El Rol del Laboratorio de Hemostasia en el Diagnóstico de Trombofilias Hereditarias y Adquiridas Susana María Ouviña Doctora en Química, Universidad de Buenos Aires Laboratorio de Hemostasia y Trombosis, Hospital Churruca, Buenos Aires, Argentina Sector Hemostasia, Laboratorio de Medicina, Buenos Aires, Argentina

TROMBOFILIA ALTERACIÓN ADQUIRIDA O HEREDITARIA DE LA HEMOSTASIA QUE PREDISPONE A UN RIESGO AUMENTADO DE ENFERMEDAD TROMBOEMBÓLICA MULTIFACTORIAL Y MULTIGÉNICA EXPRESIÓN VARIABLE INTERACCIÓN GENÉTICA Y AMBIENTAL

Objetivos de los estudios de trombofilias • Conocer la etiología e informar al paciente una condición trombofílica en un paciente con trombosis no implica conocer la causa, sino un factor que contribuyó al evento

• Decidir sobre el tratamiento, duración, intensidad, detención • Actuar sobre futuras situaciones de riesgo del paciente • Acciones sobre familiares

Trombofilia Hereditaria • • • • •

Deficiencia de Antitrombina Deficiencia de Proteína C Deficiencia de Proteína S Factor V Leiden Protrombina 20210

Trombofilia Adquirida • Inhibidor Lúpico • Anticuerpos Anticardiolipinas • Anticuerpos Anti-β2 GP I

• Hiperhomocisteinemia Otros: • MTHFR C677T • PAI 4G/5G • Factores de coagulación VIII, IX, XI

Sitio de Trombosis vs Alteración Hemostasia Deficiencia AT

Deficiencia PC Deficiencia PS Factor V Leiden FII G20210A Hiperhomocisteinemia Inhibidor Lúpico

Arterial

Venosa

-

+

+ +

+ +

+ + + +

PACIENTES DE QUE DEBEN SER EVALUADOS PARA TROMBOFILIAS HEREDITARIAS •ETEV ANTES DE LOS 50 AÑOS •HISTORIA DE TROMBOSIS RECURRENTE •TROMBOSIS NO PROVOCADA A CUALQUIER EDAD

•HISTORIA FAMILIAR DE TROMBOSIS •TROMBOSIS EN SITIOS INUSUALES (CEREBRAL, MESENTÉRICA, PORTAL, HEPÁTICA ,RENAL)

•TROMBOSIS ASOCIADA AL EMBARAZO O PUERPERIO, USO DE ANTICONCEPTIVOS ORALES Y TERAPIA HORMONAL SUSTITUTIVA •TROMBOSIS ASOCIADA A CIRUGÍA, INMOBILIZACIÓN PROLONGADA, VIAJES PROLONGADOS Arch Pathol Lab Med 2002;126(11):1277-1433

ANTITROMBINA • Inhibidor fisiológico de la coagulación sanguínea • Familia de SERPINAS • Inhibe FIIa y FXa, también FIXa, FXIa, FXIIa, kalicreína, plasmina • Síntesis hepática, vida media 2 a 3 días • Gen en cromosoma 1 (q23-25) • Complejo covalente 1:1 AT:Trombina, la heparina aumenta la afinidad 1000 veces. Mateo et al; Thromb Haemost 1977 Martinelli et al; Blood 1998 Kottke-Marchant et al;Arch Pathol Lab Med-Vol 126, Nov 2002

CE Mon TF-VIIa

IXa

VIIIa X

Xa

Xa

Va HS

Va

II

IIa IIa

ATIII I

Fibrina

XIIIa

X

Deficiencia Hereditaria de Antitrombina • Descripta en1963 por Olav Egeberg en una familia con varios casos de tromboembolismo venoso • Mayoría de los casos son heterocigotas, la deficiencia homocigota tipo I es casi siempre fatal in utero • Descriptas 127 mutaciones • Prevalencia en población general: 0.02–0.05% • Aumenta 8 veces el riesgo de trombosis venosa Kottke-Marchant et al;Arch Pathol Lab Med-Vol 126, Nov 2002

