Algérienne Démocratique et Populaire

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

Université Salah Boubnider Constantine 3 Faculté de Médecine Département de Pharmacie

Mémoire de fin d’études Pour l’obtention du diplôme de Docteur en Pharmacie

Intitulé du mémoire :

Etude isotypique des immunoglobulinopathies monoclonales

Réalisé par :

Encadré par :

 Bouguerra imane  Ghellab amira  Boumahrat khaoula

Dr. Houam fouad

SESSION : JUILLET 2019

REMERCIEMENTS

Nous tenons à remercier tout d’abord ’ALLAH ‘ pour le peu de savoir que nous avons acquis A travers ce modeste travail. Nous adressons nos très sincères remerciements, À Dr «houam fouad » pour son encadrement pendant tout cette période ; les conseils qu’elle nous a prodigués et ces nombreux encouragements furent très précieux pour l’accomplissement de ces travaux. Nos plus vifs remercîments s’adressent aux membres de jury ont d’avoir accepté d’examiner et d’évaluer notre travail. Ensuite, nous remercions tous les professeurs et Enseignants qui ont collaboré à notre formation depuis notre premier cycle d’étude jusqu’à la fin de notre cycle universitaire. Enfin, nous remercions nos familles infiniment et plus particulièrement nos parents, nos Amis et toutes ces personnes qui ont un jour nous ont toujours encouragés.

Amira; imen et khaoula

DEDICACES

Avant toute chose, je remercie Allah, Le tout puissant, pour j’avoir donnée la force, la volonté, et la patience durant toutes mes années d’étude. A mes chers parents qui sont la source éternelle de mon bonheur, Mon papa rabah : ton grand cœur ; couvre de bonheur et de tendresse depuis mes premiers jours parmi vous. Tu es et seras ma fierté pour toute la vie. A tes cotés je me sens pousser des ailes, tout problème s’envole laissant place a un sentiment de sécurité. Sur tes épaules tu m’as soulevée petite, et sur ces mêmes épaules ma tête se pose pour trouver conseil maintenant et à jamais. Je t’aime. J’espère qu’en ce jour l’un de vos rêves se réalise à travers moi en concrétisant le fruit de vos sacrifices. J’espère ne jamais vous décevoir et être toujours à la hauteur de vos attentes. Ma maman zelikha : Le jour pour lequel tu t’es donnée autant de mal est arrivé. Tu as toujours été la meilleure amie que tout le monde m’enviait, la meilleure confidente qui soit. T’avoir à mes côtés dans mes moments de doute me consolait, tu as illuminé ma vie, et pour toujours tu seras et resteras la meilleure pour donner vie à mes joies. Je t’aime A mes chères sœurs KHADIDJA et MARWA pour leur aide et leur soutien moral ; à mon frère WALID adoré pour leur compréhension ;Je vous offre aujourd’hui cette pensée car vous êtes

merveilleux, et comptez beaucoup à mes yeux.

A mon cher fiancé M.B : tu as toujours été là pour moi, à m’écouter quand je te raconte mes soucis, à me remonter le moral quand je suis fatiguer, tu m’as encouragée quand j’allais baisser les bras ; les belles valeurs que tu portes en toi, embellissent ma vie de bonheur. A toute ma famille, mes amis IMEN ;AMIRA ;RAHMA ;ZINEB ;SOULEF ;AMIRA NEHLA et tous les filles de groupe FACEBOOK :()et ma cousine AICHA , et à tous ceux qui ont contribué un jour à notre éducation.

Khaoula

Toute les lettres ne sauraient trouver les mots qu’il faut …tous les mots ne sauraient exprimer la

gratitude, l’amour, le respect, la reconnaissance…Aussi, c’est tout simplement que Je dédie cette thèse … A ma chère mère : Torch Messaouda A celle qui m’a donné la vie, qui a marqué chaque moment de mon existence avec son intarissable tendresse, à celle à qui je dois le meilleur de moi même. Tu as veillé sur mon éducation et mon bien être avec amour, tendresse, dévouement et perfection. Tes prières m’ont été d’un grand soutien au cours de ce long parcours J’espère qu’en ce jour l’un de tes rêves se réalise à travers moi en concrétisant le fruit de tes sacrifices. A toi, je dédie ce travail .Puisse Dieu tout puissant t’accorder longue vie, santé, bonheur pour que notre vie soit illuminée pour toujours A mon pére : Ali Qui peut être fier et trouver ici le résultat de longues années de sacrifices et de privations pour m’aider à avancer dans la vie. Puisse dieu faire en sorte que ce travail porte son fuit ; merci pour les valeurs nobles, l’éducation et le soutient permanent venu de toi. Une spéciale dédicace a mon chér B. SALIH Tu as toujours été présent à mes côtés. Aucun mot ne pourra exprimer ce que je ressens et tout ce que tu représente pour moi. Saches que tu es le partenaire idéal pour cette grande aventure qu’est la vie. Merci pour ton amour et ton précieux soutien et que ce travail (qui aussi tien) te comble de joie et de fierté. Je te souhaite un avenir florissant et une vie pleine de bonheur, de santé et de prospérité. Que Dieu te protège et consolide les liens sacrés qui nous unissent. A mes sœurs : wahida, karima, halima, nedjoua, meriem et warda pour leurs encouragements et leur soueien moral. A mes fréres : lhani et youcef pour leur appui et leur encouragement. A toutes ma famille pour leur soutien tout au long de mon parcours universitaire. A mes amies : zouzou, khaoula,amira,fatima,rayene,amel et rahma Merci d’etre toujours là pour moi.

Imane

Louange à dieu le tout puissant qui a éclairé mon chemin et m’a permis de menera bien la rédaction de ce mémoire Je dédie ce mémoire à Ma mère, qui a œuvré pour ma réussite, par son amour, son soutien, tous les sacrifices consentis et ses précieux conseils, pour toute son assistance et sa présence dans ma vie, reçois à travers ce travail aussi modeste soit-il, l'expression de mes sentiments et De mon éternelle gratitude. Mon père, qui peut être fier et trouver ici le résultat de longues années de sacrifices et de privations pour m'aider à avancer dans la vie. Puisse Dieu faire en sorte que ce travail porte son fruit ; Merci pour les valeurs nobles, l'éducation et le soutient permanent venu de toi. Ma mon ame sœur besma et mon cher frère wail et ma chère sœur lina , qui a toujours été présents pour les bons conseils. Veillez trouver dans ce modeste travail ma reconnaissance pour tous vos efforts. Mes chères amis : imene, zouzou ,khaoula ,rahma et fati en témoignage de l’attachement, de l’amour et de l’affection que je porte pour vous que dieu nous garde toujours Je voudrais ensuite adresser un remerciement particulier à mon amie et ma sœur khaoula bougheloutt pour son soutien toujours dans les plus difficiles moments et mon cher oncle madjid pour son aide et ses conseils Enfin, que tous ceux qui ont contribués, de prés ou de loin, directement ou indirectement, à la réalisation de ce travail trouvent ici l’expression de ma profonde gratitude

Amira

TABLE DES MATIERES

LISTE DES ABREVIATION LISTE DES FIGURES LISTE DES TABLEAUX INTODUCTION ……………………………..………………………………………………..1 Revue bibliographique : I. Les immunoglobulines …………………….……………………………………………3 I.1. Définition …………………………….…………………………………………………3 I.2. Structure ………………………………………………………………………………..3 I.3. Biosynthèse des Ig dans les plasmocytes ………………...………………………..5 I.4. fonctions ………………………………………………………………………………..5 I.5. l’hétérogénéité ……………………………………...………………………………….6 I.6. Classes …………………………………………...…………………………………….8 I.7. les anomalies des immunoglobulines ……………………..………………………10 II. Immunoglobuline monoclonale ……………………………………………………..10 II.1. Définition ……………………………………………………………………………..10 II.2. Caractéristiques …………………………………………………….……………….10 a- Identité de charge électrique ………………………….…………………………..11 b- Identité structurale ……………………………………………………….…………11 c- Identité immunologique ………………………………………...………………….11 III. les immunoglobulinopathies monoclonales ……………………………………..11 III.1.définition ………………………………………………………..…………………….11 III.2.classification ……………………………………………………..…………………. 12 a- Classification basée sur des critères cliniques ………………………………….12

1- Immunoglobulinopathies malignes ………………………..………………….. 12 2- MGUS ………………………………………………...…………………………..13 b- Classification basée sur des critères immunochimiques ………………….……14 IV. Caractérisation isotypique des Igm au fil du temps ……………...…………….15 IV .1.L’électrophorèse …………….………………………………….………………….15 IV.2. L’immunosélection …………………………………………………………………17 IV.3. L’immunofixation……………………………………………………………………18 IV.4. L’immunosoustraction…………………………………………….………………..19 V. Apport de l'isotypage dans le monitorage des gammapathies Monoclonales ……………………………………………………………………………..20 V.1. Dans le diagnostic ………………….……………………………………………. 20 V.2. Dans l’évolution, et le pronostic …………….……………………………………20 Partie pratique : Matériels et Méthodes I. Matériels …………………………………………………………………………………..23 I.1. Patients inclus…………………………………………………...……………………23 I.2. Données épidémiologiques et biologiques exploitées …..……………….………23 II.METHODES UTILISEES …………………………………….…………………….……23 II.1. Paramètres immunochimiques analysés …………………………………………23 II.2. Exploration immunochimique d’une immunoglobulinopathie …………………..23 II.2.1. Exploration Des Protéines Sériques …………………………………..……..23 II.2.1.1. Phase pré-analytique…………………………………………………..….23 II.2.1.2. Phase analytique et post-analytique …………………………………….23 II.2.2. Exploration Des Proteines Urinaires……………………………………….….33 II.2.2.1. Phase pré-analytique ……………………...……………………………..33 II.2.2.2. Phase analytique et post-analytique ………………………..……….….34

II.2.2.2.1. Dosage des protéines urinaires ………………………………..….34 II.2.2.2.2. Electrophorèse des protéines urinaires ……………………….….34 II.2.2.2.3. Analyses immunochimiques des immunoglobulines monoclonales : Isotypage ………………………………………..…34 .

