factores clave en la relación entre ambas. Sin embargo, también es bien conocido que la edad las modifica profundamente, disminuyendo la cantidad y calidad del sueño y la capacidad de la respuesta inmune, factores que se acompañan de profundos cambios en la secreción de melatonina. En anteriores investigaciones en la tórtola collariza (Streptopelia risoria) hemos observado una correlación positiva entre la función fagocítica y las concentraciones séricas de melatonina (Rodríguez y cols., 2001). Paralelamente, en estudios in vitro hemos comprobado un efecto estimulante en la función de las células fagocíticas tras la incubación con concentraciones fisiológicas y farmacológicas de la hormona (Terrón y cols., 2002). Además, recientemente hemos observado que el ritmo circadiano de la melatonina se pierde con la edad, encontrándose en animales viejos concentraciones fisiológicas de dicha hormona inferiores a animales jóvenes (Terrón y cols., 2005a). En relación con el sueño, es bien conocido que con la edad sufre importantes cambios y que sus perturbaciones constituyen la mayor fuente de quejas del anciano (Yoon y cols., 2003). En este sentido, la melatonina tiene un potente efecto regulador del sueño, produciendo además descensos en la temperatura corporal que acentúan sus efectos directos sobre el ritmo sueño-vigilia. Por otra parte, los recientes hallazgos sobre el sueño de mamíferos primitivos señalan la necesidad de reevaluar el sueño de las aves para alcanzar un marco coherente en el que se integre todo lo que se conoce del sueño de reptiles, y sus descendientes evolutivos, las aves y los mamíferos. También se sabe que la administración exógena de triptófano incrementa los niveles de serotonina en el cerebro y, siendo su precursor, también debe suponerse que influye sobre la síntesis de melatonina. Es conocido que la administración de triptófano en la dieta incrementa la disponibilidad de serotonina en el cerebro así como la potencia delta en el electroencefalograma y la cantidad de NREM (Ouichou y Pevet, 1992; Garau y cols., 2006). En los últimos años, el uso de triptófano se está extendiendo en el tratamiento de la depresión y de las alteraciones del sueño (Riemann y Vorderholzer, 1998; Cubero y cols., 2006a,b). 68

Sergio D. Paredes Royano

También la melatonina se emplea en el tratamiento de problemas de insomnio asociado a la vejez (Haimov y cols., 1995; Zhdanova y cols., 2001; Cajochen y cols., 2006). En las alteraciones del sueño, la melatonina no está implicada por sí sola, sino que también actúa por medio del mecanismo del reloj interno del organismo. La terapia con melatonina ha sido capaz de corregir los cambios de los patrones dormir-despertar en personas de avanzada edad, aunque también corrige los problemas de sueño en insomnes de edades más tempranas (Duffy y cols., 2002; Cubero y cols., 2006a). De aquí se desprende que mejorar los aportes de triptófano o un tratamiento con melatonina de acuerdo con las necesidades del ciclo circadiano en las personas de edad avanzada probablemente se traduce en un ajuste mejor de sus ciclos circadianos, lo cual implica también una mejora de su estado de salud. Hoy se tienen datos concretos de que los ciclos de sueño-vigilia y el sistema inmune están íntimamente relacionados. Así, existen evidencias de conexiones entre los ritmos circadianos del sistema inmune y de los sistemas neuroendocrino y termorregulador con los del cerebro dormido. Muchas sustancias inmunológicamente activas poseen actividad somnogénica como son la IL-1, interferón, péptido intestinal vasoactivo, factor de necrosis tumoral, insulina, hormona del crecimiento, somatostatina, factor liberador de corticotropina y, especialmente, como se ha comentado antes, la melatonina. La actividad de eosinófilos, neutrófilos, linfocitos T y B, y células mononucleares, presenta claros picos circadianos (Barriga y cols., 2006). Todas estas evidencias han hecho que una de las funciones esenciales propuestas para el sueño sea la restauración inmunológica (Moldofsky, 1997; Everson y cols., 2005). Los trabajos realizados en la especie humana sobre las diferencias en los factores circadianos que determinan la inmunidad y el sueño y los cambios que es sabido que ocurren con la edad implican una serie de problemas metodológicos que limitan las posibilidades de obtener información, además de ser costosos en términos de esfuerzos y medios. En el caso de los trabajos realizados sobre otros mamíferos, es difícil realizar extrapolaciones a la especie humana ya que la mayoría presentan actividad nocturna y además suelen ser polifásicos (Tobler, 1995). Por esto, se ha propuesto el uso en la presente tesis doctoral de la tórtola collariza, (Streptopelia risoria), animal diurno y monofásico, características circadianas similares a las presentes en el ser humano, como modelo experimental para el análisis de las 69

