EL SIGNIFICADO AMBIENTAL DE LAS PRUEBAS DE BIODEGRADABILIDAD, Y UN ENSAYO RECOMENDADO PARA AMERICA LATINA

Cardinale Pizani Pablo*, Bookland Elizabeth A, Cowan Christina E, Larson Robert J Procter and Gamble Latinoamericana, M108 P.O.Box 020010. Miami, Fl 33102. EE.UU. La biodegradación es definida como el proceso de degradación microbiana de sustancias orgánicas complejas en sustancias más sencillas. La biodegradación puede ser primaria o última. La biodegradación primaria se refiere a la desaparición de la sustancia original, y por lo tanto a los estadios iniciales de este proceso. La biodegradación completa o última se refiere al proceso mediante el cual se lleva a cabo la transformación total de una sustancia orgánica compleja en CO2, CH4, y constituyentes del material celular (biomasa). Los beneficios ambientales de una biodegradación completa, incluyen concentraciones ambientales más bajas, niveles más altos en los márgenes de seguridad, y la ausencia de residuos o metabolitos intermedios persistentes, que pudieran acumularse en algún compartimiento del ambiente. En América Latina la necesidad de establecer ensayos de biodegradabilidad ha sido reconocida ya por muchos años. Varios países latinoamericanos están en el proceso de desarrollo e implementación -o ya han implementado- criterios y pruebas de ensayo para determinar el grado de biodegradabilidad de sustancias orgánicas. Ha habido una marcada tendencia a la simple adopción de pruebas desarrolladas para países industrializados. Nos preocupa esta práctica, ya que la vasta mayoría de las aguas residuales domésticas latinoamericanas no son tratadas, como ocurre en la mayoría de los países industrializados. Estas diferencias en el tratamiento de las aguas residuales, requiere una metodología para los ensayos de biodegradabilidad que refleje el potencial real de biodegradabildad bajo las condiciones de descarga prevalentes en América Latina. En este reporte: 1) Proveeremos los fundamentos y bases técnicas de las pruebas de biodegradabilidad; 2) Explicaremos el significado ambiental de la determinación de la biodegradabilidad primaria y última; y 3) Presentaremos argumentos que apoyen el criterio de la realización de estas pruebas en ingredientes individuales, en vez de en formulaciones complejas o productos terminados, cuando se intenta evaluar la seguridad ambiental de productos de consumo masivo. Basándonos en lo anteriormente dicho, proponemos una metodología aplicable a la situación Latinoamericana para determinar la biodegradabilidad de sustancia orgánicas. Finalmente, colocaremos el concepto de biodegradabilidad dentro del contexto más amplio de Análisis de Riesgo Ambiental (ARA). Palabras clave: biodegradabilidad, ensayo, producción de CO2, SAAM, ISO9439. Introducción

Un área importante dentro de la gerencia ambiental de sustancias químicas a nivel mundial, es la del Análisis de Riesgo Ambiental (ARA), que determina la seguridad ambiental de sustancias químicas. Cowan et al. (1995), describe como conducir un ARA para productos de consumo masivo. Hay dos tipos de información que necesita ser recolectada para conducir un ARA. El primer tipo de información determina el efecto de la sustancia sobre organismos representativos del ecosistema. Para esto existen diversos bio-ensayos que predicen las concentraciones ambientales capaces de tener efectos letales y/o crónicos (p.e. LC50) sobre especies indicadoras. Los datos obtenidos de estas pruebas son usados para predecir la concentración que no producirá ningún efecto letal en el medio ambiente, PNEC (Predicted No-effect Concetration). El segundo tipo de información requerido determina el destino final de la sustancia química de interés, y se refiere a la predicción o medición del uso, descarga, y propiedades ambientales de la sustancia (Holman, 1981). Estas propiedades incluyen volatilización, absorción, solubilidad, degradación física/química y biodegradabilidad. La degradación tanto físico/química como biológica es importante porque reduce la concentración ambiental de la sustancia original. La biodegradación, por otra parte, reduce tanto la masa como la concentración, y por ende, es el proceso más eficiente de remoción de una sustancia del ambiente. También existen diversos ensayos estándar para determinar tanto la biodegradabilidad como otras propiedades relevantes al destino final de una sustancia química en el medio ambiente. Los datos obtenidos de estas pruebas son utilizados para predecir la concentración ambiental de la sustancia, PEC (Predicted Environmental Concentration). Finalmente, dentro del ARA se hace una "Caracterización del Riesgo", al calcular el cociente de riesgo: PEC/PNEC. Brevemente, si este cociente es menor que uno, la sustancia es considerada segura para el ambiente. Es por esto, que el desarrollo y entendimiento de los ensayos de biodegradabilidad son cruciales para los ARA y las buenas prácticas de gerencia ambiental. Muchos países en Latinoamérica, están en el proceso de implementación, o ya han implementado, ensayos de biodegradabilidad (Tabla 1) Tabla 1. Ensayos de Biodegradabilidad Usados en Latinoamérica País Argentina Brasil México Venezuela