II.2.2.2.3.1. L’immunofixation urinaire ………………………………...….35 II.2.2.2.3. Analyse et traitement des données ……………………………...…..36

Discussion ………………………………………………………………………………….42 Conclusion ……………………………………………………………...………………….50 Résumé………………………………………………………………………..…………….51 Références bibliographiques …………………………………………………..……….53

LA LISTE DES ABREVIATIONS : Ac: Anticorps Ag: Antigène CLLm: Chaines légères monoclonales EC: Electrophorèse capillaire EP : Electrophorèse des protéines EPS: Electrophorèse des protéines sériques EPU: Electrophorèse des protéines urinaires GM: Gammapathie monoclonale IF: Immunofixation IFS: Immunofixation sérique IFU: Immunofixation urinaire Ig: Immunoglobuline Igm: Immunoglobuline monoclonale IS: Immunosoustraction IT: Immunotypage LCR: Liquide céphalo-rachidien MGUS: Monoclonal gammapathy of undetermined significance MM : Myélome multiple SMM: Sympomatic multiple myeloma

La liste des figures : Figure (1) : Schéma d’une immunoglobuline. C : parties constantes, V : parties variables. Figure(2) : TYPES DE VARIABILITÉ Figure (3) : VARIABILITÉ ISOTYPIQUE Figure(4) : Variabilité Allotypique Figure(5) : Représentation d’un résultat normal d’électrophorèse des protéines sériques

d’un sérum normal.

Figure(6) : tracé électrophorétique anormal Figure(7) : Représentation d’un résultat anormal d’électrophorèse des protéines sériques Figure(8) : L’immunofixation (Séve.,2012) Figure(9) : Tube sec à bouchon rouge pour la réalisation du prélèvement Figure(10) : Automate COBAS INTEGRA 400(laboratoire de centre /unité d’immunologie

/HMRUC

Figure(11) : protéinogramme de l’électrophorèse Figure(12) :Automate Hydrasys (laboratoire de centre /unité d’immunologie /HMRUC) Figure(13) :Automate Capillarys (laboratoire de centre /unité d’immunologie /HMRUC) Figure(14) :Schéma de principe d’un montage d’électrophorèse capillaire. Figure(15) : Tracé électrophorétique anormal Figure(16) : A : Exemple d’une IF sérique normale, B : IF traduisant une IgG Lambda Figure(17) :Immunotypage, technique immunotyping réalisée sur Capillarys-SEBIA. Figure(18) : Immunotypage d’un sérum présentant une Ig A lambda monoclonale migrant au niveau des bêta-2 globulines (indiquée par les flèches). Figure(19) : Immunofixation urinaire présentant une chaine légère monoclonal Kappa. Figure(20) : Répartition du sexe (2010-2019) Figure(21) : Répartition des services cliniques prescripteurs de 2011 à 2019 Figure(22) :répartition des analyses immunochimiques d’identification des composants monoclonaux de 2010 à 2019 IF : immunofixation / IT :immunotypage Figure(23) : Répartition en fonction de la zone de migration Figure(24) : Répartition en fonction de la nature isotypique de l’Igm

Figure(25) : utilisation majoritaire d’IS par rapports à l’IF selon les études signalées par la société SEBIA Figure(26) : Résultat de la distribution des chaînes légères.

LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 : DESCRIPTION DES DIFFERENTS ISOTYPES DE CHAINES LOURDES Tableau 2 : REPARTION ISOTYPIQUE DES IG SELON L’AGE Tableau 3 : REPARTION ISOTYPIQUE DES IG SELON LA ZONE DE MIGRATION Tableau 4 : Répartition isotypique Tableau 5 : DISTRIBUTION DES PRESCRIPTIONS EN FONCTION DES SERVICES DEMANDEURS Tableau 6 : Les indications retenues pour dépistage systématique d’une immunoglobulinopathie monoclonale. Tableau 7 : DISTRIBUTION ISOTYPIQUE DES GAMMAPATHIES MONOCLONALES SELON LES SERIES (34)

Introduction : Une immunoglobuline monoclonale(Igm) se caractérise par l’augmentation sélective d’une seule espèce moléculaire d’immunoglobuline sérique, causée par la prolifération incontrôlée d’un clone unique de lymphocytes B, constituée soit d’une seule classe de chaîne lourde et d’un seul type de chaîne légère, soit de chaînes légères isolées d’un seul type, soit beaucoup plus rarement de fragments de chaînes lourdes d’une seule classe. Sa présence dans le sérum d’un patient n’est pas synonyme de malignité. Dans 50% des cas, voir plus en fonction de la sensibilité des techniques utilisées, l’Immunoglobuline monoclonale est associée à des contextes cliniques très variés, en dehors de toute affection maligne, ou à aucun contexte précis (gammapathie monoclonale dite de signification indéterminée, ou MGUS pour monoclonal gammapathy of undetermined significance). La découverte d’Immunoglobuline monoclonale, souvent fortuite, est une situation fréquente au-delà de 60 ans. Le diagnostic biologique d’une Immunoglobuline monoclonale repose sur la réalisation d’une analyse conjointe du sérum et des urines qui vise à affirmer son homogénéité de charge et d’isotypie. La découverte d’un pic sur l’électrophorèse des protéines (EP) doit conduire à la réalisation d’explorations immunochimiques. Cet examen permet la détection des immunoglobulinopathies

monoclonales

sous

forme

d’une

bande

étroite

(électrophorèse en gel d’agarose) ou pic (électrophorèse capillaire) migrant habituellement dans la région des gammaglobulines, parfois dans la région des betaglobulines ; ou exceptionnellement dans celle des α2-globulines. Cette découverte doit nécessairement poser la question de la mise en œuvre d’une étape d’identification immunochimique (ETUDE ISOTYPIQUE) indispensable pour préciser l’isotype de l’Immunoglobuline monoclonale secrétée. La classe de l’Immunoglobuline monoclonale et de sa chaine légère associée ou libre sont des éléments utiles au diagnostic et au pronostic de la maladie causale. Le but de notre travail est de partager l’expérience d’unité d’immunologie /laboratoire centralde l'Hôpital Militaire Régional Universitaire de Constantine (HMRUC) 1

en

matière d’identification immunologique des Immunoglobuline monoclonale dans les milieux biologiques, nous nous proposons donc d’exploiter l’ensemble des données disponibles concernant les caractéristiques épidémiologiques et biologiques d’une cohorte de 197 cas colligés sur une période de neuf années et quatre mois (20102019) et de discuter les résultats du présent travail par rapport à ceux rapportés dans la littérature. Le manuscrit est scindé en deux parties ; une partie bibliographique et une autre pratique comportant une description du matériel et méthodes suivie par une présentation de résultats et leurs discussions. Et finalement une conclusion générale.

2

I. Les immunoglobulines : I.1. Définition Les immunoglobulines (Igs) sont le support de l’immunité spécifique humorale (1) ce sont des protéines du sérum sanguin sécrétés par les plasmocytes, issus des lymphocytes (globules blancs intervenant dans l'immunité humorale) de type B en réaction à l'introduction dans l'organisme d'une substance étrangère (antigène) (2). Les Igs sont soit libres dans le sérum, soit fixées à la surface des lymphocytes B. Elles correspondent alors au récepteur des lymphocytes B pour l'Ag (2). Les Igs tirent leur nom de la découverte qu’elles migrent avec les protéines globulaires lorsqu’un sérum immun (contenant des anticorps (Ac) est placé dans un champ électrique (3). Elles appartiennent au groupe des gammaglobulines. Les Igs sont caractérisées par un certains nombres de propriétés : 

Dualité fonctionnelle : les Ig présentent deux pôles fonctionnels (régions variables, impliquées dans les fonctions de reconnaissance de l’Ag et régions constantes, responsables des fonctions effectrices).



