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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k kInt. Cl. : A61K 39/02

11 N´ umero de publicaci´on:

2 112 274

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˜ ESPANA

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 91911598.0 kFecha de presentaci´on : 24.05.91 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 597 852 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 25.05.94

T3

86 86 87 87

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54 T´ıtulo: Vacuna contra la pneumon´ıa en cerdos y m´ etodo para la preparaci´ on de la misma.

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30 Prioridad: 29.05.90 US 530669

31.08.90 US 575921 26.12.90 US 634237

Five Giralda Farms Madison, New Jersey 07940, US

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72 Inventor/es:

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74 Agente: Isern Jara, Jaime

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

01.04.98

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

01.04.98

ES 2 112 274 T3

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73 Titular/es: American Cyanamid Company

Aviso:

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Dayalu, Krishnaswamy, I.; Peetz, Richard, H.; Frantz, Joseph, C.; Roberts, David, S.; Swearingin, Leroy, A. y Kemmy, Richard, J.

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 112 274 T3 DESCRIPCION Campo de la invenci´ on 5

Esta invenci´ on hace referencia a las vacunas contra la infecci´on causada por los agentes pat´ogenos del g´enero Mycoplasma y m´ as particularmente, por las bacterinas u ´tiles como agentes profil´acticos para inhibir la infecci´ on causada por la Mycoplasma, en particular la Mycoplasma hyopneumoniae. Fundamento de la invenci´ on

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La Mycoplasma hyopneumoniae es un agente pat´ ogeno respiratorio ubicuo en el cerdo que causa la neumonia micoplasmal en el mismo (MPS). La MPS tiene lugar en el mundo entero y se considera como una de las enfermedades m´ as frecuentes y m´as importantes desde el punto de vista econ´omico, que afecta al cerdo. La transmisi´on de M. hyopneumoniae se produce aparentemente a trav´es del contacto directo con secreciones infectadas del tracto respiratorio o bien gotitas de aerosol. Se ha identificado como el pat´ ogeno primario en el complejo enzo´ otico de la neumon´ıa. Se cree que esta enfermedad tiene un coste superior a los 100 millones de d´olares anuales, debido principalmente a sus efectos adversos en los animales afectados. La infecci´on por M. hyopneumoniae da lugar a una infecci´ on cr´onica que causa una tos seca persistente y un crecimiento mal desarrollado, provocando s´ıntomas claros de enfermedad en la “etapa de crecimiento y en la etapa final”, es decir, a las 6 semanas de edad o bien m´as tarde, en los cerdos. Puede darse una lesi´ on seria del pulm´ on en el animal infectado, y/o puede aparecer la muerte a los 4 hasta los 6 meses de edad. Puesto que los casos de aparici´on natural de la MPS son infecciones mixtas en las que intervienen micoplasmas, bacterias, virus y par´ asitos, la muerte del animal se debe frecuentemente a infecciones bacterianas secundarias, v´ıricas o causadas por otras infecciones patog´enicas. En los veinticinco a˜ nos desde el descubrimiento del micoplasma como el causante de la neumon´ıa enzo´otica en 1965, los investigadores han estudiado una diversidad de medios para controlar y tratar esta enfermedad y desarrollar una vacuna segura y eficaz contra la Mycoplasma hyopneumoniae. La protecci´on contra la infecci´on inducida por los candidatos de la vacuna se mide preferiblemente por, la reducci´ on del n´ umero de l´ obulos pulmonares con lesiones, la reducci´on del porcentaje de l´ obulos pulmonares con lesiones, la reducci´ on de las cifras medias de lesi´ on pulmonar, la reducci´on de los valores de la lesi´ on microsc´opica y la reducci´on de la gravedad de la infecci´ on de la M. hyopneumoniae de acuerdo con una prueba de anticuerpos fluorescentes. Varias vacunas experimentales han dado lugar a unos resultados que no llegan a ser o´ptimos. Los estudios han demostrado que se desarrollaba una fuerte inmunidad durante el transcurso de la MPS inducida experimentalmente. Sin embargo, si se administra el tejido pulmonar neum´ onico como un ant´ıgeno, los animales son incluso m´as susceptibles al est´ımulo. Los cultivos formalinizados de M. hyopneumoniae han demostrado ser no protectores. [Ver, tambi´en, p.ej. C.A. Brandly y cols, eds., “Avances en la Ciencia Veterinaria y Medicina Comparativa”, vol. 17, Academic Press, NY (1973) y referencias citadas all´ı, R.F.W. Goodwin y cols, A. Hyg. Camb., 67:465 (1969)]. Los extractos de M. hyopneumoniae en ´eter o dodecilsulfato s´odico (SDS), y un producto repetido de congelaci´ on y deshielo han demostrado dar una protecci´on significativa contra el est´ımulo del homogenado pulmonar [K.M. Lam y cols, Am.J.Vet.Res., 32:1737 (1971)]. G. Christianson y cols. (Chemical Abstracts, 1980, Abstract Number 199756) revelan que la etilenimina binaria no era suficientemente satisfactoria para inactivar los contaminantes del micoplasma en suero. La FR-A 2.073.358 informa sobre las vacunas multivalentes y sus m´etodos de preparaci´ on. En particular, el tipo inicial que incluye la FR-A-2.073.358 y el Chemical Abstracts, 1980, Abstract Number 19975p no habla sobre un componente de la vacuna que comprenda la M. hyopneumoniae inactivada con etilenimina binaria a un nivel de dosificaci´ on de al menos 5 x 108 CCU, siendo dicho componente capaz de inducir una respuesta inmunol´ogica en el cerdo vacunado contra la M. hyopneumoniae. Las c´elulas sonicadas de M. hyopneumoniae en Tween 80 y aceite de parafina daban lugar a unos buenos t´ıtulos de hemaglutinaci´ on indirecta (IHA) en la sangre, colostro y leche cuando se inyectaban en la gl´ andula mamaria (S. Durisic et al, Acta Vet. (Beograd), 25(4):189-194 (1975)). Las preparaciones de c´elula entera y los sobrenadantes sin c´elulas han demostrado tener u ´nicamente un caracter parcialmente protector [R.F. Ross y cols., Am. J.Vet.Res., 45(10): 1899 (1984)]. Las membranas del plasma de c´elulas descompuestas s´ onicamente, reforzadas con Al2 (OH)3 o agarosa, daban una buena protecci´on pasiva [M. Kobisch y cols, Ann. Inst. Pasteur/Immunol., 138: 693-705 (1987)].

