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ESTADO DEL ARTE DE ................................................................ LA QUINUA ................................................................ en el mundo en 2013

2 Secretaría del Año Internacional de la Quinua: Salomón Salcedo (FAO) Coordinación General del Año Internacional de la Quinua: Tania Santivañez (FAO) Coordinación científica y técnica: Didier Bazile (CIRAD) Edición científica: Didier Bazile, Daniel Bertero y Carlos Nieto Revisión de textos y estilo: Raúl Miranda Diseño: Marcia Miranda Colaboradores: Sara Granados y Gonzalo Tejada

Para citar el libro completo: BAZILE D. et al. (Editores), 2014. “Estado del arte de la quinua en el mundo en 2013”: FAO (Santiago de Chile) y CIRAD, (Montpellier, Francia), 724 páginas Para citar solo un capitulo: AUTORES, (2014). Título del capítulo. Capitulo Numero XX. IN: BAZILE D. et al. (Editores), “Estado del arte de la quinua en el mundo en 2013”: FAO (Santiago de Chile) y CIRAD, (Montpellier, Francia): pp. XX-YY

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358 CAPÍTULO: 3.6.

TÍTULO: Quinua, enfermedad celíaca y la dieta sin gluten *Autores para correspondencia: Victor ZEVALLOS y Paul CICLITIRA V. F. ZEVALLOSa, L. I. HERENCIAb, P. J. CICLITIRAa a

Ciencias de la Nutrición, Gastroenterología, King’s College de Londres, Reino Unido.

b

Producción Vegetal, Universidad Politécnica de Madrid, España.

Resumen La quinoa es un cultivo andino con múltiples beneficios agronómicos, nutricionales, e industriales. La enfermedad celíaca (EC) se caracteriza por una respuesta inmune exagerada a las proteínas del gluten, afectando histológicamente al intestino delgado. El tratamiento consiste en seguir una dieta libre de gluten (DLG) de por vida. La quinoa tiene un contenido mínimo de gluten y un vínculo filogenético distante con los cereales que contienen gluten (trigo, centeno, y cebada), lo que ha motivado a considerar este grano como un producto naturalmente libre de gluten, apto para pacientes con EC. Sin embargo, existe muy pocos estudios científicos que avalen esta teoría, por lo tanto el presente capítulo tiene por objeto revisar la literatura científica en relación a la enfermedad celíaca y la quinoa. Los primeros estudios in vitro examinaron la idoneidad de la quinoa para pacientes con EC utilizando la actividad aglutinante de células indiferenciadas de leucemia mieloide (de Vincenzi et al. 1999), midiendo la concentración de péptidos celíaco-tóxicos (Berti et al. 2004), y analizando la reactividad inmune en estudios de proliferación de células T y explantes de cultivos de órgano (Bergamo et al. 2011). La limitación principal de estos estudios fue el uso de un cultivar no descrito.

Recientemente, nosotros hemos identificado cultivares de quinoa con péptidos que potencialmente tienen la capacidad de activar inmunológicamente células T CD4+ especificas de gliadina y biopsias de duodeno en pacientes celíacos. Los estudios in-vivo son casi inexistentes, con la excepción de una revisión retrospectiva del historial dietético de pacientes que consumen quinoa (Lee et al. 2009) y nuestro reciente estudio in vivo (Zevallos et al. 2014) que muestra que el consumo de quinoa a corto plazo no solo es tolerado positivamente por pacientes celíacos sino que también podría tener un efecto hipocolesterolémico y por lo tanto ser relevante para pacientes con riesgo de obesidad. En conclusión, los resultados de los estudios científicos indican que algunos cultivares de quinoa tienen pequeñas cantidades de proteínas similares al gluten con capacidad de estimular el sistema inmune pero no empeoran la enfermedad celíaca al ser consumidas como parte de la DLG. Esta claro que hace falta mas estudios de investigación que evalúen los efectos del consumo de quinoa a largo plazo pero de acuerdo a la información actual, podemos decir que la quinoa puede ser consumida sin ningún peligro para la salud de los enfermos celiacos. Palabras clave: quinoa, enfermedad celíaca, dieta libre de gluten