Dualité structurale : qui se traduit par la genèse de plusieurs classes et sous classes



Hétérogénéité : qui s’exprime par 3 niveaux(4) :  isotypie  Allotypie  Idiotypie

I.2. Structure : La structure de base des immunoglobulines est illustrée dans la Figure(1) est une protéine faite de quatre chaînes polypeptidiques : deux chaînes légères (L) (L pour light) et deux chaînes lourdes (H) (H pour heavy) identiques. Chaque chaîne légère est reliée à une chaîne lourde par un pont disulfure. Les chaînes elles-mêmes sont repliées en structure tertiaire par des ponts disulfure. Les chaînes lourdes sont glycolsylées (5) ; Ces chaînes forment une structure en Y.

3

Figure (1) : Schéma d’une immunoglobuline. C : parties constantes, V : parties variables.

• Domaines constants : Les domaines constants sont caractérisés par une séquence en acides aminés très proche d'une immunoglobuline à l'autre. Chaque chaîne légère en possède un exemplaire noté CL. Les chaînes lourdes comportent, selon la classe d'Ig, trois ou quatre domaines constants CH1, CH2, CH3 et CH4. Les domaines constants ne sont pas impliqués dans la reconnaissance de l'Ag, mais interviennent dans la fonction effectrice. • Domaines variables : Une Ig possède quatre domaines variables situés aux extrémités des deux «bras». L'association entre un domaine variable porté par une chaîne lourde(VH) et Le domaine variable adjacent porté par une chaîne légère (VL) constitue le site de reconnaissance (ou paratope) de l'Ag. Ainsi, une molécule d'Ig possède deux sites de liaison à l'Ag, un au bout de chaque bras. Ces deux sites sont identiques, d'où la possibilité de lier deux molécules d'Ag par Ac (6).

4

I.3. Biosynthèse des Ig dans les plasmocytes : La synthèse des immunoglobulines a lieu au niveau du RER au sin du cytoplasme des plasmocytes. Une fois synthétisée, les chaines lourdes et légères sont assemblées et passe au niveau de l’appareil de Golgi pour éventuelle glycosylation. La molécule d’immunoglobuline entièrement synthétisé sera véhiculé dans une vésicule d’exocytose jusqu’à fusion avec la membrane plasmique. Elle sera finalement excrétée en dehors du plasmocyte par clivage du site d’encrage de la molécule d’immunoglobuline à la paroi interne de la vésicule. (7) 1 .4 FONCTIONS : 

reconnaissance de l’antigène

Les immunoglobulines se lient de façon spécifique à un ou plusieurs antigènes appar entés. Chaque immunoglobuline se lie en fait à un déterminant antigénique spécifique . La liaison à l’antigène est la première fonction des anticorps qui, en tant que telle, p eut assurer une protection de l’hôte. La valence de l’anticorps fait référence au nombr e de déterminants antigéniques que chaque molécule individuelle d’anticorps peut lie r. La valence de tous les anticorps est d’au moins deux et peut être supérieure dans c ertains cas. 

Fonctions effectrices

Souvent, la liaison de l’anticorps à l’antigène ne conduit à aucun effet biologique direc t. Les effets biologiques importants des anticorps sont plutôt la conséquence de fonct ions effectrices secondaires. Les immunoglobulines possèdent des fonctions effectric es variées. En général, pour qu’une fonction effectrice soit mise en œuvre, il faut que l’anticorps se lie à l’antigène. Les immunoglobulines ne présentent pas toutes l’ensem ble des fonctions effectrices. Les fonctions effectrices incluent : 1. Fixation du complément. Cela conduit à la lyse de la cellule, Suite à l’activation d e la voie classique du complément

5

2. Liaison à des types cellulaires variés. Les phagocytes, les lymphocytes, les plaqu ettes, les mastocytes, les basophiles possèdent des récepteurs pour les immunoglob ulines. Cette liaison peut conduire les cellules à s’activer et à mettre en œuvre des fo nctions effectrices. Certaines immunoglobulines peuvent aussi se lier à des récepteur s sur les trophoblastes du placenta, ce qui conduit à leur passage au travers de la ba rrière placentaire. En conséquence, les anticorps maternel transférés assurent l’immu nité du fœtus et du nouveau-né. (8). Male et al. Immunology 7ème édition Chapitre 3 Murray, et al. Medical Microbiology 5ème edition, pp 110-113 I.5. l’hétérogénéité : (10) C’est l’utilisation des Igs humaines comme immunogènes qui a permis de définir les différentes spécificités antigéniques qu’on peut classer en trois types (4) :

Figure(2) : TYPES DE VARIABILITÉ(9)

6

1. VARIABILITÉ ISOTYPIQUE Caractères communs à tous les individus d’une même espèce déterminants localisés sur domaine constant des chaînes lourdes (classe et sous-classe) ou des chaînes légères(type)

Figure (3) : VARIABILITÉ ISOTYPIQUE(9)

2. Variabilité Allotypique : Déterminants

antigéniques

interindividuelles

correspondant

(variations

entre

à

des

individus

variations

d’une

même

alléliques espèce)

différences structurales ponctuelles sur AA ou séquences ligosaccharidiques, déterminants situés sur domaine constant des chaînes lourdes et légères ex : - locus Gm (24 variants sur chaînes lourdes gamma ) -locus Am (2 variants sur chaînes lourdes) -locus Km (3 variants sur chaîne légères Kappa)

7

Figure(4) : Variabilité Allotypique (9)

3. VARIABILITÉ IDIOTYPIQUE variations associées au site de liaison à l’antigène et liées à la partie variable des chaînes lourdes et légères des Ig (zones hypervariables)

I.6. Classes : Les isotypes représentent un des niveaux d'hétérogénéités des Igs. Ils permettent de définir des classes et sous-classes. Ces isotypes sont indépendants de la fonction Ac de l’Ig et correspondent à des différences structurelles qui donnent naissance à plusieurs variétés d'Ig. Les isotypes sont identiques chez tous les individus d'une même espèce. Chez l'homme on décrit cinq isotypes de chaînes lourdes (Tableau I) et deux isotypes de chaînes légères (11) désignées sous le terme kappa et lambda. Les chaînes légères et lourdes sont produites séparément à l’intérieur des plasmocytes et se rassemblent pour former une Ig entière « intacte ». Lorsque les chaînes légères sont attachées aux chaînes lourdes, les chaînes légères sont désignées sous le nom de chaînes légères liées. Cependant, lorsque les chaînes légères ne sont pas attachées au chaînes lourdes, elles sont appelées chaînes légères libres. Pour des raisons

8

inconnues, les plasmocytes produisent généralement plus de chaînes légères que nécessaire pour créer les Ig entières ou les protéines monoclonales (12) Tableau I : Description des différents isotypes de chaines lourdes (11)

9

I.7. les anomalies des immunoglobulines : Le taux d’immunoglobulines du sérum est constitué de l’association des produits de multiples clones. Il existe un équilibre fortement régulé de ces taux d’Ig sous l’action combinée d’une synthèse de novo d’immunoglobulines et d’un catabolisme. Dans différentes circonstances, il existe un dérèglement de cet équilibre on distingue différentes situations : 

Stimulation de la production de très nombreux clones responsable d’une hypergammaglobulinémie polyclonale



Stimulation de la production de quelques clones : oligoclonalité



Production excessive d’un seul clone : immunoglobuline monoclonale (Roitt., 2002) (13)

II. Immunoglobuline monoclonale : II.1. Définition : Une immunoglobuline monoclonale (Igm) est caractérisée par la présence dans le sang et/ou les urines d'une Ig d'un même type immunochimique, en quantité anormalement

élevée,

témoignant

d'une

prolifération

lymphoplasmocytaire

monoclonale. Le terme Igm se réfère au produit de sécrétion résultant de l’expansion d’un clone de cellules de la lignée B (14)-à la différence des Igs physiologique -ce qui leur confère un caractère homogène. En effet seule une production par des cellules strictement identiques, et donc monoclonales, peut expliquer la présence d'une Ig ayant des propriétés strictement identiques. (Les molécules constituantes l’Igm possèdent une même chaîne lourde et une même chaîne légère.) II.2. Caractéristiques : A la différence des Ig physiologiques, les Ig monoclonales sont synthétisées par un seul clone de cellules B malignes ou hyper stimulées, ce qui leur confère un caractère homogène. L’homogénéité des Igm est reflétée par les critères suivants (4,15) :

10

 L’identité de charge électrique Les molécules d’Igm ayant la même structure primaire, la même séquence d’acide aminé, leur charge électrique globale est donc équivalente. Il en résulte une mobilité électrophorétique homogène, objectivée par une bande étroite sur le support de migration ou un pic étroit sur le tracé. Ce pic les différencie des augmentations polyclonales d’Ig qui migrent selon une bande large. Il est très souvent retrouvé dans la zone des gammaglobulines en cas de mobilité anodique, il peut se trouver superposé à d’autres protéines (zone α1 voir α2 plus rarement). Ce pic peut être discret voir absent lorsque le composant monoclonal a un poids moléculaire suffisamment faible pour franchir le filtre glomérulaire (CLL).  L’identité structurale La population d’Igm ne possède qu’un seul type de chaîne lourde et un seul type de chaîne légère. Cette identité structurale sera d’ailleurs à la base du typage immunochimique par les techniques d’immunotypage.  L’identité immunologique L’ensemble des Igm ont les mêmes déterminants iso-, allo- et idiotypiques. Elles possèdent donc la même activité anticorps, mais celle-ci n’est que très rarement recherchée.

