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Universidad Nacional de General San Martín UNSAM
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas Instituto Tecnológico de Chascomús IIB-INTECH-CONICET
“Estudios sobre la participación de AtFH en la biogénesis de proteínas Fe-S y hemoproteínas en mitocondrias de plantas”
Tesis para optar al título de Doctor en Biología Molecular y Biotecnología
Bioquímica María Victoria Maliandi
Director: Dr. Diego F. Gómez-Casati Co-Directora: Dra. MaríaVictoria Busi
2009
Indice
Indice Indice
I
Agradecimientos
VI
Publicaciones
VIII
Abreviaturas
IX
1. Introducción 1.1. Estructura y función de la mitocondria
2
1.2. Fosforilación oxidativa
5
1.3. Comunicación núcleo-mitocondria
11
1.4. Biogénesis de los grupos Fe-S
13
1.4.1. Biogénesis de grupos Fe-S en plantas
17
1.5. Producción de especies reactivas de oxígeno
23
1.6. Hierro y daño oxidativo
26
1.7. Frataxina: estructura y función
30
1.8. Biogénesis de hemoproteínas
36
2. Hipótesis y Objetivos Hipótesis y Objetivos
42
3. Materiales y Métodos 3.1. Material vegetal y condiciones de crecimiento
45
3.2. Cepas bacterianas
45
3.3. Vectores plasmídicos
46
3.4. Medios de cultivo, antibióticos y otros reactivos 3.4.1. Medios de cultivo bacteriano
46
3.4.2. Medios líquidos y soluciones buffer
46
3.4.3. Antibióticos y otros compuestos relacionados
47
3.5. Oligonucleótidos
47
I
Indice
3.6. Preparación y análisis de ADN 3.6.1. Propagación de ADN plasmídico 3.6.1.1. Preparación de bacterias Escherichia coli competentes
50
3.6.1.2. Transformación de bacterias competentes de E. coli
50
3.6.2. Aislamiento de ADN plasmídico 3.6.2.1. Aislamiento de ADN plasmídico (kit comercial)
51
3.6.2.2. Aislamiento de ADN plasmídico mediante lisis alcalina
51
3.6.3. Electroforésis de ADN en geles de agarosa
52
3.6.4. Purificación de ADN a partir de geles de agarosa
52
3.7. Manipulación enzimática de ADN 3.7.1. Reacción de ligación
52
3.7.2. Reacciones de digestión con enzimas de restricción
52
3.8. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
53
3.9. Extracción de ARN total
53
3.10. Cuantificación de ARN total
54
3.11. RT-PCR semicuantitativa
54
3.12. PCR en tiempo real (QPCR)
55
3.13. Extracción de ADN genómico
56
3.14. Cuantificación de ADN
56
3.15. Hibridación de ácidos nucleicos (Southern-blot)
56
3.16. Preparación y análisis de proteínas 3.16.1. Extracción de proteínas
58
3.16.2. Determinación del contenido proteico
58
3.16.3. Electroforesis de proteínas
58
3.17. Obtención de anticuerpos policlonales
59
3.18. Análisis por western blot
59
3.19. Aislamiento de plantas mutantes homocigotas
60
3.20. Construcción de vectores binarios para transformación de plantas de A.thaliana
60
II
Indice
3.21. Preparación de células competentes de Agrobacterium tumefaciens y su transformación 3.21.1. Preparación de células competentes
61
3.21.2. Transformación de las células de A. tumefaciens
61
3.21.3. Obtención de ADN plasmídico de A. tumefaciens
62
3.22. Transformación de plantas de A. thaliana utilizando el método de infiltración por floral dip
63
3.23. Esterilización de semillas de Arabidopsis
63
3.24. Selección de plantas transformadas
64
3.25. Clonado, expresión y purificación de proteínas 3.25.1. Clonado molecular de AtFH de A. thaliana
64
3.25.2. Expresión y purificación de las proteínas recombinantes AtFH-His6 y AtFH- STOP de A. thaliana
64
3.26. Ensayo de degradación oxidativa de 2-deoxiribosa
66
3.27. Determinación de Fe
66
3.28. Determinación de la concentración de ATP
67
3.29. Medidas de respiración
67
3. 29.1. Tratamiento con Rotenona
68
3.30. Aislamiento de mitocondrias y determinaciones enzimáticas 3.30.1. Aislamiento de mitocondrias
68
3.30.2 Medida de la actividad enzimática de aconitasa, succinato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa
69
3.31. Infiltración de hojas con H2O2
69
3.32. Detección histoquímica de superóxido en hojas de Arabidopsis
70
3.33. Detección histoquímica de especies reactivas de oxígeno en hojas y raíces de plantas de Arabidopsis thaliana 3.34. Determinación del contenido de hemo y actividad catalasa 3.34.1. Determinación de la concentración de hemina
70 70 70
3.34.2. Medida de la actividad catalasa en hojas, flores y mitocondrias aisladas y recuperación de la actividad catalasa por el agregado de hemina exógena
71
III
Indice
3.35. Métodos bioinformáticos
72
4. Resultados y discusión 74
Capítulo I 4.1. Caracterización de plantas de Arabidopsis thaliana deficientes en la expresión de AtFH 4.1.1. Estructura del gen AtFH de Arabidopsis thaliana
75
4.1.2. Selección de plantas mutantes homocigotas de A. thaliana con inserción de T-ADN en el gen AtFH
76
4.1.3. Construcción de líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana que expresan AtFH en orientación antisentido y sentido
80
4.1.4. Efecto de la deficiencia de AtFH en plantas de Arabidopsis 4.1.4.1. Análisis fenotípico de plantas de Arabidopsis deficientes en la expresión de AtFH 4.1.5. Análisis fenotípico de las líneas mutantes atfh-2 y atfh-3
82 86
4.1.6. Caracterización de las plantas de Arabidopsis thaliana que expresan el gen AtFH en orientación sentido (s-AtFH) 4.1.6.1. Fenotipo de plantas transgénicas s-AtFH
87
Capítulo II
92
5.1. Clonado, expresión y purificación de AtFH recombinante
92
5.2. Atenuación de la reacción de Fenton por AtFH
95
Capítulo III
99
6.1. Efecto de la deficiencia de AtFH sobre la función mitocondrial en Arabidopsis thaliana
101
6.2. Efecto de AtFH sobre la transcripción y actividad del CI mitocondrial 6.2.1. Determinación de los niveles de expresión de genes del CI en plantas con deficiencia en AtFH 6.2.2. Efecto de la deficiencia de AtFH sobre la actividad del CI
104 108
IV
Indice
115
Capítulo IV 7.1. Efecto de AtFH sobre la transcripción de genes que codifican proteínas Fe-S mitocondriales
117
7.2. AtFH y stress oxidativo 7.2.1. Plantas deficientes en frataxina muestran un aumento en el contenido de Fe y en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS)
121
7.2.2. Análisis molecular de marcadores de estrés oxidativo
125
7.2.3. Respuesta de AtFH frente a agentes oxidantes
128
Capítulo V 8.1. Participación de AtFH en la biogénesis de hemoproteínas
131
8.1.1. La deficiencia de AtFH provoca una disminución en el contenido de hemo 8.1. 2. Efecto de la deficiencia de AtFH sobre la actividad catalasa
131 134
8.1.3. Efecto de la deficiencia de AtFH en enzimas claves de la síntesis del hemo
139
9. Conclusiones
145
10. Resumen
148
11. Referencias
151
V
Agradecimientos
Agradecimientos:
A mi director de tesis, Dr. Diego Gómez Casati, por estimularme día a día, por ensañarme a pensar y por haberme dado las herramientas necesarias para desarrollarme en el área de la investigación y haber podido llevar a cabo este trabajo de tesis.
A mi codirectora, Dra. María Victoria Busi, por haberme abierto las puertas en el laboratorio aquel febrero de 2004. Por haberme guiado y enseñado desde mis comienzos y por su constante predisposición tanto en lo laboral como en lo personal.
Al Consejo Directivo y al Director del Instituto de Investigaciones Biotecnológicas- Instituto Tecnológico de Chascomús (IIB-INTECH) Dr. Alberto Carlos Frasch, por permitirme realizar este trabajo de tesis en este Instituto.
A la Universidad Nacional de General San Martín por haberme dado la oportunidad de cursar la carrera de Doctorado en esta importante casa de estudios.
A la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT) y al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), por otorgarme la beca de iniciación y finalización respectivamente, que posibilitaron la realización de este trabajo de tesis.
Al Dr. Eduardo Zabaleta, que me dio la posibilidad de realizar una pasantía en el laboratorio y así poder comenzar a trabajar en investigación.
A José Luis Burgos por el apoyo técnico prestado durante el desarrollo de toda esta tesis.
Al instituto INFIVE, UNLP y al instituto IFISE, UNR,
por haberme
permitido realizar las medidas de respiración y de niveles de ATP respectivamente, informadas en este trabajo de tesis.
VI
Agradecimientos
Al Dr. Alejandro Araya, por su asesoramiento en la discusión de los resultados de la PCR en tiempo real.
A todos los que componen la “UB6” por crear un muy lindo ambiente de trabajo y compañerismo.
A Vale, por su excelente calidad humana y por siempre estar predispuesta a ayudar.
A mis amigos, Colo, Huguito, y José Luis, por habernos permitido distraer minutos de trabajo para realizar nuestras típicas charlas, por apoyarnos en momentos en los que lo hemos necesitado y por la buena relación que siempre nos ha acompañado.
A todos mis amigos del INTECH que he ido conociendo durante todos estos años y con los cuales he pasado momentos que siempre recordaré.
A Diego y Vicky, porque siempre me han brindado tanto en lo personal como en lo laboral, un gran apoyo y no tengo más que agradecimientos hacia ellos.
A mis amigos de la vida, del cole y de la facu, con los que cuento incondicionalmente.
A mi familia, que siempre me acompañan y apoyan en todas las decisiones que tomo en mi vida, y que sin ellos no hubiese podido lograr nada de lo que he realizado hasta ahora.
VII
Publicaciones Parte de estos resultados fueron presentados en: Publicaciones: 1- Busi, M.V.; Maliandi, M.V.; Valdez, H.; Clemente, M.; Zabaleta, E.J.; Araya, A. and Gomez-Casati, D.F. (2006) Deficiency of Arabidopsis thaliana frataxin alters mitochondrial Fe-S proteins activity and induces oxidative stress. The Plant Journal 48, 873-882. 2- Maliandi, M.V.; Busi, M.V.; Clemente, M.; Zabaleta, E.J.; Araya, A. and GomezCasati, D.F. (2007) Expression and one-step purification of recombinant Arabidopsis thaliana frataxin homolog (AtFH). Protein Expression and Purification 51, 157-161. 3- Maliandi, M.V.; Busi, M.V.; Araya, A. and Gómez Casati, D.F. Role of frataxin in the biogenesis of hemoproteins in Arabidopsis. Enviado para su publicación.
Presentaciones a Congresos 1- Busi MV, Clemente M, Maliandi MV, Rius S, Burgos JL, Valdez H, Zabaleta E, Araya A and GómezCasati D. Oxidative stress and A. thaliana Frataxin homolog (AtFH). XL Reunión SAIB, Posadas, Misiones, Argentina, 2004. 2- Busi, MV; Valdez, H; Clemente, M; Maliandi, MV; Zabaleta, E; Araya, A and Gómez-Casati, D. Arabidopsis thaliana frataxin homolog (AtFH) deficiency increases oxidative stress and modulates Fe-S protein activity in mitochondria. International Congress on Plant Mitochondrial Biology, Obernai, France, jun 2005. 3- Martín, M.; Maliandi, M.V.; Busi, M.V.; Lamattina, L.; Gómez-Casati, D.; Zabaleta, E. Arabidopsis thaliana frataxin (AtFH) is involved in oxidative stress and iron homeostasis. XLI Reunión SAIB, Pinamar, Argentina, 2005. 4- Maliandi, M.V.; Valdez, H.;, Clemente, M.; Busi, M.V.; Zabaleta, E.; Araya, A. and Gomez-Casati, D. Molecular Cloning, Expression and Purification of Arabidopsis thaliana Frataxin homolog (AtFH). XLI Reunión SAIB, Pinamar, Argentina, 2005. 5- Maliandi, M.V.; Busi, M.V.; Zabaleta, E.J.; Araya, A. y Gomez-Casati, D.F. Caracterización funcional de frataxina de Arabidopsis thaliana. XXVI Reunión Argentina de Fisiología Vegetal (SAFV) , Chascomús, Argentina, 2006. 6- Rodriguez Colman, M.; Maliandi, M.V.; Busi, M.V.; Graziano, M.; Gomez-Casati, D.; Lamattina, L.; Zabaleta, E.; Martin, M. A. thaliana frataxin is involved in iron homeostasis and oxidative stress. XLII Reunión SAIB, Rosario, Argentina, 2006. 7- Maliandi, M.V.; Rius, S.P.; Busi, M.V. y Gómez-Casati, D. A simply method for the addition of rotenone in Arabidopsis leaves. XLII Reunión SAIB, Rosario, Argentina, 2006. 8- Maliandi, M.V.; Busi, M.V.; Valdez, H.A.; Clemente, M.; Zabaleta, E.; Araya, A. and Gomez-Casati, D.F. Deficiency of Arabidopsis thaliana frataxin alters activity of mitochondrial Fe–S proteins and induces oxidative stress. XXXVII Annual Meeting of SBBq (Brazilian Biochemistry and Molecular Biology Society) and XI PABMB Congress (Pan- American Association for Biochemistry and Molecular Biology), San Pablo, Brasil, 2008. 9- Maliandi, M.V.; Busi, M.V y Gómez-Casati, D. Participation of AtFH in the biogenesis of hemecontaining proteins. XLIII Reunión SAIB, Carlos Paz, Argentina, 2008
VIII
Abreviaturas
Abreviaturas: ácido desoxiribonucleico ADN copia ADN genómico ADN mitocondrial ácido ribonucleico ácido ribonucleico mensajero adenosina trisfosfato albumina sérica bovina bromuro de cetil trimetil amonio 5-bromo-4-cloro-indolil-fosfato buffer (tomada del inglés) buffer fosfato salino cantidad suficiente para 2ƍ,7ƍ-diclorodihidrofluoresceina diacetato densidad óptica
ADN ADNc ADNg ADNmt ARN ARNm ATP BSA CTAB BCIP sc. amortiguadora de pH PBS c.s.p H2DCFDA D.O
diclorofenol indofenol
DCPIP
dietil pirocarbonato docecil sulfato sódico electroforesis en gel de poliacrilamida especies reactivas de oxigeno flavina adenina dinucleótido fluoruro de fenilmetilsulfonil frataxina homólogo de Arabidopsis thaliana frataxina homólogo de levaduras gentamicina higromicina isopropil ȕ-D-tiogalactopiranosido kanamicina kilodalton levaduras mutantes deficientes en frataxina milimolar nicotinadamida adenina dinucleótido reducido nitroblue tetrazolium pares de bases peróxido de hidrógeno peso fresco peso seco peso/peso peso/volumen Reacción en cadena de la polimerasa
DEPC SDS PAGE ROS FAD PMSF AtFH YFH gem hig IPTG kan kDa ǻyfh mM NADH NBT pb H 2 O2 PF PS P/P P/V PCR
IX
Abreviaturas
porción del plásmido Ti retro-transcripción rifanpicina volumen/volumen wild type (tomado del inglés), tipo salvaje
T-ADN RT rif V/V wt
X
Introducción
Introducción
1.1.
Estructura y función de la mitocondria:
Las mitocondrias son organelas dinámicas y pleomórficas de las células eucariotas involucradas en distintos procesos como por ejemplo la fosforilación oxidativa, el metabolismo del carbono y del nitrógeno, la termorregulación, la homeostasis del calcio y hierro (Mackenzie and McIntosh, 1999; Orrenius et al., 2003), la regulación de la apoptosis (Youle and Karbowski, 2005) y la síntesis de grupos Fe-S y hemo (Muhlenhoff et al., 2002; Lange et al., 1999). Estas organelas poseen una doble membrana y difieren en tamaño, forma y cantidad, dependiendo del tipo celular, función tisular y la actividad metabólica del tejido donde se encuentran. Se ha informado que en los tejidos metabólicamente más activos, las mitocondrias ocupan una gran proporción del volumen celular (Lehninger et al., 1993).
La membrana externa mitocondrial no forma pliegues y rodea completamente la organela. Esta membrana es permeable a iones y pequeñas moléculas. La membrana interna presenta invaginaciones denominadas crestas mitocondriales que proporcionan una gran área superficial y es impermeable a la mayoría de las moléculas pequeñas e iones, incluido los protones (H+). En general, las únicas especies que pueden atravesar la membrana interna son aquellas para las que existen proteínas transportadoras específicas. Es en las crestas de la membrana interna, donde se encuentran los complejos multiproteicos de la cadena de transporte de electrones y el complejo ATP sintasa (Lehninger et al., 1993; Taiz and Zeiger, 1998).
El espacio interno situado entre la membrana externa y la interna se denomina espacio intermembrana. En este compartimento se acumulan altas concentraciones de protones que provienen de la matriz mitocondrial. El mecanismo detallado que acopla la transferencia de electrones a la translocación de protones es poco conocido. El flujo de protones a través de canales proteicos y a favor de su gradiente electroquímico provee la energía libre necesaria para la síntesis de ATP, catalizado por el complejo ATP sintasa.