1 Instituto Estatal 2 Instituto de Normalización Industrial/Privado 3 Obligatorio

Año 1994 1995 1995 1995

Organización IRAM2,4 Min. San.1,3

4 COVENIN1,3 4 Voluntario SAAM = Substancias Activas al Azul de Metileno TCO2 = CO2 Teórico

Método Base AFNOR 73-265/83 ASTM D2667 ISO 9439 ASTM D2667

Medición 70% Red. de DQO 90% Red. de SAAM 70% Red. TCO2 90% Red. de SAAM

DQO = Demanda Química de Oxígeno. Red = Reducción

La principal preocupación en nuestros países es que la mayoría de las pruebas para determinar la biodegradabilidad de sustancias orgánicas publicados por agencias nacionales o internacionales como OECD, ASTM, o ISO (ver referencias), se enfocan a la remoción/biodegradación de sustancias orgánicas en plantas de tratamiento. En Latinoamérica, sin embargo, reconocemos que el tratamiento de aguas domésticas residuales no prevalece; y las aguas domésticas residuales son descargadas a pozos sépticos o directamente a los suelos o aguas superficiales. Por lo tanto, los ensayos diseñados para determinar la biodegradabilidad de una sustancia en plantas de tratamiento avanzado, no son representativos para nuestra región. Es necesario modificar y adaptar los métodos

internacionales a nuestras limitaciones y necesidades, para de esta forma, poder obtener los datos apropiados para determinar el riesgo ambiental de sustancias químicas dentro de los sistemas de descarga prevalentes en América Latina. El propósito de este trabajo es el de proveer los fundamentos y bases técnicas de las pruebas de biodegradabilidad, así como su aplicación tanto con fines regulatorios como para su uso en análisis de riesgo. Identificaremos también los factores que deben considerarse al adaptar o modificar para Latinoamérica ensayos estándar de biodegradabilidad. En los años 60, debido al uso extensivo de detergentes sintéticos a nivel SO 3 Na SO 3 Na mundial, organismos internacionales desarrollaron pruebas de biodegradabilidad para surfactantes sintéticos. El principal objetivo de estas pruebas era el diferenciar entre el Alquilbenceno Sulfonato Ramificado (ABS - Fig. 1b) y el Alquilbenceno Sulfonato Lineal (LAS - Fig. 1a). El ABS era el surfactante más comúnmente utilizado entonces, y debido a su ramificación en la cadena alquílica, se biodegradaba muy lentamente, produciendo problemas de espuma en el ambiente. Por otra parte, el LAS, gracias a su cadena alquílica lineal, se biodegrada rápidamente. Los dos primeros C 13 ABS C 12 LAS métodos establecidos por la OECD (OECD 1971

(a)