III. les immunoglobulinopathies monoclonales : III.1.définition Les immunoglobinopathies monoclonales (IM), improprement appelées gammapathies monoclonales (GM) regroupent des pathologies diverses, liées à la prolifération incontrôlée d’un clone unique lymphoplasmocytaire ou plasmocytaire au niveau du tissu hématopoïétique. Il en résulte une augmentation sélective d’une seule espèce moléculaire d’immunoglobuline, dite monoclonale, constituée d’un seul type de chaîne lourde et un seul type de chaîne légère ou parfois incomplète, représentée seulement par sa chaîne lourde ou légère. Leur découverte est une situation médicale fréquente, en raison de la systématisation des demandes d’électrophorèse des protéines sériques en pratique courante, du

11

vieillissement de la population et de l’amélioration de la sensibilité des techniques de diagnostic biologique, notamment l’immunotypage. Leur prévalence est en effet, de nos jours, importante puisqu’elle est estimée à 1% dans la population générale et de 3% chez les sujets de plus de 50 ans. [16,17] Leur mise en évidence conduit soit au diagnostic d’IM malignes (maladies de Kahler, de Waldenström…) requérant une prise en charge thérapeutique adaptée, soit à celui de gammapathies monoclonales de signification indéterminée (GMSI ou MGUS) qui ne sont ni malignes ni bénignes, mais nécessitant une surveillance clinique et biologique à vie [18].

III.2.classification a- Classification basée sur des critères cliniques : 1- immunoglobulinopathies malignes :  myélome multiple : Le myélome multiple (MM) ou maladie de Kahler est une hémopathie maligne caractérisée par une prolifération clonale incontrôlée de plasmocytes médullaires envahissant la moelle osseuse et sécrétant le plus souvent une immunoglobuline monoclonale complète (IgG, IgA, IgM et rarement IgD et IgE) ou un fragment de cette immunoglobuline (chaine légère kappa ou lambda). (19) La réalisation d’une exploration des protéines sériques et urinaires est indispensable. Dans 80% des cas, l’EPS met en évidence un pic étroit correspondant à une immunoglobuline monoclonale, migrant le plus souvent dans la zone des gammaglobulines, parfois des β-globulines ou des α2 globulines. Le diagnostic de MM est basé sur l’association d’une plasmocytose médullaire supérieure à 10 %, d’une immunoglobuline monoclonale sérique et/ou urinaire à titre significatif et de signes cliniques en rapport avec la prolifération plasmocytaire maligne. Bien qu’il reste à ce jour incurable, le MM a connu, ces dernières années, des progrès permettant une amélioration de la prise en charge des patients (20)  La Maladie des chaînes lourdes : Les MCL se caractérisent par la production d’une chaîne lourde d’immunoglobuline, plus ou moins tronquée, et dépourvue de chaîne légère.

12

Cette pathologie se détecte grâce aux efforts combinés en hématologie (clinique), et biologie. Elles font partie des hémopathies lymphoprolifératives à cellules B matures ; c’est-à-dire qu’elles sont issues d’un clone B produisant des plasmocytes qui vont alors excréter une chaine lourde. On décrit principalement 3 sous-types de MCL, en fonction du type d’Ig monoclonale produite : c’est ainsi que l’on retrouve par ordre de fréquence décroissante, la MCL alpha (α), la MCL gamma (γ) et la MCL mu (µ). 

MALADIE DE WALDENSTRÖM La macroglobulinémie de Waldenström est un variant du lymphome lymphocytique

ou lymphoplasmocytaire dans lequel les cellules néoplasiques synthétisent de grandes quantités d'IgM pentamérique monoclonale. Dans cette situation, le patient est susceptible, à côté du syndrome tumoral classique, de développer des signes cliniques directement liés à cette IgM pentamérique soit par son aspect quantitatif (syndrome d'hyperviscosité) soit du fait de son activité immunologique qu'elle soit dirigée contre des autoantigènes du système nerveux ou qu'elle ait les caractéristiques d'une agglutinine froide ou d'une cryoglobuline. Ces complications peuvent être inaugurales et peuvent se voir en général avant que le diagnostic de MW soit possible, donc dans des IgM pentamérique apparemment primitives. Les troubles hémorragiques sont liés à la présence des IgM pentamérique à la surface plaquettaire, entravant l'hémostase primaire. L'hémodilution est responsable d'une anémie régulièrement surévaluée. Il y a exceptionnellement un syndrome osseux. Une régression partielle sous l'effet du traitement est possible si celui-ci a été suffisamment précoce. (21) 2-MGUS : Les gammapathies monoclonales de signification indéterminée (MGUS) sont définies

par

un

pic

d’immunoglobuline

monoclonale,

inférieur

à

30

g/l,

asymptomatique. Elles affectent particulièrement les sujets âgés ; leur prévalence est de 1 % dans la population générale et de 10 % chez les plus de 80 ans. Leur diagnostic repose sur l’élimination des autres causes de pic d’immunoglobuline monoclonale, en particulier de myélome. Environ 25 % des MGUS évoluent dans les 20 ans qui suivent le diagnostic vers un myélome ou une autre hémopathie lymphoïde maligne. Il n’existe pas, pour l’heure, de facteur prédictif satisfaisant du risque évolutif des MGUS. Les travaux biologiques récents ont démontré la communauté étroite entre MGUS et myélome multiple sur le plan de l’immunophénotype plasmocytaire, de la 13

cytogénétique et de la biologie moléculaire. Les MGUS sont maintenant considérées comme une pathologie clonale plasmocytaire à malignité réduite. Les nouveaux paramètres biologiques devraient, dans un proche avenir, permettre de discriminer les MGUS qui resteront asymptomatiques de celles qui évolueront vers une pathologie lymphoïde maligne. (22) La découverte d’un pic d’allure monoclonale à l’électrophorèse des protides est une situation fréquente en pathologie gériatrique. Elle correspond principalement à deux diagnostics : un myélome multiple ou une gammapathie monoclonale dite bénigne. Le terme classique de gammapathie monoclonale bénigne ne doit plus être employé au regard de leur potentiel évolutif (23,24). On lui préfère donc celui de «gammapathie monoclonale dite bénigne » ou « gammapathie monoclonale apparemment bénigne » ou, plus souvent, de « gammapathie monoclonale de signification indéterminée » (traduction littérale de la terminologie anglosaxonnemonoclonal gammopathy of undeterminedsignificance, d’où l’acronyme MGUS).

B- Classification basée sur des critères immunochimiques : 1-Hyperproduction sélective d’une Ig monoclonale complète (95 à 97% des cas environs) : Cette biosynthèse anormale concerne les IgG, les IgA, les Ig M et le plus rarement les IgD ou les IgE. Elle sera en relation avec une immunoglobulinopathie monoclonale maligne ou bénigne et en général, se traduira par l’existence d’un pic monoclonal net à l’électrophorèse. 2-Hyperproduction de chaînes légères libres monoclonales (3à 5 % des cas environ) : Il existe dans ce cas une augmentation anormale de la biosynthèse des chaînes légères libres de type κ ou λ. Cette anomalie se rencontre presque exclusivement dans le myélome à chaînes légères, constamment malin. Le pic monoclonal est en général absent ou très discret sur l’électrophorèse du sérum, sauf s’il existe des polymères de chaînes légères libres de poids moléculaire (PM) trop important pour passer le filtre rénal. Une hypogammaglobulinémie d’accompagnement portant sur les trois classes d’Ig est en général présente.

14

3- Hyperproduction de chaînes lourdes libres monoclonales structuralement anormale (très rare) : Ce type d’immunoglobulinopathie monoclonale concerne les chaînes lourdes libres α, γ ou μ et se rencontre dans les pathologies rares et malignes des maladies des chaînes lourdes (MCL). Leur diagnostic est difficile et le pic monoclonal inconstant sur l’électrophorèse du sérum. (25)

IV. Caractérisation isotypique des Igm au fil du temps : C’est une étape indispensable dans la détermination de la nature du (ou des) composant(s) monoclonal (aux) ; elle doit compléter l’électrophorèse des Ig. Le principe général consiste en la formation de complexes Ags-Ac précipitant en milieu solide, et leur mise en évidence se fait soit de façon directe par des techniques de colorations classiques, soit de façon indirecte par un système d’immuno-soustraction.