Métodos para Estudiar Proteínas del Sistema de Coagulación Funcionales • Coagulométricos • Cromogénicos Inmunológicos • Inmunodifusión Radial • Electroinmunodifusión • ELISA

Deficiencia Hereditaria de Antitrombina Tipo de Defecto

AT Actividad Prevalencia Prevalencia en en Defecto Ensayo Ensayo AT pacientes en Cof Hep* Progresivo§ Antígeno población general con (0.02-0.05%) trombosis

Tipo I

BAJO

BAJO

BAJO

Cuantitativo

IIa: sitio enlace a trombina

Tipo II Cualitativo

IIb: sitio enlace a heparina

IIc: pleiotrópico

12% de todas las DAT

60% de todas las DAT

88% de todas las DAT

40% de todas las DAT

Frec BAJO

BAJO

Normal

Frec BAJO

NORMAL

Normal

BAJO

NORMAL

BAJO

*Ensayo de inactivación de la trombina o del FXa § Ensayo en ausencia de heparina ó baja concentración

Haemophilia 2008; 14:1229-1239

Deficiencia Adquirida de Antitrombina Disminución de Síntesis • Cirrosis hepática

Aumento de pérdida • Sindrome nefrótico • Enteropatías

Aumento de consumo/inactivación • • • • • • •

Sepsis Quemaduras severas Politrauma Enfermedad veno-oclusiva hepática Microangiopatías trombóticas Cirugía de by-pass cardiopulmonar Metástasis tumorales

Inducida por drogas • Tratamiento con L-Asparaginasa • Tratamiento con heparina

Haemophilia 2008; 14:1229-1239

PROTEINA C • Glicoproteína de síntesis hepática • Modificación post-traduccional vitamina K dependiente • Inhibe FVa y FVIIIa en presencia de su cofactor Proteína S. FVIIIa: R336; R562 FVa: R306; R506; R679 Dahlback B. Blood 2008;112: 19-27

Activación de coagulación

Sistema PC/PS

C4bBP

IIa

PS

Vi VIIIi

PC

PS

Ca++

TM IIa

PC

EPCR

Endotelio

EPCR

APC

Va

V

VIIIa APC PS

Plaquetas Endotelio

V

Deficiencia Hereditaria de Proteína C • Griffin et al (1981) describe deficiencia de PC en flia con ETV recurrente • Mayoría presenta deficiencia heterocigota, nivel aprox 50% • Deficiencia homocigota severa púrpura neonatal fulminans: trombosis intravascular en la microcirculación. • Prevalencia en población general: 0,2 – 0,5%

Dahlback B. Blood 2008;112: 19-27

Deficiencia de Proteína C Proteína C funcional

Proteína C antigénica

Coagulométrico/ cromogénico

IDR, Laurell,ELISA

Tipo 1

Disminuida Disminuida

Tipo 2

Disminuida

Normal

Hankey et al; Stroke 2001 Douay et al; Acta Neurol Scand 1998 Munts et al; J Neurol 1998 Boekholdt SM et al 2007

Deficiencia Adquirida de Proteína C • • • • • • •

Tratamiento con dicumarínicos Enfermedad hepática o renal CID Cirugía Trauma Embarazo Deficiencia de Vitamina K Dahlback B. Blood 2008;112: 19-27

PROTEINA S • Glicoproteína de síntesis hepática, vitamina K dependiente • PS circula como PS libre: 40% y como PS-C4BP: 60% • Cofactor esencial de la PC en la inhibición de FVIIIa y FVa. • Sólo PS libre es la forma activa • Deficiencia hereditaria autosómica dominante, 131 mutaciones descriptas Am. J. Hematol. 86:418–421, 2011

PROTEINA S Proteína S Total = Proteína S libre + Proteína S-C4BP

C4BP

PS

Inactiva

FVIIIa

FVIII

FVa

FV

PS libre Proteína C ERPC

Proteína C activada Trombina Trombomodulina

CE

Deficiencia Hereditaria de Proteína S Prevalencia en población general: 0.1% Aumenta 8-11 veces el riesgo de trombosis venosa