Justificación y objetivos

alteraciones que sufren los ciclos circadianos con la edad. Además, bajo condiciones seguras, como ocurre con estas aves en cautividad, duermen simultáneamente con los dos hemisféricos, ya que cierran bilateralmente los ojos, dando lugar al denominado sueño bihemisférico (Amlaner y Ball, 1994), fenómeno que también se da en la especie humana.

En vista a los antecedentes comentados, el Objetivo General de la presente tesis ha sido evaluar la conexión funcional entre triptófano y melatonina sobre los ritmos de actividadreposo y respuesta inmune innata, evaluando ésta última a través de la función fagocítica y el metabolismo oxidativo de heterófilos de tórtola collariza (Streptopelia risoria) de animales jóvenes y viejos. Este Objetivo General ha sido desglosado a su vez en los siguientes Objetivos específicos:

1.- Determinar los ritmos de actividad-reposo basales en animales jóvenes y viejos con el fin de identificar las posibles diferencias que se podrían encontrar debido al proceso de envejecimiento.

2.- Determinar los ritmos de melatonina y serotonina (niveles circulantes y parámetros cronobiológicos –amplitud, acrofase y MESOR–) en animales jóvenes y viejos y establecer las posibles correlaciones entre ellos y los ritmos de actividad en cada grupo de edad.

3.- Evaluar el efecto de la administración oral de melatonina una hora antes del apagado de luces a las concentraciones de 0,25, 2,5 y 5 mg por kg de peso sobre los ritmos de actividad-reposo en animales jóvenes y viejos, con el fin de determinar qué tratamientos son los más efectivos en cuanto a la mejora del descanso nocturno.

4.- Determinar los cambios que los tratamientos más efectivos en cuanto a la mejora del descanso nocturno provocan sobre los niveles circadianos circulantes y los parámetros cronobiológicos de los ritmos de serotonina y melatonina.

70

Sergio D. Paredes Royano

5.- Evaluar el efecto de la administración oral del precursor de la melatonina y la serotonina, el aminoácido triptófano, una hora antes del apagado de luces o una hora después del encendido de las mismas, a las concentraciones de 125 y 300 mg por kg de peso sobre los ritmos de actividad-reposo en animales jóvenes y viejos, con el fin de determinar qué tratamientos son los más efectivos en cuanto a la mejora del descanso nocturno.

6.- Determinar los cambios que los tratamientos más efectivos en cuanto a la mejora del descanso nocturno provocan sobre los niveles circadianos circulantes y los parámetros cronobiológicos de los ritmos de serotonina y melatonina.

7.- Estudiar los efectos de la administración oral de melatonina una hora antes del apagado de luces a las concentraciones de 0,25 y 2,5 mg por kg de peso en animales jóvenes y viejos, respectivamente, sobre la viabilidad celular, la función fagocítica y el metabolismo oxidativo de heterófilos sanguíneos a la acrofase y nadir del ritmo de melatonina, estableciendo correlaciones entre los niveles de hormona y los distintos parámetros inmunes analizados.

8.- Estudiar los efectos de la administración oral de triptófano a la concentración de 300 mg por kg de peso una hora después del encendido de luces en animales viejos, sobre los niveles circulantes de serotonina y melatonina, viabilidad celular, función fagocítica y metabolismo oxidativo de heterófilos sanguíneos en el punto en donde los ritmos de serotonina y melatonina se acoplan.

71

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3. MATERIALES, MÉTODOS, RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE CADA UNO DE LOS OBJETIVOS.

73

Resultados

PREÁMBULO.