1. Introducción. El principal tratamiento para los pacientes celiacos es seguir una estricta dieta libre de gluten (DLG) que consiste en evitar cereales como el trigo, el centeno y la cebada. La DLG permite que la mucosa intestinal se recupere pero las transgresiones dietéticas de gluten provocan la activación de mecanismos inmunopatológicos que evitan esta recuperación. Los productos libres de gluten son fabricados principalmente con harinas de maíz, arroz, patata y mijo, afectando su palatabilidad, disponibilidad, valor nutricional y precio. Nuevos ingredientes que mejoren cualquiera de estos parámetros, contribuirían a mejorar la DLG, siempre y cuando tengan niveles mínimos de gluten y sean apropiados para las personas con la EC. En el presente capítulo exploraremos la evidencia científica que apoya la incorporación de la quinoa como parte de la DLG. 2. Enfermedad celíaca. La enfermedad celíaca (EC) es una enfermedad autoinmune multiorgánica que afecta principalmente la arquitectura vellosa del intestino delgado proximal en individuos genéticamente predispuestos. La EC fue descrita por primera vez por Areteo, 200 DC, como una síndrome malabsortivo con diarrea crónica (Thomas, 1945). La EC se caracteriza por una respuesta inmune exagerada tras la ingesta de gluten, proteínas de almacenamiento de semillas, en cereales (trigo, cebada, y centeno). Los típicos síntomas gastrointestinales incluyen diarrea, distensión abdominal, vómitos, y dolor abdominal. El único tratamiento efectivo es mantener una estricta dieta libre de gluten (DLG) que ayuda a la recuperación de la mucosa intestinal dañada. Las transgresiones dietéticas de gluten pueden causar un relapso de síntomas, evitando que la mucosa se recupere. 2.1 Prevalencia. La prevalencia de la EC en adultos europeos es aproximadamente 1 en 100, en EE.UU. 1 en 133 (Fasano et al. 2003), en Australia, Nueva Zelanda y Oceanía, las cifras son parecidas a Europa (Logan y Bowlus, 2010). Otras regiones (Japón, China) donde la EC era históricamente rara, han empezado a informar de nuevos casos (Wu et al. 2010). En el Norte de África, los niños de origen árabe-berebere que viven en el Sahara Occidental tenían un 5.6% de prevalencia de anticuerpo antiendomisio

(Catassi et al. 1999) y 2.6% anti transglutaminasa tisular en México, indicando que la EC podría ser poco reconocida en esos territorios (Remes-Troche et al. 2006). 2.2 Patogenia. Prácticamente todos los pacientes celíacos tienen alelos heterodiméricos HLA clase II que codifican HLA-DQ2 o DQ8; estas moléculas expresadas en células presentadoras de antígenos tales como macrófagos, células dendríticas y células B, presentan peptidos de gluten a las células CD4+T en la lámina propia. Esta presentación activa la vía de las células T auxiliares, que luego aumentan la secreción de interferón-γ (INF-γ) que contribuye a la expansión de células T citotóxicas, fibroblastos y la liberación de metaloproteasas para degradar la matriz extracelular de los enterocitos en la lámina propia (Daum et al. 1999; Sollid 2002) Además, estos efectos pueden ser aumentados por la desamidación de péptidos, un proceso mediado por la enzima transglutaminasa tisular II (TG2) que aumenta el número de residuos con carga negativa al convertir la glutamina en ácido glutámico (Molberg et al. 1998). El número de residuos de anclaje con carga negativa es muy importante para las moléculas HLA que tienen sitios de unión de péptidos diseñados específicamente para acomodar este tipo de residuos. Por otra parte, la posición de los aminoácidos afectados por la desamidación y la presencia de residuos de prolina resistentes a las enzimas digestivas también contribuyen a un aumento en la antigenicidad (Shan et al. 2002; Vader et al. 2002). La activación innata de monocitos, macrófagos y células dendríticas por proteínas del gluten y proteínas ajenas al gluten por medio de las diferentes vías (perforina, granzima, y Fas/FasL) facilita la actividad citotóxica de los linfocitos intraepiteliales (LIE) en el epitelio del duodeno (Junker et al. 2009), induce la expresión de moléculas MICA clase I no clásicas en el epitelio intestinal que actúan sobre las células asesinas naturales y las células T (Salvati et al. 2005) e incrementan la producción de interleuquina15 (IL-15) epitelial. La IL-15 tiene un papel fundamental en la activación de respuestas inmunes innatas y adaptativas, es un factor de crecimiento importante para LIE, bloquea las vías inmunosupresoras y podría actuar junto a la IL-21