IV .1. L’électrophorèse : L’électrophorèse des protéines est une analyse de laboratoire basée sur la séparation de protéines dans un champ électrique. Pour faire ce test, les laboratoires peuvent utiliser un milieu solide (tel que le gel d’agarose) ou des tubes de silice extrêmement fins remplis de liquide, appelés : capillaires. Lorsqu’un échantillon contenant un mélange de protéines différentes est déposé sur un gel ou injecté dans un capillaire, les différentes protéines du mélange seront séparées en fonction de leur charge électrique (fig 5.). (26) Pour rechercher une protéine monoclonale, les laboratoires analysent le sérum et les urines par électrophorèse des protéines qui est le seul test permettant de confirmer la monoclonalité sans aucune ambigüité. (26)

15

Figure(5) : Représentation d’un résultat normal d’électrophorèse des protéines sériques d’un sérum normal. (26)

C’est une technique de séparation des protéines sériques en cinq ou six fractions « Albumine, Alpha-1, Alpha-2, Bêta (qui pourra être séparée en Bêta-1 et Bêta-2) et Gamma » selon la méthode de L’EPS utilisée par le laboratoire capillaire ou bien sur gel. Les immunoglobulines normales (polyclonales) présentes dans le sérum diffèrent légèrement les unes des autres dans leur structure et leur charge électrique. Par conséquent, après l’électrophorèse, elles forment une large zone diffuse et symétrique sans aucune déformation visible (zone Gamma). Par contre, Les protéines monoclonales « sont produites par un seul clone de plasmocytes », Elles sont identiques entres elles et possèdent exactement la même charge électrique. C’est pour cette raison qu’elles migrent en formant un pic sur le tracé d’électrophorèse. Dans la plupart des cas, le pic se trouve au niveau de la zone Gamma (fig 6,7), cependant, il est possible de le trouver dans la zone Bêta-2( fig 6) , Bêta1 voire même dans la zone Alpha-2 (ce dernier cas reste rare). (26)

16

Figure (6) : tracé électrophorétique anormal L’EPS peut être utilisée pour rechercher une protéine monoclonale mais aussi dans le suivi du patient pour quantifier la protéine monoclonale.

Figure (7) : Représentation d’un résultat anormal d’électrophorèse des protéines sériques (24)

IV.2.L’immunosélection (27-28) Contrairement aux autres Igs monoclonales, les molécules retrouvées au lourdes délaitées, en principe au niveau du premier domaine constant, ce qui explique leur sécrétion sans chaînes légères. Leur taux est le plus souvent faible, de l’ordre du g/L 17

ou moins, et leur présence peut passer inaperçue àl’électrophorèse ; en raison de leur structure, ces protéines ont une grande hétérogénéité de charge : s’il existe une bande à l’électrophorèse, celle-ci sera plus souvent large qu’étroite, et de plus parfois de migration très rapide, notamment pour les chaînes μ.

Dans le sérum l’immunoélectrophorèse met en

évidence un constituant qui précipite avec un seul antisérum antichaine lourde (α, ɣ et μ par ordre de fréquence) sans réagir avec les antisérums anti-chaînes légères. Cette absence de précipitation avec les antisérums anti-κ et anti-λ n’est pas un critère suffisant, notamment pour la maladie des chaînes lourdes alpha, puisque qu’il peut parfois être difficile de mettre en évidence les chaînes légères lambda des IgA ou IgD monoclonales. Il faut avoir recours à une technique spéciale d’immunosélection combinée à l’immunoélectrophorèse ou à l’immunofixation. Cette méthode consiste à incorporer dans la gélose des antisérums antichaines légères de forte affinité afin de précipiter toutes les moléculesd’Igs entières, monoclonales ou polyclonales, ne laissant plus persister que l’arc de la chaîne lourde pathologique. IV.3. L’immunofixation : Ce concept de base a été décrit pour la première fois par Afonso en1964, mais ce n'était pas une technique pratique qu’après modification en 1969 par Alper et Johnson(29). Lorsqu’un pic étroit est détecté sur le tracé de l’électrophorèse des protéines, la présence d’une protéine monoclonale est suspectée. Il est alors nécessaire de confirmer sa présence et de déterminer la nature en identifiant le type de chaînes lourdes et légères qui la composent. La connaissance du type de la protéine-M est importante à la fois pour poser un diagnostic et suivre le patient. L’immunofixation (IFX) est une technique complémentaire de l’électrophorèse. Elle est effectuée à l’aide des antisérums monospécifiques permet l’identification des bandes monoclonales dépistées par électrophorèse. (fig.8) (30) Les techniques d’IFX sont plus sensibles que les méthodes d’électrophorèse des protéines. Elles peuvent détecter de faibles bandes monoclonales qui ne sont pas visibles à l’électrophorèse.(26) . Cette technique est largement utilisée actuellement dans les laboratoires pour différentes raisons : elle est plus rapide (1 à 2 heures), elle est en partie automatisable, l’interprétation des résultats est plus aisée, elle offre une meilleure

18

sensibilité (seuil de détection à 0.20 g/L) que l’immunoélectrophorèse (31), et enfin elle permet de caractériser plusieurs Igms (profils oligoclonaux) despécificité de chaînes lourdes ou légères différente migrant au même niveau.

Figure(8) : L’immunofixation (Séve, 2012)

IV.4. L’immunosoustraction : La dernière et plus récente technique mise en routine pour typer une Igm, est l’immunosoustraction. Cette technique s’est développée grâce à l’émergence de l’électrophorèse capillaire qui est son support direct. Deux méthodologies existent. La première, celle de Beckman, sur l’automate Paragon CZE 2000® qui utilise des billes de sépharose sur lesquelles sont fixés des Ac spécifiques réagissant respectivement avec les chaînes lourdes , μ, α , γ et les chaînes légères κ , λ ; un puits sert de référence. Les complexes Ags-Ac précipitent alors au font des puits par sédimentation, c’est l’immunosoustraction. Les surnageantssont,ensuite prélevés et injectés dans les capillaires où a lieu l’étape classique deséparation électrophorétique (32).

19

La deuxième technique d’immunosoustraction a été développée par la société SEBIA en 2005 (33) sur le Capillarys®.

V. Apport de l'isotypage dans le monitorage des gammapathies Monoclonales : La classe de l’Ig et de sa chaine légère associée ou libre sont des éléments utiles au diagnostic et au pronostic de la maladie causal.

V.1. Dans le diagnostic : Au diagnostic d’une GM il est indispensable d’identifier l’isotype de l’Igm, en effet le myélome multiple est fait généralement d’Ig d’isotype IgG, IgA, IgD ou de CLLm. Dans la maladie de Waldenstrom c’est généralement l’isotype IgM (34). V.2. Dans l’évolution, et le pronostic : De la découverte du pic à la transformation en myélome multiple, il s’écoule en moyenne onze ans. De l’ensemble 10 % à 20 % des patients ayant un pic monoclonal évolueront vers un myélome multiple ou un cancer associé. Cependant, les GM de signification indéterminée ne comportent pas toutes le même risque d’évolution. Grâce à des études rétrospectives, des facteurs paracliniques prédictifs ont pu être dégagés afin de mieux planifier l’évaluation et le suivi. Le plus utilisé est celui de la Clinique Mayo qui comprend trois paramètres : un pic monoclonal de 15 g/l ou plus, le type d’Ig (IgG contre IgA ou IgM) et un rapport des chaînes k/l libres anormal (35). Le risque de progression lié à l’isotype d’Igm est estimé à 1.8 pour l’IgA et 1.1 pour l’IgM par rapport à l’IgG. D’autres éléments tels que l’absence de protéinurie de BenceJones ou la baisse des Ig normales ne sont pas retrouvés de façon constante comme facteurs prédictifs. Différents scores prédictifs ont été proposés parmi lesquels celui de Rajkumar qui tient compte de l’isotype (IgG ou non-IgG), du taux de protéine monoclonale (inférieur ou supérieur à 15 g/l) et du rapport k/l. Ce score sépare clairement les MGUS à très faible risque de progression (0 facteur, 5% à 20 ans) des MGUS à haut risque de progression (3 facteurs, 58% à 20 ans) et présente l’avantage de ne pas tenir compte de la plasmocytose médullaire

20

Récemment, un score prédictif se basant sur le taux de plasmocytes médullaires anormaux (seuil de 95%) et l’aneuploïdie, identifiés par cytométrie en flux, sépare les MGUS à faible risque de transformation (absence de facteur péjoratif, 2% à 5 ans) des MGUS à haut risque (2 facteurs péjoratifs, 46% à 5 ans) (36).

21

Partie pratique Matériels et Méthodes

I. Matériels : Il s'agit d'une étude rétrospective d’une durée d’approximativement neuf ans et 4 mois allant de juin 2010 Jusqu’à avril 2019 (2010-2019) concernant 197cas pour lesquels une électrophorèse des protéines sériques a été effectuée, et un immunotypage par IF ou IS réalisé soit sur prescription du médecin ou systématiquement après détection d’un pic d’allure monoclonal à l’électrophorèse ou d’une hypogammaglobulinémie .