El
compartimento
interno
de
la
mitocondria,
denominado
matriz
mitocondrial, contiene diferentes complejos proteicos y enzimas como el complejo 2
Introducción
piruvato deshidrogenasa, las enzimas del ciclo del ácido cítrico, enzimas relacionadas con la oxidación de ácidos grasos y metabolismo de aminoácidos, ribosomas y ADN mitocondrial (Lehninger et al., 1993; Logan, 2006) (Figura 1).
Figura 1: Estructura esquemática de la mitocondria. Tomada de Proyecto biosfera, www. recursos.cnice.mec.es.
A diferencia de otras estructuras membranosas como los lisosomas, el complejo de Golgi o la envoltura celular, las mitocondrias tienen naturaleza semiautónoma: deben dividirse para pasar a la siguiente generación a partir de mitocondrias previamente existentes. Esta división se logra por fisión como ocurre en la mayoría de los procariotas (Lenhinger., 2005).
Debido su origen endosimbiótico y por encontrarse en algunas algas inferiores, podría esperarse que la mitocondria utilice la maquinaria de fisión heredada de bacterias progenitoras. FtsZ es una GTPasa, estructuralmente homóloga a la tubulina que media la división celular en bacterias al ensamblarse a un anillo en el sitio medio de la división celular (McFadden and Ralph, 2003). En cloroplastos de plantas superiores, se conocen dos genes FtsZ codificados a nivel nuclear, FtsZ1 y FtsZ2 (Vitha et al., 2001). Dichos genes se
han encontrado a su vez en procariotas relacionados con las
mitocondrias y presumiblemente participen en la división mitocondrial de algas y otros 3
Introducción
protistas (Beech and Gilson, 2000; Beech et al., 2000; Takahara et al., 2000). Sin embargo, y en contraste con lo que ocurre en cloroplastos, no se han encontrado homólogos del gen FtsZ en el genoma mitocondrial de Arabidopsis, humanos, ratones, C. elegans y levaduras. En su lugar, en plantas superiores, se ha descripto la existencia de dos proteínas denominadas “dynamin-like proteins”, ADL2a y ADL2b, las cuales participarían en el proceso de división mitocondrial (Arimura and Tsutsumi, 2002; Arimura et al., 2004).
Cada una de las mitocondrias presentes en la célula contiene su propio ADN, ARN y ribosomas. Este hecho da soporte a la teoría que supone que las mitocondrias descienden de bacterias aeróbicas que vivían simbióticamente con las células eucariotas primitivas (Lenhinger., 2005). Normalmente, el ADN presente en el total de mitocondrias de una célula somática no llega al 0.1 % del ADN celular total. El ADN mitocondrial codifica ciertas proteínas específicas de la membrana mitocondrial interna y algunos ARNt y ARNr mitocondriales. Si bien la mitocondria tiene su propio material genético, más del 98% de las proteínas que se localizan en esta organela están codificadas en el genoma nuclear que luego son sintetizadas en el citosol e importadas dentro de la mitocondria (Leaver, 1983; Unseld et al., 1997; Gray et al., 1999; Duby et al., 2002; Whelan and Glaser, 1997).
El primer informe sobre el importe de proteínas hacia la mitocondria de plantas fue realizado en 1987 (Boutry et al., 1987). Estudios posteriores determinaron la existencia de dos maquinarias en la membrana externa de mitocondrias: (i) la traslocasa general de membrana externa (TOM, Translocase of the Outher Membrane) y (ii) la maquinaria de ensamblaje SAM (Sorting and Assembly Machinery”) (Rapaport, 2002; Stojanovski et al., 2007). Además las mitocondrias contienen una tercera maquinaria de importe y ensamblado de proteínas del espacio intermembrana (MIA, Machinery for Intermembrane space import and Assembly”) (Neupert and Herrmann, 2007; Bolender et al., 2008).
4
Introducción
1.2.Fosforilación oxidativa
La fosforilación oxidativa es la síntesis de ATP impulsada por la transferencia de electrones al oxígeno, y la fotofosforilación, que es la síntesis de ATP impulsada por la luz, son los dos mecanismos más importantes de producción de ATP en las células, y generan conjuntamente la mayor parte del ATP sintetizado en los organismos aeróbicos (Lehninger et al., 1993; Hüttemann et al., 2008).
En la fosforilación oxidativa, se produce la reducción de O2 a H2O con electrones cedidos por el NADH y el FADH2 que captan los electrones de las reacciones oxidativas del complejo de la piruvato deshidrogenasa, del ciclo del ácido cítrico, de la ruta de la ß-oxidación de ácidos grasos y de reacciones del catabolismo de aminoácidos. Estos electrones son canalizados en forma de pares electrónicos hacia los complejos proteicos que forman la cadena respiratoria o cadena de transporte de electrones mitocondrial (Lehninger et al., 1993).
La cadena respiratoria mitocondrial está compuesta por cuatro complejos enzimáticos y dos transportadores electrónicos que en general son proteínas integrales de membrana, con grupos prostéticos capaces de aceptar y donar uno o dos electrones. Cada componente de la cadena puede aceptar electrones del transportador precedente y transferirlo al siguiente en una secuencia específica. Los complejos que forman esta cadena son: NADH deshidrogenasa (complejo I, CI), succinato deshidrogenasa (complejo II, CII), citocromo bc1 (complejo III, CIII), citocromo oxidasa (complejo IV, CIV), coenzima Q (ubiquinona) y el citocromo c (Hüttemann et al., 2008) (Figura 2).
5
Introducción
Figura 2: Representación esquemática de la cadena de transporte de electrones de la membrana interna mitocondrial (Lenhinger., 2005).
El CI se encuentra en la membrana interna mitocondrial y transfiere los electrones desde el NADH hacia la ubiquinona vía varios centros redox (FMN y centros Fe-S). Este complejo está formado por múltiples subunidades, alrededor de 30 a 46 en hongos y mamíferos. La mayoría de ellas están codificadas a nivel nuclear, mientras que algunas pocas subunidades están codificadas en el ADN mitocondrial. Por esto, se postula que es necesaria una fina regulación entre ambos genomas a fin de asegurar el correcto ensamblado y estequiometría del complejo (Rasmusson et al., 1998). En Arabidopsis, un total de 30 proteínas forman parte del CI, muchas de las cuales son homólogas a las encontradas en otros organismos. Recientemente han sido identificadas cuatro subunidades codificadas a nivel del genoma mitocondrial (ND1, ND5, ND7 Y ND9) y 17 subunidades codificadas a nivel nuclear (Heazlewood et al., 2003 ).
La succinato deshidrogenasa (CII), es una enzima que participa tanto en el ciclo del ácido cítrico como en la cadena de transporte de electrones. Cataliza la reacción de oxidación de succinato a fumarato y la reducción de ubiquinona a ubiquinol. (Scheffler, 1998; Ackrell, 2000). El CII ha sido caracterizado en bacterias, protozoos, hongos y animales y en todos ellos se ha encontrado que está compuesto por cuatro subunidades: una flavoproteina (SDH1), una subunidad Fe-S (SDH2), y dos 6
Introducción
subunidades de anclaje a membrana (SDH3 y SDH4) (Horsefield et al., 2004; Millar et al., 2004b). El sitio de unión al succinato está formado por el polipéptido SDH1, el cual se une covalentemente al FAD, actuando como aceptor de protones en el paso inicial de la oxidación del succinato. Esta subunidad flavoproteica, interactúa con la subunidad Fe-S que contiene tres centros Fe-S no hemínicos, [Fe2-S2], [Fe4-S4] and [Fe3-S4], que actúan como conductores de electrones desde la flavoproteína hacia la membrana (Scheffler, 1998; Ackrell, 2000; Hüttemann et al., 2008).
En Arabidopsis se ha podido separar el CII de los otros complejos por la técnica de “Blue-native Page”, y se demostró que está compuesto por al menos 8 subunidades proteicas. Así, el CII de Arabidopsis contiene las cuatro subunidades clásicas, las cuales poseen secuencias similares a las encontradas en otros organismos y 4 subunidades específicas de este organismo (Eubel et al., 2003). Las cuatro subunidades adicionales fueron denominadas SDH5, SDH6, SDH7 y SDH8, y serían subunidades específicas de plantas (Millar et al., 2004b). Las ocho subunidades de SDH se encuentran codificadas en el genoma nuclear (Scheffler, 1998; Figueroa et al., 2001; Millar et al., 2004b), encontrándose que varias de ellas están codificadas por más de un gen. Por ejemplo, la subunidad SDH1, está codificada por dos genes nucleares SDH1-1 y SDH1-2; SDH2, está codificada por tres, llamados, SDH2-1, SDH 2-2 y SDH2-3; SDH3 está codificada por otros tres, la subunidad SDH4 está codificada por un único gen nuclear y SDH7 se encuentra codificada por dos genes nucleares (Millar et al., 2004b).
La
ubiquinona-citocromo
c
oxidoreductasa
(CIII),
consiste
en
10
subunidades, incluídas las peptidasas mitocondriales, codificadas por 16 genes, ya que seis de estas subunidades, están codificadas por más de un gen en A. thaliana (Braun and Schmitz, 1992; Eubel et al., 2003). La mayoría de las subunidades que forman este complejo, están codificadas por el genoma nuclear (Kruft et al., 2001; Werhahn and Braun, 2002; Meyer et al., 2008), aunque existe una única subunidad, el citocromo b, que está codificada en el genoma mitocondrial (Unseld et al., 1997).
7
Introducción
La citocromo c oxidasa (COX, CIV) está formada por 13 subunidades en mamíferos, tres de las cuales están codificadas en el genoma mitocondrial y diez son nucleares. Previamente se había informado la existencia de 7 u 8 subunidades de este complejo en plantas (Peiffer et al., 1990). Estudios recientes llevados a cabo por Eubel y col. (Eubel et al., 2003) y Millar y col. (Millar et al., 2004) han dilucidado la presencia de al menos 12 subunidades del CIV en plantas de Arabidopsis. En estos trabajos se han identificado ocho proteínas homólogas a las subunidades conocidas de COX de otros organismos y otras seis subunidades específicas de plantas (Millar et al., 2004).
La mitocondria de plantas posee una bifurcación de la cadena de transporte de electrones clásica, dada por la presencia de cinco enzimas accesorias que no translocan protones: cuatro NADH deshidrogenasas insensibles a rotenona (NDH-DHS) y una oxidasa alternativa (Moller, 2001a) (Figura 3).
Figura 3: Organización de la cadena de transporte de electrones de mitocondria de plantas y el complejo ATP sintasa (CV). Adicionalmente a los complejos respiratorios CI al CIV encontrados en mitocondrias de otros organismos, la mitocondria de plantas contiene una oxidasa alternativa y NAD(P)H deshidrogenasas en el lado interno y externo de la membrana interna de la organela. (Tomado de Taiz y Zeiger, Plant Physiology, 2ª Edición).
La vía alternativa de respiración está compuesta por una única proteína llamada oxidasa alternativa (AOX) (Elthon and McIntosh, 1987), la cual existe como homodímero en la membrana mitocondrial interna (Umbach and Siedow, 1993), y se presenta en dos formas, una oxidada o menos activa, y otra reducida o activa (Umbach 8
Introducción
and Siedow, 1993) (Figura 3). Cuando ocurre alguna inhibición de los complejos respiratorios, especialmente CIV, como así también alguna saturación en la cadena de citocromos, produciendo un aumento de la relación ATP/ADP y NADH/NAD+, los electrones se desvían de la cadena de transporte clásica hacia la vía alternativa, al nivel del pool de ubiquinona (Lambers, 1982; Laties, 1983).
La enzima AOX cataliza la reducción de cuatro electrones del oxígeno hacia el agua, salteándose dos centros de conservación de energía (CIII y CIV) y, por lo tanto, no se genera el gradiente de protones que llevaría a la síntesis de ATP. Consecuentemente, la energía que es conservada como ATP en la vía clásica, se pierde como calor cuando los electrones pasan a través de la vía alternativa (Lambers, 1982). En Arabidopsis, AOX,
esta codificada por cinco genes, cuatro de los cuales se
denominan tipo AOX1 y uno tipo AOX2 (Considine et al., 2002). Se observó que la expresión de los diferentes genes que codifican para AOX depende del tipo tisular y el estadío de desarrollo del mismo (Saisho et al., 1997; Saisho et al., 2001; ThirkettleWatts et al., 2003). AOX1a se expresa en la mayoría de los tejidos, aunque AOX1c lo hace en cotiledones jóvenes y flores, teniendo mayores niveles de expresión en estas últimas. AOX1b, AOX1d y AOX2 se expresan en todos los tejidos pero en menores niveles. Se ha informado que AOX, tiene un papel antioxidante en la mitocondria de plantas, encontrándose mayores niveles de expresión en situaciones de estrés como el ocasionado por frío, ataque de patógenos, sequía, y daño celular. En estas situaciones los genes más afectados son los AOX1a y AOX1d (Millar et al., 2008 ).
La otra bifurcación de la cadena de transporte clásica, se da a nivel del complejo I por la presencia de NADH y NADPH deshidrogenasas insensibles a rotenona. Estas enzimas transfieren los electrones a la ubiquinona desde la matriz o el espacio intermembrana donde se encuentra el pool de NAD(P)H (Rasmusson et al., 2004). Como hemos mencionado, estas deshidrogenasas son insensibles a rotenona (inhibidor del CI) y consecuentemente la respiración en las plantas puede continuar en presencia de este compuesto (Roberts et al., 1995). Sin embargo, bajo estas condiciones el CI no puede translocar protones y por lo tanto habría una deficiencia en la producción de ATP. 9
Introducción
Por otro lado, se han identificado 7 genes de NDH-DHs en Arabidopsis y se los han dividido en tres clases: NDA (NDA1 y NDA2), NDB (NDB1, NDB2 y NDB4) y NDC (NDC1) (Michalecka et al., 2003). Usando experimentos de importe de proteínas marcadas radiactivamente, se reveló que NDA1, NDA2 y NDC1 están localizadas en el interior de la membrana interna, mientras que NDB1, NDB2 y NDB4 están localizadas en la parte externa de la membrana interna (Elhafez et al., 2006 ). A través de estudios de caracterización bioquímica en mitocondrias aisladas de plantas, se ha demostrado que las NADH deshidrogenasas internas, operan en paralelo con el CI (Rasmusson and Moller, 1991). Del lado externo de la membrana interna, el NADH y el NADPH, son oxidados por deshidrogenasas dependientes de Ca+2 (Roberts et al., 1995). A su vez, el NADPH interno puede oxidarse de una manera dependiente de Ca+2, mientras que la oxidación del NADH interno es la única actividad independiente de Ca+2 (Moller, 2001b). La diferente especificidad de cada una de las deshidrogenasas le permite a la planta poder oxidar el NAD(P)H durante distintas situaciones .
Algunos de los complejos de la cadena transportadora de electrones están compuestos por centros Fe-S, formando proteínas ferro – sulfuradas, en las cuales el hierro está presente no en la forma de hemo (como en los citocromos), sino en asociación con átomos de azufre inorgánico, con residuos de cisteína de la proteína, o con ambos (Lenhinger., 2005). Así, el complejo NADH deshidrogenasa contiene 8 centros Fe-S (Herald et al., 2003), el Complejo II posee 3 centros Fe-S (Elorza et al., 2004) y el citocromo c un grupo (Millar et al., 2004a). Además se ha descripto la presencia de otras proteínas Fe-S en la matriz mitocondrial como la enzima aconitasa (Elorza et al., 2004), que interviene en el ciclo de Krebs .
Uno de los tópicos de estudio en este trabajo de Tesis está relacionado con la caracterización de genes y sus productos proteicos que participan en el ensamblado de los centros Fe-S y biogénesis de ferrosulfoproteínas en plantas. Dado que la mayoría de las proteínas Fe-S mitocondriales está codificada por genes nucleares, el ensamblado de las mismas constituye un buen modelo para el estudio de los mecanismos de comunicación entre el núcleo y la mitocondria.
10
Introducción
1.3. Comunicación núcleo-mitocondria
La coordinación de funciones entre diferentes compartimentos y organelas celulares es esencial para el crecimiento y desarrollo de la planta. En estos últimos años, se ha incrementado el estudio y los conocimientos sobre las señales generadas por organelas como el cloroplasto y la mitocondria y la adaptación de la respuesta transcripcional nuclear a esas señales. A este proceso se lo denomina señalización retrógrada (Pogson et al., 2008).
Las mitocondrias y cloroplastos de plantas, tienen un origen bacteriano y un genoma propio y único. Sin embargo, durante la evolución, la mayoría de los genes endosimbióticos originales, han sido transferidos al núcleo, necesitando una señal que permita que la proteína sea sintetizada en el citosol y luego dirigida a la organela (Giege´ et al., 2005).
Como se mencionó anteriormente, más del 98% de las proteínas mitocondriales están codificadas en el ADN nuclear y son importadas dentro de la mitocondria, donde cumplen su función (Leaver, 1983; Unseld et al., 1997; Whelan and Glaser, 1997; Gray et al., 1999; Duby et al., 2002). Para ello, los genes nucleares que codifican para proteínas mitocondriales han adquirido señales de transcripción adecuadas (promotores) y secuencias de importe necesarias para que los productos sean dirigidos a la organela (Margulis, 1995; Figueroa et al., 1999). Aproximadamente de las 1000 o más proteínas que se estiman que constituyen la mitocondria funcional de plantas (Millar et al., 2004a), únicamente 33 proteínas, 3 ARNr y 20 ARNt son codificadas en el genoma mitocondrial en Arabidopsis thaliana (Unseld et al., 1997; Duchêne and Maréchal-Drouard, 2001).