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ES 2 112 274 T3 Una cepa avirulenta, viva de LKR de M.hyopneumoniae tambi´en daba una buena protecci´ on a los cerdos contra est´ımulos con una cepa virulenta de M. hyopneumoniae (L.C. Lloyd y cols, Abstract 4593 en Bacteriology and Bacterial Diseases, del Australian Vet.J. 66 (1):9-12 (1989)). 5

La infecci´on por M. hyopneumoniae actualmente se controla, en parte, con diversas clases de antibi´ oticos, como la tetraciclina, lincomicina y tiamulina. Sin embargo, los antibi´ oticos tienen un valor terap´eutico limitado ya que no impiden el que aparezca una infecci´ on, y se pueden desarrollar lesiones pulmonares una vez finalizado el tratamiento. La presencia de pat´ogenos secundarios tambi´en dificulta la selecci´on del antibi´ otico apropiado (R.Landon, Topics in Vet.Med., 1(1):14-21 (1990)).

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Otros m´etodos actualmente utilizados para reducir el impacto de las enfermedades respiratorias cr´onicas causadas por la M.hyopneumoniae, son los sistemas m´ınimos contra la enfermedad como los sistemas brit´anicos y suecos y la cochiquera para cerdas mayores. Se recomienda la minimizaci´on del esfuerzo o carga, las condiciones ´optimas de tratamiento y todos los sistemas globales internos y externos de producci´on. Se necesita pues una vacuna eficaz contra la M.hyopneumoniae, que proporcionar´ıa protecci´on contra el est´ımulo de la M.hyopneumoniae y reducir´ıa tambi´en de forma significativa la morbididad y mortalidad de los pat´ ogenos respiratorios secundarios, como la Pasteurella multocida.