I.1. Patients inclus : Le fichier Excel et les chemises d’archive d’unité d’immunologie de laboratoire centrale de l'Hôpital Militaire Régional Universitaire de Constantine(HMRUC) ont été utilisés pour identifier les cas d’immunoglobulinopathies répertoriés dans l’ensemble des services. Dans la présente étude, nous avons inclus les patients chez lesquels une étude isotypique a été réalisé incluant les différentes analyses immunochimiques, notamment l’immunofixation sérique(IFS) et urinaire(IFU), ainsi que l’IS.

II.METHODES UTILISEE II.1. Paramètres immunochimiques analysés : Les résultats biologiques de chaque patient sont classées dans les chemises d’archive correspondante ; comporte les paramètres suivant :  Le taux des protides totaux sériques, ainsi que Les résultats de l’électrophorèse des protéines sériques.  Les résultats de l’immunotypage.  Les données de la protéinurie.

II.2. Exploration immunochimique d’une immunoglobulinopathie : II.2.1. Exploration Des Protéines Sériques : II.2.1.1. Phase pré-analytique : C’est une étape cruciale, car elle peut influencer les résultats. L’étude d’une l’immunoglobuline monoclonal se fait impérativement sur un échantillon de sérum, soit 23

un prélèvement réalisé sur tube sec (bouchon rouge) suivi d’une centrifugation de 2500 à 3000 t/min (sérum car le fibrinogène présent dans le plasma simule une immunoglobuline monoclonal ). Le patient doit être à jeun depuis 12h car les sérums troubles peuvent être à l’origine d’une fausse interprétation des résultats (éviter l’utilisation du plasma et du sérum hémolysé). Les prélèvements sont conservés à +4°C lorsque l’analyse est différée pour une durée maximum d’une semaine.

Figure (9) : Tube sec à bouchon rouge pour la réalisation du prélèvement

II.2.1.2. Phase analytique et post-analytique II.2.1.2.1. Dosage des protéines totales Le dosage de la protidémie a été réalisé par l’automate COBAS INTEGRA 400 (fig.10), Ce système possède de nombreux avantages. Il est rapide ce qui permet de travailler en urgences mais il convient également très bien pour la routine. C’est un appareil autonome qui effectue lui-même la plupart de ses maintenances ou les dilutions des échantillons. Cet instrument permet de doser des enzymes, des substrats, des protéines spécifiques, des médicaments et des drogues. Le module ISE (électrodes sélectives aux ions) effectue la détermination des électrolytes sodium, potassium, chlorures et du lithium. En fonction de ces paramètres, les dosages se réalisent sur du sérum, du plasma ou de l’urine. Le Cobas Integra est un appareil de chimie liquide, les réactifs sont contenus dans des cassettes à l’intérieur de l’automate dans un compartiment réfrigéré. Principe Les dosages effectués sur le Cobas Integra 400 plus reposent sur plusieurs principes de mesure différents : Photométrie d’absorption : La photométrie est une méthode d’analyse basée sur le fait que les substances colorées absorbent une partie du spectre lumineux. Lorsqu’un rayon lumineux traverse une substance, une partie de la lumière traverse la solution, une autre est absorbée par les particules en solution et une petite partie est dispersée. La photométrie va s’intéresser à la partie du spectre lumineux qui est absorbée par la 24

substance. L’absorbance d’une solution est proportionnelle à l’épaisseur de la solution et à sa concentration.

Figure(10) : Automate COBAS INTEGRA 400(unité d’immunologie /laboratoire central / HMRUC)

II.2.1.2.2. L’électrophorèse des protéines sériques : L’électrophorèse des protéines sériques est une analyse de laboratoire basée sur la séparation de protéines du sérum dans un champ électrique en utilisant le caractère amphotère des protéines radicaux amines et carboxyliques. Cette analyse est faite sur un milieu solide : gel d’agarose à l’aide de l’appareil SEBIA HYDRAGEL. Lorsqu’un échantillon contenant un mélange de protéines différentes est déposé sur le gel, les différentes protéines du mélange seront séparées en fonction de leur charge électrique dont La vitesse de migration est en fonction de la taille des particules, force ionique et porosité du support.

25

Figure(11) : protéinogramme de l’électrophorèse

En outre les immunoglobulines normales présentes dans le sérum diffèrent légèrement les uns des autres dans leur structure et leur charge électrique. Par conséquent, après l’électrophorèse, elles forment une large zone diffuse et symétrique sans aucune déformation visible (fig 11). Principe de l’électrophorèse sur gel d'agarose (Hydrasys®) Les échantillons sont déposés à l’aide d’une micropipette dans des encoches d’applicateur au plastique déposé sur le gel. L’appareil d’électrophorèse est branché à une source de courant et mis sous tension. Les molécules chargées contenues dans les échantillons pénètrent alors le gel à travers des mailles. Les molécules dont la charge nette est négative migrent vers l’électrode positive de l’appareil d’électrophorèse (anode), alors que les molécules dont la charge nette est positive migrent vers l’électrode négative (cathode). Dans une 26

certaine fourchette, plus le champ électrique est fort, plus les molécules migrent rapidement. Le tampon sert à la fois de conducteur à l’électricité et de contrôle du pH. L’électrophorèse

sur

gel

d’agarose

(Hydrasys®)

est

une

technique

semiautomatisée permettant la migration et la séparation des protéines sériques en tampon alcalin (pH = 9,2) sur un gel d’agarose (Hydragel® protéine 15/30). Les protéines sont séparées en cinq fractions : albumine, α1- et α2-globulines, β-globulines et γ-globulines. Ces protéines séparées sont colorées par une solution d’amide de Schwarz. La densitométrie (à 570 nm).

Figure(12) : Automate Hydrasys (unité d’immunologie / laboratoire central /HMRUC)

Principe de l’électrophorèse capillaire (Capillarys®) Les protéines sont séparées dans un milieu liquide. La migration à travers un tube capillaire très fin de 20 μm, obtenue par un très haut voltage de 9000 volt. Ce système permet une séparation très rapide en 7 minutes avec une excellente résolution, et évite l'inconvénient de la coloration des protéines, puisque celles-ci sont détectées directement dans le spectre ultraviolet lorsqu'elles passent devant la cellule du photomètre incorporée dans l'appareil. La sensibilité de l'électrophorèse capillaire pour la détection des composants monoclonaux (paraprotéines) est nettement 27

augmentée par rapport aux techniques classiques. De plus, il serait théoriquement possible de séparer une centaine de protéines différentes dans le sérum ; cependant le constructeur de l'appareillage a voulu garder un profil comparable à celui obtenu sur gel d'agarose, et ainsi l'aspect général de l’intégration électrophorétique n'est pas fondamentalement modifié. Certaines protéines, en particulier la transferrine et le complément C3 dans les β-globulines, apparaissent cependant très distinctement et ne doivent pas être prises pour des paraprotéines.

Figure (13):Automate Capillarys (unité d’immunologie / laboratoire central /HMRUC )

28

Figure(14) : Schéma de principe d’un montage d’électrophorèse capillaire.

II.2.1.2.3. Analyses immunochimiques des immunoglobulines Monoclonales : Isotypage Le typage des Immunoglobulines monoclonales a été réalisé soit par IF, soit par IS, pour certains patients les deux techniques ont été utilisées en parallèle. Le choix entre les deux techniques répond aux recommandations de la société SEBIA, en effet la réalisation d’une IF est souhaitable s’il y’a présence :  D’une hypogamma sans pic visible  D’antécédent de gammapathie et pas de pic visible  D’une protéine de Bence Jones dans les urines sans anomalie dans le  sérum  D’une discrète augmentation en β1 ou d’une discrète déformation en β1  ou β2  D’une discrète augmentation isolée en α2  L’IS est réalisée s’il y’a présence :  D’un pic ou d’une déformation en ɣ 29

 D’une franche augmentation en β1 ou d’une nette déformation en β1  D’une franche augmentation ou d’une nette déformation en β2  D’une augmentation isolée des β 2 (β2 ≥ β1)  D’une augmentation des α2 II.2.1.2.3.1. L’immunofixation sérique : Les immunoglobulines monoclonales, marqueurs des gammapathies, sont préalablement détectées lors de l’électrophorèse des protéines. Elles se présentent sous forme de bandes anormales situées essentiellement dans la zone bêta ou gamma globulines.

Figure (15) : Tracé électrophorétique anormal (38) Afin de typer la protéine-M, une autre méthode d’électrophorèse sera utilisée et est appelée immunofixation (IF). Lors d’une IF, des réactifs spécifiques, appelés antisérums, sont utilisés. Chacun de ces antisérums réagit avec un type particulier de chaîne lourde ou de chaîne légère. Les protéines monoclonales réagissent habituellement avec un type d’antisérum anti-chaîne lourde et un type d’anti-chaîne légère. Certains plasmocytes peuvent produire uniquement des chaînes légères libres ; dans ce cas, la protéine monoclonale réagira uniquement avec l’un ou l’autre antisérum des deux types de chaînes légères. Elle se réalise en quatre étapes :  Séparation électro-phorétique des protéines en gel d’agarose.  Fixation et immunoprécipitation des protéines séparées par électrophorèse : application du fixateur et des antisérums sur le gel, au niveau des pistes de

30

migration. Le fixateur et les antisérums diffusent dans le gel. Le fixateur précipite toutes les protéines et les anticorps précipitent les antigènes correspondants.  Élimination des protéines non précipitées par pompage et lavage. Les protéines précipitées restent piégées dans le gel.  Coloration des protéines et comparaison de la position des bandes immunoprécipitées avec celle des bandes anormales observées après électrophorèse des protéines.