Por lo descripto más arriba, debe existir una comunicación y regulación precisa entre el núcleo y la mitocondria para asegurar la expresión coordinada de ambos genomas. Esto es particularmente importante en la biogénesis de los complejos respiratorios de la membrana mitocondrial interna. Es claro, que la interrelación entre los factores de transcripción y coactivadores contribuyen a la expresión de genes 11
Introducción
respiratorios tanto nucleares como mitocondriales. Además, la regulación de la biogénesis mitocondrial depende de proteínas que al interaccionar con el ARN de proteínas mitocondriales, influencian su metabolismo y expresión (Cannino et al., 2007).
Estudios desarrollados por Brennicke y col. en Arabidopsis, han demostrado que la regulación de la expresión génica de mitocondrias, incluye un complejo proceso a nivel transcripcional y posttranscripcional, como el procesamiento del 5´y 3´ ARN, splicing de intrones, edición del ARN y regulación de la estabilidad del ARN (Binder and Brennicke, 2003). Estudios comparativos entre actividad transcripcional y los niveles de varios ARN codificados en el genoma mitocondrial de Arabidopsis, revelan una baja correlación entre la actividad relativa de los promotores y la abundancia de los transcriptos, sugiriendo una fuerte regulación a nivel postraduccional (Giegé et al., 2000).
Con el objeto de ampliar los conocimientos sobre los mecanismos de comunicación núcleo – mitocondria, en nuestro laboratorio se ha desarrollado un modelo de estudio basado en la construcción de plantas que presentan una disfunción mitocondrial generada por la expresión de un gen "no-editado" u-ATP9 (Hernould et al., 1993; Zabaleta et al., 1996; Gómez-Casati et al., 2002). La deficiencia mitocondrial indujo la expresión de tres genes nucleares que codifican proteínas Fe-S del complejo CI (PSST, TYKY y NADHbp), como así también otros factores asociados a este complejo, como es ARR2 (Arabidopsis Response Regulator 2). Este gen se expresa predominantemente en granos de polen y activaría la transcripción de algunos genes que codifican subunidades del CI como PSST (Lohrmann et al., 2001). El modelo de disfunción mitocondrial de las plantas u-ATP9 mostró también la inducción en los niveles de expresión de algunos genes nucleares relacionados con la síntesis de proteínas Fe-S en mitocondrias, como el homólogo de frataxina de Arabidopsis (AtFH) (Busi, et al., 2004).
12
Introducción
1.4 Biogénesis de los grupos Fe-S
La biogénesis de grupos Fe-S es una de las funciones esenciales de la mitocondria. Los grupos Fe-S son moléculas inorgánicas que forman parte de ferrosulfoproteínas celulares (Beinert et al., 1997). En los organismos vivos estos grupos se encuentran formando diferentes estructuras: (i) diméricas ([Fe2-S2]) que tienen estructura rómbica y (ii) tetraméricos ([Fe4-S4]), de estructura cúbica. Aunque los dos grupos descriptos son los más abundantes entre las proteínas Fe-S, también existen formas de mayor complejidad estequiométrica como por ejemplo el grupo [Fe8-S7] en la enzima nitrogenasa. En general, los grupos Fe-S están unidos a las cadenas polipeptídicas mediante enlaces que se establecen entre las cisteínas de la proteína y los átomos de azufre del cofactor (Figura 4). Una excepción la constituye la proteína Rieske (una de las subunidades del CIII mitocondrial) en la cual el átomo de Fe coordina con dos residuos de histidina en lugar de dos residuos de cys (Rieske et al., 1964; Iwata et al., 1996).
Figura 4: Esquema de la estructura de los grupos Fe-S unidos a un polipéptido. (a) Estructura simple con un único átomo de Fe coordinado con cuatro residuos de cys. Existen algunos centros que incluyen dos S inorgánicos y dos átomos de S de cisteínas (b) Fe2-S2 y (c) Fe4-S4 (Lenhinger., 2005).
Las ferrosulfoproteínas están involucradas en una gran cantidad de procesos celulares como reacciones enzimáticas, respiración celular, biogénesis de ribosomas, regulación de la expresión génica, fijación de nitrógeno y las respuestas a estrés. Una de las funciones más importantes está relacionada con la transferencia de electrones en los 13
Introducción
complejos respiratorios mitocondriales y en el aparato fotosintético de cloroplastos (Balk and Lobréaux, 2005; Lill and Muhlenhoff, 2008). Las ferrosulfoproteínas, pueden participar en estos procesos debido al amplio rango de potencial redox que presentan, ya que varía de -0.65 V hasta +0.45 V. Durante el proceso de transferencia de electrones, un átomo de Fe del centro Fe-S es oxidado o reducido dependiendo del microambiente en que se encuentre y el tipo de proteína a la cual esté unido (Beinert, 2000). Algunos ejemplos de proteínas Fe-S son los complejos respiratorios mitocondriales CI, CII y CIII; la aconitasa, presente en la matriz mitocondrial y relacionada con el ciclo de Krebs (Beinert et al., 1997); la nitrogenasa, relacionada con la fijación de N2 (Peters et al., 1995; Rees and Howard, 2000); la aldehído oxidasa, involucrada en la biosíntesis de ácido indolacético y ácido absícico (Andrade et al., 2000), la ferredoxina que participa en el proceso fotosintético (Hall et al., 1966; Palmer and Sands, 1966); la Iron Responsive Protein IRP1, de localización citosólica (Lill et al., 2005); y la endonucleasa Ntg2p presente en el núcleo celular (Lukianova and David, 2005) (Tabla 1).
14
Introducción
Tabla 1: Proteínas Fe-S y localización sub-celular en plantas superiores Proteína Aconitasa Adenosina 5´fosfosulfato reductasa (APS reductasa) Adrenodoxina (ferredoxina mitocondrial) Aldehído oxidasa Amidofosforibolsiltransferasa Biotina sintasa Clorofila a oxigenasa Colina monooxigenasa Cnx2 (síntesis molibdopterina) Acido dehidroxi dehidratasa ADN glicosilasa Endonucleasa III (NTH1) Ferredoxina Ferredoxina-tioredoxina reductasa Glutamato sintasa (Fd-GOGAT) Lipoato sintasa (relacionado con biotin sintasa) NADH- plastoquinona oxidoreductasa subunidades K, I, H (PsbG, NdhI, NdhH) NADH- ubiquinona oxidoreductasa (CI) Homólogo NBP35 (P-loop NTPasa) NAR1 (tipo hidroxilasa) Nitrito reductasa Feofórbido a oxigenasa (LLS1) Fotosistema I subunidades PsaA y PsaB Fotosistema I subunidade PsaC Proteína Rieske (PetC)(complejo citocromo b6f) Proteína Rieske (ubiquinol-citocromo c reductasa) Tipo inhibidor RNAsaL Sirohidroclorin ferroquelatasa Succinato deshidrogenasa subunidad 2 Sulfito reductasa Tic55, proteína plástidica de maquinaria de importe Xantina deshidrogenasa
Centro Fe-S [Fe4-S4] [Fe4-S4]
Localización a Mitocondria, citosol Plástido
[Fe2-S2] 2[Fe2-S2] [Fe4-S4] [Fe2-S2], [Fe4-S4] [Fe2-S2] (tipo Rieske) [Fe2-S2] (tipo Rieske)
Mitocondria Citosol Plástido Mitocondria Plástido Plástido Citosol (P) Plástido Núcleo Núcleo Plástido Plástido Plástido Mitocondria, plástido Plástido
b
[Fe4-S4] [Fe4-S4] [Fe4-S4] [Fe2-S2] [Fe4-S4] [Fe3-S4] [Fe2-S2], [Fe4-S4]? b
b b b
[Fe4-S4] [Fe2-S2], (tipo Rieske) [Fe4-S4] 2[Fe4-S4] [Fe2-S2] (tipo Rieske) [Fe2-S2] (tipo Rieske) b
[Fe2-S2] [Fe2-S2], [Fe3-S4], [Fe4-S4] [Fe4-S4] [Fe2-S2] (tipo Rieske) 2[Fe2-S2]
Mitocondria Citosol (P) Citosol (P) Plástido Plástido Plástido Plástido Plástido Mitocondria Citosol (P) Plástido Mitocondria Plástido Plástido Citosol
a
Fe-S proteínas encontradas en varias vías metabólicas en plantas, incluidas fotosíntesis, respiración, asimilación de nitrógeno y azufre, reparación al DNA y cofactores de biosíntesis. La mayoría de las proteínas Fe-S se encuentran en cloroplastos (plástidos) y mitocondria. (P) Predicho en base a secuencias u otra información b Tipo de centro Fe-S todavía no determinado. Tomada de Balk and Lobréaux, (2005).
Los centros Fe-S se pueden ensamblar a apoproteínas in vitro en presencia de S=, Fe+2 y Fe+3 y ditiotreitol (Balk and Lill, 2004). Esta reacción no puede llevarse a cabo in vivo, ya que el azufre y el hierro en sus formas libres son extremadamente tóxicos para la célula. Por este motivo, es necesario que la biosíntesis de los grupos Fe15
Introducción
S y su inserción a apoproteínas se lleve a cabo bajo un proceso controlado. In vivo, el ensamblado de los grupos Fe-S está asistido por una compleja maquinaria proteica de ensamblado que utiliza el aminoácido cisteína como fuente de sulfuro y se combina con el Fe, asociado a numerosas proteínas molde o scaffold, para formar los grupos Fe-S (Lill and Muhlenhoff, 2008).
La maquinaria de ensamblado está representada en la naturaleza por tres sistemas, estructural y funcionalmente relacionados: NIF, SUF e ISC (Balk and Lobréaux, 2005). El sistema NIF fue el primero en ser descripto en la bacteria fijadora de nitrógeno Azotobacter vinelandii, asociado con la biogénesis de la nitrogenasa, de allí su nombre (NItrogen Fixation) (Zheng et al., 1993). La maquinaria SUF, llamada así por su participación en la movilización de sulfuro, se encuentra en numerosas bacterias, arqueas y en cloroplastos de plantas, pero está ausente en hongos y metazoos. Este sistema se encuentra estrechamente relacionado al estrés oxidativo y al sensado de hierro en la célula (Takahashi and Tokumoto, 2002; Loiseau et al., 2003). La maquinaria ISC (Iron-Sulfur Cluster) representa el sistema más utilizado para la biogénesis de los grupos Fe-S y maduración de ferrosulfoproteínas de las células vivas, y ha sido descripto en cianobacterias, hongos, insectos, plantas y animales. En algunas bacterias, incluida Escherichia coli, el sistema ISC y SUF están presentes en paralelo, mientras que en otras especies existe solamente uno de estos sistemas. En eucariotas la maquinaria ISC está localizada en las mitocondrias aunque en los últimos años se ha postulado la existencia de un sistema paralelo en el citosol y en núcleo (Kispal et al., 1999; Mühlenhoff and Lill, 2000). La localización del sistema ISC en la mitocondria estaría asociada al ambiente reductor provisto por estas organelas (evidenciado por la ausencia de puentes disulfuros en las proteínas), condiciones que favorecen el ensamblado de los grupos Fe-S.
El mecanismo básico de biosíntesis de los grupos Fe-S requiere la presencia de 3 ó 4 proteínas claves, aunque en algunos organismos se han descripto hasta 10 y 12 polipéptidos involucrados (Balk and Lobréaux, 2005). Dentro de las proteínas claves se encuentra una cisteína desulfurasa y dos o tres proteínas scaffold, que actuarían como molde o soporte para la síntesis de los grupos Fe-S. En la Figura 5 se muestra un esquema de las etapas que serían comunes en los sistemas NIF, ISC y SUF. 16
Introducción
Figura 5: Representación esquemática de los pasos básicos en la biosíntesis de centros Fe-S. Tomado de Balk y Lobreaux (2005)
1.4.1. Biogénesis de grupos Fe-S en plantas
Recientemente, se ha descripto en Arabidopsis thaliana la existencia de genes homólogos a los que participan en la biogénesis de grupos Fe-S en otros organismos como levaduras y mamíferos (Balk and Lobréaux, 2005). Se postuló que en plantas existiría compartamentalización de las vías metabólicas que llevan a la síntesis de estos grupos y que dicho proceso está adaptado a las necesidades específicas de las células de organismos fotosintéticos. Los plástidos y las mitocondrias contienen vías genéticas y bioquímicamente diferentes para el ensamblado de centros Fe-S, sin embargo, se han encontrado numerosas proteínas homólogas en ambos compartimentos, sugiriendo que mecanismos similares estarían conservados en los pasos básicos del proceso de ensamblado (Balk and Lobréaux, 2005) (Figura 6, Tabla 2).
17
Introducción
Figura 6: Compartamentalización de la biogénesis de proteínas Fe-S en la célula vegetal. Las proteínas cuya localización no ha sido confirmada experimentalmente se encuentran en gris. Por analogía con levaduras, la mitocondria podría importar un componente (X) que sería requerido para la biogénesis de proteínas Fe-S en el citosol y el núcleo (flechas discontinuas) (Balk and Lobréaux, 2005).
18
NFU, CNFU-V
NFU3, CNFU-IVa
NFU4, NFU-III
NFU5, NFU-I
NAP1, SUFB,ABC1
NAP7, SUFC
At5g49940
At4g25910
At3g20970
At1g51390
At4g04770
At3g10670
Plástido(E)
Plástido(E)
Mit(E)
Mit(E)
Plástido(E)
Plástido(E)
Plástido(E)
NFU, CNFU-IVb
At4g01940
Plástido
Mit(P)
ISCA, SUFA
At1g10500
Mit(E)
At5g03905
ISU3
At3g01020
Mit(E)
Citosol(P)
ISU2
At4g04080
Mit(E)
At2g36260
ISU1
At4g22220
Plástido(P)
Plástido(E)
Mit(E)
Localización
Mit(P)
SUFE
At4g26500
e
At2g16710
NFS2, CpNifS
At1g08490
Nombre de la proteína
NFS1
a
At5g65720
Locus Arabidopsis
b
Isa
Isa1
Isa1
Isa
Isu1,2
Isu1,2
Isu1,2
----
SufC
SufB
----
----
NP_312283 Nfu1
NP_312283 Nfu1
NP_312283 Nfu1
NP_312283 Nfu1
NP_312283 NFU1
Isc/SufA
Isc/SufA
Isc/SufA
Isc/SufA
IscU
IscU
IscU
SufE
SufS/CsdB ----
c, e
Homologos E.coli Levadura IscS Nfs1
d
Slr0075(Sy)
Slr0074 (Sy)
C-term, NifU (Av)
Ssl2667 (Sy)
Slr1417 (Sy)
N-term, NifU(Av)
Slr1419 (Sy)
Slr0077 (Sy)
SII0387,Slr0704 (Sy)
NifS(Av),
Otros
Tabla 2: Proteínas confirmadas y candidatas de ensamblado de proteínas Fe-S en Arabidopsis thaliana
ABC/ATPasa
ABC/ATPasa
Scaffold
Scaffold
Scaffold
Scaffold
Scaffold
Scaffold
Scaffold
Scaffold
Scaffold
Scaffold
Scaffold
Scaffold
Co-enzima de SufS
Cys desulfurasa grupo II
Cys desulfurasa grupo I
Función Molecular
ADX1, MFDX2
ADX2, MFDX1
ADXR, MFDR
At4g21090
At4g05450
At4g32360
ATM1, STA2
ATM2
ATM3, STA1
ERV1
HCF101
HCF101-L2
HCF101-L1
APO1
At4g28630
At4g28620
At5g58270
At1g49880
At3g24430
At5g50960
At4g19540
At1g64810
Plástido(P)
At1g54500?