Los materiales, métodos y resultados obtenidos durante el desarrollo experimental de esta tesis doctoral se exponen a continuación en el formato de las publicaciones a las que han dado lugar o, en su caso, en la forma preliminar en la que se encuentran en periodo de revisión. Con esta forma de exponer los resultados se pretende ofrecer una mayor concisión y fidelidad al trabajo experimental desarrollado. Además de la discusión que contiene cada artículo, la cual favorece la interpretación de cada objetivo de investigación planteado, hemos incluido tras el apartado de resultados una discusión general final conjunta de nuestra investigación.

74

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3.1. Estudio comparativo de los ritmos de actividad-reposo en tórtolas collarizas jóvenes y viejas (Streptopelia risoria): Correlaciones con los niveles séricos de melatonina y serotonina. 75

Resultados

76

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77

Resultados

78

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79

Resultados

80

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Resultados

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Resultados

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Resultados

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Resultados

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89

Resultados

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3.2. Efecto de la administración oral de melatonina sobre los ritmos de actividad-reposo, niveles circulantes y parámetros cronobiológicos de los ritmos de melatonina y serotonina de tórtolas collarizas (Streptopelia risoria) jóvenes y viejas. 91

Resultados

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Resultados

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95

Resultados

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97

Resultados

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99

Resultados

100

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101

Resultados

102

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3.3. Efecto de la administración oral de triptófano sobre los ritmos de actividad-reposo de tórtolas collarizas (Streptopelia risoria) jóvenes y viejas y sobre los niveles circulantes y parámetros cronobiológicos de los ritmos de melatonina y serotonina de animales viejos. 103

Resultados

104

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105

Resultados

106

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107

Resultados

108

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109

Resultados

110

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3.4. Evaluación del efecto de la administración de melatonina sobre la viabilidad celular, la resistencia a estrés oxidativo inducido así como sobre la capacidad de ingestión y metabolismo oxidativo de heterófilos de tórtolas collarizas (Streptopelia risoria) jóvenes y viejas. 111

Resultados

Mol Cell Biochem (accepted)

Effect of exogenous melatonin on viability, ingestion capacity, and free radical scavenging in heterophils from young and old ringdoves (Streptopelia risoria) Sergio D. Paredes, Mª Pilar Terrón, Ana Mª Marchena, Carmen Barriga, José A. Pariente, Russel J. Reiter2 and Ana B. Rodríguez

Department of Physiology, Faculty of Science, University of Extremadura, Badajoz, Spain 2

Department of Cellular and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, San Antonio, Texas, USA

Address correspondence to:

Carmen Barriga Ibars, Department of Physiology, Faculty of Science, University of Extremadura, Avda. de Elvas, S/N, 06071, Badajoz, Spain. Phone: +34 924 289 388. Fax: +34 924 289 388. E-mail: [email protected]

Running head: Melatonin, viability and phagocytosis of heterophils and age Key words: Melatonin, heterophil, viability, phagocytic process, age, bird

112

Sergio D. Paredes Royano

ABSTRACT

treated animals, the effect being greater in

The decrease of melatonin production with

young than in old ringdoves. At the nadirs,

aging contributes to the decline in immune

no change was observed in any parameter

function as organisms age. Treatment with

analyzed. In both young and old animals,

the exogenously administered indolamine

phagocytosis

restores

immunological

positively correlated, while superoxide

functions. Therefore, we investigated the

anion levels and melatonin were negatively

effect of melatonin on viability, phagocyte

related.

ingestion

melatonin enhanced heterophil viability in

the

reduced

capacity

and

free

radical

and

In

melatonin

conclusion,

were

exogenous

generation levels of heterophils from

old

young and old ringdove (Streptopelia

phagocytosis and free radical scavenging

risoria)

years,

in both age groups during the nocturnal

respectively. Animals received a single

period, accompanied by an increase in the

oral dose of melatonin one hour before

levels of the indolamine.

lights

aged

off

for

Experiments acrophases

3-4

3

were

11-13

consecutive performed

nadirs

well

as

increasing

days. at

the

INTRODUCTION Aging is a complex physiological process

Melatonin treatment significantly increased

that involves a number of changes that are

serum melatonin levels at the acrophases

manifested in individual cells as well as in

but not at the nadirs of the two age groups.

