El proyecto del genoma humano (PGH) Inició en 1990 y fue un esfuerzo coordinado de13 años entre el Departamento de Energía y el Instituto Nacional de Salud. Fue planeado para 15 años pero los avances en secuenciación aceleraron para completarlo en el 2003. OBJETIVOS: Identificar los 20-25000 genes del genoma humano Determinar la secuencia nucleotídica de los 3 millones de pares de bases Almacenar la información en Bases de Datos Mejorar las herramientas de análisis de datos Permitir la Transferencia de las tecnologías relacionadas al sector privado Manejar las implicaciones éticas, legales y sociales que surgieran en el proyecto.

Cuales son los beneficios prácticos del PGH?

Conocimiento acerca de los efectos de las variaciones entre los individuos que dirijan a nuevos métodos revolucionarios para diagnosticar, tratar y algún día prevenir los miles de trastornos que nos afectan. Al mismo tiempo provea claves para el entendimiento de la biología humana, aprendizaje de las secuencias de otros organismos y un entendimiento de sus capacidades naturales que puedan ser aplicadas a la solución de los retos de salud, agricultura, producción energética, bioremediación y el secuestro de carbono.

Medidas y Métodos del PGH

MAPEO DEL GENOMA

MAPA

Bases de Datos de Secuencias PGH

Interfases para navegar sobre secuencias genómicas ensambladas

Mapas físicos y genéticos • Físico: muestra el orden de características a lo largo del cromosoma y su distancia en kilobases o Mb • Genéticos: muestran su orden y probabilidad de que se separen mediante recombinación

Definición • Determinación de la variación del DNA dentro de una especie

Recombinantes y no recombinantes • La recombinación es un mecanismo que genera Variabilidad Genética • Descubrir la frecuencia con que se separan 2 loci

Recombinación meiótica

Meiosis I Profase I

Meiosis II

Ligamiento de genes • En Cis o trans (según estén combinados los alelos de cada uno de los genes) – Si en el cromosoma heredado del padre hay un alelo dominante de un gen y otro dominante del otro gen el ligamiento es en FASE DE ACOPLAMIENTO, por ende en el cromosoma materno si el individuo es heterocigoto estarán los alelos recesivos de ambos genes – En cambio cuando en 1 cromosomas hay un alelo dominante y el otro gen está en forma recesiva, y al revés, en el otro cromosoma los genes están ligados en FASE DE REPULSION (trans)

Ligamiento de genes

P

M

P

M

Ligamiento • También puede ser TOTAL o PARCIAL dependiendo de que distancia los separe • Cuánto más cerca están uno de otro menor es la probabilidad de que suceda un crossing over entre ellos y por lo tanto tienden a heredarse en la misma combinación o haplotipo que poseía el cromosoma materno o paterno • A esto se le denomina LIGAMIENTO TOTAL

• Si en cambio la distancia que los separa es suficiente para permitir entrecruzamientos entre ellos el ligamiento es PARCIAL

Ligamiento parcial • Considerar que en algunas células habrá crossing over y recombinación y otras donde no lo haya • Por lo tanto el porcentaje de gametos que tienen nuevas combinaciones o RECOMBINANTES siempre es más bajo que el porcentaje de gametos con la combinación original o PARENTAL

VNTR´s

Marcadores genéticos • Interés en enfermedades mapa que muestre orden y distancia entre los genes patológicos • El mapeo genético requiere heterocigotos dobles – Personas heterocigotas para 2 enf diferentes son muy raras – Si se encuentran no tienen hijos, no adecuadas para análisis genéticos

Marcadores genéticos • Marcador: cualquier carácter mendeliano polimórfico que puede utilizarse para seguir un segmento cromosómico a través de una genealogía – Útil: que sea fácilmente calificable, material disponible sin gran costo (cel sanguíneas en lugar de biopsia de cerebro!!)

– Suficientemente polimórfico para que 1 persona seleccionada al azar tenga 1 buena posibilidad de ser heterocigoto

Marcadores polimórficos

Haplotipos: producto de la reproducción sexual en el tiempo

A

 Los cromosomas intercambian Muchas generaciones

fragmentos en cada individuo en cada generación  Algunos segmentos son compartidos por

A

A

varios individuos  Los haplotipos son conjuntos de

variaciones contenidas en regiones que no han sido interrumpidas por recombinación, es decir, que se han heredado en bloque.