-----
----------
Nar1
------
Cfd1
Mrp -----
-----
Nbp35
-----
Erv1
Atm1
Atm1
Atm1
Yfh1
Jac1
Ssq1
Arh1
Yah1
Yah1
----
Mrp
Mrp
Mrp
-----
-----
-----
-----
CyaY
HscB
HscA
Fdx
Fdx
SufD
RubA(Syc)
NifH (Av)
Slr0067 (Sy)
Frataxina (Hs)
Slr0076(Sy)
Rubredoxina
Tipo hidrogenasa
Desconocida
P-loop NTPasa
P-loop NTPasa
P-loop NTPasa
P-loop NTPasa
Sulfidril oxidasa
Transportador ABC
Transportador ABC
Transportador ABC
Chaperona Fe
Co-Chaperona
Chaperona (HSP70)
Reductasa
Ferrodoxina
Ferrodoxina
Proteína ABC
Proteínas componentes de la maquinaria de ensamblado de proteínas Fe-S en plantas, por evidencia experimental o por homología con proteínas de levaduras o bacterias. b Localización subcelular está basada en resultados experimentales (E) o predichos por programas bioinformáticos (P) o alguna otra evidencia.
a
Citosol(P)
Plástido(E)
Mit(P)
Citosol (P)
Plástido (E)
Mit(E)
Mit(E)
Mit(P)
At4g16440
Rubredoxina
Mit(P)
FH
At4g03240 Mit(E)
Mit(P)
Mit(P)
Mit(E)
Mit(E)
Mit(E)
Plástido(E)
At5g06410
At5g09590
At4g37910 o
NAP6, SUFD
At1g32500
Todas las proteínas plastídicas excepto APO1 tienen homólogos in la cianobacteria Synechocystis , sugiriendo que la maquinaria de ensamblado de centros Fe-S es heredada de sus ancestros comunes, de acuerdo con la teoría endosimbiótica. El homologo de las proteínas IscS y IscU en E.coli están localizadas en mitocondria (Mit). Notar que la mitocondria no tiene homólogos de SUF, de acuerdo con su ausencia en el genoma de levaduras y mamíferos. d Homólogos seleccionados en otros organismos: Av, bacteria fijadora de nitrógeno Azotobacter vinelandii ; Sy, la cianobacteria Synechocystis sp. .PCC 6803; Syc la cianobacteria Synechochoccus sp. PCC 7002; Hs, Homo sapiens; C-term., C-terminal; N-term., N-terminal. e Indica ausencia de homólogos; las celdas vacías en las columnas significan que los loci o las proteínas no han sido anotadas o nombradas por el momento Tomada de Balk and Lobreaux (2005).
c
Introducción
Takahashi y colaboradores han demostrado la existencia del proceso de ensamblado de centros Fe-S en el estroma del cloroplasto, dependiente de ATP y de NADPH (Takahashi et al, 1991). Se han identificado además, en el genoma de Arabidopsis dos genes que codifican para cisteínas desulfurasas: NFS1 y NFS2 (Kushnir et al., 2001; Pilon-Smits et al., 2002). Recientemente se inició la caracterización parcial de AtNfs1, AtNfs2 y AtSUFE, que codifican para las cisteínas desulfurasas mitocondrial y plastídica, y para el activador de estas enzimas, respectivamente (Pilon-Smits et al., 2002b; Xu and Møller, 2006).
Otro de los genes descriptos en el genoma de Arabidopsis a partir de análisis bioinformáticos es el homólogo de Suf. Este gen codifica para una proteína de plástidos y se ha descripto como activador de las cisteínas desulfurasas cloroplásticas (Balk and Lobréaux, 2005; Ye et al., 2006). Por otra parte, también se han encontrado cinco genes
NFU, tres de los cuales codifican para proteínas localizadas en plástidos (Léon et al., 2003).
Hasta el momento no existen estudios in vivo donde se haya demostrado el ensamblado de proteínas Fe-S en mitocondrias de plantas, sin embargo, estas organelas contienen varios componentes que son homólogos a la maquinaria ISC de bacterias y levaduras. Por ejemplo, dos de las cinco proteínas NFU y la proteína “scaffold” IscA/Isa de Arabidopsis se encuentran localizadas en mitocondria. Por otro lado, el genoma de Arabidopsis contiene tres genes con alta similitud de secuencia con IscU/Isu que codifican proteínas con localización mitocondrial (Léon et al., 2005). Otra de las proteínas asociadas con la síntesis de grupos Fe-S es la proteína frataxina. Mediante análisis bioinformáticos, Huynen y col. (2001) predijeron la participación de frataxina en el ensamblaje de los grupo Fe-S a proteínas. Se postuló también que esta proteína estaría relacionada con daño oxidativo y disfunción mitocondrial (Koutnikova et al., 1997; Rotig et al., 1997). Recientemente en nuestro laboratorio se ha aislado y caracterizado el gen AtFH que codifica para la frataxina de Arabidopsis thaliana (Busi et al., 2004). La función y estructura de esta proteína en mitocondrias de plantas será objeto de estudio en este trabajo de Tesis.
22
Introducción
Con lo mencionado hasta el momento, se postula que los componentes claves de la maquinaria ISC mitocondrial, como fue identificada en levaduras, estarían presentes también en la mitocondria de plantas, indicando que esta organela sería capaz de ensamblar sus propias proteínas Fe-S.
A pesar de que las proteínas Fe-S son más abundantes en cloroplastos y mitocondrias, un gran grupo de proteínas Fe-S desarrollan sus funciones en el citosol y el núcleo. Cómo estas proteínas obtienen sus cofactores Fe-S es un punto de gran interés e investigación en este momento. Ya hemos mencionado la presencia, en eucariotas no fotosintéticos, de un sistema de ensamblado para proteínas Fe-S citosólicas (CIA), posiblemente las plantas cuenten con un sistema similar (Balk and Lobréaux, 2005).
1.5. Producción de especies reactivas de oxígeno
Las especies reactivas del oxígeno (ROS) son un conjunto de moléculas derivadas del metabolismo celular en el cual el oxígeno cumple un papel fundamental. .-
Entre las ROS se encuentran: (i) el anión superóxido (O2 ) que es un potente oxidante; (ii) el peróxido de hidrógeno (H2O2), que es el más estable de las ROS, pudiendo difundir a través de la membrana y causar daño oxidativo a proteínas distantes a la zona .
de producción (Moller, 2001a); y (iii) el radical hidroxilo ( OH) que es la especie más reactiva. La alta reactividad de las ROS se debe a que poseen electrones desapareados que les hace reaccionar con otras moléculas orgánicas en procesos redox.
El estrés oxidativo incluye una serie de procesos deletéreos que resultan del desbalance entre la formación excesiva de ROS y/o de especies reactivas de nitrógeno (RNS) y la limitada defensa antioxidante. Mientras que pequeñas fluctuaciones en los niveles de concentración de ROS juegan un papel importante en la señalización intracelular (Droge and 2002; Balaban et al., 2005), un aumento descontrolado de estos oxidantes lleva a una liberación de especies reactivas provocando daño a proteínas (Stadtman and Levine, 2000), lípidos (Rubbo et al., 1994), polisacáridos (Kaur and 23
Introducción
Halliwell, 1994;) y ADN (LeDoux et al., 1999; Richter et al., 1988). Esta producción de ROS provoca daño mitocondrial, ocasionando un amplio rango de patologías que pueden llevar a apoptosis (Figura 7).
Figura 7: Esquema de la producción de ROS mitocondrial (Murphy M., 2009). La producción de ROS por la mitocondria puede causar daño a proteínas mitocondriales, membrana y DNA, imposibilitando a la mitocondria a sintetizar ATP y otra gran cantidad de funciones metabólicas que se llevan a cabo en ella. El daño oxidativo en la mitocondria puede aumentar la tendencia de la mitocondria a liberar proteínas del espacio intermembrana como con la citocromo c (cyt c), al citosol, permeabilizando la membrana externa y de esta manera activar la maquinaria apoptótica de la célula. Además, la producción de ROS en la mitocondria produce la inducción de poros de permeabilidad transitoria (PTP), produciendo daño en la permeabilidad de la membrana. Por otro lado, la producción de ROS puede mediar la señalización redox, afectando reversiblemente las funciones de mitocondria, citosol y núcleo. Mitochondrion: mitocondria. Intermembrane space: espacio intermembrana. Outer membrane: membrana externa. Inner membrane: membrana interna. Respiratory chain: cadena respiratoria. Lipid peroxidation: peroxidación lipídica. Oxidative damage: daño oxidativo. Defective proteins: proteínas defectuosas. Mutations and deletions: mutaciones y deleciones.
En 1966, se dio a conocer el primer trabajo en donde se involucraba a la cadena de transporte de electrones como productora de ROS (Jensen, 1966). Otros estudios demostraron que mitocondrias aisladas tenían la capacidad de producir H2O2 (Loschen et al., 1971; Chance et al., 1979; Jensen, 1966). Sin embargo, las mitocondrias no son el único sitio de producción de ROS en las células, se informó que también existe producción de ROS en cloroplastos, peroxisomas, retículo endoplásmico, núcleo y citosol (Moller, 2001a; del Río et al., 2003 ;Andreyev et al., 2005). 24
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Dentro de las mitocondrias, los complejos CI y CIII de la cadena de transporte de electrones son dos de los principales sitios de producción de ROS. Se describió también, que la inhibición del CI por rotenona o del CIII por antimicina A lleva a un aumento en los niveles de ROS (Sugioka et al., 1988; Chen et al., 2003 ). Sin embargo, se ha descripto en células de mamíferos, que en algunas condiciones patológicas existiría una disminución de ROS en CI luego del tratamiento con rotenona (Becker et al., 1999).
Existen diversos mecanismos para disminuír los niveles de ROS en las células. Las superóxido dismutasas (SODs), constituyen la primera línea de defensa contra las ROS, catalizando la dismutación del radical superóxido a peróxido de hidrógeno y oxígeno (Fridovich, 1995; del Río et al., 2003 ). De acuerdo al metal que utiliza la enzima como cofactor, las SODs se clasifican en tres grupos: Fe-SOD, la cual está localizada en los cloroplastos, Mn-SOD, localizada en mitocondrias y peroxisomas, y la Cu-Zn-SOD, localizada en el cloroplasto, citosol y espacio extracelular (Fridovich, 1986 ; Bannister et al., 1991; Kanematsu and Asada, 1991; Smith and Doolittle, 1992). El peróxido de hidrógeno producido se descompone a agua y oxígeno por acción de una enzima que contiene hemo, la catalasa (Kwon and Sun An, 2007). La catalasa, está localizada mayoritariamente en los peroxisomas, aunque se ha reportado la existencia de isoformas mitocondriales y apoplásticas (Scandalios et al., 1980).
El peróxido de hidrógeno se remueve además por otros mecanismos en la mitocondria de plantas. Uno de estos mecanismos, es el ciclo glutatión – ascorbato el cual está compuesto por la ascorbato peroxidasa, la dehidroascorbato reductasa y la glutatión reductasa (Jimenez et al., 1997 ; Chew et al., 2003). La ascorbato peroxidasa reduce el peróxido de hidrógeno a agua usando ascorbato, que es reducido por una secuencia de reacciones a cargo de la monohidroascorbato reductasa y la dehidroascorbato reductasa que utilizan glutatión reducido. Por último la glutatión reductasa regenera el glutatión reducido (GSH) a su forma oxidada (GSSG) para continuar el ciclo.
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Otras proteínas que intervienen en la respuesta a daño oxidativo son las peroxiredoxinas. Las peroxiredoxinas mitocondriales regulan los eventos de traducción de señales mediados por peróxido a la vez que lo reducen, pudiendo también detoxificar alquilhidroperóxidos y peroxinitrito (Dietz et al., 2006; Finkemeier et al., 2005). Debido a esta actividad, estas proteínas modularían la oxidación lipídica y la señalización relacionada con NO (Baier and Dietz, 2005; Rhee et al., 2005). Las peroxiredoxinas utilizan tioredoxina o glutatión como fuente de poder reductor. Además, en estas reacciones también intervienen las enzimas tioredoxina reductasa o la glutatión reductasa y el NADPH mitocondrial (Gelhaye et al., 2004; Sweetlove and Foyer, 2004). Se informó también que la actividad de la AOX cumple un papel importante en la reducción de los niveles de ROS en las células vegetales (Maxwell et al., 1999).
Por otro lado, además de los procesos enzimáticos que hemos descripto, las plantas poseen otros mecanismos para contrarrestar los efectos del estrés sobre las proteínas como la sobreexpresión de chaperonas y otras proteínas estabilizadoras, como así también la acumulación de moléculas orgánicas de bajo peso molecular conocidas como osmolitos o solutos compatibles (Chen and Murata, 2002; Wang et al., 2004). Estos mecanismos influyen sobre el aumento de la estabilidad y la prevención de la agregación de las proteínas y la degradación irreversible de la molécula dañada.
1.6. Hierro y daño oxidativo.
Una porción significativa del hierro intracelular en las células de mamíferos es dirigido a la mitocondria, dependiendo de los requerimientos metabólicos celulares (Schueck et al., 2001). La captación citosólica de hierro ocurre cuando el transportador extracelular transferrina se une al receptor de alta afinidad de superficie y es endocitado (Napier et al., 2005). El receptor de transferrina (TfR) es expresado ubicuamente en todas las células (Klausner et al., 1993.). Una vez que el complejo transferrina-TfR es internalizado en los endosomas, el hierro es liberado en el citosol y reducido del estado Fe3+ a Fe2+ soluble utilizando el transportador de metales divalentes (DMT-1) (Garrick et al., 2003). Este transportador está ampliamente expresado como una proteína integral 26
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de membrana que transporta cationes de metales divalentes, incluido el Fe+2 (Gunshin et al., 1997; Fleming et al., 1998). Los mecanismos específicos que determinan y facilitan la captación de hierro por la mitocondria siguen sin definirse (Carraway et al., 2006).
Para mantener la homeostasis celular del hierro, la expresión de transportadores citosólicos y de proteínas de almacenamiento (ferritina, DMT-1 y TfR) es rápidamente regulada por cambios en los niveles de hierro celular. El control posttranscripcional de la estabilidad del ARNm y su traducción ocurre a través de la interacción entre proteínas regulatorias de hierro (IRP) y elementos regulatorios de hierro (IRE) ubicados en regiones no transcriptas del ARNm. Cuando los niveles de hierro aumentan, estas interacciones causan un rápido descenso en la expresión de TfR y un aumento de la ferritina (Klausner et al., 1993.; Gunshin et al., 1997; Fleming et al., 1998; Carraway et al., 2006).
El hierro es un nutriente esencial para las plantas. Su función es donar y aceptar electrones, hecho fundamental en la cadena de transporte de electrones de la respiración y fotosíntesis. Sin embargo, es tóxico cuando se acumula a altos niveles: puede actuar vía la reacción de Fenton generando radicales hidroxilo que dañan lípidos, proteínas y ácidos nucleicos (Figura 8). Las plantas deben entonces ser capaces de responder ante dos situaciones, la sobrecarga y la deficiencia de hierro (Connolly and Guerinot, 2002,).
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Figura 8: Vía metabólica de formación de especies reactivas de oxígeno en plantas. La figura muestra la participación de otras enzimas importantes en esta vía metabólica: APX, ascorbato peroxidasa; GSH glutatión peroxidasa; SDO, superóxido dismutasa. (Tomado de Mori y colaboradosres (Mori and Schroeder, 2004)).
Debido a la potencial toxicidad asociada a los altos niveles de hierro, las células lo almacenan en la proteína especializada ferritina. Las múltiples subunidades (más de 24) que componen la ferritina forman una estructura hueca que puede albergar más de 4.500 átomos de hierro en su interior. Así, la ferritina juega un papel importante en la homeostasis de hierro. Los estudios de las ferritinas de plantas han revelado diferencias importantes en su estructura, localización y regulación respecto a las de animales. Mientras que éstas últimas son encontradas en el citosol, las de plantas contienen péptidos tránsito que las dirigen a organelas (Proudhon et al., 1996). Además, mientras que la expresión regulada por hierro de la ferritina animal es controlada principalmente a nivel de traducción mediante el sistema IRE-IRP, los experimentos realizados en maíz y soja demostraron que la expresión está regulada tanto a nivel transcripcional (Lescure et al., 1991; Lobréaux et al., 1992; Wei and Theil, 2000; Petit et al., 2001) como post transcripcional (Fobis-Loisy et al., 1996). Un detalle significativo es que no se han encontrado regiones regulatorias IRE en las ferritinas de plantas (Briat et al., 1999).
La mayor cantidad de hierro requerida en una célula eucariota es consumido en su gran mayoría por la vía de síntesis del grupo hemo y la biosíntesis de centros FeS. Estos dos procesos son llevados a cabo por la mitocondria y necesitan del transporte 28
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activo del hierro reducido a través de la membrana interna mitocondrial (Lange et al., 1999). Hace varias décadas se ha postulado la presencia de proteínas capaces de captar hierro en la mitocondria (Flatmark and Romslo, 1975) y estudios recientes han identificado proteínas de la membrana mitocondrial interna que estarían involucradas en transporte activo de hierro mitocondrial (Kispal et al., 1997 ; Foury and Roganti, 2002; Park et al., 2002).
Como se comentó más arriba, altas concentraciones de Fe pueden favorecer la producción de radicales ·OH, un potente oxidante que causa daño de moléculas incluyendo al ADN y proteínas. Por el contrario, la deficiencia de Fe interrumpe el normal ensamblado de ferro- y hemoproteínas de la cadena respiratoria mitocondrial (Attama et al, 2001; Lin et al, 2001; Nihei et al, 2001) hecho que conduce también a un desbalance de especies del oxígeno. Una deficiencia en el proceso de síntesis de grupos Fe-S puede provocar la acumulación de Fe3+ y S2-, tóxicos metabólicos que generan daño celular. La mitocondria contiene concentraciones micromolares de Fe biodisponible y uno de los mayores retos biológicos en la célula es mantener este hierro en forma soluble (Fe+2) y no tóxica dado al pH alcalino y la alta producción de anión superóxido y peróxido de hidrogeno que posee la mitocondria (Tangerås, 1985; Mori and Schroeder, 2004). Es esencial, entonces, que exista una fina regulación de la formación y el correcto ensamblado del hierro a las ferrosulfo- y hemoproteínas para que no se acumule hierro a niveles tóxicos.
Se ha descripto que en levaduras y animales la proteína frataxina es esencial para la homeostasis celular de hierro y la supervivencia ante el daño oxidativo mientras que en plantas, este fenómeno no había sido abordado hasta el momento. A principios de 2009, se presentaron resultados que vinculan los niveles de hierro intracelulares y el aumento de óxido nítrico (NO) con la deficiencia de frataxina y estrés oxidativo (Martin et al., 2009).