y 1976), median la desaparición del surfactante original, es decir su biodegradabilidad primaria. Este tipo de pruebas tenían sentido entonces, pues nuestro entendimiento del proceso de biodegradación apenas comenzaba, y nuestra principal preocupación era que la espuma desapareciera de las aguas superficiales. Sin embargo, la degradación primaria no nos dice nada sobre el destino final de una sustancia; si se mineraliza completamente, o forma substancias intermedias recalcitrantes. Es por esto que en los 80's, el enfoque en las pruebas de biodegradabildad se cambió de primaria, última o completa. La OECD estableció distintos tipos de ensayos de biodegradabilidad última, denominados biodegradabilidad Inmediata (Ready), Inherente (Inherent), y de Simulación (Simulation). Estas pruebas han sido adoptadas a nivel mundial, y forman las bases para determinar la biodegradabilidad de sustancias orgánicas en EE.UU., Europa y Canadá, así como institutos internacionales de normalización, como ISO. Los ensayos de biodegradabilidad Inmediata, sirven como prueba inicial, son relativamente simples, baratos, y se aproximan a las condiciones microbianas comúnmente encontradas en aguas superficiales. Resultados falsos positivos son muy poco probables, pero resultados falsos negativos son bastante comunes. Los ensayos de biodegradabilidad Inmediata más conocidos son la Prueba de Sturm y el MITI-I (Karsa y Porter, 1995). Los ensayos de biodegradabilidad Inherente o Predictivos, se realizan con niveles más altos de biomasa y nutrientes que la pruebas de biodegradación Inmediata, y por lo tanto tienen una mayor probabilidad de predecir el potencial que tiene una sustancia de ser biodegradada en ambientes con biomasas microbianas altas, como por ejemplo en lodos activados. Un resultado positivo indica que la sustancia es removida, ya bien sea por absorción o biodegradación, de ambientes aclimatados con biomasas microbianas altas, y la posibilidad de resultados falsos negativos es muy baja. Los ensayos de biodegradabilidad Inherente más conocidos son el SCAS, MITI-II, y Zahn-Wallens (Karsa y Porter, 1995). Finalmente existe un último nivel conocido como ensayos de Simulación o Confirmatorios, que tienen el potencial más alto de predecir, sin errores, si una sustancia es biodegradada en plantas de tratamiento; estas pruebas son mucho más difíciles de ejecutar que las anteriores, y sus resultados tienen poca aplicación a situaciones de descarga sin tratamiento. En general, las fortalezas y limitaciones de la pruebas Inmediatas e Inherentes tienden a compensarse, y por esto estas pruebas son comúnmente realizadas en secuencia, para de esta manera, poder desarrollar un mejor entendimiento de las características de biodegradación y desaparición de una sustancia en el ambiente (Larson, 1979). Figura 1.

(b)

Alquilbenceno Sulfonato (a) Lineal, (b) Ramificado

Perspectivas Regulatorias:

Creemos que en Latinoamérica, una combinación de determinaciones de biodegradabilidad primaria y última, proveen la mejor estrategia para satisfacer tanto las necesidades de ARA, como las reguladoras o fiscalizadoras. El obtener información sobre la biodegradabilidad primaria de los surfactantes es importante porque la desaparición del compuesto original coincide con la desaparición de el poder surfactante y por ende su poder espumante y su toxicidad acuática. De la misma manera, los muestreos de campo generalmente quantifican la concentración ambiental de la sustancia original. A través de los años, la determinación de la biodegradabilidad primaria ha demostrado ser un buen sistema normativo, específico para cada sustancia o tipo de sustancia, a través de la determinación de la presencia del compuesto original -o una sustancia indicadora- en el ambiente, y de correlacionar datos de muestreos ambientales, con datos obtenidos en el laboratorio. Por otra parte, a pesar de que la determinación de la biodegradabilidad última de una sustancia es más relevante desde el punto de vista de ARA y un óptima protección ambiental, los resultados de estas pruebas son imposibles de correlacionar con datos de muestreos en el ambiente. Como especificaremos en la siguiente sección, las pruebas de biodegradabilidad última determinan parámetros "no específicos" como CO2, Oxígeno, o Carbono Orgánico Disuelto (COD). Prueba de Biodegradabilidad Recomendada para Latinoamérica: Modificación de la Norma ISO9439.

El principio de todos los ensayos que existen para determinar la biodegradabilidad de una sustancia consiste en el exponer dicha sustancia a una población mixta de microorganismos ambientalmente representativa, y medir su desaparición como consecuencia de la actividad de estos microorganismos. Para lograr esto, todas las pruebas de biodegradabilidad incluyen: 1) Inóculo de micro-organismos descomponedores, 2) Una sustancia a probar y una forma de detectar su desaparición, y 3) Tiempo, que en la mayoría de los ensayos ha sido establecida arbitrariamente en 28 días.