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para reforzar la inmunidad innata (Maiuri et al. 2001). 2.3 Manifestaciones clínicas. La típica manifestación clínica de EC en adultos incluye malabsorción generalizada, pérdida de peso y diarrea que puede ser continua, intermitente, o alternada con periodos de estreñimiento. Signos atípicos que se están volviendo más predominantes incluyen índices de masa corporal (IMCs) sobre 25, ausencia de diarrea, lasitud vaga, dolor abdominal, hinchazón y cansancio (Dickey y Bodkin 1998; Lo et al. 2003). En niños los síntomas típicos como anorexia, vómitos, y anemia se observan durante los primeros meses de vida, seguidos de pérdida del apetito, retraso en el crecimiento, problemas de comportamiento, distensión abdominal, baja estatura, desgaste muscular y defectos en el esmalte durante los primeros años (Aine et al. 1990). Por otra parte, casos más leves caracterizados por la ausencia parcial de síntomas también se están volviendo cada vez más comunes (Rodrigues y Jenkins, 2006). La EC es una condición compleja asociada a muchas enfermedades, principalmente enfermedades autoinmunes, pero también trastornos reproductivos, neurológicos, y dermatológicos. La falta de respuesta a una DLG en pacientes con EC después de una exhaustiva revisión dietética e histológica es una indicación temprana de enfermedad celíaca refractaria (ECR). Su prevalencia es desconocida, pero es probable que afecte a un 5% de la población (Tack et al. 2010). La ECR puede ser dividida en tipo I, con linfocitos intraepiteliales (LIEs) fenotípicamente normales, y tipo II, con LIEs anormales que se caracterizan por expresar CD3 citoplásmico, pero a los que le falta la expresión de los marcadores de células T CD3, CD84 y los receptores de células T (Verbeek et al. 2008) que pueden desarrollarse en un linfoma de células T asociado a enteropatía (LTAE). 2.4 Diagnóstico Los síntomas gastrointestinales leves y la predisposición genética podrían ser una indicación inicial de EC que se puede evaluar con pruebas serológicas. El diagnóstico generalmente se realiza sobre la base de una biopsia duodenal anormal en una dieta que contiene gluten y una mejora

histológica posterior después de seguir una DLG. Sin embargo, el espectro más amplio de la EC requiere un examen cuidadoso y la disposición de revisar el diagnóstico más adelante a la luz de los avances clínicos y la investigación. La principal prueba serológica es el anticuerpo endomisial IgA (EMA) y la prueba de ELISA IgA anti-tTG con una alta especificidad (95 a 99%), sensibilidad (90 a 93%) y buena correlación con el grado de daño a la mucosa (Stern y Grupo de trabajo sobre cribado serológico de la enfermedad celíaca 2000). Hace poco se demostró que los péptidos de gliadina desamidada (DGP) son de valor diagnóstico (Volta et al. 2010), aunque un meta análisis sugirió que la prueba de anticuerpos tTG supera a la DGP (Lewis y Scott 2010). Sin embargo, el uso de inmunoensayo multiplex (MIA) para medir un panel de tTG, y pruebas DGP de IgG e IgA podrían reducir el tiempo y costo, en particular para pacientes de EC con deficiencias de IgA, pero se requiere más estudios de investigación para determinar su eficacia en un entorno clínico. La evaluación histológica del intestino delgado sigue siendo la norma de oro en el diagnóstico de la enfermedad celíaca. La lesión celíaca afecta predominantemente a la mucosa del duodeno proximal con disminución de daños hacia la parte distal. Se necesitan múltiples biopsias utilizando fórceps de tamaño estándar debido a la naturaleza irregular de los cambios en las vellosidades (Bonamico et al. 2002; Siegel et al. 1997). En 1992 Marsh clasificó la progresión histológica de la EC en cinco etapas según su severidad: lesiones preinfiltrativas, infiltrativas, hiperplásicas, destructivas, e hipoplásicas (atróficas) (Marsh 1992). El examen de biopsias entrega una ventaja diagnóstica clara sobre las pruebas serológicas, pero podrían surgir problemas cuando las mediciones se toman de biopsias mal orientadas, especialmente en pacientes con predisposición genética, sin un diagnostico claro y con una estructura mucosa cuasi-normal. 3. Dieta libre de gluten. El tratamiento para la EC desde 1950 es seguir una estricta dieta libre de gluten (DLG) de por vida, lo que mantiene la estructura normal de la mucosa intestinal, y reduce el riesgo de complicaciones y la tasa de mortalidad en pacientes celíacos (Nachman