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1.7. Frataxina: estructura y función
El primer hallazgo de la existencia de frataxina, surgió a partir de los conocimientos de una enfermedad humana denominada Ataxia de Friedreich (FRDA). Ésta es una enfermedad cardio-neurodegenerativa con baja sobrevida, causada por la deficiencia de frataxina, una proteína codificada a nivel nuclear y de localización mitocondrial. La proteína proveniente de humanos contiene 169 aminoácidos y está codificada por un gen de 507 pb ubicado en el cromosoma 9 (Campuzano et al., 1996; Schapira, 1998; Becker et al., 2001).
La deficiencia en la expresión del gen de frataxina es consecuencia de la presencia de una expansión del triplete GAA en el primer intrón (Campuzano et al., 1996). Esta expansión intrónica provoca una conformación inusual en la heterocromatina dando una estructura ȕ –ADN (triple hélice) poco común, que determina el silenciamiento y la subsecuente reducción de la expresión de frataxina (Sakamoto et al., 1999). La mayoría de los pacientes son homocigotas para la expansión GAA, aunque se han encontrado también algunos heterocigotas con una mutación puntual en uno de los alelos y una expansión del triplete GAA en el otro alelo del gen (Cossée et al., 1999).
Esta enfermedad es progresiva y en los tejidos especializados de alta demanda energética, (neuronas de los ganglios de la raíz dorsal, células de músculo cardíaco y células ȕ del páncreas) se observa una disfunción mitocondrial y muerte celular (Puccio et al., 2001). La ataxia progresiva de los miembros, la hipertrofia cardíaca y la diabetes mellitus encontrada en estos pacientes se atribuyen a los bajos niveles de ATP producidos en estos tejidos (Lodi et al., 1999). Cuanto mayor sea la expansión del triplete GAA, se produce mayor deficiencia en la expresión de frataxina determinando mayor gravedad de la enfermedad (Campuzano et al., 1997).
La frataxina es una proteína que ha sido ampliamente conservada a través de la evolución en bacterias, levaduras, mamíferos y plantas sin presentar mayores cambios estructurales. Esta conservación secuencial, y la presencia de un único y novedoso 30
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plegamiento proteico (llamado dominio frataxina), sugiere que puede cumplir un papel similar en todos estos organismos (Dhe-Paganon et al., 2000; Musco et al., 2000). El dominio frataxina parece ser característico de esta proteína (y los homólogos relacionados) y no se han encontrado hasta la fecha otras proteínas en banco de datos con este dominio particular (Cho et al., 2000; Musco et al., 2000). La Figura 9 muestra la conservación de los elementos correspondientes a la estructura secundaria de frataxinas de diferentes organismos. No existen deleciones o inserciones significativas entre las regiones de Į hélice predichas y las láminas ȕ.
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Figura 9: Alineamiento de la secuencia de la frataxina humana con homólogos procariotas y eucariotas. En verde agua se muestran los segmentos responsables de la estructura secundaria Į hélice, y en verde brillante los correspondientes a láminas ȕ. Los alineamientos fueron realizados por el programa Multalin. Los residuos iguales se encuentran en rojo. Los residuos altamente conservados en azul. Los residuos en mayúsculas en las secuencias consenso ocurren con una frecuencia de un 83%, los residuos en minúsculas ocurren entre un 67% y 83% de frecuencia (Dhe-Paganon et al., 2000).
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El dominio frataxina de la proteína de humanos (residuos 88-210, sin la secuencia N-terminal de importe a mitocondria) presenta una conformación de Įȕsandwich (Figura 10A). Doce residuos acídicos de la hélice Į1 y de la hoja ȕ1 forman una larga y continua zona de alta densidad de carga negativa en la superficie de la proteína creando un dipolo (Figura 10B) (Dhe-Paganon et al., 2000). Debido al tamaño y naturaleza de este dipolo, se postula una potencial interacción de esta proteína con otros ligandos u otras proteínas. Tanto la estructura global como su superficie aniónica, se encuentra conservada en todos los organismos estudiados (Gibson et al., 1996; Cañizares et al., 2000). Nueve de los 12 residuos con carga negativa, descriptos para la frataxina humana, están conservados en AtFH (homologo de frataxina en Arabidopsis thaliana). La presencia de esta superficie con carga negativa, más la conservación de residuos aminoacídicos, sugieren dos cosas: (i) frataxina podría interaccionar con otras proteínas para ejercer su función biológica y (ii) los aminoácidos cargados negativamente podrían ser claves en determinar esta función.
Figura 10 A: Estructura de la frataxina. El diagrama muestra el plegamiento de la frataxina, una estructura compacta Įȕ-sandwich. Las Į-hélices están mostradas verde agua y láminas ȕ en verde brillante. Las láminas desde ȕ1 a ȕ5, forman un piso de láminas ȕ antiparalelo, que interacciona con las dos Į hélices. Las dos hélices están cercanamente en paralelo entre ellas y con el plano de la larga lámina ȕ formada. Se forma una pequeña lámina ȕ en el extremo C-terminal de ȕ5 y las láminas ȕ6 y ȕ7 (Dhe-Paganon et al., 2000).
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Figura 10 B: Representación de la superficie molecular de frataxina. La superficie molecular fue calculada y sombreada de acuerdo con los potenciales electrostáticos (-10 kt/e, rojo y +10 kt/e, azul) con el programa GRASP (Nicholls et al., 1991). Los residuos individuales en la superficie acídica están marcados (Dhe-Paganon et al., 2000).
Se han propuesto diversas funciones en las cuales frataxina podría intervenir, incluyendo homeostasis del hierro y respiración (Babcock et al., 1997), metabolismo del hemo (Lesuisse et al., 2003), ensamblado de centros Fe-S (Chen et al., 2002), fosforilación oxidativa y estrés oxidativo (Ristow et al., 2000) y acumulación de Fe en mitocondria bajo una forma hidrosoluble y no tóxica (Babcock et al., 1997; Isaya et al., 2004). Sin embargo, hasta el momento no está clara su función precisa.
En eucariotas, frataxina es necesaria para el normal funcionamiento de la mitocondria (Wilson and Roof, 1997; Koutnikova et al., 1998). Levaduras deficientes en la expresión del homólogo de frataxina, YFH, presentaron una disminución en la respiración (Wilson and Roof, 1997), pérdida de DNA mitocondrial (Koutnikova et al., 1997) y acumulación de hierro en la mitocondria (Babcock et al., 1997). En extractos de mitocondrias de levaduras que carecen de frataxina, la formación de proteínas Fe-S está severamente reducida, sugiriendo su participación en la biogénesis de proteínas Fe-S (Huynen et al., 2001; Muhlenhoff et al., 2002). Se ha descripto recientemente que la frataxina actuaría como una chaperona de hierro y modularía la actividad de proteínas mitocondriales como por ejemplo, la aconitasa (Bulteau et al., 2004). Zhang y col (2005) han sugerido que frataxina jugaría un papel importante en la protección del Fe
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biodisponible dentro de la mitocondria, facilitando su utilización no sólo en el ensamblaje de Fe-S proteínas, sino también para síntesis del grupo hemo.
Otros trabajos sugieren que frataxina estaría involucrada en la conversión energética mitocondrial y la fosforilación oxidativa. Se informó que la sobreexpresión de frataxina en células de mamíferos causa una inducción del flujo del ciclo de Krebs con un incremento en la actividad respiratoria, aumento del potencial de membrana mitocondrial y elevado contenido de ATP celular (Ristow et al., 2000).
La mayoría de los trabajos realizados sobre frataxina fueron llevados a cabo en bacterias, levaduras y mamíferos, no habiendo ninguna descripción de esta proteína en plantas. Como mencionamos más arriba, se aisló recientemente en nuestro laboratorio el gen de frataxina de Arabidopsis thaliana (AtFH, At4g03240). AtFH se encuentra codificado en el cromosoma 4, y está compuesto por cinco exones y cuatro intrones, dando un ARNm de 564 pb que codifica una proteína de 187 aminoácidos y de masa molecular 14kDa. El análisis con el programa PSORT o MITOPROT II sobre la secuencia aminoacídica de AtFH, permitió identificar un posible péptido tránsito para la localización mitocondrial, compuesto por los primeros 31 aminoácidos (Busi et al., 2004). Este resultado coincide con los resultados obtenidos con el homólogo de frataxina de levaduras, ya que estudios de localización celular mostraron que YFH se encuentra en mitocondrias (Cavadini et al., 2000). Además se describió que YFH es procesado por proteasas para dar luego la forma madura y funcional de la proteína (Branda et al., 1999). Es importante destacar que el homólogo de frataxina de humanos es doblemente procesado, dando lugar también a la forma madura de la proteína con posible localización en el espacio intermembrana mitocondrial (Cavadini et al., 2000).
Se llevaron a cabo también ensayos de complementación con AtFH de células de Saccharomyces cerevisiae mutantes nulas para la expresión de frataxina (ǻyfh). La cepa mutante nula muestra baja tasa respiratoria y alta sensibilidad a agentes oxidantes. Los resultados de complementación mostraron que AtFH restauró la tasa respiratoria y provocó una disminución a la sensibilidad a agentes oxidantes en levadura complementada (Busi et al., 2004). Estos datos permiten postular que AtFH sería una 35
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proteína funcional y que podría estar involucrada en la respiración mitocondrial y en respuesta a estrés oxidativo. Por lo tanto, aunque se han sugerido diversas funciones para frataxina, su función precisa queda aún por dilucidarse. Hasta el momento no existían reportes sobre la presencia o función de esta proteína en organismos vegetales.
1.8. Biogénesis de hemoproteínas
Como describimos más arriba, la función de la mitocondria, depende de un continuo suministro de hierro para la formación de centros Fe-S (ISC) y para la vía de biosíntesis del hemo (O'Neill et al., 2005). Estos dos procesos son llevados a cabo dentro de la organela (Muhlenhoff et al., 2002; Lange et al., 2004).
Los tetrapirroles son compuestos que juegan un papel vital en varios procesos celulares, incluídos la
fotosíntesis y respiración. Las plantas superiores contienen
cuatro clases de tetrapirroles: clorofilas, hemo, sirohemo y fitocromobilinas. Se ha descripto que todos los tetrapirroles derivan de una vía fotosintética común (Tanaka and Tanaka, 2007) (Figura 11).
La vía de biosíntesis de tetrapirroles presenta numerosas ramificaciones. Las etapas que van desde glutamato a uroporfirinógeno III son comunes para la síntesis en plantas superiores de los cuatro tetrapirroles antes mencionados. Los tres pasos siguientes, hasta la producción de protoporfirina IX son comunes para la biosíntesis de clorofila, hemo y fitocromobilina. Finalmente, las últimas etapas son únicas para cada uno de los tetrapirroles descriptos (Tanaka and Tanaka, 2007).
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Figura 11: Biosíntesis de tetrapilloles. Los números indican las enzimas que catalizan cada reacción. 1: glutamil t-RNA sintetasa, 2: glutamil t-RNA reductasa, 3: glutamato 1- semialdehído aminotransferasa, 4: ALA dehidratasa o porfobilinógeno sintasa, 5: porfobilinógeno deaminasa, 6: uroporfirinógeno III sintasa, 7: uroporfirinógeno III decarboxilasa, 8: coproporfirinógeno III oxidasa (CPOX), 9: protoporfirinógeno IX oxidasa (PPOX), 10: magnesio quelatasa, 11: magnesio protoporfirina IX metiltransferasa, 12: magnesio protoporfirina IX monometilester ciclasa, 13: protoclorofilina oxidoreductasa, 14: divinilclorfilina reductasa, 15: clorofila sintasa, 16: clorofilina a oxigenasa, 17:clorofilasa, 18 y 19: clorofila b reductasa, 20: metiltransferasa, 21: oxidasa no identificada hasta el momento, 22: sirohidroclorin ferroquelatasa, 23: ferroquelatasa (FeCh), 24: hemo oxigenasa, 25: fitocromobilin sintasa.
La mayor parte de la síntesis de tetrapirroles en plantas ocurre en los cloroplastos. Esta localización no es sorprendente para la rama de bifurcación de la biosíntesis de sirohemo y clorofilas, ya que los productos finales de esta rama funcionan exclusivamente en plástidos. A su vez, todos los pasos metabólicos identificados para la síntesis de fitocromobilina, también están localizados en el cloroplasto a pesar que la unión del cromóforo a la apoproteína ocurre en el citosol (Kohchi et al., 2001; Terry et al., 2002).
La síntesis del grupo hemo es bastante más compleja, y su localización exacta es todavía incierta, particularmente en organismos vegetales. Se ha sugerido que las últimas tres enzimas de la vía de biosíntesis de hemo, CPOX (coproporfirinógeno oxidasa III), PPOX (protoporfirinógeno oxidasa IX) y FeCh (ferroquelatasa) se localizan tanto en cloroplastos como en mitocondrias, pero hasta el momento no existe un consenso al respecto (Tanaka and Tanaka, 2007). Recientemente, Williams y col. han reportado la presencia de dos isoformas de CPOX en maíz, una de localización cloroplástica y la otra mitocondrial (Williams et al., 2006). Por otro lado, Santana y col. describieron que uno de los dos genes homólogos de CPOX de Arabidopsis thaliana (At4g03205) contiene una deleción que causa un cambio en el marco abierto de lectura del gen, concluyendo que se trata de un pseudogen (Santana et al., 2002); mientras que la otra isoforma de CPOX (At1g03475) se localiza exclusivamente en el cloroplasto. Estos datos son consistentes con las observaciones realizadas por Smith y col. que muestran que la actividad de CPOX está localizada en cloroplastos de hojas etioladas de arvejas y no en mitocondrias (Smith et al., 1993). En contraste, la actividad de PPOX, fue detectada tanto en cloroplastos como en mitocondrias de arvejas y cebada (Jacobs 38
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and Jacobs, 1987; Smith et al., 1993). De acuerdo con estos resultados, la presencia de al menos dos isoformas de PPOX ha sido informada en A. thaliana y tabaco (Narita et al., 1996; Li et al., 2003).
A diferencia de lo que ocurre con PPOX, existen algunas controversias sobre la exacta localización de las isoformas de FeCh en mitocondrias de plantas. Cornah y col. han reportado que la mayor actividad de la ferroquelatasa en arvejas, ha sido asociada a cloroplastos (Cornah et al., 2002). Masuda y col., han encontrado que dos isoformas FeCh de pepino, fusionadas a GFP, se dirigían al cloroplasto y no a mitocondria (Masuda et al., 2003). Lister y col. describieron que dos isoformas de la ferroquelatasa de A. thaliana son importadas hacia el cloroplasto in vitro (Lister et al., 2004). Otros trabajos realizados por van Lis y col., informaron sobre la existencia de un único gen de FeCh en C. reinhardtii con localización cloroplástica, sugiriendo que en este organismo el hemo se produciría únicamente en el cloroplasto y se exportaría al citosol y a la mitocondria (van Lis et al., 2005).
La información detallada en el párrafo anterior indicaría que la FeCh se localizaría únicamente en el cloroplasto, pero que una fracción de FeCh o una proteína no identificada aún, presentaría una actividad mínima en mitocondria. Por otro lado, si la proteína ferroquelatasa no existiera en mitocondria, no debería haber una necesidad biológica para que exista PPOX en esta organela (Tanaka and Tanaka, 2007).
El grupo hemo es una de las moléculas más importantes en las células de plantas superiores. Aunque es menos abundante que las clorofilas, el hemo posee funciones muchos más diversas. Constituye el grupo prostético de citocromos fotosintéticos y respiratorios involucrados en traducción de energía; de oxidasas como la catalasa, peroxidasa y NADPH oxidasa; de hemoglobinas incluídas leghemoglobinas, involucradas en homeostasis del oxígeno; así como también se lo encuentra en los citocromos P450 interviniendo en la biosíntesis de varios metabolitos secundarios (Pal Singh et al., 2002). Por otro lado el hemo está implicado en el fino control de la síntesis de los tetrapirroles, a través de la inhibición de la enzima glutamil-tRNA reductasa,
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involucrada en la producción de la primer molécula de la vía, ácido 5- aminolevulínico (Terry and Kendrick, 1999).
Hemos discutido que la última enzima de la vía de biosíntesis del hemo es la ferroquelatasa, que cataliza la incorporación de Fe en estado ferroso dentro del anillo porfirínico, y es el último intermediario común entre la vía del hemo y de clorofilas. Es por esto, que FeCh sería importante en la regulación de esta bifurcación metabólica entre las dos vías, y tendría un papel relevante en la coordinación de la producción de hemo y aproproteínas (Lange et al., 2004).
Diferentes trabajos asociaron a la proteína mitocondrial frataxina en el ensamblado de centros Fe-S (Rotig et al., 1997; Huynen et al., 2001; Duby et al., 2002; Puccio and Kœnig, 2002). Sin embargo, hasta el momento no está clara la participación de frataxina en la biosíntesis de hemo. El nexo entre el metabolismo de Fe y la proteína frataxina se estableció originalmente por la caracterización de unas cepas de levaduras a las cuales se les había delecionado el homologo de frataxina (YFH1) (Babcock et al., 1997). En estas levaduras mutantes se acumulaba Fe dentro de las mitocondrias formando un precipitado tóxico inorgánico (Lesuisse et al., 2003); al mismo tiempo, proteínas que contenían Fe, incluyendo las Fe-S proteínas y hemoproteínas decrecían o eran inactivas.