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Resumen de la invenci´ on

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En un aspecto, la invenci´on hace referencia a una composici´on u ´til para vacunar cerdos contra la Mycoplasma hyopneumoniae. Esta composici´on comprende organismos inactivados de M.hyopneumoniae en un medio aceptable desde el punto de vista farmac´eutico, estando los organismos presentes en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunol´ ogica en los cerdos, de protecci´ on contra el est´ımulo de la M.hyopneumoniae. En otro aspecto, la presente invenci´ on aporta una composici´ on de vacuna que comprende la composici´on inactivada de la M.hyopneumoniae ya mencionada, en combinaci´ on con otros componentes adicionales de la vacuna, que incluyen uno o m´ as componentes capaces de inducir protecci´on contra la rinitis atr´ ofica que sigue a la infecci´on por P.multocida, y dem´as agentes infecciosos para el cerdo. Dichas vacunas pueden incluir cantidades inmunog´enicas de uno o m´ as de los siguientes componentes de las vacunas: un toxoide de P.multocida libre de c´elulas, soluble, estable, una bacterina entera de Pasteurella multocida con toxoide enlazado a la c´elula, una bacterina B. bronchiseptica o bien un extracto de bacterina Erysipelothrix rhusiopathiae, una bacterina Actinobacillus pleuropneumoniae, una bacterina Haemophilus parasuis, y/o componentes v´ıricos de las vacunas, como procedentes de un virus Pseudorabies. Otros componentes convencionales de las vacunas pueden a˜ nadirse tambi´en a las composiciones de las vacunas de esta invenci´on.

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Como otro aspecto adicional, la presente invenci´on proporciona un m´etodo para fabricar los componentes de las vacunas descritos con anterioridad. El componente de la vacuna M. hyopneumoniae se prepara siguiendo una serie de pasos que incluyen el pre-tratamiento del medio de cultivo con resinas de intercambio i´ onico, como la resina Amberlites, que aumenta el contenido de ox´ıgeno disuelto del cultivo inoculado entre un 20 y un 40%, e inactiva el cultivo con un agente de inactivaci´ on seleccionado. Otro de los aspectos de esta invenci´ on incluye un m´etodo para aumentar la resistencia de los cerdos o puercos a la infecci´on causada por M. hyopneumoniae, que comprende la administraci´ on de una cantidad eficaz de las composiciones de las vacunas de la presente invenci´on a los cerdos.

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Otro aspecto de esta invencion incluye un m´etodo para proteger cerdos ante la infecci´on por M. hyopneumoniae y otras infecciones patog´enicas que comprenden la administraci´ on secuencial o simult´anea a un animal de una cantidad eficaz de la vacuna de M. hyopneumoniae y una o m´ as vacunas que contengan un ant´ıgeno adicional, p.ej., de pat´ogenos como los identificados con anterioridad. 55

Otros aspectos y ventajas de la presente invenci´ on se describen en la siguiente detallada descripci´on de las estructuras preferidas de la presente invenci´ on. Descripci´ on detallada de la invenci´ on 60

La presente invenci´on aporta los componentes de las vacunas, las formulaciones de las vacunas y los m´etodos para su preparaci´ on y uso en cerdos como una ayuda para prevenir la infecci´ on por M. hyop3

ES 2 112 274 T3 neumoniae. Los componentes de las vacunas y las vacunas de esta invenci´ on proporcionan protecci´ on frente al est´ımulo de la M. hyopneumoniae con una cepa tipo salvaje as´ı como con otras cepas virulentas conocidas. La propia invenci´ on es tambi´en capaz de reducir de forma significativa la morbididad y mortalidad de agentes pat´ ogenos respiratorios secundarios, como la Pasteurella multocida. 5

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Las cepas de Mycoplasma hyopneumoniae u ´tiles para preparar las vacunas de la presente invenci´ on pueden ser aisladas del cerdo infectado con cepas tipo salvaje o bien otras cepas conocidas que causan neumonia micoplasmal en los cerdos. Otras cepas conocidas de M. hyopneumoniae, tanto virulentas como no virulentas pueden ser u ´tiles en las composiciones de esta invenci´on. Las cepas u ´ tiles se pueden obtener de recopilaciones acad´emicas o comerciales, como el American Type Culture Collection en Rockville, Maryland, U.S.A. Puede prepararse un componente de la vacuna de acuerdo con esta invenci´ on mediante la inoculaci´ on de un medio capaz de soportar el crecimiento del Micoplasma, en particular del M. hyopneumoniae, con un almac´en de semillas seleccionado de M. hyopneumoniae. Un medio de cultivo seleccionado puede incluir medios conocidos por aquellos expertos en la tecnolog´ıa de propagar el micoplasma, como los descritos en Freundt, citado anteriormente y otros anteriores. Una formulaci´ on de un medio particularmente deseable para el cultivo de la M. hyopneumoniae se ha descrito en el ejemplo 1 siguiente e incluye el caldo PPLO, el extracto de levadura, el suero inactivado por el calor, el clorhidrato de cisteina, la dextrosa, un antibi´ otico para inhibir el crecimiento bacteriano y un agente opcional que indica el crecimiento y evita cambios excesivos de pH, p.ej., el fenol rojo (fenol-sulfonftale´ına) Preferiblemente, el medio seleccionado se trata previamente con una resina de intercambio ani´ onico, Amberlite (forma clorada). Se cree que esta etapa aumenta el crecimiento de los organismos eliminando los agentes inhibidores. Otros m´etodos convencionales, como la filtraci´on en gel, puede ser tambi´en u ´ tiles en esta etapa de pretratamiento. Esta etapa de pretratamiento se aplica preferiblemente al caldo de cultivo antes de la adici´on de otros componentes del medio y previamente a la inoculaci´on. La exposici´on a la resina de intercambio i´onico puede mantenerse entre una hasta cuatro horas a una velocidad de aproximadamente 500 gramos/10 litros de caldo de cultivo.