et al. 2010; West et al. 2004). La DLG incluye comidas sin gluten como son las frutas, verduras, carnes no procesadas, pescados y aves de corral. Los productos como la pasta, el pan, los cereales para el desayuno, las galletas y bocadillos que generalmente se fabrican con harinas de cereales que contienen gluten (trigo, cebada, y centeno) son reemplazados por harinas de cereales libres de gluten como maíz, arroz, mijo, trigo sarraceno, y sorgo. La adhesión a la DLG depende principalmente de factores tales como palatabilidad, disponibilidad, la edad y el precio. Los alimentos que contienen fuentes “ocultas” de gluten, tales como espesantes de trigo, malta de cebada con niveles inseguros de gluten y etiquetas ambiguas también afectan al cumplimiento con la DLG (Lerner 2010). 3.1 Gluten. Gluten es un término genérico para identificar las proteínas de almacenamiento de cereales tales como el trigo, la cebada, el centeno y la avena. Los granos de trigo pueden ser separados en salvado, germen, y endospermo. La proteína dentro de la parte del endospermo del grano de trigo puede ser subdividida según su solubilidad en agua, sal, alcohol y álcalis en albúminas, globulinas, prolaminas y gluteninas respectivamente (Osborne 1907). Las prolaminas son proteínas de almacenamiento solubles en alcohol caracterizadas por su contenido más alto de prolina y glutamina con un peso molecular de entre 10 a 100 kDa (Hilu y Esen 1988). Las prolaminas son una fuente importante de nitrógeno, azufre, y carbono para el embrión en desarrollo. Se les asigna un nombre de acuerdo al cereal de origen, es decir, las prolaminas del trigo son conocidas como gliadinas, las de cebada como hordeinas y las del centeno como secalinas. Según su movilidad electroforética decreciente, las gliadinas pueden dividirse en gliadinas α, β, γ y ω. Basado en las secuencias de aminoácidos N-terminales las gliadinas se pueden clasificar en α, β, γ y ω. Las gluteninas consisten en subunidades solubles en alcohol que forman polímeros insolubles en alcohol. Estas subunidades son estabilizadas por enlaces disúlfidos intercatenarios y han sido clasificadas según su movilidad electroforética en peso molecular alto (HMW), peso molecular medio (MMW) y grupos de peso molecular bajo

(LMW), que es el grupo principal (Shewry y Tatham 1990; Wieser 1994). Las proteínas de estos grupos pueden dividirse además en dos diferentes tipos sobre la base de homologías de secuencia, el grupo LMW y el grupo HMW que contiene subunidades de glutenina HMW (HMW-GS) (trigo), secalinas HMW (centeno) y D-hordeinas (cebada). Las HWM-GS son las proteinas que contribuyen principalmente a la formación de masa de pan; este grupo de proteínas se subdivide además en las subfracciones 1Dy10, 1Dx5, 1Dx4, y 1Dy9. El centeno y la cebada tienen subfracciones de glutenina HMW equivalentes pero son menos adecuadas para la formación de masa de pan. 3.2 Cereales que afectan la enfermedad celiaca. Los cereales que afectan la EC son parte de la familia Gramineae, también conocida como Poaceae debido a su asociación con el género tipo Poa. Esta familia incluye 12 subfamilias, de las cuales dos son más relevantes a la enfermedad celíaca. La familia Pooidae que incluyen trigo, centeno y cebada (dañinos para pacientes celíacos) y la familia Panicoidae que incluye el maíz, mijo y sorgo (aptos para la DLG) (Bracken et al. 2006; Kasarda 1994). Para determinar los cereales que afectan a la enfermedad celiaca, se han realizado extensos estudios sobretodo con trigo pero también cebada y centeno. Sin embargo, para determinar los cereales que no afectan a los EC, se ha utilizado la clasificación taxonómica (Kasarda 1994). Las plantas monocotiledóneas, miembros de la familia Gramineae y de la tribu Triticeae (trigo, cebada y centeno) fueron consideradas dañinas y las de otras tribus (maíz, arroz, teff), se asumieron seguras para los pacientes celíacos, por lo tanto la quinoa, una planta dicotiledónea de la familia Chenopodiacea, también fue considerada segura para los pacientes celíacos. 4. Dieta libre de gluten y la quinoa (Chenopodium quinoa Willdenow) La idoneidad nutricional de la DLG ha sido disputada en varias ocasiones, ya que la eliminación del trigo, cebada y centeno reduce la ingesta dietética de minerales y vitaminas, aumentando el riesgo de deficiencia nutricional en pacientes celíacos (Gray 2006). Otros estudios encontraron que el contenido de vitaminas de los cereales libres de gluten puede dejar a los pacientes con EC vulnerables a