Se informó que levaduras deficientes en frataxina contienen bajos niveles de citocromos. Además, los niveles de ferroquelatasa (Hem15) también están reducidos, posiblemente por una represión transcripcional, pero sin alterar los niveles de hemo celulares (Lesuisse et al., 2003). En células de mamíferos, se describió que la deficiencia de frataxina lleva a la regulación en menos de algunos transcriptos que codifican enzimas de la vía de síntesis del hemo (Schoenfeld et al., 2005). Recientemente, Zhang y col reportaron que levaduras mutantes en frataxina mostraban defectos en la síntesis de hemo (Zhang et al., 2005). A partir de los resultados mencionados se postuló que frataxina jugaría un papel importante en la protección del Fe biodisponible dentro de la mitocondria, facilitando su utilización no sólo en el ensamblaje de Fe-S proteínas, sino también para síntesis del grupo hemo. 40
Hipótesis y Objetivos
Hipótesis y Objetivos
Hipótesis de trabajo:
En los últimos años se intensificó el estudio del ensamblaje de los centros FeS y su inserción en polipéptidos para producir proteínas funcionales. Sin embargo, existe muy poca información sobre la ocurrencia de estas vías en organismos vegetales, siendo los organismos más estudiados las levaduras, bacterias y mamíferos. Investigaciones recientes sugieren que en plantas, tanto la mitocondria como los plástidos tendrían su propia maquinaria para la producción de ferrosulfoproteínas. La proteína mitocondrial, AtFH de Arabidopsis thaliana estaría involucrada en múltiples funciones tales como conversión energética y fosforilación oxidativa, participaría en ensamblaje de clusters Fe-S a proteínas, biosíntesis de hemoproteínas y en el metabolismo del hierro.
Objetivo:
El objetivo general de este trabajo es identificar y caracterizar proteínas y ligandos que participan en la biogénesis de proteínas Fe-S y hemoproteínas mitocondriales. El estudio está enfocado a las proteínas que regularían el ensamblaje de los complejos respiratorios de la membrana interna de la mitocondria (debido a que muchos de ellos contienen ferrosulfoproteínas y hemoproteínas) que están poco caracterizadas, especialmente en plantas.
Objetivos específicos:
1-
Determinar el papel fisiológico de AtFH a través de pruebas de pérdida y
ganancia de función: Caracterizar plantas deficientes en AtFH (mutantes insercionales por T-DNA y plantas transgénicas que expresan el gen de AtFH en orientación antisentido, as-AtFH) y plantas que sobreexpresen AtFH (s-AtFH).
42
Hipótesis y Objetivos
2- Clonar, expresar y purificar AtFH recombinante y determinar su función bioquímica in vitro.
3- Analizar el efecto de la deficiencia de AtFH sobre la respuesta transcripcional nuclear, especialmente de genes que codifican proteínas relacionadas con la biogénesis de mitocondrias. Determinar su papel en la biogénesis de proteínas que contienen grupos Fe-S, particularmente las de localización mitocondrial.
4- Evaluar la participación de AtFH en la respuesta a estrés oxidativo en plantas.
5- Estudiar la participación de AtFH en la síntesis del grupo hemo y su participación en la biogénesis de hemoproteínas
43
Materiales y Métodos
Materiales y Métodos
3. Materiales y Métodos
3.1. Material vegetal y condiciones de crecimiento Plantas de A. thaliana var. Columbia-0 (Col-0) fueron utilizadas como línea tipo salvaje (wild type, wt). Las tres líneas mutantes, atfh-1 (SALK_021263), atfh-2 (SALK_ 094203) y atfh-3 (SALK_122008) fueron obtenidas de la T-DNA Express Collection en el Salk Institute (http://signal.salk.edu/cgibin/tdnaexpress). Las mismas contienen una inserción de T-DNA dentro de la secuencia del gen AtFH. En la línea atfh-1, el T-DNA se encuentra en la región no traducida (5´UTR), por delante del codón ATG de iniciación de la traducción. Las otras dos líneas atfh-2 y atfh-3 contienen la inserción de T-DNA en el primer intrón y el cuarto exón respectivamente.
Las semillas de cada una de las líneas fueron germinadas directamente en tierra y mantenidas a 4°C al menos por 72 h. Las plantas fueron crecidas en condiciones de invernadero a 25°C bajo luz fluorescente (Grolux, Sylvania y Cool White, Philips) con una intensidad de 150 ȝmol m-2 s-1 utilizando un fotoperíodo de 16 h. luz/8 h. oscuridad.
3.2. Cepas bacterianas
En este trabajo se utilizaron diferentes cepas de Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens: 1) E. coli XL1-Blue: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F’proAB lacIZ ǻM15 Tn10 (Tet r)]. 2) E. coli BL21 CodonPlus-RIL: F- ompT hsdSB (r B- m-B) dcm+ Tetr Gal endA Hte [argU ileY leuW Camr. 3) A. tumefaciens: cepa GV3101; plásmido Ti: pTiC58; chromo C58; opines:Nopalina.
45
Materiales y Métodos
3.3. Vectores plasmídicos
Los vectores utilizados en este trabajo y sus características se detallan en la Tabla M 1.
Tabla M 1. Características de vectores utilizados pET24a
Novagen
Expresión de proteínas
nºcatálogo: 69749-3
pDH51
(Pietrzak y col., 1986)
Casete promotor terminador CaMV35S , ampR.
y
Cedido por el lab. Dr. Carrillo, UNR, Argentina
pCAMBIA 1302
CAMBIA
Expresión de proteínas en plantas, hyg R (plantas), KanR (bacteria)
Cedido por el lab. del Dr. Araya, REGER, CNRS, Francia
3.4. Medios de cultivo, antibióticos y otros reactivos 3.4.1. Medios de cultivo bacteriano
Medio LB (Luria Bertani) líquido: Tripteína 10 g; Extracto de levadura 5 g; NaCl 10 g; agua c.s.p. 1 litro. Medio LB agar: Idem medio LB líquido con el agregado de 15 g/l de agar. Medio MS (Murashige y Skoog): (Murashige y Skoog, 1962). Nº catálogo: M0404 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Medio MS cultivo de células: Murashige y Skoog shoot multiplication médium A (MSMA) (Murashige y Skoog, 1962). Nº catalogo: M7024 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).
3.4.2. Medios líquidos y soluciones buffer
10 X TBE buffer: TRIZMA base 108 g; ácido bórico (H3BO3) 55 g; 0.5 M EDTA, pH 8 40 ml; agua c.s.p. 1 litro. TE buffer: TRIZMA base 10 mM; EDTA pH 8.0 1 mM; agua c.s.p. 800 ml; ajustar pH 8 con HCl; agua c.s.p. 1 litro.
46
Materiales y Métodos
20 X SSC: NaCl 3 M; acetato de sodio (C6H5Na3O7.2H2O) 0.3 M; agua c.s.p. 800 ml; HCl 1 M hasta pH 7.0; agua c.s.p. 1 litro. 10 X PBS: NaCl 80 g; KCl 2 g; Na2HPO4.7H2O 26.8 g; KH2PO4 2.4 g; agua c.s.p. 800 ml; HCl hasta pH 7.4; agua c.s.p. 1 litro.
3.4.3. Antibióticos y otros compuestos relacionados
Los antibióticos, así como algunos compuestos usados en la selección de clones positivos, se detallan en la Tabla M 2.
Tabla M 2. Antibióticos y otros compuestos relacionados utilizados en el estudio
Compuesto
Concentración stock
Concentración en cultivo
ampicilina
50 mg / ml
50 mg/l
gentamicina
25 mg / ml
25 mg / l
kanamicina
50 mg / ml
50 mg / l
rifampicina
100 mg / ml
100 mg / l
cloranfenicol
25 mg / ml
25 mg / l
higromicina
50 mg/ ml
20 ȝg/ ml ( en placa)
1M
250 ȝM – 1 mM
Isopropil
ȕ-D-tiogalacto-
piranósido (IPTG)
3.5. Oligonucleótidos
Los oligonucleótidos fueron sintetizados por Sigma-Aldrich, St. Louis, USA. En la Tabla M3 se describe la secuencia de los distintos cebadores utilizados, el gen sobre el cual fueron diseñados y el sitio de restricción (si corresponde).
47
Materiales y Métodos
Nombre
Secuencia (5´-3´)
Gen
Sitio restricción
NPTII Fw
TGGATTGCACGCAGGTTCTCCG
NPTII
NPTII Rv
CGAGGAAGCGGTCAGCCCATTC
Oligo dT
pd (T)12-18
Act2 Fw
AATCTCCGGCGACTTGACAG
Actina
Act2 Rv
AAACCCTCGTAGATTGGCACAG
At3g18780
*Act2Fw
TGCTGGAATCCACGAGACAACCTA
Actina
Act2Rv
TGCTGAGGGAAGCAAGAATGGAAC
At3g18780
*cbp Fw
CCGGCCTATTCGTGTGGATTTTGA
CBP
cbp Rv
CATAATTCGTTGGCGCAGCTTGAG
At5g44200
*ucb Fw
GACTCCTTACGAAGGCGGTGTTTT
UCB
ucb Rv
GCTCAGGATGAGCCATCAATGCTA
At5g25760
p-CaMV35S
ATGTGATATCTCCACTGACGTAA
p-CaMV 35S
35StermFw
ATTTCAGCGGGCATGCCTGCAG
t-CAMV35S
CAL Fw
AATTCGAAGATGGATGGG
Calreticulina
CAL Rv
AACATAATGCTGTAAGGA
At1g56340
AOX Fw
ATTTTTTCAGAGACGATA
Oxidasa
AOX Rv
GCGAATGTCAGAAGCAAA
alternativa At5g64210
PEROX Fw
ATCTTCAAGGGGAAGAAA
Peroxirredoxina
PEROX Rv
GCCGACCATCTCTCAGAC
At3g06050
Aco Fw
GAAGTGATTCCAACAAAATCAA
Aconitasa
Aco Rv
AACACCAGGCAATACCATACTC
At4g26970
SDH21 Fw
AAACATATGGCGGAGGCGGAAACAAAA
Succinato
SDH21 Rv
AAACTCGAGACGCTGAAGTTGCTTGAT
deshidrogenasa At2g18450
Fra5New
AAACATATGGCTACAGCTTCAAGG
Fw
AtFH At4g03240
FRATEN Fw
AAAGGATCCATGCTTTGTGTATTT
At4g03240
fra2X Fw
GGGCATATGGAGGAAGAGTTTCACAAA
At4g03240
NdeI
48
Materiales y Métodos AtFH Fra-his Rv
AAACTCGAGTGAGAGTTGGATTGGTTC
XhoI At4g03240
Fra-stop Rv
AAACTCGAGTTATGAGAGTTGGATTGGTTC
At4g03240
XhoI
as-AtFHbam Fw
AAAGGATCCATGGCTACAGCTTCAAGG
At4g03240
BamHI
5´UTR Fw
GTGACAGAACCGCCATGGCTACA
At4g03240
Sma I
TGTTTTAAAGCCTTCTTTATGAGA
At4g03240
PSST Fw
GCCTAGTCCTCGCCAGTCTG
PSST
PSST Rv
GCTGGAGTAGTCCATAGAGC
At5g11770
TYKY Fw
GATTTTGGCTCGCAGGTCACTG
TYKY
TYKY Rv
GCGGACCATTTCTGTGAGGAAC
At1g79010
NADH BP Fw
GAAAGCTGTGGGCAGTGCAC
NADH BP Rv
TCTCGAGCTCTGGCCTAAAG
3´UTR
Rv
NADH binding protein At5g08530 Catalasa1 CAT1 Fw
GATAAGCTACTCCAGACCCGGA
CAT1 Rv
CTGAGACCAGTAAGAGATCCA
CAT2 Fw
GATAAGCTGCTTCAAACCCGTG
CAT2 Rv
CTGAGACCAGTAAGAGATCCA
CAT3 Fw
ACGACAAGCTGCTCCAGTGTA
CAT3 Rv
CTGAGACCAGTAAGAGATCCA
*AtFEQ1 Fw
CAGTCAGTTTCGTGAGTGAGCACA
Ferroquelatasa1
AtFEQ1 Rv
TCTGAGTCAACCACTGCATTTGGG
At5g26030
*AtFEQ2 Fw
CAAACCTTGAAGCTCGACAGTCGT
AtFEQ2 Rv
CAAGATGCCCCACTGATGCAGAAA
At1g20630
Catalasa2 At4g35090
Catalasa3 At1g20620
Ferroquelatasa2 At2g30390
Porfobilinógeno *AtHemB1 Fw
TGCTGACGTAGTTAGTCCGAGTGA
sintasa1
AtHemB1 Rv
TCACGTGCCTCAATCAATGCCT
At1g69740
*AtHemB2 Fw
AGGCATTGCTAGAAGCACGAGAAG
AtHemB2 Rv
GGCGGATGCATAACAATGACTCCA
Porfofilinógeno sintasa2 At1g44318 Coproporfirinógeno *AtHEMF2 Fw
AACCTGGTCCGATTCCGTTCTTTG
AtHEMF2 Rv
ACGACCGAATGAAAGTGCTTGACG
sintasa2 At4g03205
* Oligonucleótidos utilizados para la técnica de PCR en tiempo real.
49
Materiales y Métodos
3.6. Preparación y análisis de ADN 3.6.1. Propagación de ADN plasmídico 3.6.1.1. Preparación de bacterias Escherichia coli competentes
Reactivos y soluciones utilizados: Medio LB-agar y LB-liquido. Solución A (MgCl2 100 mM), Solución B (CaCl2 100 mM) y Solución C (CaCl2 100 mM, 15% V/V glicerol). Se crecieron células de Escherichia coli en una placa de LB-agar durante 12 h. a 37°C. A partir de una de las colonias crecidas, se inoculó en 3 ml de medio LB. El cultivo se creció a 37°C con agitación durante 12 h. Posteriormente, 1 ml de este cultivo se utilizó para inocular 100 ml de medio LB y se incubó a 37°C con agitación hasta alcanzar la fase logarítmica de crecimiento (determinada por cuantificación de la absorbancia a 600 nm). Posteriormente, se centrifugó el cultivo a 4°C y 3000 × g durante 10 min. El precipitado resultante se resuspendió en 50 ml de solución B y se incubó en hielo durante 20 min. Posteriormente se centrifugó a 4°C y 2100 × g durante 10 min. Finalmente el precipitado se resuspendió en 1 ml de solución C y el homogenado conteniendo las células competentes se fraccionó en alícuotas de 100 ȝl que fueron guardadas a -80°C hasta su uso.
3.6.1.2. Transformación de bacterias competentes de E. coli. Se transformaron 100 ȝl de células de E. coli (XL1-Blue o BL21, según corresponda), con 10 ȝl de ADN proveniente de las reacciones de ligación o con 2 ȝl de ADN plasmídico (10-20 ng/μl). Las células se incubaron durante 30 min. a 4ºC. Posteriormente, la mezcla fue sometida a un shock térmico (45 s a 42ºC seguido de 15 min. en hielo). Se agregaron 600 ȝl de medio LB y se incubó por 1 h. a 37ºC con agitación. Finalmente, las bacterias transformadas fueron crecidas en medio LB-agar con el antibiótico correspondiente, durante 18 h a 37ºC.
50
Materiales y Métodos
3.6.2. Aislamiento de ADN plasmídico 3.6.2.1. Aislamiento de ADN plasmídico (kit comercial)
Para la obtención de ADN plasmídico se utilizó el equipo comercial “GenElute™ Plasmid Miniprep Kit” (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), según las instrucciones del fabricante, obteniéndose ADN libre de ARN. Este método se utilizó para obtener ADN plasmídico con el que se llevaron a cabo procesos de secuenciación, clonado o digestión con enzimas de restricción.
3.6.2.2. Aislamiento de ADN plasmídico mediante lisis alcalina
La extracción de ADN plasmídico para el análisis rutinario de colonias se realizó según el método de Sambrook con algunas modificaciones (Sambrook et al., 1989). Se centrifugó 3 ml de cultivo de células en fase estacionaria de crecimiento durante 1 min. a 12000 × g. A continuación, se resuspendió el precipitado en 200 ȝl de solución P1 (Glucosa 50mM, Tris-HCl 25mM, pH 8.0, EDTA 10mM, pH 8.0). Posteriormente se adicionó 300 ȝl de solución P2 (NaOH 0.2N, SDS 1% P/V) y se mezcló por inversión, hasta lograr la clarificación de la solución y se incubó durante 5 min. en hielo. Se agregó 300 ȝl de solución P3 (acetato de potasio 3M, pH 4.8), se mezcló rápidamente por inversión y se incubó durante 5 min. en hielo. Posteriormente se centrifugó durante 20 min. a 12000 × g. El sobrenadante fue transferido a otro tubo, se agregó 5 ȝl ARNasa A (1 ȝg/ȝl) y se incubó a 37ºC durante 30 min. Luego se agregó 400 ȝl de cloroformo, se agitó por inversión y se centrifugó a 13400 rpm durante 5 min. La fase superior se transfirió a otro tubo. Para lograr la precipitación del ADN plasmídico se agregó igual volumen de isopropanol, se mezcló por inversión y la mezcla fue incubada en hielo durante 25 min. Luego de centrifugar a 13400 rpm durante 25 min. se retiró el sobrenadante y se agregó 500 ȝl de etanol 70% y se centrifugó durante 5 min. Finalmente, se retiró el sobrenadante, se dejó secar el precipitado y el ADN se resuspendió en un volumen adecuado de agua estéril (aprox 40 μl).