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Una vez pretratado el medio, ´este se inocula con una suspensi´on de la cepa seleccionada de M. hyopneumoniae, preferiblemene a una inoculaci´ on del 5-20%. El cultivo se incuba luego a una temperatura comprendida entre aproximadamente 30◦ C y 40◦C. Se prefiere un margen de temperatura entre 35◦ C y 38◦C, siendo los 37◦ C la temperatura particularmente preferida. 35

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En una realizaci´ on de la invenci´ on particularmente preferida, el contenido de ox´ıgeno disuelto del cultivo se incrementa a un nivel entre un 20% y un 40% de saturaci´ on. Un contenido de ox´ıgeno preferido del cultivo durante la incubaci´ on es el de aproximadamente un 25%. Los cultivos que contienen un contenido de O2 disuelto superior al 20%, producen concentraciones superiores en el organismo. El aumento del contenido en ox´ıgeno disuelto se consigue siguiendo un m´etodo convencional, como el de la aireaci´ on con aire est´eril y agitaci´on. Este paso en especial del cultivo del componente de la vacuna se cree que proporciona elevadas concentraciones de M. hyopneumoniae.

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El pH del cultivo se mantiene neutro a ligeramente alcalino. Se desea que el pH del cultivo se mantenga entre 6,2 y 7,9. Un intervalo de pH m´ as preferible es el de 7,0 ± 0,5. El pH deseado se puede mantener a˜ nadiendo NaOH est´eril cuando sea necesario.

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Los cultivos se incuban durante 36 a 168 horas. M´ as preferiblemente, el periodo de incubaci´ on se sit´ ua entre las 36 y 96 horas, hasta que se consigue un t´ıtulo m´ınimo de 1 x 108 unidades de cambio de color (CCU) en el medio de valoraci´on l´ıquido (A.W. Rodwell y R.H. Whitcomb (1983) en Methods in Mycoplasmology, Vol. 1, Cap´ıtulo 14; Shmuel Razin y Joseph G. Tulley, Eds.). M´ as preferiblemente,el t´ıtulo es de al menos 5 x 108 CCU/ml, y puede ser de hasta 5 x 1010 CCU/ml determinado por CCU o por un ELISA.

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Al final del periodo de cultivo, los organismos se inactivan mediante la adici´on de un conocido agente de inactivaci´on. Dicho agente de inactivaci´on preferido es la etilenimina binaria (BEI). Otros agentes de inactivaci´ on pueden incluir, por ejemplo, el formaldehido o glutaraldehido. El agente de inactivaci´ on se a˜ nade en una cantidad aproximada de 4,0 mM. Una vez a˜ nadido el agente de inactivaci´ on, se incuba el cultivo de nuevo agitando durante al menos 24 horas.

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El agente de inactivaci´ on puede ser retirado o neutralizado siguiendo m´etodos convencionales, y el cultivo puede ser incubado de nuevo durante al menos 24 horas para completar la neutralizaci´ on del 4

ES 2 112 274 T3 agente de inactivaci´on. Una vez inactivado, puede formularse el componente de la vacuna en una vacuna para su administraci´ on a animales.