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la deficiencia de folato (Thompson 2006b) y que la DLG tradicional era nutricionalmente deficiente en comparación con una dieta regular, afectando negativamente el estado vitamínico a largo plazo (Hallert et al. 2002). La creciente demanda por productos alimenticios e ingredientes alternativos para suplementar el valor nutritivo de la DLG ha dirigido a los pacientes y a la industria a buscar alimentos como los granos andinos. Estos cultivos tienen múltiples aplicaciones agroindustriales y nutricionalmente contienen altas cantidades de carbohidratos, proteínas, vitaminas, y minerales. Los principales granos andinos son la quinoa (Chenopodium quinoa Willd.), kiwicha (Amaranthus caudatus) y kañiwa (Chenopodium pallidicaule). Su adaptabilidad a diferentes ambientes es otra ventaja, por ejemplo, la quinoa obtuvo un rendimiento moderado en Europa, con niveles de producción de 2 a 3.8 toneladas por hectárea en pruebas de campo, sugiriendo que podría convertirse en un cultivo alternativo sustentable para la agricultura europea (Aufhammer et al. 1995; Herencia y Alia 1999; Jacobsen et al. 1994). La quinoa emerge como un potencial nuevo cultivo en varias regiones del mundo debido a sus aplicaciones agronómicas, nutricionales, e industriales. Una de las características que destaca su valor desde el punto de vista nutricional es la cantidad y calidad de sus proteínas. La quinoa tiene un contenido elevado de proteína y un perfil de aminoácidos equilibrado comparado con la mayoría de cereales (Drzewiecki et al. 2003; Ruales y Nair 1992). Las proteínas de la quinoa se pueden clasificar en albúminas, globulinas, prolaminas y gluteninas tras la extracción secuencial en diversos solventes (Prakash y Pal 1998). El principal tipo de proteínas son las albúminas y globulinas (44-77%); las prolaminas son menos prevalentes (0,5 a 7%) (Lindenboom 2005). Basado en su lejana relación taxonómica con el trigo y sus bajos niveles de prolaminas, se asume que es poco probable que la quinoa dañe el intestino de pacientes celíacos y, por lo tanto, también se asume que se podría añadir a la DLG. Sin embargo, sobre la base del conocimiento actual, esta suposición no se ve apoyada por datos experimentales fuertes, lo que incita a la pregunta de si las prolaminas de

la quinoa efectivamente no afectan la enfermedad celíaca y si son una adición segura a la DLG, por lo tanto hasta que estas preguntas se aclaren satisfactoriamente, la quinoa y otros granos andinos no serán recomendados oficialmente como parte de la DLG (Farrell y Kelly 2002; Nicolas et al. 2003). Además, una encuesta de 63 organizaciones de celíacos y 42 médicos demostró que hay una gran preocupación por la falta de estudios que avalen la idoneidad de cultivos nuevos como la quinoa en la DLG (Thompson 2000a). Debido a estas razones, existe la posibilidad de controversia y malos entendidos entre los profesionales de la salud, y como resultado, la quinoa será continuamente excluida de las diversas listas de productos recomendados para pacientes celíacos, a menos que se presenten sólidas pruebas científicas. 5. Evaluación inmunoquímica de las prolaminas de la quinoa. El número limitado de plantas con propiedades parecidas a cereales celíaco-tóxicos (trigo, centeno, y cebada) ha dado lugar a la búsqueda de productos alternativos que reemplacen estos cereales. La naturaleza hipoalergénica de la quinoa y su imagen “orgánica” ha llevado a recomendar la quinoa como una fuente de proteína vegetal para propósitos dietéticos especiales tales como una dieta libre de gluten (DLG). Todos los nuevos productos que se añadan a la DLG necesitarían pruebas estrictas que confirmen su idoneidad, pero para facilitar su incorporación, se suele hacer una evaluación relativamente simple y rápida que consiste en medir el nivel de gluten y evaluar el origen taxonómico de la planta en cuestión. Usando este sistema, se determino que la quinoa no tiene niveles altos de gluten y que podría ser agregada a la DLG. Sin embargo, el nivel de prolaminas en la quinoa es altamente variable dependiendo del cultivar y el ambiente donde se cultiva la planta (Herencia y Alia 1999). Además, la clasificación taxonómica es sólo una guía basada en el origen taxonómico de las plantas monocotiledóneas. Ya que la quinoa es una planta dicotiledónea, esta guía debería considerarse como menos aplicable. 5.1 Propiedades inmunoquímicas de las proteínas de quinoa.