PS Libre

PS total

I aprox 80% II 0.1 a 5%

Actividad funcional Disminuida Disminuida

Disminuida Normal

Disminuida Normal

III aprox 20%

Disminuida

Disminuida

Normal

Tipo

Am. J. Hematol. 86:418–421, 2011

Deficiencia Adquirida de Proteína S • • • • • • • • • •

Evento tromboembólico Cirugía CID Hepatopatía Deficiencia de Vitamina K Tratamiento con anticoagulantes orales dicumarínicos Estados inflamatorios crónicos Tratamiento con anticonceptivos orales Terapia de reemplazo hormonal Embarazo (fisiológico) Am. J. Hematol. 86:418–421, 2011

Métodos de Estudio de Antitrombina, Proteína C y Proteína S Método de screening Antitrombina

Proteína C

Proteína S

Funcional cromogénico basado en FXa Funcional cromogénico o coagulométrico Proteína S libre

Si da alterado AT antigénica

PC antigénica

Funcional coagulométrico/ PS total

Int. Jnl. Lab. Hem. 2014; 36: 289-295

RESISTENCIA A LA PROTEINA C ACTIVADA • Factor V Leiden: G1691A

R506Q

• Prevalencia: 1-8% caucásicos, muy rara en asiáticos y africanos •

Aumenta 5-7 veces el riesgo de TV

•

Aumento del riesgo en presencia de factores adquiridos: – Anticonceptivos orales/TRH

– Embarazo – Tabaquismo Bertina RM, Koeleman BPC, Koster T, Rosendaal FR, et al. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistence to activated protein C. Nature. 1994;369:64-67.

Arg 709

V A1 VaArg A1 306

PCa

Arg 1018 Arg 1545

A2

A2

B

A3 C1 C2

Ca++

A3 C1 C2

Arg 679

Arg 506 Arg 709

VLeiden VaLeiden

A1 A2

B

A1 A2

Ca++

Arg 306

X

Arg 1018

Arg 1545

A3 C1 C2 A3 C1 C2

Arg 679

Gln 506

FVLeiden: mutación 1691GA VL

V VIIIa PCa

PS

VIIIi

Factor V Leiden NO es cofactor de la PCa en inactivación del Factor VIIIa

RPCa: Métodos Funcional APTT + PCa + FV defic APTT + FV defic Biología Molecular PCR: G1691A

>2

PROTROMBINA 20210 Poort SR, Rosendaal FR, Reitsman PH, Bertina RM. A common genetic variation in the 3´-untraslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin level and an increase in venous thrombosis. Blood. 1996;88:3698-3703.

• Sustitución de A por G en posición 20210 • Niveles más elevados de Protrombina (FII), aprox 30% de aumento • Aumenta 3 veces el riesgo de trombosis venosa

•Ridker et al. Circulation 1999

Anticuerpos Antifosfolípidos • 1972 Introducción del término Anticoagulante Lúpico: autoanticuerpos presentes en pacientes con LES que causan prolongación de pruebas de coagulación sin causar sangrados y están relacionados a tendencia trombótica. • 1983 Introducción del primer ELISA para Anticuerpos Anticardiolipinas.

ANTICUERPOS ANTIFOSFOLIPIDOS

Grupo heterogéneo de anticuerpos • Especificidades • Proteínas distintas • Diferentes epítopes en una misma proteína

• Afinidad • Isotipos • IgG, IgM, IgA

• Actividad IL

Los anticuerpos antifosfolípidos no sólo involucran al fosfolípido sino también a otra proteína, a la que se le denomina cofactor. Anticuerpos dirigidos al fosfolípido + cofactor

Anticuerpos dirigidos sólo al cofactor

Anticuerpos dirigidos sólo al fosfolípido cofactor fosfolípido

Anticuerpos Antifosfolípidos Mecanismos patogénicos • Activación e injuria celular • Efectos sobre mecanismos pro y antitrombóticos

• Inmunidad celular-citoquinas • Interacción con factores genéticos de trombosis • Activación del complemento Forastiero R, Martinuzzo ME. Antigen Specificity and Clinical Relevance of Antiphospholipid Syndrome. Current Rheumatology Reviews, 2005, 1,