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La presente invenci´on tambi´en contempla los componentes de la vacuna para su uso en combinaci´on con el componente de la vacuna M. hyopneumoniae descrito con anterioridad. Los componentes de la vacuna, que incluyen las bacterinas inactivadas o bien los toxoides purificados, de uno o m´ as pat´ ogenos, como la Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis y ascaris larva, tambi´en pueden emplearse junto con los componentes de las vacunas descritos con anterioridad en las vacunas de combinaci´on o en los m´etodos terap´euticos que implican la co-administraci´ on secuencial o simult´anea. Dicha vacuna de combinaci´ on se prepara mezclando una cantidad inmunog´enica de M. hyopneumoniae inactivada, tal como se ha descrito, y una cantidad inmunog´enica de una bacterina o toxoide de otro pat´ ogeno con adyuvantes adecuados y veh´ıculos fisiol´ ogicos para su inyecci´on en mam´ıferos. Una terapia de co-administraci´on puede emplear uno o m´ as de los ant´ıgenos formulados con anterioridad en vacunas individuales. La vacuna M. hyopneumoniae y la vacuna seleccionada adicionalmente pueden administrarse a trav´es de las mismas v´ıas de administraci´ on usando diferentes lugares para la administraci´ on. La administraci´ on puede ser secuencial o simult´anea. Las preferencias en cuanto a dichas vacunas de combinaci´on o bien a las terapias de co-administraci´ on de las vacunas incluyen cantidades inmunog´enicas de uno o m´ as de los siguientes componentes de las vacunas: un toxoide de P. multocida libre de c´elulas, soluble, estable, una bacterina entera de Pasteurella multocida con toxoide enlazado a la c´elula, la c´elula entera P. multocida, tipo A y tipo D, una bacterina B. bronchiseptica o bien un extracto de bacterina Erysipelothrix rhusiopathiae. Las combinaciones adicionales de las vacunas con el componente de M. hyopneumoniae de esta invenci´on pueden incluir el ant´ıgeno Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, y el virus Pseudorabies. Estos componentes adicionales pueden ser u ´ tiles en una formulaci´ on de vacuna o en una terapia para cerdos destetados, preferiblemente para una administraci´ on tan prematura como la de 3 a 6 semanas de edad.

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Bas´andose en al menos un est´ımulo, resulta que una co-administraci´ on de vacunas con una vacuna que contenga el componente de la vacuna M. hyopneumoniae y una segunda vacuna que contenga un componente de la vacuna P. multocida al que se hace referencia, evidenciaba que por las respuestas de seroconversi´on no se determinaban efectos inmunosupresores debidos a la vacuna de M. hyopneumoniae en los animales.

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Las vacunas de la invenci´ on se pueden preparar como composiciones farmac´euticas que contienen una cantidad inmunog´enica eficaz del organismo inactivado, como ingredientes activos en un portador aceptable desde el punto de vista farmac´eutico, est´eril y no t´ oxico. Dicha vacuna puede comprender el componente inactivado de la vacuna descrito antes mezclado con conservantes opcionales y emulgentes.

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De modo alternativo o adicional, la M. hyopneumoniae inactivada puede ser adsorbida o mezclarse con un adyuvante convencional. El adyuvante se utiliza como un irritante no espec´ıfico para atraer a los leucocitos o incrementar una respuesta inmune. Dichos adyuvantes incluyen, entre otros, el anfigen, el aceite mineral y la lecitina, el hidr´ oxido de aluminio, el dip´eptido de muramilo y las saponinas como el Quil A. Una realizaci´ on preferida de la vacuna de la invenci´ on contiene una suspensi´ on o soluci´ on acuosa que contiene la cepa inactivada P-5722-3 de M. hyopneumoniae, preferiblemente tamponada a pH fisiol´ ogico, en una forma lista para su inyecci´ on. Se prefiere que la vacuna de la invecci´ on, si se trata de una preparaci´ on farmac´eutica, est´e presente en las formas de dosificaci´on unitaria. Para fines de esta invenci´ on, una cantidad inmunog´enica deseable de organismo inactivado, si se administra como el u ´nico principio activo se sit´ ua entre 5x108 (CCU)y 5 x on se administra preferiblemente en dos dosis de 2 ml, contenidendo 109 (CCU). La vacuna de la invenci´ cada dosis la concentraci´ on deseada. La inmunizaci´ on primaria de los cerditos deber´ıa iniciarse con aproximadamente una semana de edad con una dosis repetida dos semanas m´ as tarde. Para la inmunizaci´ on primaria del cerdo pre˜ nado, se recomiendan dos dosis aproximadamente a las cuatro semanas adem´as de la u ´ltima dosis administrada dos semanas antes de parir. Se recomienda una dosis repetida antes de cada parto subsiguiente. Se recomienda la vacunaci´ on semianual para los cerdos. 5

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Se prefiere que la vacuna de la invenci´ on, en caso de una preparaci´ on farmac´eutica, se encuentre presente en formas de dosificaci´on unitarias. Las formas de dosificaci´ on contienen preferiblemente unos 2 ml. Para fines de esta invenci´ on, una cantidad inmunog´enica de la M. hyopneumoniae, inactivada se sit´ ua ´ nico principio activo. En una composici´ on entre 5x108 y 5x109 CCU por dosis, si se administra como u de la vacuna que contiene componentes antig´enicos adicionales, puede emplearse la misma cantidad inmunog´enica o bien una cantidad reducida de M. hyopneumoniae.