Figure(16) : A : Exemple d’une IF sérique normale, B : IF traduisant une IgG Lambda

II.2.1.2.3.2. L’immunosoustraction sérique : Son principe consiste à faire réagir sur l’automate Capillarys® (Sebia®), le sérum renfermant le composé monoclonal avec différentes familles de billes de sépharose sur lesquelles a été greffé un Ac réagissant contre les chaînes ɣ , α , μ, kappa ou lambda. Après agitation puis sédimentation des billes, une nouvelle électrophorèse est réalisée sur le surnageant, soumises à un champ électrique, les protéines sont séparées puis détectées par photométrie d’absorbance à 200 nm. Les profils électrophorétiques sont ensuite analysés visuellement pour détecter les anomalies et caractériser les protéines monoclonales mises en évidence.

31

Figure(17) :Immunotypage, technique immunotyping réalisée sur

Capillarys-

SEBIA.

L’analyse des résultats se fait en comparant les six électrophorégrammes de l’échantillon testé. La présence d’une Igm se traduit par l’absence ou la diminution d’un pic observé avec un antisérum anti-chaînes lourdes, et l’absence ou la diminution d’un pic observé avec un antisérum anti-chaînes légères, en superposition avec l’électrophorégramme de référence.

32

Figure(18) : Immunotypage d’un sérum présentant une Ig A lambda monoclonale migrant au niveau des bêta-2 globulines (indiquée par les flèches).

II.2.2. Exploration Des Proteines Urinaires : II.2.2.1. Phase pré-analytique : L’échantillon urinaire destiné à l’analyse immuno-électrophorétique, environ 25 ml, doit être représentatif de la diurèse des 24 heures, car l’excrétion des chaînes légères varie au cours du nycthémère.

33

II.2.2.2. Phase analytique et post-analytique : II.2.2.2.1. Dosage des protéines urinaires : La protéinurie physiologique est d’environ 40 à 80 mg/24h. Une protéinurie supérieure à 150 mg/j est anormale chez l’adulte, ou 0,15 g de protéinurie/g de créatininurie. Chez l’enfant, une protéinurie est définie chez le nouveau-né (moins de 30 jours), le nourrisson (jusqu’à 12 mois), le jeune enfant (de 2 à 10 ans) comme étant supérieure à 145 mg/m2/j, 110 mg/m2/j et 85 mg/m2/j respectivement. Certains utilisent néanmoins la même définition de la protéinurie chez l’enfant que celle chez l’adulte, soit une protéinurie supérieure à 150 mg/j. Les patients ayant une recherche de la protéinurie positive à deux reprises espacées de 1 à 2 semaines sont considérés comme ayant une protéinurie permanente par opposition aux protéinuries intermittentes. II.2.2.2.2. Electrophorèse des protéines urinaires : Lorsqu’une protéine monoclonale est présente dans le sérum, un excès de chaînes légères libres sera souvent présent dans l’urine, appelé protéine de Bence Jones. Elles seront visibles sous forme d’un pic étroit, le plus souvent dans la zone Gamma ou Bêta. L’électrophorèse des protéines urinaire(EPU) est utilisée dans le but de rechercher une protéine de Bence Jones et de suivre sa concentration dans le temps. Cette technique peut également permettre l’évaluation des lésions rénales qui représentent une complication fréquente du myélome multiple. Le résultat de l’électrophorèse des protéines urinaires ressemble alors à celui du sérum avec cinq ou six fractions visibles (26).

II.2.2.2.3. Analyses immunochimiques des immunoglobulines monoclonales : Isotypage

34

II.2.2.2.3.1. L’immunofixation urinaire : En

ce

qui

concerne

l’immunotypage

d’une

chaine

légère

libre

monoclonale(CLLM) ou immunoglobuline monoclonale, le principe est le même que pour le sérum. L’urine à analyser est déposée sans concentration préalable, dans les 6 puits constituant le gel. La première piste sert de piste témoin et les cinq autres sont mises en contact avec les antisérums suivants : un antisérum trivalent (G, A, M) réagissant avec les chaînes lourdes γ, α, μ , des 3 principales classes d’Ig, un antikappa libres et liées, un anti-lambda libres et liées, et enfin un anti-kappa et lambda libres. Cette technique est très sensible pour mettre en évidence et identifier la nature d’une CLLM ou une Ig monoclonale suspectée à l’électrophorèse. Le seuil de détection se situe autour de 15 à 20 mg/L. précisant que l’Ig typée dans le sérum permet en général de présager de la nature de l’Ig complète révélée par l’antisérum trivalent G, A, M.

Figure(19) : Immunofixation urinaire présentant une chaine légère monoclonal Kappa.

35

Il faut noter que les résultats des IF et des IS sont interprétés par au moins deux immunologistes du service après discussion permettant de confronter les données cliniques et biologiques et aboutissant à un accord pour l’interprétation finale des profils. II.2.2.2.3. Analyse et traitement des données Les données ont été saisies et traitées par les logiciels Excel 2007. Les résultats ont été exprimés par la moyenne ± écart-type pour les variables quantitatives et par pourcentage (effectif) pour les variables qualitatives. Ils sont reportés dans des tableaux, ou représentés sous formes d'histogrammes, de secteurs …

1-Etude épidémiologique : Notre étude épidémiologique est réalisée sur 197 dossiers de patients qui représentent des immunoglobulinopathies monoclonales de neuf ans et quatre mois entre juin 2010 et avril 2019. Ces patients sont âgés de 33 à 85ans. On a évalué nos résultats selon 6 paramètres : l’âge, sexe, le service clinique prescripteur, l’examen immunochimique réalisé, la nature isotypique de l’immunoglobuline monoclonale et la zone de migration.

1.1. Selon le sexe : La distribution du sexe des patients de 2010 à 2019 fait apparaître une nette prédominance masculine. Celle-ci s’observe, d’ailleurs, La Figure représente cette répartition. On note la forte prédominance masculine de 51 % des cas .avec un sexe ration 1.46

36

Titre du graphique

41%

59%

femme

homme

Figure(20) : Répartition du sexe (2010-2019)

1.2 .Répartition selon l’âge : On a 197 cas dont 87 cas l’âge est mentionné ; L’âge des cas de la cohorte étudiée, varie entre33 ans et 85 ans, avec une moyenne de 62, 46, et une médiane à 62 ans. Ce résultat est illustré dans le tableau suivant :

Moyenne d’âge

Médiane d’âge

Extrêmes d’âges

(ans)

(ans)

(ans)

62.46

62

33 ans et 85 ans

Tableau (II) : REPARTION ISOTYPIQUE DES IG SELON L’AGE

37

1.3. Selon le service clinique prescripteur : Le graphe ci-dessous représentent les demandes issues de ces différents services : Pendant ces 9 année et 4 mois on peut relever que le plus grand nombre de demandes nous parvient du service de l’hématologie ; externe et médecine interne qui constituent de ce fait les principaux services prescripteurs. Et moins de 7 pour les autres services.

de 2011 à 2019 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Figure(21) : Répartition des services cliniques prescripteurs de 2011 à 2019

1.4. Répartition en fonction de l’examen immunochimique réalisé : Les tests effectués sur 162 patient(le nombre real de patient est 197 mais on a 162 cas seulement mentionnes, pour le reste on a un manque de réactifs) durant ces années (de 2011 à 2019) ont été partagés entre les différentes analyses immunochimiques, notamment l’immunofixation et l’immunotypage. Le graphe cidessous montre une utilisation de la technique IT majoritaire par rapport à l’utilisation de la technique IF

38

2% 37% 61%

IF IT IF+IT

Figure(22) : répartition des analyses immunochimiques d’identification des composants monoclonaux de 2010 à 2019 IF : immunofixation / IT : immunotypage

1.5. Répartition en fonction de la zone de migration à l’EPS : Sur les 197 demandes d’EPS ayant nécessité une analyse immunochimique, Un pic d’importance variable a été noté chez 162 profils soit 82.23%.Le pic d’allure monoclonale est principalement situé au niveau de la zone γ (119 cas), soit 73%. Dans 24 cas, soit 15%, on le retrouve au niveau de la zone β+ γ, et dans 17 cas soit 10% on le retrouve au niveau de la zone β. au niveau de la zone des alpha1 ou alpha 2 globulines. La répartition isotypique de la série étudiée selon leur classe et zone de migration, figure dans le tableau !. On peut noter par rapport à l’ensemble de notre série, une forte prédominance de l’iso type même remarque IgG qui représente près de 66%, et IgM 17% contre seulement 7% pour IgA migrants dans la zone γ. Par ailleurs la proportion des IgA représente plus de 59% dans la zone β, contre 18% et23% respectivement pour IgG et CCLm lambda.