the whole organism. One of these changes

In both young and old animals there was

is a reduction of the rate of production and

increased heterophil viability at acrophases

a significant decline in the amplitude and

with respect to nadirs, and also increased

mean levels of melatonin – the "melatonin

cell resistance to oxidative stress in the old

deficiency

state"

animals after the melatonin treatment. At

amplitude

of

acrophases,

and

advanced age is both an indication as well

increased

as a cause of age-related disturbances in

index, of

of

as

melatonin.

efficiency

and

and

animals

percentage

phagocytosis

[1].

This

melatonin

loss

of

rhythm

in

significantly, and superoxide anion levels

the

decreased significantly with respect to the

chronobiological disorders [2], which is

nadir values of vehicle and melatonin-

accompanied by a general deterioration of

circadian

pacemaker

leading

to

113

Resultados

cognitive,

psychological,

and

social

Thus,

by

sleep

circulating levels of the indolamine with

disturbances [1,3]. In particular, in birds

age might somehow contribute to the

there has been shown a reduction of the

diminished innate immune function typical

amplitude of the melatonin rhythm with

of the age, as well as suggesting a

increased age that alters their activity/rest

relationship of the melatonin levels in

rhythms

advanced age with the total antioxidative

functioning

as

[4],

well

as

rendering

the

circadian

the

characteristic

decline

in

pacemaker a less self-sustained, often

capacity of the organism.

highly damped oscillatory system [5].

Previously, we have found a significant

Aging also affects the innate immune

decline in nocturnal serum melatonin

system [6,7]. In this case, functional

levels in old ringdoves (>10 years) with

impairment

in

respect to the concentrations observed in

neutrophils from aged individuals, finding

young animals (aged 2-3 years) [4] and

a diminished chemotactic and phagocytic

that the treatment with melatonin at the

capacity, as well as disturbances in the

doses of 0.25 and 2.5 mg/kg b.w. in young

degree of oxidative stress [8,9].

and old animals, respectively, restored the

In recent years much attention has been

amplitude of the serum melatonin rhythm

devoted to the possible interaction between

in old doves to that of the young birds, also

melatonin and the immune system [10-13].

improving their nocturnal rest [25]. This

The literature suggests that there is a close

was also the case when treating the animals

connection

with

has

been

between

reported

melatonin

and

tryptophan,

the

precursor

of

immune regulation in both mammals [14-

melatonin [26]. Also, both in vivo and in

16] and birds [17-20], showing correlations

vitro,

between diurnal and seasonal changes in

pharmacological doses of the indolamine

the immune system and the synthesis and

led to an increase in the immune response

secretion

[21].

[27,28]. In the present experiments, we

Melatonin may also possess significant

studied the effects of oral administration of

anti-aging properties [22], acting as an

melatonin over three days to young and old

ubiquitously direct free radical scavenger

ringdoves given 0.25 and 2.5 mg/kg

and a natural indirect antioxidant [22-24].

b.w./animal/day,

114

of

the

indolamine

the

administration

respectively,

of

on

low

the

Sergio D. Paredes Royano

circulating levels of the indolamine and the

the circadian system due to age, including

viability,

immune alterations.

phagocytic

function,

and

oxidative metabolism of blood heterophils

The study was approved by the Ethical

at the acrophases and nadirs of the

Committee

melatonin

Extremadura

cycle.

Also,

correlations

of

the (Badajoz,

University

of

Spain)

in

between the levels of the indolamine and

accordance with the National Institute of

the various immune parameters analyzed

Health Guide for the Care and Use of

were performed in both basal, vehicle and

Laboratory Animals.

melatonin treatment conditions. Melatonin Melatonin (N-acetyl-5-methoxytryptamine,

MATERIALS AND METHODS

Sigma, St. Louis, MO, USA) solution was Animals

prepared

in

phosphate-buffered

saline

Male and female ringdoves (Streptopelia

(PBS) solution, starting from a base

risoria) of 3-4 years of age (young) and

solution of 10 mg/mL which was dissolved

11-13 years of age (old; average life span

by stirring, followed by dilution to the

of 15 years) weighing 150±20 g were used

working solutions (0.25 and 2.5 mg

in the study (n= 10, per age group). The

melatonin per kg b.w.).