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Otras dosis apropiadas eficaces desde el punto de vista terap´eutico pueden ser determinadas f´ acilmente por aquellos especialistas en la materia bas´andose en las cantidades inmunog´enicas indicadas, teniendo en cuenta el estado y las caracter´ısticas fisiol´ ogicas del animal. En presencia de agentes activos adicionales, estas dosis unitarias pueden ajustarse f´ acilmente por los especialistas. Un r´egimen de dosificaci´on deseable implica la administraci´ on de una o dos dosis de la composici´ on de vacuna deseada, donde el contenido antig´enico de cada fracci´on es deseable tal como se ha indicado antes. Naturalmente, si es preciso o deseable, la administraci´on se puede repetir a intervalos apropiados

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El tipo de administraci´ on de las vacunas de la invenci´ on puede ser cualquier v´ıa apropiada que proporcione la vacuna al hu´esped. Sin embargo, la vacuna se administra preferiblemente a trav´es de una inyecci´on intramuscular. Tambi´en se pueden emplear otras formas de administraci´ on, donde se desee, como la subcut´ anea, intradermal, intraperitoneal o intranasal.

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Los ejemplos siguientes de la invenci´on son solamente ilustrativos y no pretenden ser restrictivos. Ejemplo 1 25

Propagaci´ on y cultivo de M. hyopneumoniae

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La cepa M. hyopneumoniae P-5722-3 fue facilitada cortesmente por el Dr. Charles Armstrong, Purdue on 55052. Esta cepa University, y depositada con la American Type Culture Collection con el n◦ de admisi´ tiene las caracter´ısticas inmunoqu´ımicas y bioqu´ımicas de ser manosa positiva, arginina negativa y ureasa negativa. La cepa es positiva para la inhibici´on del crecimiento con antisuero anti-M. hyopneumoniae y positiva por el ensayo directo de anticuerpos fluorescentes con anticuerpo conjugado de fluoresceina de anti-hyopneumoniae. Esta cepa se propag´ o tal como se ha descrito a continuaci´ on.

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Se prepar´ o un medio de cultivo de acuerdo con el procedimiento siguiente. Un caldo de PPLO del 83% sin cristal violeta (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) se trataba con una resina de intercambio R ,Sigma IRA400-forma clorada) de una a cuatro horas, a la velocidad de 500 gramos i´onico (Amberlite de resina por cada diez litros de caldo.

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El extracto de levadura se preparaba a˜ nadiendo quinientos gramos de gr´ anulos de levadura activa a tres litros de agua destilada o desionizada, agitada a temperatura ambiente. Despu´es de una mezcla intensa, la suspensi´on se agitaba durante unos 15-45 minutos adicionales despu´es de los cuales se a˜ nad´ıan 16,2 ml de NaOH 10 N, gota a gota. La mezcla se colocaba luego en un autoclave durante 15-45 minutos on o microa 121◦ C. Se decantaba el sobrenadante en un recipiente y se aclaraba mediante centrifugaci´ filtraci´ on. Al sobrenadante aclarado, se a˜ nad´ıa HCl 1N a una velocidad de 2 ml por 100 ml de extracto. El extracto se agitaba durante al menos quince minutos a temperatura ambiente y luego se aclaraba tal como se ha descrito antes. El extracto aclarado se esterilizaba en el autoclave tal como se ha descrito antes o bien por microfiltraci´ on.

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Al caldo de cultivo pretratado se a˜ nad´ıan los componentes del medio siguientes: 0,01% de acetato de talio; 0,005% de ampicilina; 0,0125% de clorhidrato de cisteina; 6,25% de extracto de levadura, 1% de dextrosa; 10% de suero bovino (Gibcco) inactivado por el calor; y opcionalmente, un 0,0026% de fenol rojo. El pH del medio de cultivo se ajustaba a pH 7,5 ± 0,2 y se esterilizaba el filtro.

