REVISTA ENLACE QUÍMICO, UNIVERSIDAD DE GUANAJUATO VOL 2 NO 1, JUNIO DEL 2008 No 04-2010-101813383300-102 ®

EFECTO DE GLUCOSA SOBRE CÉLULAS RENALES EFFECT OF GLUCOSE ON RENAL CELLS Barbosa Sabanero K.Y*., Salgado M**., Barbosa- Sabanero G*., Cruz M***., Sabanero M****. *Instituto de Investigaciones Médicas, **CINVESTAV, ***Centro Medico Siglo XXI IMSS, ****Instituto de Investigación en Biología Experimental. Noria Alta s/n, Col. Noria Alta, C.P. 36050, Guanajuato Gto. Tel. 73 2 00 06 ext. 8158 [email protected] RESUMEN La hiperglicemia es la principal causa de las complicaciones vasculares en la diabetes, tales como la nefropatia diabetica, pero los mecanismos de estos efectos dañinos no se conocen. Diversas moléculas han sido involucradas en la señalización entre estas se incluyen citocinas proinflamatorias como IL-6 y TGF-β1. El objetivo del presente trabajo fue determinar los efectos de la hiperglucemia sobre el citoesqueleto y la producción de citocinas en cultivos de células renales humanas. La inducción de la hiperglucemia en cultivos celulares (HEK-293), fue mediante la adición de 20mM D- glucosa, durante 48 y 72 h y la concentración de glucosa de las células control, fue de 5.5mM. Las fibras de actina fueron analizadas con faloidina –FITC y la producción de IL-6 y TGF-β1 fue determinada mediante kits de ELISA. Los resultados muestran que la exposición de células a altas concentraciones de glucosa estimulan la producción de IL-6 y TGF-β1, además el citoesqueleto de actina es alterado presentándose agregados de actina en la región cortical de la membrana. En conclusión la glucosa induce alteración de citocinas y estructuras celulares, dañando el epitelio renal y consecuentemente se presenta la nefropatía diabética. Palabras Clave: citoesqueleto, citocinas, hiperglucemia, nefropatía.

ABSTRACT Hyperglycemia is one of the major causes of vascular complications in diabetes, such as diabetic nephrophaty but the mechanism of its detrimental effects is not clear. Molecules involved in signalling are diverse and include proinflamatories cytokines as Transforming Growth Factor (TGF-β1) and Interleukin -6 (IL-6). The aim of the present study was to determine in human renal cell culture the effects of hyperglycemia on cytoskeleton and cytokines levels. The induction of hyperglycemia in cell culture (HEK-293), was by addition of 20mM D- glucose, during 48 and 72 h and the control cell has normal glucose 4

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concentration (5.5mM).Using Plloidin-FITC as analized of actin fibers and IL-6 and TGFβ1 were determined by ELISA kits. These results shown that exposure of cells to hyperglycemia stimulates IL-6 and TGF-β1 production, moreover actin cytoskeleton is altered i.e. actin cumulus in region cortical of membrane was observed. In conclusion the glucose induced alteration of cytokines and cell structures injured renal epithelial and consequently is present the diabetic nephropathy. Key Words: cytoskeleton, cytokines, hyperglycemia, nephropathy.

INTRODUCCIÓN La diabetes mellitus tipo 2 (DM2) es una enfermedad metabólica, caracterizada por una hiperglucemia. La nefropatía diabética, es una de las complicaciones vasculares más importantes y la mayor causa de morbilidad y mortalidad en pacientes con DM2 (ADA 2005). El costo medico en servicios de salud por complicaciones en pacientes con DM2 es uno de los más altos. En el Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) el costo de atención de los pacientes con DM2 en el año 2000 fue de 552 mdp de los cuales el 47% del total se aplicó en costos directos y el 23% en el tratamiento de insuficiencia renal por nefropatía diabética (Aguirre y cols., 2000). Se ha sugerido que el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β1) esta involucrado en la acumulación de matriz extracelular y además se ha reportado que es el mejor mediador de cambios hipertroficos y escleróticos en la enfermedad diabética renal (Ziyadeh 2004). Por otra parte, se ha sugerido que la inflamación tiene un papel crucial en la nefropatía.Una de las citocinas posiblemente implicadas en la nefropatía diabética es la Interleucina 6 (IL6). IL - 6 ha sido involucrada en diabetes e hiperglucemia. (Kishimoto y cols., 1992 ) recientes estudios sugieren a IL 6 como marcador de inflamación y predictor de DM2 en mujeres sanas ( Hu y Col. 2004). En la nefropatía diabética se desconoce el papel de factores implicados como: citocinas y el citoesqueleto. Por ello, es importante entender a nivel celular los cambios estructurales que se presentan; así como los niveles de las diferentes citocinas. En este trabajo se describe las alteraciones en células renales humanas durante la hipergluce mia.

METODOLOGÍA Cultivos Celulares. Las células de riñón humano de la línea HEK 293, fueron cultivadas (1 x 106 células/ml), utilizando Medio de cultivo DMEM (GIBCO), suplementado con 10% Suero Fetal Bovino; incubados en una atmósfera húmeda a 37°C y 5% de CO2. 5

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Exposición a Glucosa. Los cultivos fueron expuestos a las siguientes condiciones experimentales: cultivos de células control 5.5mM de glucosa y cultivos de células expuestas a 20mM de glucosa durante 48 y 72hrs. Inmunocitoquímica. Los cultivos fueron fijados con paraformaldehído al 4% y glutaraldehído al 0.05% por 30 min. Las células fueron lavadas tres veces con PBS, posteriormente permeabilizadas y teñidas con Faloidina-FITC (Sigma). Finalmente, las preparaciones fueron examinadas en un microscopio de epifluorescencia. Ensayos tipo ELISA. Los niveles de TGF-β1, e IL-6 se determinaron mediante ensayos de tipo ELISA (R&D Systems ), aplicando las instrucciones del proveedor. Análisis Estadístico. Los resultados de tres experimentos independientes fueron analizados aplicando la T de Student. RESULTADOS Niveles de IL-6 de células renales expuestas a glucosa. Los niveles de IL-6 de células control son de 3.89 pg/ml y las expuestas a glucosa 4.24 pg/ml durante 48 h. Los niveles de IL-6 de células control son 4.13pg/ml y las expuestas a glucosa 4.78pg/ml durante 72 h. Los resultados muestran que los niveles de IL-6 presentan diferencias significativas en comparación con el control p