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Recomendamos una adaptación de la prueba de biodegradabilidad Inmediata descrita en la Norma Internacional ISO 9439 (1990). La modificación más significativa aquí propuesta, involucra la medición de tres parámetros, en vez de uno, al determinar la biodegradabilidad de sustancias orgánicas. Éstos son: producción de CO2, desaparición del COD, y un indicador de biodegradación primaria (p.e. SAAM). Este ensayo puede ser utilizado para determinar la biodegradabilidad de cualquier sustancia orgánica no-volátil, soluble o insoluble, conocida o no. Así mismo, esta prueba permite detectar efectos tóxicos o inhibitorios que la sustancia a probar pueda tener sobre el inóculo, algo crucial para eliminar resultados falsos negativos. También la ISO 9439, especifica los pasos para obtener y preparar el inóculo con aguas domésticas residuales, y permite tanto su pre-acondicionamiento como su pre-exposición. Esta prueba se basa en la medición del CO2 producido durante la biodegradación de la sustancia a probar, al pasar el gas proveniente de las cámaras o botellas experimentales a través de una solución de hidróxido de bario (Ba(OH)2), donde el CO2 es precipitado como carbonato de bario (BaCO3). Se utiliza una solución de 0.024N de Ba(OH)2, cuya normalidad es calibrada a través de una titulación contra un estándar conocido. Esta calibración se debe realizar constantemente, pues la normalidad del Ba(OH)2 cambia al entrar en contacto con CO2. Con una titulación por retroceso de la solución de (Ba(OH)2) con 0.05N ácido clorhídrico (HCl), la cantidad de CO2 producida se determina al sustraer de los resultados de esta titulación, los resultados de una titulación similar de un control blanco. Como discutiremos posteriormente, el control blanco, no posee sustancia a probar, y la producción de CO2 en éste, se considera línea base. La producción de CO2 de todas las cámaras o botellas experimentales se mide cada dos días durante la completa duración de la prueba, y se compara con la producción de CO2 teórica (TCO2) si se asume una completa degradación de la sustancia. La producción teórica de CO2 se calcula utilizando la siguiente ecuación (ec. 1): TCO2 = 44/12 x Conc. de C de la Sustancia Experimental x Volumen (ec.1) Para obtener una curva de la tasa de biodegradación se grafica el porcentaje de CO2 producido en referencia al TCO2 versus el tiempo transcurrido. Tradicionalmente en este ensayo una sustancia es considerada biodegradable si >60% del TCO2 es producido en 28 días. Se asume que el carbono restante (40%) ha sido incorporado como material celular del inóculo, siempre y cuando el COD haya sido reducido a 60% de la producción teórica de CO2 y un > 90% de desaparición del COD original, ya que esto indicaría o un inóculo pobre, o condiciones experimentales desfavorables para la actividad bacteriana. Sustancias de referencia comúnmente utilizadas incluyen glucosa, acetato de sodio, benzoato de sodio, y anilina. Para determinaciones de la biodegradabilidad de surfactantes aniónicos, también se recomienda utilizar como sustancias de referencia, muestras comerciales de grado analítico de C12-LAS y ABS • Concentración de la Sustancia a Probar: Otro factor que afecta los resultados de las pruebas de biodegradabilidad, es la concentración de la sustancia a probar utilizada para la dosis de las botellas experimentales. La sustancia a probar puede ser tóxica para el inóculo a las concentraciones aplicadas, produciendo resultados falsos negativos. Esta es una causa común de resultados falsos negativos en determinaciones de biodegradabilidad de surfactantes. Por ejemplo, el LAS es tóxico en agua de río a concentraciones de 10 mg/l (Larson y Perry, 1981); sin embargo para la mayoría de los surfactantes, su concentración en aguas superficiales es menor de 1 mg/l, inclusive en aquellos lugares donde no existen sistemas de tratamiento de aguas residuales (Fischer 1980; Gerike et al. 1989). Por lo tanto para realmente simular si una sustancia es biodegradable en el ambiente, se deben utilizar concentraciones comparables a aquellas encontradas en el ambiente. Para surfactantes se recomienda aplicar una dosis superior a 1 mg/l, pero que no exceda las concentraciones que pudieran ser tóxicas para el inóculo. Hemos utilizado exitosamente un rango entre 5-10 mg/l, con bajas concentraciones de COD. Generalmente se pueden utilizar concentraciones entre 10 a 20 mg/l sin observar efectos inhibitorios o tóxicos al inóculo. La toxicidad potencial de una sustancia se puede determinar comparando un conteo de bacterias viables de un cultivo de una muestra de sustancia de referencia conocida como no tóxica, con un conteo similar de un cultivo obtenido de las botellas experimentales con la sustancia(s) a probar. Una manera más sencilla de detectar efectos tóxicos al inóculo, es mediante la adición de un "spike" de glucosa al final del ensayo; si la sustancia a probar a tenido efectos tóxico o inhibitorios sobre la población bacteriana del inóculo, no habrá degradación de la glucosa, o ésta será muy limitada. También es una indicación de efectos tóxicos de la sustancia experimental sobre el inóculo, si la respiración en los controles blancos, es superior a la de las botellas experimentales. • Duración de la Prueba/Muestreo: Como esta prueba determina la biodegradabilidad Inmediata de sustancias orgánicas, utiliza niveles bajos de biomasa y concentraciones de la sustancia a probar relativamente altas. Bajo estas condiciones, la tasas de biodegradación obtenidas son generalmente lentas, y es por esto que este ensayo requiere