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Para iniciar la producci´ on, la semilla principal congelada de M. hyopneumoniae se descongelaba y se inoculaba una suspensi´ on del 5-20% en 100-3000 ml del medio de cultivo descrito con anterioridad. El cultivo se incubaba a 30◦C hasta 39◦C durante 36 hasta 168 horas. Despu´es de un crecimiento satisfactorio, el cultivo se transfer´ıa a un recipiente de inoculaci´on con medio nuevo, usando un in´ oculo del 5-20%. Este cultivo se incubaba a 37◦C ± 1◦ C de 36 a 96 horas.

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Los cultivos de producci´ on de M. hyopneumoniae se colocan en fermentadores, se incuban a 37◦ C ± 1◦C durante 36 a 96 horas despu´es de la inoculaci´on. El contenido en ox´ıgeno disuelto del cultivo se 6

ES 2 112 274 T3 mantiene entre un 20-40% por aireaci´ on con aire est´eril y agitaci´on. Puede utilizarse anti-espuma est´eril para controlar la espuma.

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Al final del periodo de crecimiento, el pH del cultivo se elevaba a 7,6 ± 0,2 y el pH se manten´ıa en este intervalo durante una hora. Para inactivar el organismo, se a˜ nad´ıa una soluci´ on acuosa esterilizada por filtraci´ on, de 2-bromoetilaminahidrobromuro (BEA) a una concentraci´ on final de aprox. 4,0 mM. La BEA se transforma en el agente de inactivaci´ on, etilenimina binaria (BEI) cuando aumenta el pH on constante durante un m´ınimo de 24 del cultivo. El cultivo se incubaba a 37◦C ± 1◦ C con una agitaci´ horas.

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Despu´es del periodo de incubaci´ on de 24 horas, una soluci´ on acuosa, esterilizada por filtraci´on, de tiosulfato s´ odico, un agente neutralizante est´ andar, se a˜ nad´ıa a una concentraci´on final de aproximadamente 4mM para neutralizar el exceso de BEI. El cultivo se incubaba durante un periodo adicional de 24 on. horas a 37◦ C ± 1◦ C para completar la inactivaci´ 15

Ejemplo 2 Preparaci´ on de una vacuna 20

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Despu´es de la inactivaci´on del componente de la vacuna del ejemplo 1, se formulaba una vacuna a˜ nadiendo a la M. hyopneumoniae inactivada varios componentes convencionales de las vacunas. Se combinaba una cantidad suficiente de M. hyopneumoniae inactivada con diluyente salino tamponado de axima de 5 x 109 fosfato para obtener una concentraci´ on de ant´ıgeno m´ınima de 5 x 108 CCU y una m´ CCU de M. hyopneumoniae por una dosis de 2 ml. Se a˜ nad´ıan soluciones est´eriles de mertiolato del 10% y de ´acido etilendiamintetrac´etico del 10% (EDTA, sal dis´odica o tetras´ odica) como agentes conservantes. El aceite mineral est´eril (Drakeol) que contiene de un 5% a un 40% en peso de lecitina (Central Soya) se a˜ nad´ıa como un adyuvante. La concentraci´ on final comprendida entre un 0,7% y un 3,2% de Tween 80 y un 0,3% hasta un 1,8% de Span se a˜ nad´ıa como un emulgente. Para el aceite y los emulgentes se pueden a˜ nadir como conservantes adicionales los parabens seleccionados (p-hidroxilbenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propilo, p-hidroxilbenzoato de butilo). Ejemplo 3 Experimentos del est´ımulo de las vacunas

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Se realizaban dos experimentos distintos sobre el est´ımulo de la vacunaci´ on para evaluar las capacidades protectoras de una vacuna de M. hyopneumoniae inactivada reforzada en el cerdo.

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Se obten´ıan treinta y tres cerdos cruzados de seis semanas y media de edad, de una piara cerrada, sin enfermedades respiratorias y que correspond´ıa a un grupo de control estimulado no vacunado (grupo 1), dos grupos estimulados vacunados (grupos 2 y 3), y un grupo de control no estimulado ni vacunado (grupo 4).