Interferencia con el Sistema Anticoagulante de la PC/PS C4bBP

PS

PC

PS FVIIIa FVa

PC LA/APA

TM IIa

β2GP1

Endothelium

aPC

PS

FVIIIi

FVi

Mecanismos protrombóticos de los Ac aFL CE

tPA

PAI-1

TM EPCR T PC

Plaqueta

PS APC Plaqueta

Plasmina

PS

PT

Plg

β2GPI

Ac aFL PT T

Plaqueta

Va Plaqueta

Xa

Anexina A5

T AT

TFPI

TF

Xa

X

VIIa

CE Forastiero R, Martinuzzo ME. Antigen Specificity and Clinical Relevance of Antiphospholipid Syndrome. Current Rheumatology Reviews, 2005, 1,

Sindrome antifosfolípido: Criterios actualizados SAF presente si al menos 1 criterio clínico y 1 criterio de laboratorio están presentes Criterios Clínicos • Trombosis vascular (arterial, venosa, pequeños vasos, cualquier órgano o tejido) confirmada por estudios de imágenes o histopatología. • Una o más muertes inexplicadas de fetos morfológicamente normales de 10 o mas semanas de gestación • Una o más nacimientos prematuros de neonatos morfológicamente normales de menos de 34 semanas de gestación (eclampsia, insuficiencia placentaria) • Tres o mas abortos espontáneos inexplicados antes de las 10 semanas de gestación, excluidas causas anatómicas o genéticas

Semin Thromb Hemost 2009;35:695-710

Sindrome antifosfolípido: Criterios actualizados Criterios de Laboratorio • Presencia de Inhibidor Lúpico en plasma detectada en 2 o más ocasiones con una diferencia de por lo menos 12 semanas determinado según las normas del SSC en anticuerpos antifosfolípidos de la ISTH. • ACA IgG y/o IgM presentes en suero o plasma en título moderado ó alto (> 40 GPL o MPL) en 2 o más ocasiones con una diferencia de al menos 12 semanas medidas con un ELISA estandarizado. • Ac anti β2 GPI Ig G y/o IgM presentes en suero o plasma en dos o más ocasiones con una diferencia de al menos 12 semanas medido con un ELISA estandarizado Semin Thromb Hemost 2009;35:695-710

Inhibidor Lúpico: Laboratorio • • • • • • • • •

Obtención y preparación de la muestra Pruebas de Screening: APTT, dRVVT (sensibilidad) Pruebas de mezcla con pool normal Pruebas confirmatorias con fosfolípidos Determinar valores de corte para cada test Resultado positivo se repite a las 12 semanas No realizar el estudio en el evento agudo RIN < 1.50 cuando sea posible Ptes con HBPM tomar muestra antes de aplicación de la dosis • Interpretación de los resultados del estudio, conclusión.