animals were bred in our department and individually environmental

housed

under

coditions

controlled

(22ºC;

Experiment

A:

Determination

of

70%

melatonin concentrations at acrophases

humidity), kept under a 12/12 h light/dark

and nadirs of the melatonin rhythm in

photoperiod (darkness from 20:00 to

each experimental group (young vs old)

08:00), and fed ad libitum (food and water). This species is characterized by

A1. Animal treatment

being diurnal and monophasic with sleep-

The birds received a single daily oral dose

wake cycles similar to those of human

(0.25 mg and 2.5 mg / 0.1 mL per animal /

beings and therefore represents a very

day) of melatonin for 3 consecutive days

good model to investigate impairments in

one hour before lights off. Vehicle animals received 0.1 mL of PBS with the same 115

Resultados

schedule as the melatonin-treated animals.

temperature for 15 min at 300×g. The

The administration was carried out using a

serum was then divided into aliquots in

plastic Pasteur pipette. Basal levels were

Eppendorf vials, and kept frozen at -30°C

blood values from animals studied before

until

treatment that had not been treated with

collections were performed under dim red

either PBS or melatonin. Based on

light which the birds perceive as darkness.

previous research, the acrophases of the

The extractions were performed before

melatonin rhythm (times at which the

initiating the treatment (basal values) and

variables reach their maximums) in the

on the third day of treatment.

the

time

of

assay.

Nocturnal

basal groups were established at 02:00 and 01:00 h, and the nadirs (times at which the

A3. Serum melatonin assay

variables reach their minimums) at 14:00

Melatonin was assayed by means of a

and 13:00 h, in young and old ringdoves,

commercial radioimmunoassay kit (IBL,

respectively [4]. In the melatonin-treated

Hamburg, Germany) that consisted of

birds, the acrophases and nadirs were

melatonin

respectively established at 02:30 and 14:30

enzyme,

h and 03:00 and 15:00 h in young and old

standards, rabbit anti-melatonin antiserum,

animals respectively [25].

precipitating

(140

kBq),

enzyme

assay

buffer,

agent,

125

I-

buffer,

melatonin

and

controls

(lyophilized serum samples), according to A2. Blood collection

the

Blood samples were drawn from all 10

Determinations

birds in each of the two age groups at

duplicate. Results are expressed in pg/mL.

acrophases and nadirs, allowing at least

Experiment B: Determination of viability,

one week between consecutive samplings.

phagocytic

The collections (1 mL) were made with a

metabolism of heterophils at acrophases

25-gauge needle and a syringe from the

and nadirs of melatonin rhythm in each

brachial

experimental group (young vs old)

vein

and

then

transferred

unheparinized to a pre-prepared tube containing samples 116

serum-separating were

centrifuged

gel. at

The room

manufacturers were

function,

instructions. carried

and

out

in

oxidative

Sergio D. Paredes Royano

B1. Animal treatment

previously described [29]. For calcein

The birds received a single daily oral dose

loading, cells were incubated for 45 min

(0.25 mg and 2.5 mg / 0.1 mL per animal /

with 1 µM acetoxymethyl (calcein AM) at

day) of melatonin for 3 consecutive days

37 ºC, centrifuged 10 min at 2100 rpm,

one hour before lights off. Vehicle-tretated

resuspending the pellet in fresh buffer.

animals received 0.1 mL of PBS with the

Fluorescence was recorded from 2 mL

same schedule as the melatonin-treated

aliquots

birds. The administration was carried out

spectrophotometer. Samples were excited

using a plastic Pasteur pipette. Basals

at 494 nm and the resulting fluorescence

levels were blood values from animals

was measured at 520 nm. After incubation

studied before treatment that had not been

with 1 µM, 10 µM 100 µM 100 or 1 mM

given either PBS or melatonin.

hydrogen peroxide (H2O2) for 30 or 60 min

using

a

fluorescence

at 37 ºC, cells were centrifuged and B2. Isolation of heterophil leukocytes

resuspended in fresh buffer. The calcein

Heterophil

obtained

fluorescence remaining in the cells after

immediately after the collection of 1 mL of

incubation with these concentrations was

blood (at acrophases and nadirs of the

recorded.