Variabilidad Genómica (Polimorfismos) • Un polimorfismo genético se refiere a variaciones genéticas que se presentan en más del 1% de la población • SNP: Polimorfismos de un sólo nucleótido ( “snips”)

• Se encuentran aproximadamente 1 cada 350 pb La gran mayoría en regiones no codificantes Un gen contiene en promedio 4 SNP’s en su región codificante

Desarrollo de marcadores genéticos humanos Tipo de marcador

Núm. De loci

Características

Gpos sanguíneos (1910-1960)

20

Sangre fresca, antisueros raros No siempre posible deducir el genotipo por el fenotipo debido a la dominancia No es fácil la localización física

Variantes de movilidad electroforética de proteínas séricas (1960-1975)

30

Suero fresco, valoraciones especializadas No es fácil la localización física Polimorfismo limitado

Tipo de tejido HLA (1970-)

1

Un gpo enlazado. Muy informativo Solo puede estudiar por enlace a 6p21.3

(haplotipo)

RFLP de DNA (1975-)

>105 (potencial mente)

2 marcadores de alelos, heterocigosidad máx de 0.5 Inicial/ requería Southern blotting, hoy PCR Localización física fácil

Desarrollo de marcadores genéticos humanos Tipo de marcador

Núm. De loci

Características

NVRT de DNA (minisatélites) (1985-)

>104 (potencialmente)

Muchos alelos. Muy informativo Southern blotting Localización física fácil Tiende a agruparse cerca de los telómeros

NVRT de DNA (microsatélites) repeticiones de di-, tri- y tetra nucleótidos(1985-)

>105 (potencialmente)

Muchos alelos. Muy informativa Tipifica mediante PDR multiplex automatizada Localización física fácil Distribuido en la totalidad del genoma

SNP de DNA (polimorfismos de nucleótido único)

>4 x 10 6

Menos informativo que microsatélites Puede tipificarse a muy grande escala mediante equipo automatizado sin electroforesis en gel

NVRT: número variable de repeticiones en tándem

Polimorfismos que pueden genotipificarse • SNP: polimorfismos 1 sólo nucleótido; se origina x el cambio de 1 nucleótido aislado. Suelen valorarse mediante secuenciación de DNA • VNTR (número variable de repeticiones en tándem):surge x inestabilidad en 1 arreglo de repeticiones tándem q causa 1 cambio en el núm de repetición (se emplea + p/minisatélite)

Como se originan los polimorfismos

Subclases de polimorfismos • SNP de sitio de restricción: el cambio en el nucleótido causa pérdida o ganancia de un sitio de restricción. Se tipifica mediante PCR o hibridación Souhtern (RFLP) • VNTR microsatélite: polimorfismo de repetición tándem corto (PRCT), o polimorfismo de repetición de secuencia simple (PRSS); repetidos de 1-4 nucleótidos • VNTR minisatélite: unidad repetida de 9-65 pb de longitud

¿Qué son los Tag SNPs? Son SNP’s representativos de una región en el genoma, con los cuales, mediante cálculos estadísticos se pueden inferir otros SNP’s, que junto con ellos, se heredan en bloque. SNPs marca o tag: A/T 1

G/A G/C 3 2

T/C G/C 4 5

A/C 6

A A T T

G G A A

T C C C

A C C C

alta r2

G C G C

alta r2

G C G C alta r2

Carlson et al. (2004) AJHG 74:106

SNP 1 SNP 3 SNP 6 SNPs inferidos: SNP 2 SNP 4 SNP 5 Se analizan solamente 3 SNPs y se obtiene información sobre al menos 6

Clonación posicional • Ir estrechando el cerco al gen a partir de su localización cromosómica • Se parte de varios pedigrees en la que se ve la segregación del rasgo respecto a múltiples marcadores genéticos polimórficos. • En humanos, lo ideal es que la separación entre marcadores no sea mayor de 1cM. • Luego, por paseo o salto cromosómico, se va uno acercando al gen. • Análisis de genes candidatos • Se han aislado muchos genes por clonación posicional, pero la mayoría de ellos sobre la base de mutaciones de delección, translocación o amplificaciones de trinucleótidos. • La clonación posicional a partir de mutaciones puntuales es más ardua

Mapeo de genes • Algunos genes se habían localizado respecto al MODO DE HERENCIA ligado al X, algún FENOTIPO SE HEREDABA EN TANDEM con algún grupo sanguíneo o con un heteromorfismo citogenéticamente detectable.