Berti et al. (2004) obtuvieron granos de quinoa de la Asociación Nacional de Productores de Quinoa (Anapqui, Bolivia) para analizar la cantidad de proteína parecida a la gliadina y la reactividad imunoquímica de fracciones proteicas extraídas de forma secuencial. El perfil de proteínas de cada extracto fue analizado por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) en condiciones reductoras, inmunotransferencia con suero de pacientes celíacos o anticuerpo antigliadina policlonal de conejo, y el contenido de gliadina fue medido por un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). La inmunoreactividad de las proteínas de quinoa fue muy baja con el anticuerpo antigliadina comercial y con el suero de un paciente celíaco y fue comparable a la de las proteínas en la harina libre de gluten (control negativo). La única banda débilmente positiva detectada por anticuerpos del suero humano (IgA o IgG) podría atribuirse a la reactividad cruzada con una proteína que también está presente en las harinas libres de gluten. El contenido de gluten en la harina de quinoa fue medido utilizando un kit ELISA comercial basado en anticuerpos monoclonales contra las ω-gliadinas resistentes al calor (Skerrit y Hill 1991). El contenido de proteínas similares a la gliadina fue evaluado también en harinas obtenidas de otros granos (soja, trigo sarraceno, avena, y maíz). Una muestra de trigo fue el control positivo. Los estándares de gliadina cubren el rango de 2-20 ng de gliadina. La soja y maíz mostraron un contenido de gluten por debajo de los límites de detección del ensayo. El contenido de gluten de la quinoa (1.6 ± 0.6 mg/kg) fue menos de la mitad que en el trigo sarraceno (4.2 ± 0.2 mg/kg.). Berti y colaboradores concluyeron que la quinoa podría ser una elección segura para la producción de productos libres de gluten, por lo menos desde un punto de vista inmunoquímico. Sin embargo, sólo incluyeron un cultivar desconocido y probaron esta muestra utilizando anticuerpos monoclonales en contra de las ω-gliadinas resistentes al calor. 5.2 Prolaminas de 15 cultivares de quinoa. Nosotros también determinamos el nivel de prolaminas de quinoa in vitro con epítopos parecidos al gluten (Zevallos et al. 2012), utilizando

una biblioteca de anticuerpos monoclonales murinos (mMAbs) de subunidades de anti-gliadina y anti-gluteninas de peso molecular alto (HMW-GS) mediante inmunoensayo de punto y ELISA doble sándwich. Las prolaminas fueron extraídas de quince cultivares de quinoa del banco de germoplasma en el Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA Perú). Se utilizaron cuatro mMAbs, a saber, PN3 (anti A-gliadina 31-49), CDC5 (anti α-gliadina 56-75), CDC3 y CDC7 (anti HMW-GS 1Dy10). Los estudios de toxicidad in vivo han demostrado que el péptido A-gliadina 31-49, un péptido 19-mer, y el α-gliadina 56-75, el epítopo inmunodominante de célula-T de gliadina (Anderson et al. 2000) son responsables de la destrucción de la arquitectura vellosa (Fraser et al. 2003) y que las HMW-GS 1Dy10, HMW-GS (importantes para la formación de la masa de pan) que probablemente también estén implicadas en el daño epitelial. Se compararon quince cultivares de quinoa con estándares de almidón de trigo con contenido de gluten conocido (A, B, y C) y los controles negativos (sorgo y mijo). Los estándares de almidón de trigo fueron clasificados de acuerdo con la intensidad del color como A (-), B (++), y C (+++). Ocho muestras de quinoa resultaron completamente negativas y fueron equivalentes al almidón de trigo aceptable para pacientes con EC (A). El cultivar Witulla dio una ligera reacción (+) a los anticuerpos contra péptidos de gliadina. Los cultivares 03-21-1181, CICA-17 y Blanca de Jujuy dieron una leve reacción (+) a los anticuerpos contra HMW-GS y los cultivares Ayacuchana, LP-4b e INIA Pasankalla dieron una leve reacción (+) tanto a los anticuerpos de péptidos de gliadina como a los de HMW-GS. También, el cultivar Ayacuchana fue el único cultivar que mostró una reacción (++) moderada al anticuerpo anti-gliadina CDC5 (anti α-gliadina 56-75) (Cuadro 1).

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Cuadro 1. Nivel de epítopos celíaco-tóxicos en cultivares de quinoa, controles positivos y negativos analizados por imunoensayo de punto y ELISA no competitiva. Las muestras con cantidades indetectables de epítopos tóxicos están representadas por un signo menos. HMW-GS, subunidad de glutenina de alto peso molecular; mMAb, anticuerops monoclonales murinos; ND, no determinado. Método