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aproximadamente cuatro semanas (28 días). La duración exacta del ensayo es arbitraria, y lo dicta básicamente la naturaleza de la sustancia a probar y las condiciones experimentales. En la mayoría de los casos se recomienda continuar el ensayo, hasta que la producción de CO2 llegue a un plateu (< 3%/semana). La frecuencia con la cual se toman la alicuotas para las determinaciones de CO2 y de SAAM (u otra medición de biodegradación primaria dependiendo del caso), viene dada por la aparición del precipitado blanco (BaCO3) en las trampas de Ba(OH)2 colocadas en serie después de cada cámara experimental (Fig. 2). • Interpretación de los Resultados: : Los resultados de la biodegradación primaria de la sustancia, generalmente son reportados de forma gráfica, indicando el porcentaje de % desaparición del compuesto original a través del tiempo (Fig. 3). De este S A gráfico se obtiene la tasa de biodegradación primaria, utilizando la ecuación de A primer orden (ec. 2): M I N I C I A L

k = constante

a = grado de biodegradación

Tiempo (días)

Figura 3. Biodegradabilidad Primaria, SAAM.

y = a e-k1x

(ec. 2)

Donde, y es el porcentaje de desaparición de la sustancia indicadora (p.e. SAAM), a es la asíntota de la curva (%), x es el tiempo en días, y k1 es la tasa de desaparición o biodegradación primaria. De la misma manera, los resultados de la biodegradación última se reportan graficando el porcentaje del TCO2 producido versus el tiempo en días (Fig. 4). El porcentaje de producción de TCO2 se utiliza para calcular la tasa de biodegradación utilizando la ecuación 1 (ec. 3):

P r o d u c c i ó n

y = a (1-e-k2(x-c))

(ec. 3) Donde, y es el porcentaje acumulativo de la producción de CO2, a es la asíntota de la curva (%), x es el tiempo en días, c es el período latente (días), y k2 es la tasa de primer orden (1/días) de biodegradabilidad k = constante última. de La vida media de biodegradación (VMB) de la sustancia se calcula utilizando la CO2 c = periodo latente ( % T C O 2) ecuación (ec. 4): VMB = ln2/k = 0.67/k (ec. 4) Tiempo (días) Donde k es la tasa de biodegradación, ya bien sea primaria o última dependiendo del caso. Figura 4. Biodegradabilidad Última Estos resultados son entonces usados en los ARA (Larson y Cowan, Producción de CO2 1995). Cuando los resultados de biodegradabilidad última indican que la sustancia experimental es completamente mineralizada, k1 debe ser utilizada en los ARA, ya que el cociente de riesgo se hace con datos referentes a la sustancia original. En este caso k1 y k2 son similares. Si por lo contrario, la sustancia no se biodegrada completamente, entonces se deben conducir análisis de riesgo ambiental, tanto para la sustancia original, como para todos aquellas sustancia intermedias. a = grado de biodegradación

Ensayo de Biodegradabilidad sobre Productos Terminados versus Ingredientes Individuales:

