UNIVERSIDAD ANDRÉS BELLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS DOCTORADO DE BIOCIENCIAS MOLECULARES

Estudio de la función de la variante de histona macroH2A2 en el desarrollo de la retina del pez cebra Tesis entregada para optar al grado de Doctor en Biociencias Moleculares

Laura Inés Guajardo Cáceres 2012

Director de Tesis: Dr. Ariel E. Reyes

RESUMEN

La variante de histona macroH2A regula la expresión génica principalmente por represión de la transcripción, asociándose a eventos de heterocromatinización, como la inactivación del cromosoma X. Estudios in vitro indican que macroH2A podría regular el desarrollo embrionario, permitiendo la expresión de genes Hox y de las familias génicas Dix, Pax y Six que regulan el desarrollo temprano del sistema nervioso, ojo y retina. Además, sólo el transcrito de la isoforma macroH2A2 se expresa durante el desarrollo embrionario del pez cebra. En este contexto el objetivo principal de este trabajo fue la caracterización de la función de macroH2A2 durante la formación de la retina del pez cebra. La determinación del patrón de expresión del transcrito macroH2A de pez cebra por hibridación in situ, muestra que sólo la isoforma macroH2A2 se expresa en el cerebro y retina durante el desarrollo embrionario, principalmente en la región anterior del embrión, en el primordio, vesícula y copa ópticas, el neuroepitelio retinal y en las capas de células ganglionares y plexiforme interna de la retina diferenciada. Esta expresión concuerda con las etapas de proliferación, especificación y diferenciación de distintos territorios en el sistema nervioso central, especialmente con el desarrollo de la retina. Con estos antecedentes se decidió caracterizar el efecto de la falta de función (knockdown) de macroH2A2 durante el desarrollo de la retina usando la inyección de morfolinos específicos. El knockdown específico de macroH2A2 afectó principalmente la región anterior del embrión, coincidente con los territorios de expresión del transcrito de

 

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macroH2A2. Se obtuvieron dos fenotipos reproducibles y dependientes de la concentración de morfolino inyectado: embriones acéfalos (fenotipo severo) y con microcefalia, microftalmia y ausencia de las capas retinales (fenotipo leve). Este último consecuencia de una retinogenesis defectuosa. La caracterización del fenotipo leve, durante el desarrollo de la retina muestra que la etapa proliferativa de los progenitores retinales, que darán origen a todos los tipos celulares de la retina, se llevó a cabo normalmente. Sin embargo, la etapa de determinación ocurrió en forma defectuosa. Se observaron defectos en la inhibición de la proliferación, necesaria para la salida del ciclo celular de los progenitores retinales y posterior diferenciación. En la retina de las larvas morfantes se mantuvieron elevados los niveles de ciclinaD1, PCNA y p-Histona H3, con un evidente alargamiento de la fase S del ciclo celular. Por otro lado, también se detectaron niveles aumentados de βcatenina en las retinas morfantes de macroH2A2, siendo posiblemente ésta una de las causas de la proliferación aumentada observada en tejido de la retina. Estos antecedentes sugieren fuertemente que macroH2A2 contribuiría a la regulación de la inhibición de la vía de señalización Wnt/β-catenina en la retina en desarrollo y que además sería necesaria para la progresión y salida del ciclo celular de los progenitores retinales. Este trabajo de tesis es el primer estudio in vivo que describe la función de la variante de histona macroH2A2 en un proceso específico del desarrollo embrionario, la retinogenesis. Estos datos contribuyen a aumentar nuestro conocimiento, aún escaso, sobre la participación de mecanismos epigenético en el desarrollo embrionario.

 

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SUMMARY

The

histone

variant

macroH2A

regulates

gene

expression

mainly

by

transcriptional repression, associated to heterochromatinization events such as X chromosome inactivation. In vitro studies indicate that macroH2A could regulate embryonic development, allowing expression of Hox genes and gene families Dix, Six y Pax that control the early development of the nervous system, eye and retina. Moreover, only the transcript of the macroH2A2 isoform is expressed during zebrafish embryonic development. In this context the main goal of this work was the characterization of macroH2A2 function during zebrafish retinal development. Determination of transcript expression pattern in zebrafish by in situ hybridization shows that only the macroH2A2 isoform mRNA is expressed in the brain and retina during embryonic development, mainly in the anterior region of the embryo, primordium, vesicle and optic cup, retinal neuroepithelium and retinal ganglion cells and inner plexiforme layers, in the differentiated retina. This expression is consistent with the steps of proliferation, specification and differentiation in different territories of the central nervous system, especially with retinal development. With this evidence, we decided to characterize the effect of loss of function (knockdown) of macroH2A2 during retinal development by injection of specific morpholinos. The specific knockdown of macroH2A2 affected mostly the anterior region of the embryo, coincident with macroH2A2 transcript expression territories. Two reproducible phenotypes were obtained, depending on the concentration of morpholino injected: headless embryos (severe phenotype) and microcephalia, microphthalmia and

 

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absence of retinal layers (mild phenotype). The latter was a result of defective retinogenesis. Characterization of retinal development in the mild phenotype shows that the proliferative stage of the retinal progenitors that give rise to all cell types in the retina, proceeds normally. However, the determination step was defective. Defects were observed in the inhibition of proliferation that is required for the retinal progenitor cells to exit the cell cycle and consequently differentiate. In the retina of morphant larvae, elevated levels of cyclinD1, PCNA and p-Histone H3 remained, with an evident elongation of S phase of cell cycle. Furthermore, levels of β-catenin expression were also increased in the macroH2A2-morphant larvae, probably constituting the cause of this increased proliferation observed in the retinal tissue. These facts strongly suggest that macroH2A2 contributes to the regulation of the inhibition of the Wnt/β-catenin signaling pathway in the developing retina and macroH2A2 also is required for progression and cell cycle exit of retinal progenitors. This thesis is the first in vivo study that describes the function of macroH2A2 histone variant in a specific process of embryonic development, retinogenesis. These data contribute to our knowledge, still scarce, about the involvement of epigenetic mechanisms in embryonic development.

 

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