Mapeo físico de genes • Asigna a genes localizaciones determinadas a lo largo de un cromosoma • Utilizando medidas que son el reflejo de la distancia física entre los genes • En unidades de pares de bases

Mapeo genético • Utiliza un análisis de ligamiento, la medición de la frecuencia con la que dos genes permanecen juntos tras una meiosis cuando pasan de generación en generación.

MAPEO FÍSICO DE GENES HUMANOS • Cultivo celular – Clonas, crecer en algunos de manera indefinida – Fibroblastos son la célula más útil, 30-300 generaciones, senescencia vs transformación. – Sangre periférica con transformación blastoide

Mapeo por transferencia cromosómica

• Permite la transferencia de cromosomas enteros o segmentos desde una célula donante hacia una receptora en cultivo • Hibridos de cel. Somáticas interespecíficas – Heterocariontes – Homocariontes

Se pierden cromosomas humanos pero no de roedor!!

Mapeo de un gen a una determinada región de un cromosoma

Radiación

Translocaciones

Medida de la distancia genética • Entre una descendencia el 80% de los genotipos son NO RECOMBINANTES (es decir igualito a lo del progenitor, se comportan como si no tuvieran recombinación durante la meiosis)

RECOMBINANTES

y 20% son

• Entonces la frecuencia de recombinación , es del 20% • A 20 cM un alelo del otro, convirtiendo la fracción de recombinación en una distancia génica.

• No se realiza observando a una sola familia

De verdad DOS LOCI ESTAN LIGADOS? • Necesitamos saber si: – La fracción de recombinación , es significativamente diferente que 50% (del azar entre dos loci en diferentes cromosomas o simplemente no ligados) – Que tan “significativa” es, se utiliza la razón de probabilidades (likelihoods odds ratio) • Los valores de Z mayores a uno sugieren que los loci están ligados. 3 o mayor es una evidencia definitiva de que los loci están ligados Bajo esta fórmula cuando es cero, o sea no hay recombinantes, en los descendientes todos tienen igual que el progenitor, la Z es 1.81

Mapas de ligamiento • Supongamos que dos loci, A y B, están ligados a una distancia de 10cM. • Esta información no es suficiente para construir un mapa, no sabemos el orden • Pero si tenemos un locus C y sabemos que este esta a 12 cM de A y a 5cM de B pues tenemos el orden A B C

Relación entre distancia genética y distancia física • Comparación de parámetros citogenéticos, físicos y genéticos en el genoma Citogenéticos

Tamaño físico

Distancia génica

Contenido en genes

23 cromosomas

3*10 9 pb

4300 cM

50, 000!

Cromosoma medio

1.5 * 10 8 pb

200 cM

2 200

Banda

3 *10 6 pb

5 cM

50

Mapeo de genes de enfermedad por análisis de ligamiento

Heterogeneidad de locus

10cM • Tiene que estar a un máximo de 7.5 millones de pb del gen de la enfermedad para que pueda detectarse ligamiento

MARCADORES INFORMATIVOS DE ANCESTRIA: Los Marcadores Informativos de Ancestría (AIMS) pueden ser STRs o SNPs, dependiendo de la informatividad de los mismos. Actualmente, con el desarrollo de métodos que permiten determinar simultáneamente SNP’s a mediana y gran escala, hacen que sea una estrategia más económica y técnicamente accesible.

El criterio para seleccionar los SNP’s es que presenten frecuencias alélicas sustancialmente diferentes entre poblaciones bio-geográficas. chrom chr4 chr15 chrX chrX chr18 chr4 chr17 chr18

rs_number rs4385038 rs1426654 rs2294504 rs2182191 rs12606216 rs2970869 rs9893497 rs1259807

alleles A/G A/G C/T A/G A/G A/G A/G A/G

CEU 0.925 1 0.756 0.256 0.992 0.242 0.442 0.283

YRI 0.133 0.025 1 1 0.858 0.025 0.217 0.7

CHB 0.744 0.011 0.091 0.265 0.3 0.289 1 0.456

JPT 0.625 0.011 0.061 0.227 0.261 0.5 1 0.659

AMI 0.52 0 0.17 0.87 0.4 1 0.89 1

Las Variaciones Genómicas nos hacen miembros individuales de nuestra especie • Dan lugar a las características físicas que diferencian a los individuos y a las poblaciones

• Confieren susceptibilidad o resistencia a enfermedades comunes • Modulan la respuesta a tratamientos farmacológicos

La información genética contiene información de ancestría (muy importante al aplicar tratamiento farmacológico). Firma Genética.

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