Ensayo de inmunounión de punto

ELISA

mMAbs

Anti-gliadina

Anti-HMW-GS

PN3

CDC5

CDC3

CDC7

Illpa INIA

-

-

-

-

-

Kamiri

-

-

-

-

-

03-21-1181

-

-

+

-

-

Salcedo

-

-

-

-

-

Kancolla

-

-

-

-

-

03-21-0386

-

-

-

-

-

Rojo Achachino

-

-

-

-

-

Chullpi Rojo

-

-

-

-

-

Blanca de Jujuy

-

-

+

+

-

CICA-17

-

-

-

+

-

Ayacuchana

+

++

+

+

2,56

LP-4B

+

-

-

+

1,38

INIA-Pasankalla

+

-

+

+

1,21

Witulla

+

+

-

-

1,64

Rojo Coporaque

-

-

-

-

-

Almidón de trigo A

-

-

-

-

ND

Almidón de trigo B

++

++

++

++

ND

Almidón de trigo C

+++

+++

+++

+++

ND

Sorgo

-

-

+

+

-

Mijo

-

-

-

-

-

Anti-gliadina PN3

Cultivares de quinoa

La concentración de prolamina de 15 cultivares de quinoa pura también fue determinada utilizando mMAb PN3 contra el péptido tóxico A-gliadina 3149. La concentración más alta se observó en los cultivares Ayacuchana (2,56 mg/kg) y en orden descendiente, en Witulla, LP-4B e INIA-Pasankalla. Los resultados indican que todos los cultivares de quinoa tuvieron un contenido de gluten por debajo de la cantidad máxima de gluten (20 mg/kg) sugerida para alimentos que pueden ser etiquetados como “libres de gluten” (FAO y WHO 2008). Siete

cultivares mostraron niveles cuantificables de prolaminas tóxicas con valores máximos de 2,56 mg/kg (Ayacuchana) y mínimos de 0,48 mg/kg (Rojo Achachino). Para concluir, quince cultivares de los Andes tienen niveles bajos (menos de 20 mg/kg) de prolaminas con una estructura similar a epítopos de gluten tóxicos conocidos y, por lo tanto, pueden ser etiquetados como libres de gluten.

6. Respuesta inmunoestimulante adaptativa e innata a las prolaminas de la quinoa. El sistema inmune adaptativo juega un papel importante en la inmunopatogénesis de la EC. La transglutaminasa tisular II (TG2), ubicada en la mucosa intestinal, desamida los péptidos de gliadina, que a continuación, pueden ser presentados a las células T CD4+ de la lámina propia por las células presentadoras de antígenos (DQ2+ o DQ8+). Las células T CD4+ activadas que siguen la vía de las T auxiliares (Th) tipo 1 inician la producción de interferón gamma (IFN-γ) y el posterior deterioro de la mucosa (Nilsen et al. 1998; Sollid 2002). Sin embargo, otros estudios sugieren que algunos péptidos de gluten pueden inducir daño a la mucosa a través de la activación directa de mecanismos de inmunidad innata tales como la secreción de interleuquina 15 (IL-15) (Maiuri et al. 2003). Por lo tanto, los sistemas in vitro que aborden tanto la respuesta inmune innata como la adaptativa, deben considerase para evaluar los efectos de proteínas con capacidad de afectar la EC. 6.1 Actividad aglutinante celular de las prolaminas de la quinoa. De Vincenzi et al. (1999) examinaron la idoneidad de la quinoa para pacientes celíacos en proteínas solubles en alcohol extraídas de granos de quinoa y expuestas a células K562(s), una línea de tejido leucémico mieloide crónico, midiendo el nivel de aglutinación celular. La digestión con pepsina y tripsina (PT) se resolvió asimismo en una columna sefarosa-6B-manano, y se obtuvieron dos fracciones: la fracción A que representa el 94% y la fracción B, el 1% de la carga total de proteínas. Además, los autores midieron la cantidad potencial de epítopos celíaco-tóxicos por ELISA comercial, basado en una mMAb que reconoce la ω-gliadina. Los resultados indicaron que los niveles de prolaminas tóxicas en las muestras de quinoa eran bajos (0,003g/100 g de harina integral) y posiblemente subestimados debido a las limitaciones del sistema ELISA y la composición de aminoácidos de las prolaminas de quinoa, que tienen niveles más bajos de prolamina en comparación con las prolaminas celíaco-tóxicas. La digestión péptica-tríptica de las prolaminas de la quinoa no aglutinó las células K562(s), ni si quiera en los análisis realizados en concentraciones