51
Materiales y Métodos
3.6.3. Electroforésis de ADN en geles de agarosa
Las moléculas de ADN con un tamaño comprendido entre 0.2 y 10 Kb se separaron en geles de agarosa 0.8% P/V con bromuro de etidio (5 mg/ml). Estos geles fueron sometidos a electroforesis horizontal en un campo eléctrico de dirección constante, utilizando el Buffer TBE 1 X. Los fragmentos fueron visualizados en un transiluminador UV y sus tamaños fueron determinados por comparación con marcadores de masa molecular comerciales (400 bp, 100 bp, Productos bio-Lógicos, UNQ) 3.6.4. Purificación de ADN a partir de geles de agarosa
Los fragmentos de ADN de interés se aislaron de los geles de agarosa y se purificaron utilizando el kit comercial “GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification kit” (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden). El ADN se purificó siguiendo las instrucciones del fabricante. 3.7. Manipulación enzimática de ADN 3.7.1. Reacción de ligación
Las reacciones de unión de los fragmentos aislados de ADN a los vectores plásmídicos se llevó a cabo de la siguiente manera: Se utilizó una relación inserto:vector 3:1. Se mezcló el inserto con el vector más 1 ȝl de buffer de ligación 10X (Tris-HCl 60 mM pH 7.8, MgCl2 20 mM, DTT 20 mM, ATP 2 mM y PEG 10 % V/V) y 1 ȝl de T4 ADN ligasa. A continuación, se agregó H2O destilada c.s.p. 10 ȝl y por último, se incubó la reacción en un baño a 16°C durante 18 h.
3.7.2. Reacciones de digestión con enzimas de restricción
Todas las reacciones de digestión realizadas siguieron un mismo procedimiento que consistió en tratar 50-100 ng de ADN lineal y el vector plasmídico con 10-15 U de enzima de restricción, 2 ȝl de buffer 10X específico para cada enzima, según las indicaciones del fabricante, y H2O destilada estéril c.s.p. 20 52
Materiales y Métodos
ȝl. La mezcla de reacción se incubó durante 1 h. a la temperatura correspondiente para cada enzima. En el caso de las digestiones realizadas con dos enzimas de restricción el tiempo de incubación se incrementó a 3 h.
3.8. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Todas las reacciones de PCR realizadas se llevaron a cabo utilizando buffer de PCR 1X (Promega, WI, USA), dNTPs 0.4 mM, 0.4 ȝM de cada oligonucleótido, MgCl2 2 mM, Taq Polimerasa 1 U, H2O c.s.p. 25 ȝl y ADNg (ADN genómico) o ADNc (ADN copia) como molde. El protocolo general de amplificación constó de un ciclo de desnaturalización inicial a 94°C durante 4 min., un número determinado de ciclos: fase de desnaturalización a 94°C 30 seg; fase de hibridación a la temperatura óptima para cada juego de oligonucleótidos determinado por gradiente de temperatura; fase de elongación 1 min. por cada 1000 pb a amplificar, a 72°C, más una extensión final de 10 min. a la misma temperatura. El número de ciclos se estableció en función del objetivo buscado en cada experimento. 3.9. Extracción de ARN total
El ARN total de diferentes tejidos fue extraído usando el reactivo Trizol (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA, USA), compuesto por una mezcla de fenol y tiocianato de guanidina. Cada muestra se homogeneizó con nitrógeno líquido, según la relación 50-100 mg de tejido: 1 ml de Trizol. Se agregó 200 μl de cloroformo y se agitó vigorosamente de forma manual durante 15 s. La mezcla se dejó reposar durante 3 min. a temperatura ambiente y luego se centrifugó 15 min. a 12000 × g a 4°C. Luego de esta etapa se observa una separación en la mezcla de dos fases, una inferior orgánica de color rojo y otra superior, acuosa e incolora, que contiene al ARN. Se transfirió la fase superior a otro tubo y se agregó 188 μl de alcohol isopropílico. Luego de agitar, se dejo reposar a temperatura ambiente durante 10 min. Posteriormente se centrifugó a 12000 × g durante 10 min. a 4°C y se descartó el sobrenadante (el ARN precipita en el fondo del tubo). Se lavó exhaustivamente el precipitado con etanol 70% y se agitó utilizando un vortex durante 2 min. Se
53
Materiales y Métodos
centrifugó a 7000 × g durante 5 min. a 4°C y se descartó el sobrenadante. El ARN se resuspendió en agua tratada con DEPC (dietilpirocarbonato, para la inactivación de ARNasas). El material así obtenido se encuentra en condiciones de ser procesado por RT-PCR. 3.10. Cuantificación de ARN total
La cantidad de ARN total se determinó espectrofotométricamente a 260 nm (1 unidad de absorbancia equivale a 40 μg de ARN). La pureza de las muestras obtenidas se determinó mediante la relación de absorbancia 260 nm/280 nm.
3.11. RT-PCR semicuantitativa
La RT-PCR es un método específico y sensible muy utilizado para medir transcriptos de ARN y la detección de cambios en sus niveles de transcripción bajo diferentes condiciones experimentales, utilizando como referencia un gen constitutivo. El ARN de hojas y flores fue extraído según se detalló en la Sección 3.9. Para los estudios de RT-PCR, el ARN fue sometido a un tratamiento con ADNasa I para eliminar las impurezas de ADN, según se detalla a continuación: 5 μg ARN; 1 μl Buffer reacción; 2 U ADNasa I (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA). La mezcla se incubó durante 25 min. a temperatura ambiente y luego se adicionó 1 μl de EDTA 25 mM y se incubó 20 min. a 70°C. Posteriormente, se realizó la síntesis de ADNc utilizando una transcriptasa reversa M-MLV RT (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase, USB Corp. Cleveland, OH, USA). Para ello se cuantificó espectrofotométricamente el ARN y se procesó según el siguiente protocolo:
54
Materiales y Métodos
Hexámeros Random pd(N)6 (Amersham Biosciences, UK) (1 μg/ul)
1 μl
ARN
5 μg
Buffer 5X M-MLV
5 μl
dNTPs (10 mM)
0.5 μl
Inhibidor de ARNasas (Amersham Biosciences, UK)
25 U
M-MLV RT H2O DEPC c.s.p.
200 U Vol.final
25 μl
La mezcla de reacción se incubó durante 1 h. a 42°C y luego a 70°C durante 15 min. Una vez terminada la RT se realizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a fin de evaluar los niveles de ARNm de cada gen. Los genes de ȕ-ACTINA o ARNr 18S (Ambion Inc. Austin, TX, USA) se utilizaron como control interno. El número de ciclos mínimo de PCR para los genes constitutivos fue de 24. Para poder comparar las muestras entre sí se hicieron distintas diluciones de las mismas a fin de tener en todas la misma cantidad de partida de ADNc.. En el caso del ARNr 18S se utilizó una relación de primers 18S: competímeros de 2:9, respectivamente, para modular la eficiencia de amplificación del ARNr 18S, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para evaluar los niveles de los diferentes transcriptos, se realizaron reacciones de PCR a 16, 20, 24 y 28 ciclos utilizando como molde ADNc. Para cada ADNc se determinó el número apropiado de ciclos a fin de obtener los datos durante la fase exponencial de la reacción de PCR.
3.12. PCR en tiempo real (QPCR)
A partir de ARN total extraído con Trizol (ver sección 3.9) se realizó una transcripción reversa para obtener ADNc utilizando el kit Superscript II Reverse transcriptase. El medio de reacción contenía ARN (2 a 20 μg), 2 μl de dNTPs 10 mM, 2 μl de oligo dT (23mer), 2.5 μg/ul y H2O csp 26 μl. El medio se incubó a 65°C por 10 min. y luego se enfrió en hielo. Posteriormente se agregó 8 μl de Buffer 5X, 4 μl de DTT y 2 μl de Superscript II en un volumen final de 40 μl. La mezcla de reacción se incubó 1h. a 42°C y luego 10 min. a 70°C. El ADNc se purificó utilizando el kit QIAquick PCR purification kit (Qiagen Inc. Valencia, CA, USA). 55
Materiales y Métodos
La PCR cuantitativa se realizó en placas de 96 pocillos. El medio de reacción contenía 4.3 μl de primers fw y rv (7.5 μM), 10 ng de ADNc y 12.5 μl de mezcla de reacción (Maxima SYBR Green qPCR Master Mix 2X, Fermentas). Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador iCycler (BioRad, Hercules, CA, USA). Como control interno se utilizaron los genes de ȕ-ACTINA, CBP y UCB.
3.13. Extracción de ADN genómico
El ADN genómico (ADNg) extraído de hojas de A. thaliana fue utilizado para la caracterización genotípica de las líneas mutantes por T-ADN. Se partió de aproximadamente 100 mg de tejido vegetal, el cual se trituró en N2 (l) en microtubos. Se agregó 200 μl de buffer bromuro de cetil-trimetil-amonio (CTAB) y se trituró hasta lograr la completa homogeneización del tejido. Posteriormente, se agregó 100 μl más de buffer CTAB y se incubó a 60ºC durante 30 min. Se centrifugó a 13400 rpm durante 5 min. y al sobrenadante se le agregó 300 μl de cloroformo. Después de agitar, se centrifugó nuevamente a 13400 rpm por 5 min. La fase acuosa (superior) fue transferida a otro tubo al que se le agregó un volumen igual de isopropanol y se precipitó el ADN por 20 min. a temperatura ambiente. El precipitado obtenido luego de centrifugar a 7000 × g por 10 min. fue lavado etanol 70% V/V y secado. Finalmente, el precipitado se resuspendió en 20 μl de agua destilada estéril y se cuantificó espectrofotométicamente.
3.14. Cuantificación de ADN
La cantidad de ADN total se determinó espectrofotométricamente a 260 nm (1 unidad de absorbancia equivale a 50 μg/μl de ADN). La pureza de las muestras obtenidas se determinó mediante la relación de absorbancia 260 nm/280 nm.
3.15. Hibridación de ácidos nucleicos (Southern-blot)
Se realizó una electroforesis en gel de agarosa 0.8% P/V en TBE 1X a 100 V. Los geles fueron tratados a 254 nm por 2 min. en un horno UV Crosslinker (BioRad
56
Materiales y Métodos
Laboratories, Munich, Germany). Posteriormente, los geles se incubaron durante 30 min. en solución desnaturalizante (NaOH 0.5 N, NaCl 1.5 M) con agitación. Se lavó 3 veces con agua destilada y luego se incubaron durante 30 min. en solución de renaturalización (Tris-HCl 0.5 M, pH 7.4, NaCl 1.5 M) con agitación. Después de lavar con agua destilada los geles se colocaron sobre un puente de papel Whatman (Whatman Int. Ltd., Maidstone, England), embebido con buffer SSC 10X y en contacto con el mismo. Sobre el gel de agarosa se ubicó una membrana de nylon (Hybond N+, Amersham Biosciences, UK) y sobre ella, tres hojas de papel de filtro Whatman, más una pila de papel secante y se dejó transfiriendo 16 h. Finalmente, la membrana de nylon conteniendo el ADN fue irradiada a 254 nm por 2 min. en horno UV Crosslinker. El fragmento de ADN escogido como sonda se obtuvo por PCR utilizando oligonucleótidos específicos para el gen de interés. Cada sonda de ADN (aprox 100 ng, cc. final 10 ng/μl) fue desnaturalizada a 100°C durante 5 min. y luego enfriada 5 min. en hielo. Se agregó 10 μl del reactivo de marcado (conteniendo la enzima peroxidasa) ECL Gold (Amersham Biosciences, UK) y 10 μl de solución de glutaraldehído. La mezcla fue incubada 10 min. a 37°C y usada inmediatamente para la hibridación. La membrana de nylon conteniendo los fragmentos de ADN fue prehibridada a 42°C durante 1 h. en buffer ECL Gold (Amersham Biosciences, UK), NaCl 0.5M, agente bloqueante 5% (P/V) en agitación. Luego se agregó la sonda marcada y se mantuvo en agitación durante 18 h. a la misma temperatura. Posteriormente la membrana se lavó dos veces con una solución SSC 0.5X, SDS 0.5% P/V a 55°C durante 20 min. A continuación se lavó la membrana dos veces con solución SSC 2X durante 5 min. a temperatura ambiente. La membrana fue sumergida en solución de detección (mezcla de sc. 1, productor de peróxido de hidrogeno y sc. 2, luminol), durante 1 min. Luego de escurrido el exceso de solución,
la membrana de nylon fue expuesta a una película fotográfica durante diferentes períodos de tiempo.
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Materiales y Métodos
3.16. Preparación y análisis de proteínas 3.16.1. Extracción de proteínas
Los diferentes tejidos de A. thaliana se cortaron en pequeños trozos, se congelaron en N2 (l) y se homogeneizaron con un émbolo hasta lograr un polvo. Se agregó un medio de extracción conteniendo: Tris-HCl 20 mM, pH 6.8; EDTA 1 mM; PMSF 1 mM. Las fracciones solubles se obtuvieron por centrifugación a 10000 x g durante 30 min., a 4ºC. 3.16.2. Determinación del contenido proteico
La concentración de proteína total se determinó por el método de Bradford (1976). Se utilizó BSA como testigo.
3.16.3. Electroforesis de proteínas
Tanto los extractos de tejido vegetal como bacterianos o proteínas purificadas se sometieron a una electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), utilizando un equipo Mini Protean II Cell (BioRad, Hercules CA, USA) y siguiendo la técnica descripta por Laemmli (1970). La concentración de acrilamida en el gel de separación fue de 12-15% P/V según la muestra a analizar y en el gel de concentración fue de 5% P/V. Las muestras se incubaron a 100ºC durante 2 min. en presencia del siguiente buffer de muestra: Tris-HCl pH 6.8 12 mM; 5% V/V glicerol; 0.4% P/V SDS; 2.88 mM 2-mercaptoetanol y 0.02 % P/V azul de bromofenol. La electroforesis se realizó a 120 V (voltaje constante). Las bandas de proteína se revelaron por tinción con azul brillante de Coomassie R-250, seguido de desteñido con una solución de etanol: ácido acético: agua (3:1:6).
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Materiales y Métodos
3.17. Obtención de anticuerpos policlonales
Los anticuerpos policlonales contra AtFH recombinante de A. thaliana fueron obtenidos mediante inmunización de conejo luego de la inyección de cuatro dosis de 100 μg de la proteína recombinante purificada (Harlow and Lane, 1988).
3.18. Análisis por western blot
Los extractos proteicos o proteínas purificadas se sometieron primero a una electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE) y luego a una electrotransferencia utilizando la celda Bio-Rad Mini-Trans-Blot transfer siguiendo el protocolo desarrollado por Burnette (Burnette, 1981). Los geles se transfirieron a membranas de nitrocelulosa durante 16 h. a 4°C y a 30 V (voltaje constante) en presencia del siguiente buffer de transferencia: Tris-HCl 20 mM; glicina 150 mM; 20 % V/V metanol; pH 8.0. Las membranas se incubaron en una solución de bloqueo compuesta por 3 % P/V BSA en PBS (NaCl 137 mM; KCl 2.7 mM; Na2HPO4 4.3 mM; KH2PO4 1.4 mM) durante 1 h. Luego, se realizaron 2 lavados de 15 min. con H2O y se incubó las membranas 1 h. con el anticuerpo primario correspondiente. Los anticuerpos primarios que se utilizaron fueron (i) anticuerpos policlonales de conejo anti-AtFH de Arabidopsis thaliana (Maliandi et al., 2007); (ii) anticuerpos monoclonales anti-Histag (Qiagen Inc, Valencia, CA, USA); (iii) anticuerpos policlonales anti-catalasa (cedidos gentilmente por el Profesor Mikio Nishimura, Department of Cell Biology, National Institute for Basic biology, Okazaki, Japan); (iv) anticuerpos policlonales anti-NAD9 (cedidos por el Dr. Daniel Gonzalez, UNL). Luego de la incubación con el anticuerpo primario correspondiente, las membranas se lavaron 3 veces con una solución 2 % P/V BSA en PBS durante 15 min., y se incubaron 1 h. con anti-IgG conjugada con la enzima fosfatasa alcalina. (Para los anticuerpos primarios monoclonales, se utilizaron anticuerpos secundarios anti-ratón y para los anticuerpos primarios policlonales se utilizaron anticuerpos secundarios anti-conejo). Finalmente, las membranas se lavaron 2 veces con PBS durante 10 min. y fueron incubadas por 5 min. con buffer sustrato conteniendo: Tris-HCl 100 mM pH 9,5; NaCl 100 mM; MgCl2 5 mM. La presencia de las bandas proteicas se reveló
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Materiales y Métodos
mediante el agregado de 66 μl de azul de nitrotetrazolio (NBT, 50 mg/ml) y 33 μl de 5-bromo-4-cloro-3-indoilfosfato (BCIP, 50 mg/ml) en 10 ml de buffer sustrato (la reacción se desarrolló al resguardo de la luz hasta la aparición de bandas de color púrpura y se detuvo con lavados de H2O destilada). Para estimar la abundancia relativa de cada banda proteica, en algunos casos se realizó un análisis densitométrico utilizando el programa Gel PRO Analyzer Version 3.0
(Media
Cybernetics, Inc. Bethesda, MD, USA).