melatonin cycle in each experimental

samples incubated during the established

group) drawn from the brachial vein to

times but not in the presence of H2O2.

leukocytes

were

Control

samples

were

cell

which 0.5 mL of phosphate-buffered saline solution (PBS) and 0.5 mL of lithium

B4. Phagocytosis of latex beads

heparin

by

The trials of phagocytosis of inert particles

centrifugation at 600×g for 15 min in a

(latex beads) were performed according to

gradient using Histopaque (1 mL of 1119,

a technique previously described [30].

1 mL of 1077; Sigma, St. Louis, MO,

Aliquots of 200 µl of the suspension of

USA).

phagocytes (5×105 cells/mL) were placed

were

added,

followed

into the wells of plastic macrophage B3. Cell viability under oxidative stress

migration-inhibition factor (MIF) type

Cell viability was assessed using calcein as

plates, and after 30 min of incubation at 37

a fluorescent probe, following a technique

ºC in an oven with 5% CO2 atmosphere, 117

Resultados

the adhered monolayer was washed with

USA, 1mg/mL in PBS solution) in the

PBS at 37 ºC. Then 20 µl of latex beads

presence of 50 µl of latex beads (S,

(1.09-mm diameter particle size, dilluted to

stimulated samples) (1.09 mm, diluted to

1% in PBS; Sigma, St. Louis, MO, USA)

1% in PBS). Aliquots of the heterophil

and 200 µl PBS were added, followed by

suspension incubated in the absence of

another 30-min incubation under the same

latex beads were used as non-stimulated

conditions. Finally, the samples were fixed

samples (NS). In all cases, after shaking

and

(Dade

incubation at 37 ºC, the reaction was

Behring, Liederbach, Germany) containing

stopped with 2.5 mL of 0.5 N hydrochloric

methanol (5 min), eosin (five passes), and

acid.

haematoxylin (five passes). The plates

The tubes were centrifuged for 30 min at

were washed with tap water and dried,

600×g,

followed by counting under oil-immersion

supernatant

phase-contrast

a

spectrophotometer at 525 nm using dioxan

magnification of 100×. The number of

as the blank control. The stimulation of

particles ingested per 100 heterophils

NBT reduction was then determined as a

expressed the latex-bead phagocytosis

percentage relative to the absorbance

index (PI). The percentage of cells that had

obtained in the tubes without latex beads.

stained

with

Diff-Quick

microscopy

at

and

the

absorbance

was

determined

of

the

in

a

phagocytozed at least one latex bead expressed the phagocytosis percentage

Statistical analysis

(PP).

Data are expressed as mean (X) ± standard

The

ratio

PI:PP

gave

the

phagocytosis efficiency (PE).

deviation of the number of determinations carried out in duplicate. The results were

B5. Quantitative nitroblue tetrazolium

analyzed using non-parametric tests: the

(NBT) test

ANOVA two-way test by addition of

The method used was that described by our

Friedman ranges (paired samples) and the

group [28]. An aliquot of 250 µl of

ANOVA one-way test by addition of

heterophil suspension (1×106 cells/mL)

Kruskal-Wallis ranges (unpaired samples)

was incubated for 60 minutes with an equal

for multiple comparisons. Correlations by

volume of NBT (Sigma, St. Louis, MO,

multiple regression of different capacities

118

Sergio D. Paredes Royano

with the melatonin values at the hours

values measured in the old birds. No

studied were taken as significant if

changes were observed during the day in

2

R >0.05.

either age group (nadir values). Table 1 shows

the

effect

of

increasing

concentrations of H2O2 (ranging from 1

RESULTS of

µM to 1 mM) on cell viability of the bird

melatonin concentrations at acrophases

heterophils. The results indicate that H2O2

and nadirs of the melatonin cycle in each

induced a dose-dependent decrease in the

experimental group (young vs old)

heterophil

viability.

inhibitory

effect

Experiment

As

no

A:

significant

Determination

was

this

statistically

were

significant (p