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Los animales del grupo 2 recib´ıan la vacuna descrita en el ejemplo 1 a excepci´ on de que el cultivo de M. hyopneumoniae se inactivaba con un 0,3% de formalina en lugar de BEI; y los animales del grupo 3 recib´ıan la vacuna descrita en el ejemplo 1, en ambos casos administrada en dosis de 2 ml por via intramuscular el d´ıa “0” y el d´ıa “14”. Ambas vacunas conten´ıan c´elulas enteras inactivadas reforzadas del mismo modo, que difer´ıan u ´nicamene con respecto al agente de inactivaci´on utilizado. Los cerdos del grupo 4 recib´ıan dosis de 6 ml de caldo de micoplasma Friis reforzado de Freund incompleto (placebo) por la misma v´ıa.

55

La neumon´ıa era inducida por inoculaci´ on intratraqueal de los cerdos (Bentley, O.E. y Farrington, D.O. 1980. Am.J.Vet.Res. 41:1870) siete d´ıas despu´es de la segunda dosis de la vacuna con una dosis individual de 10 ml de homogenado pulmonar crudo que conten´ıa cepa 232 de M. hyopneumoniae (derivada de la cepa 11). Los cerdos del grupo 4 recib´ıan 10 ml de caldo de micoplasma Friis.

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60

La necropsia se realizaba aproximadamente 3 semanas despu´es del est´ımulo. Los criterios utilizados para la determinaci´ on de la eficacia de las vacunas para la profilaxis de la enfermedad por M. hyopneumoniae eran a) gravedad de los signos cl´ınicos; b) lesiones macrosc´ opicas de neumon´ıa; c) lesiones microsc´opicas t´ıpicas de la enfermedad; y d) infecci´ on del tejido pulmonar determinada por inmunofluorescencia (Amaneu, W y cols. Proceedings, IPVS Congress, Copenhagen, Denmark. p.223 (1980)).

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ES 2 112 274 T3

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10

15

Tal como se muestra en las tablas 1 y 2 a continuaci´on, los cerdos de los grupos 1 y 2 tend´ıan a tener valores de tos ligeramente superiores que los cerdos de los grupos 3 y 4. Todos los cerdos del grupo 1 (control positivo) y la mayor´ıa de cerdos de los grupos 2 y 3 (vacunados)presentaban lesiones. Ninguno de los cerdos del grupo 4 presentaba lesiones. El n´ umero de l´ obulos con lesiones era sustancialmente inferior en los cerdos del grupo 3 que en los cerdos de los grupos 1 y 2. Lo m´as importante, el porcentaje medio de pulmones con neumon´ıa y de lesiones pulmonares era significativamente inferior en el grupo 3 vacunado que en el grupo 1. La gravedad de la neumon´ıa en el grupo 2 no era significativamente distinta de la del grupo 1 (tabla 1). La mayor´ıa de cerdos de todos los grupos ten´ıan algunas lesiones microsc´opicas. La gravedad de las lesiones microsc´opicas era significativamente inferior en los grupos 2, 3 y 4 que en el grupo 1 positivo. La evaluaci´on de los pulmones mediante inmunofluorescencia revelaba que 7 de los 8 cerdos del grupo 1 eran positivos para la enfermedad. Solamente cuatro de los diez cerdos y tres de los nueve cerdos daban Fa positivo en los grupos 2 y 3 vacunados, respectivamente. Todos los cerdos de los grupos 2 y 3 hab´ıan desarrollado un elevado t´ıtulo de fijaci´ on del anticuerpo (CF) complementario a la M. hyopneumoniae en el momento de ser estimulados. Con el grupo 2 se observaba un desarrollo m´ as r´apido del estado positivo del anticuerpo CF que con el grupo 3.

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25

En resumen, la vacuna administrada a los cerdos del grupo 3 aportaba una protecci´ on relativamente fuerte contra el est´ımulo intratraqueal con homogenado pulmonar de M. hyopneumoniae. La protecci´ on se evidenciaba por el numero reducido de l´obulos con lesiones, el porcentaje reducido de l´obulos con lesiones, el n´ umero medio reducido de lesiones pulmonares, la cifra reducida de lesiones microsc´ opicas y el n´ umero reducido de cerdos FA positivos. TABLA 1

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Grupos N◦ de cerdos Vacuna Tos valor medio ± D.S.

35

40

1

2

3

4

8 1,11 ± 0,11

10 XMHP4 1,13 ± 0,15

9 XMHP5 1,05 ± 0,10

6 Placebo 1,01 ± 0,02

8 35/56 7,93 ± 4,5

7 23/70 6,80± 7,73

6 12/63 1,9 ± 3,39

0 0/42 0

8 2,81 ± 0,40

7 2,0 ± 0,84

8 1,72 ± 0,68

4 1,29 ± 0,25

7 0,63