elevadas. La fracción A tampoco aglutino las células K562(s), mostrando el mismo comportamiento que la digestión PT total, pero la fracción B fue muy activa en aglutinar las células K562(s). Además, esta actividad fue inhibida cuando se combinó con la fracción A, sugiriendo que las prolaminas enteras de digestión PT de la quinoa no podían aglutinar las células K562(s), potencialmente porque los péptidos en la fracción A interfieren con los de la fracción B. Los resultados de este experimento proporcionan información muy importante sobre las prolaminas de la quinoa. Sin embargo, la EC es una enfermedad mediada por células T que afecta principalmente al epitelio del intestino delgado, por lo que seria más apropiado utilizar líneas de células T específicas de gliadina de biopsias duodenales para entender los efectos de las prolaminas de quinoa en la EC. 6.2 Evaluación inmunológica de prolaminas de potenciales granos libres de gluten. Bergamo et al. (2011) analizaron la actividad inmune de las prolaminas del teff, mijo, amaranto, y quinoa, en comparación con la gliadina del trigo, utilizando líneas de células T intestinales (iTCLs), cultivos de explantes duodenales de pacientes celiacos HLADQ2 y ratones transgénicos HLA-DQ8. Las células T intestinales de pacientes con EC fueron aisladas e incubadas con cuatro extractos de prolamina desamidada (teff, mijo, amaranto, y quinoa) y comparadas con la gliadina desamidada. La producción de INFg aumentó en la gliadina desamidada pero no fue detectada en otras muestras analizadas. Además se probaron muestras en biopsias intestinales de cultivo de órgano de 24 horas y se observó la activación de CD25 en la lámina propia y un aumento en la densidad de CD3 LIE en muestras de biopsia cultivadas con PT-gliadina. Sin embargo, no se detectaron diferencias importantes en los niveles de CD25 / CD3 en comparación con las muestras cultivadas solo con el medio de cultivo. Los autores también probaron las muestras extraídas en ratones transgénicos HLA-DQ8 sensibilizados a la gliadina e inmunizados con PT-gliadina lo que indujo una respuesta inmune significativa in vitro en células del bazo y nodos linfáticos mesentéricos (NLMs) después de expuestas nuevamente a PT-gliadina. En contraste, ninguna proliferación significativa fue observada cuando las células

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fueron expuestas a las PT-prolaminas de teff, mijo, amaranto y quinoa, incluso en concentraciones más altas. En conclusión el teff, mijo, amaranto, y la quinoa no muestran reactividad inmune cruzada con epítopos de gliadina DQ2- y DQ8, ni inducción de inmunotoxicidad innata, y podrían considerarse adecuados para su uso en la DLG. Sin embargo, tenemos que destacar que sólo se utilizó un cultivar no descrito por cada muestra. 6.3 Respuesta inmune adaptativa e innata de las prolaminas de la quinoa en la enfermedad celíaca. La capacidad de las prolaminas de quinoa para estimular la respuesta inmune innata i adaptativa en pacientes celíacos fue determinada midiendo el nivel de INF-γ en sobrenadantes de líneas de células T especificas de gliadina y la activación inmune innata de biopsias duodenales de pacientes celíacos (Zevallos et al. 2012). Para este propósito, nosotros aislamos los linfocitos T CD4+ (específicos de gliadina) de biopsias duodenales de 10 pacientes celíacos y realizamos ensayos de proliferación incubando células T con y sin antígeno, midiendo la captación celular de timidina tritiada en cuentas por minuto y calculando

el índice de estimulación (IE). También se midió la citoquina INF-γ de sobrenadantes de cultivos celulares con y sin antígeno. Además, biopsias duodenales ex-vivo de 8 pacientes celíacos fueron expuestas a gliadinas y prolaminas de quinoa. Las citoquinas (IL-15 e INF-γ) secretadas de las biopsias cultivadas con y sin antígeno fueron medidas por ELISA y los resultados fueron corregidos por peso de la biopsia y volumen del sobrenadante antes de compararlos utilizando una prueba estadística no paramétrica. Se observaron IE positivos (IE ≥ 2) en las diez líneas de células T cultivadas con gliadina (Rektor) con índices de estimulación desde 2,1 a 24,1. Dos de las diez líneas de células T (C y G) cultivadas con prolaminas de los cultivares Ayacuchana y Pasankalla mostraron índices de estimulación positivos. En la línea C de células T, la gliadina Rektor indujo una secreción de INF-γ de 108 pg/mL, mientras que una igual concentración de prolaminas de Pasankalla indujo una concentración más baja, 20 pg/mL. En la línea G de células T, no se obtuvieron valores detectables (Cuadro 2).

Cuadro 2. Índices de estimulación de cada línea de célula T contra las prolaminas desamidadas de trigo y cuatro cultivares de quinoa (Rektor, Ayacuchana, Pasankalla, Witulla y LP-4B). * indica índices de estimulación positivos (es decir, ≥ 2).

Células T

Índices de estimulación (IE)

Líneas

Rektor

Ayacuchana

Pasankalla

Witulla

LP-4B

A

2,9*