Generalmente, las primeras preguntas referentes a la aplicabilidad de este tipo de ensayos sobre productos de consumo masivo, están dirigidos a las razones por las cuales se realizan sobre ingredientes individuales y no sobre el producto terminado. Sin embargo, al entender el destino final y los mecanismos involucrados en el comportamiento de una mezcla compleja (p.e. producto terminado) una vez que ésta ha sido descargada al ambiente, así como también las inmensas dificultades que implica la interpretación de datos obtenidos de pruebas de biodegradabilidad realizadas sobre mezclas, el lector entenderá las razones por las cuales estos análisis se realizan sobre ingredientes individuales. Cualquier formulación de un producto de consumo masivo contiene una gran variedad de ingredientes con propiedades individuales. Una vez que éste producto es descargado al medio ambiente, cada uno de los ingredientes que lo constituyen forman parte de una matriz compleja en las aguas residuales. El destino final de cada uno de estos ingredientes dependerá de sus propiedades individuales, fisicoquímicas y/o biológicas. Es decir que estos pueden ser transformados por procesos de degradación fisicoquímica (hidrólisis, fotodegradación) o biológica (biodegradación), o removidos de la fase acuática por procesos de absorción o volatilización. Por ende, las propiedades individuales de cada ingrediente, y su potencial para ser degradado biológicamente, nos proveen la información más relevante para estimar el destino final de una sustancia en el medio ambiente. De cualquier manera, incluso quisieramos realizar ensayos de biodegradabilidad sobre productos terminados, no existe ninguna forma práctica o posible de interpretar los datos obtenidos. Por ejemplo, al realizar una prueba de biodegradabilidad de un producto que contuviera tanto LAS como ABS, se obtendrían resultados de una biodegradabilidad incompleta. Sin embargo, sería imposible deducir cual ingrediente es el responsable de este resultado Existen alternativas analíticas para la realización de las pruebas de biodegradabilidad sobre extractos de los productos finales. Estas no son recomendables, pues introducen una serie de solventes y otros reactivos, que a través de los años han demostrado confundir los resultados, por razones de contaminación cruzada, toxicidad, entre otros. Por ejemplo, la extracción alcohólica que se establece en el método brasileño (Tabla 1), resulta en la obtención de un extracto con todos los ingredientes del detergente que se disuelven en alcohol, y no sólo los surfactantes aniónicos como el ensayo pretende. Así mismo, contaminantes presentes en el alcohol, pueden producir efectos inhibitorios para el inóculo. Las agencias regulatorias a nivel mundial que exigen pruebas de biodegradabilidad, lo hacen sobre ingredientes individuales y no sobre productos terminados. A su vez establecen un sistema de confianza y cooperación con las

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compañías manufactureras, donde se les asegure que la formulación del producto que llega al mercado, posee realmente los ingredientes reportados. Recomendaciones y Conclusiones:

Los criterios que recomendamos sean utilizados al desarrollar, adaptar, o elegir un ensayo de biodegradabilidad relevante a las situaciones de descarga prevalentes en Latinoamérica, son: • La fuente del inóculo debe ser de aguas domésticas residuales, pre-acondicionada mediante aireación, para reducir el COD y aumentar el numero de bacterias por ml. (aproximadamente. 20 mg/l COD, 103-105 UFC/ml, y 100-300 mg/l SS). • Para la determinación de la biodegradabilidad de surfactantes o sustancias comúnmente usadas (p.e. LAS), la pre-exposición puede no ser necesaria, ya que debido a sus presencia en las aguas residuales domesticas, el inóculo ha sido previamente expuesto a la sustancia. La pre-exposición es necesaria al experimentar con sustancia nuevas. • Si se experimenta con surfactantes, su concentración en las botellas experimentales debe estar entre 5-10 (máximo 20) mg/l, y se debe eliminar la posibilidad de efectos tóxicos o inhibitorios. • La duración del ensayo debe ser por lo menos 28 días. • Se deben usar controles blancos y sustancias de referencia (p.e. glucosa, anilina). • Para efectos regulatorios y de ARA, se deben medir la biodegradabilidad primaria y última. • Un surfactante es considerado biodegradable en una prueba de biodegradabilidad primaria si se mide un >90% de desaparición del compuesto original, o de la sustancia indicadora. Así mismo, éste se considera biodegradable si en una prueba de biodegradabilidad última como la aquí propuesta, produce el >60% del TCO2, siempre y cuando la concentración final de COD sea