HOMOCISTEINA

Métodos: HPLC, quimioluminiscencia, ELISA

Factores que influyen en el nivel plasmático de Homocisteína Factores genéticos

Drogas

Nutrición

HOMOCISTEÍNA

Edad

Enfermedades sistémicas

Mecanismos Trombogénicos Hiperhomocisteinemia

Disfunción/Injuria Endotelial

Activación plaquetaria

Activación coagulación

Fibrinolisis

Errores Preanalíticos en el Laboratorio de Hemostasia Evento Preanalítico

Descripción

Efecto que causa

Efecto adverso en los test de rutina de coagulación

Efecto adverso en los test diagnósticos de coagulación

Muestra de paciente incorrecto

Demora en etiquetar el tubo

Se realizan test a paciente equivocado

Resultado no pertenece al paciente

Resultado no pertenece al paciente

Toma de muestra en paciente estresado

Liberación de proteínas de fase aguda

Elevación en componentes de hemostasia

Falsa elevación de Fibrinógeno

Falsa elevación de FVIII y FvW: enmascara EvW

Toma de muestra en paciente en tto con heparina

Pte internado se solicita est trombofilia

Inhibe la coagulación

Prolonga test de coagulación

Falsa disminución de AT, falso IL

Paciente en tto con anti Vitamina K

Solicitud de est de trombofilia a pte ambulatorio con anti Vit K

Anti Vit K disminuyen actividad de ciertas prot de coagulación

Tiempos de coagulación prolongados

Falsa disminución de PC, PS, falso IL

Tomar muestra inmediato al evento trombótico

Pte internado por trombosis se solicita est de trombofilia

Consumo y aumento de componentes de hemostasia

APTT acortado por aumento de FVIII

Falsa disminución de AT, falso negativo para IL

Muestra tomada en paciente embarazada

Solicita est trombofilia por pérdidas fetales

Disminución de algunos componentes, aumento de otros

APTT acortado por aumento de FVIII

Disminución de PS, PC, falso negativo para IL

Recolección de muestra inapropiada

En EDTA,suero heparina. Contaminación por orden de llenado de tubos

EDTA y heparina inhiben la coagulación. El suero carece de factores e inhibidores

Falsa prolongación de tpos de coagulación. Innecesarias repeticiones o estudios adicionales

Falsa disminución de factores de coagulación e inhibidores, falso IL

Falsa prolongación de tiempos de coagulación

Falso diagnóstico de deficiencias de componentes de Hemostasia

Mezcla El llenado de Coagulación inapropiada de varios tubos parcial de la la muestra puede demorar muestra el mezclado

Falsamente acortados o alargados tests de coagulación

Niveles de factores e inhibidores falsamente disminuidos

Inapropiado manejo de la muestra

Centrifugación insuficiente o inapropiada: plaquetas remanentes

Liberación de contenido celular luego de desfreezar la muestra

Falso acortamiento de los tiempos de coagulación

Falsa disminución de AT (hemólisis) IL falso negativo

Transporte inapropiado de la muestra

Refrigeración de sangre entera. Plasmas no freezados.

Activación del FVII. Pérdida de actividad de factores e inhibidores.

Tiempos falsamente acortados. Tiempos falsamente prolongados

Falso negativo para IL y para deficiencia de factores.

Tubo mal enrasado

Alta relación citrato:plasma

Dilución de la muestra

Interpretación de los Resultados Test

Resultado del Test

AT

Disminuido

PC/PS

Disminuido

PS

Elevado

APCR

Disminuido

Considerar Def hereditaria muy rara. Tiempo del evento agudo, tto con heparina, hepatopatía, CID, sindrome nefrótico, tto con L-asparaginasa, hemólisis, presencia de fibrina. Excluir estas condiciones. Repetir el estudio. Def hereditaria muy rara. Tiempo del evento agudo, tto con anti Vitamina K, deficiencia de Vit K, hepatopatía, TRH, anticonceptivos orales, embarazo, sindrome nefrótico, CID, hemólisis, presencia de fibrina. Método coagulométrico es interferido por presencia de IL. Excluir estas condiciones. Repetir el estudio. FR interfiere el método inmunoturbidimétrico IL positivo interfiere el método

Interpretación de los Resultados Test

Resultado del Test

Considerar

IL

Positivo

Se repite en 12 semanas para confirmar

ACA

Negativo

Sugerir IL si no fue solicitado; repetirlo en 12 semanas si la clínica es sugestiva

ACA

Positivo

Repetir en 12 semanas para confirmar

Incluir comentarios en el informe interpretando los resultados, advirtiendo posibles interferencias por medicación, status del paciente, etc. Sugerir repetir el estudio alterado; completar con otros test, etc.

CONCLUSIONES •Determinar (Laboratorio + Médico) la necesidad clínica de realizar el estudio, al paciente adecuado y en el momento correcto •Estricto Control de Variables Preanalíticas

•Estricto Control de Etapa Analítica •Correcta interpretación de los resultados, incluir conclusión del estudio en el informe.

CONCLUSIONES • Guiar en la interpretación de los resultados considerando las limitaciones e interferencias de los test, las variables preanalíticas, analíticas y post analíticas, sugerir como proseguir el estudio • Repetir el resultado alterado • Estudiar a la familia en caso de trombofilias hereditarias (Laboratorio + Médico) • Tener presente las Implicancias psico-sociales, laborales, obra social, económicas, etc de los resultados sobre el paciente y su entorno