Estrategias de evaluación de antioxidantes en extractos vegetales Dr. Gustavo E. Zúñiga Laboratorio de Fisiología y Biotecnología Vegetal Departamento de Biología Facultad de Química y Biología Universidad de Santiago de Chile e-mail:
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Tópicos • Estrés oxidativo /Especies reactivas de oxigeno • Modo de acción de antioxidantes • Medición de antioxidantes
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Estrés oxidativo y especies reactivas de oxigeno • estrés oxidativo: acumulación de especies reactivas de oxigeno (ROS), que provocan daño celular. • ROS O2. H2O2 .OH + OHH2O • O2 superoxido
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peroxido
radical hidroxilo
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Fuentes de ROS • Ambientales –Humo de cigarrillos, polución, ozono de superficie –Radiación UV –Condiciones de estrés en Plantas. –Endógenas Enzimas Sistema de transporte de electrones interacción de ROS con metales de transición xxxxxx
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Sistemas antioxidantes • Antioxidantes primarios. – Liposolubles: tocoferoles, ubiquinoles, carotenoides. – Hidrosolubels: ascorbato, glutation, ácido úrico, etc
• Antioxidantes secundarios – Enzimas: SOD, APx, POD, CAT, etc – Fitoquímicos.
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Antioxidantes de plantas • Derivados de isoprenoides – Carotenoides, tocoferoles
• Sustancias fenolicas – Polifenoles, flavonoides
• Sustancias derivadas de aminoacidos – Glutation
• Acidos grasos y lipidos insaturados
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Estructura de polifenoles
3' 2' 8 7
A
C
2 3
6 5
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1'
O
4
4'
B 6'
5'
• A and B son anillos fenolicos • C es un anillo heterociclico • Los polifenoles difieren en el estado de oxidacion del anillo C
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Flavanoles
OH OH O
HO
OH OH
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Flavonoles
OH OH O
HO
OH OH
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O
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Flavonas
OH OH O
HO
OH xxxxxx
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Antocianinas
OH OH O
HO
+
OH OH
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Isoflavonas
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Modo de acción de antioxidantes • Primarios. Interrumpen la reacción en cadena generando un radical menos activo – ROO· + AH ROOH + A · – ROO · + A · ROOA • Secundarios. Preventivos – Quelantes. Desactivan metales – Removedores de ROS – Atrapadores de oxigeno singlete xxxxxx
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Atrapamiento de metales
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Atrapamiento de radicales
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METODOS DE EVALUACION • Existen diferentes métodos para determinar la actividad antioxidante de plantas. • Medición del contenido de fenoles. – Folin-Ciocalteau
• Medición de antocianinas • Capacidad atrapadora de radicales. • Capacidad antioxidante total
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Contenido de fenoles • Se basa en el uso del reactivo de FolinCiocalteu. – Una alícuota del extracto se mezcla con el reactivo diluido (5- 10 veces) (1:1, 1:5). – Se agrega además 5 volúmenes de carbonato de sodio 10% – Se incuba a 50 C durante 5 minutos. – Se enfría y se lee absorbancia a 760 nm. Se usa como estándar ácido galico. xxxxxx
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Contenido de antiocianinas • Extraer en metanol con 1% de HCl a 4 °C durante 24 hrs. • Medir absorbancia a 530 nm y expresar como equivalentes de cianidina usando un ε 29500
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Análisis de flavonas y flavonoles • Tomar extracto y disolver en agua. • Tomar alícuota de esta fracción y agregar HCl 6M y Alcohol puro. • Calentar durante media hora y enfriar. • El contenido de flavonas y flavonoles se determina mediante HPLC. •
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Actividad atrapadora de radical hidroxilo • Preparar una solución que contenga 0,2 m de benzoato de sodio (10 mM), 0,2 ml de FeSO4 x 7H2O (10 mM) y 0,1 ml de EDTA (10 mM). • Llevar a un volumen final con 1,8 ml de buffer fosfato (pH 7,4 0, M) • Agregar 0,2 ml H2O2 (10 mM) • Incubar a 37 °C x 2 hrs • Medir fluorescencia a 407(emisión) y 305 (excitación) xxxxxx
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Actividad atrapadora de radical superoxido O2• Preparar 3 ml de una solucion con: buffer fosfato 50 mM (pH 7,8), metionina 13 mM, rivoflavina 2 µM, EDTA 100 µM, NBT 75 µM • Agregar 0,5 ml de la muestra • Medir aumento de la absorbancia a 560 nm, durante 10 min mientras se ilumina con lampara fluorescente.
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Actividad atrapadora de Radicales DPPH • Solución de DPPH (0,04%) en MeOH • Agregar alícuota de extracto • Medir Absorbancia a 517 nm durante 30 min.
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Capacidad atrapadora de radicales
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Capacidad antioxidante equivalente a trolox (TEAC) • Se basa en la capacidad del antioxidante para atrapar el radical cationico 2,3 azinobis(3ethylbenzothiazoline-6-sulphonate) (ABTS+) • Se mide desaparición del catión a 734 nm. • Se usa como estándar trolox
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Determinación de la capacidad antioxidante total • Mezclar 0,1 ml de extracto con 2 ml de solución reactiva (ácido sulfúrico 0,6 M, fosfato de sodio 28 mM y molibdato de amonio 4 mM) • Incubar a 95 C durante 90 min • Leer absorbancia a 695 nm. • Estándares Ácido ascórbico o ácido gálico.
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Gracias
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Ferric reducing/ antioxidant power (FRAP) • Se basa en la capacidad reductora del antioxidante. • Fe+3
Fe+2
• Fe+2 /2,4,6 tripiridil-s-triazina •
A593
• Complejo azul /antioxidante
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complejo azul
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Decae A593
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Sistema β-caroteno- acido linoleico (βCLAMS) • Este método se basa en la decoloración del βcaroteno por la accion de peroxidos originados durante la oxidacion de acido lonoleico. • Se lee la absorbancia a 490 nm entre 0 y 15 min.
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Capacidad de absorción de radicales de oxigeno (ORAC) • Se utiliza una proteína fluorescente, Rficoeritrina (R-PE) y un generador de radicales peroxido, 2,2-azobis(2-amidinopropano) dihidrocloruro. • Se mide a 540 nm (excitación) y 565 nm (emisión).
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