3.19. Aislamiento de plantas mutantes homocigotas
A fin de aislar plantas homocigotas de las mutantes insercionales atfh-1, atfh2 y atfh-3, se comprobó en primer lugar, la ubicación del inserto en el gen AtFH mediante una reacción de PCR sobre ADNg y utilizando oligonucleótidos específicos flanqueando el lugar de inserción del T-DNA (Fraten Fw/ Fra-Sma Rv y Fra 5 New Fw / FraSma Rv para las líneas atfh-1 y Fra 5 New Fw/ FraSma Rv y NPTII Fw y Rv para las líneas atfh-2 y atfh-3). El ADNg fue extraído a partir de hojas utilizando el método modificado de extracción con CTAB (Sambrook et al., 1989) (ver sección 3.13).
3.20. Construcción de vectores binarios para transformación de plantas de A. thaliana
A partir de ADNc obtenido por retrotranscripción utilizando ARN total, se realizó un ensayo de PCR con oligonucleóticos secuencia
de
AtFH
en
orientación
específicos para amplificar la sentido
(AtFHBam
up:
AAAGGATCCATGGCTACAGCTTCAAGG el sitio BamHI esta subrayado; Frastop: subrayado)
AAACTCGAGTTATGAGAGTTGGATTGGTTC, el sitio XhoI esta y
AtFH
en
orientación
AAAGGATCCATGGCTACAGCTTCAAGG, FraSma:
antisentido
(AtFH
Bamup:
el sitio BamHI esta subrayado;
AAACCCGGGTGAGAGTTGGATTGGTTC,
el
sitio
SmaI
esta
subrayado). El fragmento de interés fue aislado y purificado y se sometió a digestión (ver sección 3.7.2) con las endonucleasas BamHI y XhoI para la construcción s-
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Materiales y Métodos
AtFH. Para la construcción as-AtFH se utilizaron las endonucleasas SmaI y BamHI. El vector pDH51, se sometió a digestión con las endonucleasas BamHI y SalI para la construcción s-AtFH. El sitio de clonado múltiple dentro del vector no contiene el sitio XhoI, por consiguiente se digirió con SalI ya que ambas generan extremos cohesivos compatibles. Para la construcción as-AtFH el vector se digirió con las endonucleasas SmaI y BamHI. El fragmento de DNA resultante para cada construcción, fue clonado en el vector pDH51 dentro del sitio de clonado múltiple, entre el promotor y terminador del CaMV35S. Se transformaron células de E. coli y se analizaron los clones positivos, que contienen el casete con el fragmento AtFH en orientación sentido (s-AtFH) o el fragmento AtFH en orientación antisentido (asAtFH). Estos casetes fueron liberados con EcoRI y clonado en el vector binario pCAMBIA 1302 que previamente había sido digerido con EcoRI.
3.21. Preparación de células competentes de Agrobacterium tumefaciens y su transformación 3.21.1. Preparación de células competentes
Una colonia de A. tumefaciens GV3101 fue crecida 16 h. en medio LB líquido suplementado con antibióticos (rifanpicina 100 μg/ml y gentamicina, 25 μg/ml) a 30°C. Luego, utilizando 2 ml de este cultivo se inoculó 200 ml de medio LB y antibióticos y las células se crecieron con agitación hasta alcanzar una OD600 = 0.3 – 0.4. Posteriormente el cultivo se centrifugó a 3000 × g durante 20 min. a 4°C. El precipitado se lavó con 10 ml de buffer TE frío y se resuspendió en 5 ml de LB y antibióticos. La suspensión de células competentes se fraccionó en alícuotas de 500 ȝl, se congeló en N2 (l) y se mantuvieron a –70°C hasta su utilización o hasta tres meses.
3.21.2. Transformación de las células de A. tumefaciens A una alícuota de 500 ȝl células competentes se le agregó 0.5-1.0 ȝg de ADN plasmídico. Se incubó sucesivamente 5 min. en hielo, 5 min. en N2 (l) y 5 min. a 37°C. La suspensión se diluyó a 1 ml con medio LB y antibióticos rif-gen-kam y se
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Materiales y Métodos
incubó con agitación a 28°C durante 2- 4 h. Posteriormente, se inocularon 200 ȝl del cultivo en medio LB-agar y antibióticos y se incubaron las placas a 28°C durante 48 h. La transformación fue verificada por PCR sobre ADN plasmídico obtenido mediante minipreparaciones a partir de diferentes colonias (ver seccion 3.21.3).
3.21.3. Obtención de ADN plasmídico de A. tumefaciens
Células de A. tumefaciens fueron inoculadas en 5 ml de medio LB suplementados con los antibióticos correspondientes y se crecieron por 16 h. a 30°C. Los cultivos se centrifugaron a 1500 × g por 15 min. a 4°C. Se descartó el sobrenadante y se resuspendió el precipitado en 200 ȝl de Solución I (glucosa 50 mM, EDTA 10 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 8.0 y lisozima 5 mg/ml de) agitando en un vortex y luego se incubó durante 10 min. a temperatura ambiente. Se agregó 400 μl de Solución II (SDS 1% V/V, NaOH 0.2 N) preparada en el momento y se mezcló por inversión cuatro veces. El homogenado se incubó 10 min. a temperatura ambiente. Posteriormente, se agregó 60 μl de fenol alcalino (2 volúmenes de NaOH 0.2 N más 1 volumen de fenol equilibrado en Tris-HCl 1M, pH 8.0 y mezclado en el instante previo al uso). Se mezcló por inversión, por lo menos 16 veces. Se agregó 300 μl de acetato de sodio 3 M, pH 5.0 y se mezcló por inversión 20 veces. Se incubó durante 20 min. a –20°C y luego se centrifugó 5 min. a temperatura ambiente a 1500 × g. El sobrenadante fue recolectado y se adicionó un volumen igual de fenol equilibrado con Tris-HCl, 1M, pH 8.0. Luego se procedió a la extracción del ADN por separación de fases tras agitación por inversión aproximadamente 20 veces. Después de centrifugar a 12000 × g por 5 min., se tomó la fase superior y se agregó un volumen igual de cloroformo. Se agitó y luego se centrifugó a 12000 × g por 5 min. Luego de decantar, se separó la fase superior, se agregó 0.7 volúmenes de isopropanol para precipitar el ADN y se incubó a –20°C por 20 min. Después de centrifugar 10 min. a 12000 × g se descartó el sobrenadante y se lavó el precipitado con 500 μl de etanol 70% V/V. Finalmente se centrifugó 5 min. a 12000 × g, se descartó el sobrenadante y se dejó secar. El precipitado fue resuspendido en un volumen adecuado de agua destilada (aprox 40 μl).
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Materiales y Métodos
3.22. Transformación de plantas de A. thaliana utilizando el método de infiltración por floral dip
La transformación de plantas de Arabidopsis se realizó mediante la técnica de floral dip (Clough and Bent, 1998). Brevemente, se cultivaron plantas de Arabidopsis wt (var. Col-0) a 23ºC hasta alcanzar el estadio de floración (aprox 6 semanas). Para tener un buen número de brotes florales, las inflorescencias primarias fueron cortadas aproximadamente 4 días antes de la transformación para eliminar la dominancia apical y posibilitar la emergencia de múltiples botones florales secundarios. Dos días antes de la transformación se inició un cultivo de 3 ml de células de A. tumefaciens GV3101, transformadas con el plásmido binario con la construcción correspondiente. El cultivo se realizó a 28ºC en medio LB (gen-rif) y el antibiótico que permita la selección del plásmido de interés. Con estos pre-inóculos se inocularon 250 ml de medio LB suplementado con los antibióticos antes mencionados. Se crecieron en agitación a 30ºC por 24 h. Al día siguiente, las bacterias se cosecharon por centrifugación a 7000 × g por 10 min. y se resuspendieron en 250 ml de medio de infiltración (sacarosa 5% P/V, detergente SILWET® L-77-Ag 0.005% V/V) hasta lograr una OD600 = 0.8. El medio de infiltración se colocó en vasos de precipitado, y se sumergieron los brotes florales durante 15 s. Las macetas se colocaron en forma horizontal en bandejas de plástico y cubiertas con plástico transparente, de forma tal de mantener la humedad y posibilitar el paso de luz. Luego de dos días, las plantas se colocaron de forma vertical y se retiró la cubierta plástica. Aproximadamente luego de 3 a 5 semanas se cosecharon las semillas que fueron mantenidas a 4ºC hasta ser utilizadas.
3.23. Esterilización de semillas de Arabidopsis
Las semillas de Arabidopsis fueron esterilizadas en Solución de Bleach (NaClO 5% V/V, SDS 1% P/V) mediante agitación en vortex durante 8 min. y luego se realizaron 3 lavados sucesivos con H2O destilada estéril. Las semillas fueron resuspendidas en TOP-agar (0.2 % P/V agar) y luego sembradas en placas con medio MS y cuando corresponda, con el antibiótico de selección.
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Materiales y Métodos
3.24. Selección de plantas transformadas
Las semillas esterilizadas se inocularon en placas de Petri conteniendo medio MS, agar 0.8% P/V, sacarosa 1% P/V y el/los antibióticos correspondientes, y se incubaron durante 48 h. a 4ºC en oscuridad. A los dos días, las placas se pasaron a invernadero y se crecieron a 23°C con iluminación. Las plantas transgénicas serán aquellas que crezcan en presencia de los antibióticos (resistentes). Luego de la aparición de las primeras hojas verdaderas, las plantas fueron pasadas a tierra (rusticación). 3.25. Clonado, expresión y purificación de proteínas 3.25.1. Clonado molecular de AtFH de A. thaliana
El ADNc correspondiente al gen AtFH (564 pb) fusionado a histidina y con codón de terminación, fueron obtenidos por RT-PCR usando los oligonucleótidos: fra2x y Fra-his; fra2x y Fra-stop, respectivamente. Los productos de PCR resultantes fueron digeridos usando endonucleasas de restricción (ver sección 3.7.2) y clonados en el vector pET24a (Novagen, EMD Biosciences Inc, Madison, WI, USA). Los clones positivos fueron verificados por secuenciación de ADN. Así, se generaron los plásmidos recombinantes pATF01 (que codifica para AtFH-His6, conteniendo en el extremo C-terminal la fusion a histidina y pATF02 que codifica para AtFH-STOP, conteniendo el codón de terminación.
3.25.2. Expresión y purificación de las proteínas recombinantes AtFH-His6 y AtFH- STOP de A. thaliana
Los plásmidos pATF01 y pATF02, se utilizaron para transformar células competentes de E.coli BL21 (DE3) y BL21 (DE3)-RIL (ver sección 3.6.1.2). Se inoculó medio LB suplementado con kanamicina (30 mg/l), con las células transformadas. Se crecieron a 37ºC en agitación (160 rpm) hasta obtener una DO600= 0.4-0.6. La expresión de la proteína recombinante se indujo con el agregado 1 mM de IPTG por aproximadamente 4-5 h. a 30 ºC. El tiempo óptimo de expresión fue
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Materiales y Métodos
seleccionado luego del análisis por SDS-PAGE de muestras tomadas a diferentes tiempos luego de la inducción con IPTG. Para realizar la purificación, los cultivos conteniendo las células transformadas fueron colectados por centrifugación a 3000 × g por 20 min. a 4ºC, se lavaron dos veces y se resuspendieron con 2 ml de buffer A (Na2HPO4 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM) por cada gramo de células. Luego los cultivos se sonicaron (130 Watt Ultrasonic Processor, Vibra Cell, Sonics & Materials UK) y centrifugaron a 12000 × g por 10 min. a 4°C. El extracto crudo se filtró a través de una membrana de acetato de celulosa de 0.2 μm. Para la purificación se utilizaron columnas comerciales de afinidad de 1 ml cargada con Ni+2 como ligando (Hi Trap chelating HP, Amersham Biosciences, UK) y una bomba peristáltica (Biologic LP, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). En primer lugar, se lavó la columna con 10 ml de agua destilada y 10 ml de buffer A (flujo 1 ml/min). Posteriormente se cargó la muestra en la columna y se equilibró con 10 ml de buffer de unión, B (NaH2PO4 0.02 M, NaCl 0.5 M, imidazol 20 mM, pH 7.4). La elución de la proteína se realizó en un volumen de 25 ml utilizando un gradiente de imidazol 20 mM inicial (buffer de unión) - 500 mM final en buffer de unión. Las fracciones que contenían AtFH eluyeron a una concentración de imidazol de alrededor de 250 mM. Estas fracciones se recolectaron, se concentraron hasta 1 mg/ml y se guardaron a 20ºC. En estas condiciones la proteína fue estable por lo menos por 2 meses.
Para la expresión y purificación de AtFH-STOP, células de E.coli BL21 (DE3)-RIL conteniendo el plásmido pATF02 fueron crecidas en medio LB a 37ºC hasta llegar a una DO600 = 0.5. La expresión de la proteína se indujo con 1 mM de IPTG. Las células se cultivaron con agitación por 4 h a 30 ºC, se centrifugaron y luego se resuspendieron en buffer C (Tris-HCl 50 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM). Posteriormente las células se sonicaron (130 Watt Ultrasonic Processor, Vibra Cell, Sonics & Materials UK). La fracción soluble del extracto celular se cargó en una columna comercial de DEAE-Sepharosa fast flow (Amersham Biosciences, UK) equilibrada con buffer C. Luego se lavo con 5ml del mismo buffer. La proteína se eluyó usando un gradiente de buffer D (Tris-HCl 50 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM, y KCl 600 mM). La fracción que contenía AtFH-STOP, se recolecto y concentró y luego diluyó 10 veces con buffer C. La nueva solución se sembró en una columna
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Materiales y Métodos
Mono–Q (Amersham Biosciences, UK) y se eluyó con un gradiente lineal de KCl (0450 mM) en buffer E (Tris-HCl 50 mM, pH 8.0 y EDTA 1 mM). La fracción conteniendo la proteína se recolectó y concentró. Luego se realizó una cromatografía en una columna de filtración molecular (Superosa 12) usando buffer E con KCl 150 mM. La proteína purificada fue concentrada y almacenada a – 20 ºC.
3.26. Ensayo de degradación oxidativa de 2-deoxiribosa
Una mezcla de Fe (II) 15 μM, H2O2 8 μM, 2- deoxyribosa 5 mM (Fluka, St. Louis, USA) en buffer Hepes-KOH 10 mM, pH 7.0, fue incubada en ausencia o en presencia de AtFH-His6 y AtFH-STOP recombinantes por 30 min. a 25 ºC (vol. final 100 ȝl). Posteriormente, se agregó 50 μl de ácido fosfórico 4 % V/V y 50 μl de ácido tiobarbitúrico 1% P/V. La mezcla de reacción fue incubada por 10 min. a 100 ºC y posteriormente enfriada en hielo. Después de este procedimiento se agrego 75 μl de SDS 10% V/V. La cantidad de malondialdehído producida fue determinada espectrofotométricamente a 532 nm.
3.27. Determinación de Fe
Se partió de 60-100 mg de hojas de Arabidopsis de plantas wt y atfh-1 de 6 semanas. Se homogeneizó el material con 500 μl de acetato de sodio 0.1 M y luego se centrifugó a 13400 rpm por 5 min. Se utilizó 250 μl de sobrenadante y al mismo se le agregó 100 μl hidroxilamina 10% P/V, 500 μl de acetato de sodio 0.1 M, 1.4 ml H2O y 250 μl fenantrolina 2 mM. Se dejo incubando la mezcla de reacción a temperatura ambiente por 10 min. hasta desarrollo de color y se cuantificó la absorbancia a 510 nm. La curva de calibración se realizó utilizando soluciones de distintas concentraciones de Fe (NH4)2(SO4)2 (2.10-6 M, 3.6.10-6 M, 7.2.10-6M, 1.44.10-5M, 2.88.10-5M, 3.6.10-5M, 7.2.10-5M, 1.44.10-4M, 2.88.10-4M) (Greenbers, et al., 1992).
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Materiales y Métodos
3.28. Determinación de la concentración de ATP
Se cuantificó el contenido total de ATP en hojas de roseta y flores de plantas wt, mutantes y transgénicas de 6 semanas (Teixeira et al., 2005). Las mismas fueron congeladas en N2 (l) y trituradas hasta lograr un polvo. Se utilizó aproximadamente 20 mg de tejido para cada determinación y cada muestra se homogeneizó con 60 μl de HCl 0.1 M en microtubos de 1.5 ml. El homogenado fue centrifugado a 20000 × g por 10 min. a 4°C. El sobrenadante se cargó en un micro-concentrador Microcon YM-3 (Millipore Corp, Bedford, MA, USA) a 14000 × g a 4°C a fin de concentrar y desalar la muestra, ya que altas concentraciones de sales en la muestra pueden causar un efecto inhibitorio en la actividad luciferasa y disminuir la sensibilidad de la técnica. Luego de neutralizar con buffer Tris-HCl pH 7.4, la solución filtrada fue usada para la medida del contenido de ATP por luminiscencia mediante la utilización del ATP bioluminescent assay kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
El
fundamento de la reacción se basa en la medida de la emisión de luz cuando el ATP es consumido al reaccionar con la D-luciferina, a través de una reacción catalizada por la enzima luciferasa. La cantidad de luz fue cuantificada utilizando un luminómetro (LD-400 Luminescence Detector-Beckman Coulter, Inc.) y es proporcional al ATP presente en la muestra. Los niveles de ATP se expresaron en nmol .g–1 PF. Todos los datos fueron sometidos a análisis de t-Student, con un nivel de probabilidad P