39

alpha 2+β, 1% alpha 2, 1%

β+γ, 15%

β, 10%

γ, 73%

β

γ

β+γ

alpha 2+β

alpha 2

Figure(23) : Répartition en fonction de la zone de migration

Isotype

Zone β

Zone γ

Nombre %

N

Zone β+ γ

Alpha2+ β

Alpha2

%

N

%

N

%

N

%

(N) IgG

3

18

79

66

4

14

/

/

/

/

IgM

/

/

20

17

1

4

/

/

/

/

IgA

10

59

9

7

17

71

1

100

1

100

kappa

/

/

2

2

1

4

/

/

/

/

Lambda

4

23

9

8

1

4

/

/

/

/

Tableau III : Répartition isotypique selon la zone de migration On constate, par ailleurs, que la zone γ est le secteur de migration privilégiée des IgG, des IgM, alors que les IgA migrent très souvent dans la zoneβ.

40

1.6. Répartition en fonction de la nature isotypique de l’Igm On peut noter par rapport à l’ensemble de notre série, une forte prédominance de l’isotype IgG qui représente environ 53%, alors que les IgA représentent 23% quant aux IgM environ 13%. On note une prédominance de CLL lambda 8%, par rapport à la CLL kappa qui représente 3 %.

Lambda, 8% Kappa, 3%

IgM, 13% IgG, 53% IgA, 23%

IgG

IgA

IgM

Kappa

Lambda

Figure(24) : Répartition en fonction de la nature isotypique de l’Igm

lors de l’immunofixation ou l’immunotypage on observe L’absence de réaction avec l’une des anti-chaînes lourdes appliquée, mais avec présence d’une chaîne légère ça peut être expliqué par : a/ la présence d’une gammapathie à Ig D ou Ig E (ils ne peuvent etre confirmés en raison du manque les antisérums spécifiques anti-chaînes lourdes delta et epsilon au niveau d’unité d’immunologie /laboratoire central de l’HMRUC). b/ la présence d’une chaîne légère libre qu’il conviendra de confirmer avec les antisérums spécifiques anti-chaînes légères libres kappa ou lambda.

41

Kappa

Lambda

IgG

49

36

IgA

17

21

IgM

18

3

Total

84(59%)

60(41%)

Tableau IV : Répartition isotypique

Les résultats présentés objectivent la prédominance des chaînes légères kappa (59%) par rapport aux chaînes légères lambda (41%). Par ailleurs, les chaînes légères kappa semblent majoritaires pour les IgG et IgM, alors que, pour les IgA, ce sont les chaînes lambda qui prédominent. Discussion : I. Caractéristiques épidémiologiques et cliniques 1. Sex-ratio : La prédominance masculine notée dans différentes séries de la littérature est vérifiée dans notre série (sex-ratio :1.46), notamment en Tunisie (37, 38), .A en Allemagne (39).Ces résultats peuvent être confirmés par les données de la littérature sur le myélome (ratio de 1.4) (40). Il est à souligner toutefois que notre résultat est un peu plus élevé comparativement aux autres études citées, cela pourrait être influencé par le fait que les patients recrutés sont majoritairement militaires, donc de sexe masculin. 2. Selon l’âge : Dans la présente étude, l’âge moyen du diagnostic est de 63 ans avec un pic de fréquence aux alentours de 60 ans. La découverte d’une gammapathie est une éventualité fréquente après 50 ans : elle augmente avec l’âge et varie dans la population adulte de 1 à 10 %, atteignant approximativement 3 % des sujets de plus de 70 ans et 10 % des sujets de plus de 80 ans (41). Notre résultat est en accord avec les études tunisiennes (42), et Allemande (43) qui présentent une moyenne d’âge autour de 62ans. Il est intéressant de noter que d’autres études Islande (42) affichent une moyenne d’âge plus élevée variant

42

entre 69 et 71 ans. Cependant on note un chiffre plus élevée à 79 ans chez les patients de la série de Blois (43).

3. selon Service prescripteur : L’EPS est principalement indiquée en cas de suspicion de myélome multiple pour le diagnostic et le suivi, et pour le diagnostic de la maladie de Waldenström. Les signes révélateurs sont divers et variés. Ils peuvent être décelés durant un examen biologique de routine. Dans d’autres cas, ce sont des signes cliniques qui peuvent constituer des circonstances de découverte (44). Le rôle du médecin traitant est essentiel pour dépister la maladie et pour initier la démarche diagnostique en lien avec les autres spécialistes, notamment : l’hématologue, le rhumatologue, le neurologue, le néphrologue, le biologiste, le radiologue, le pathologiste, l’oncologue médical, le radiothérapeute, le chirurgien orthopédique, le neurochirurgien, l’interniste et le gériatre (45).Nos résultats sont parfaitement cohérents avec la littérature, (Tableau) :

Service

Nombre de

Pourcentage

cas HEMATOLOGIE

77

39.69%

EXTERNE

49

25.25%

MEDECINE INTERNE

25

12.89%

Néphrologie

14

7.21%

Orthopédie

4

2.06%

Gastrologie

4

2.06%

Maladies infectieuse

4

2.06%

Cardiologie

3

1.54%

43

ophtalmologie

3

1.54%

hémodialyse

3

1.54%

Neuro-chirurgie

2

1.03%

urologie

2

1.03%

Rééducation

1

0.51%

Réanimation

1

0.51%

Neurologie

1

0.51%

Réanimation

1

0.51%

CTCV

1

0.51%

Tableau V : Distribution des Prescriptions en fonction du Services demandeur.

Il est à souligner toutefois que notre résultat est élevé concernant les cas externes au laboratoire, notons que les malades sont suivis à titre externe par les mêmes spécialistes que pour les malades à titre interne. Les médecins à titre externes n’ont pas été répertoriés. Il n’existe pas de recommandation de dépistage systématique chez un patient asymptomatique, néanmoins la prescription d’une électrophorèse des protéines, présente une indication dans de nombreuses disciplines (46). Les indications retenues sont celles qui ont obtenu un consensus pour plus de la moitié des experts (47). (Tableau)

44

Tableau VI : Les indications retenues pour dépistage systématique d’une immunoglobulinopathie monoclonale.

1.4 Selon l’examen immunochimique réalisé : La découverte fortuite d’un pic monoclonal à l’électrophorèse des protéines(ELP) est un évènement fréquent, surtout depuis le gain de sensibilité apporté par les techniques d’électrophorèse capillaire. La méthode traditionnelle est l’Immunofixation sur gel (IF). Dans le présent travail, dans près de 61% des casons a eu recours à une immunosoustraction qui tient une place importante face à seulement 37 % pour l’immunofixation. Ce résultat est similaire à des études signalées par lasociété SEBIA®qui montrent aussi que l’IT(IS) prend une place plus importante que l’IF (figure).

45

Figure(25) : utilisation majoritaire d’IS par rapports à l’IF selon les études signalées par la société SEBIA IS: Immunosoustraction; IF : Immunofixation

5 .Répartition des Igm selon la zone de migration : Une gammapathie monoclonale est fréquemment diagnostiquée grâce à la mise en évidence d’un pic plus ou moins grand au niveau des γ globulines, la migration de l’Igm peut plus rarement se situer au niveau des autres fractions protéiques (48).Les résultats de cette répartition vont de pair avec ceux de la littérature qui confirment la migration privilégiée des IgG et des IgM dans la zone des γ-globulines et des IgA dans

46

la zone des β-globulines (49, 50). L’EPS permet rarement de révéler un pic monoclonal en zone des alpha-globulines(51). En effet, dans notre série on a identifié l’ Igm dans la zone des alphaglobulines.

6 .Répartition isotypique des Igm : Concernant la distribution isotypique des GM de notre série (fig.), on remarque la prédominance de l’isotype IgG qui représente plus de la moitié des cas avec 53%, suivi par l’isotype IgA avec 23%, puis IgM avec 13% et les gammapathies à chaînes légères libres λ et κ qui représentent 11% des cas. Nos résultats sont en accord avec l’étude de Mseddi-Hdiji et al., 2005(38), la place prépondérante qu’occupent les IgG de leur série avec 51.7%.Les IgA occupent la 2ème place avec plus de 21 % des cas et les chaines légéres libres (K et λ)pour 13.6% des cas et les IgM ne représente que 8.7% . Alors que dans la plupart des séries internationales les IgM occupent la seconde place avec une proportion allant de plus de 20% à près de 32 %. Ces différences peuvent en partie être expliquées par la plus forte prévalence de la maladie de Waldenström en Europe de l’Ouest par rapport au bassin méditerranéen. D’autres facteurs génétiques et environnementaux non encore parfaitement connus devraient intervenir. (Mseddi-Hdiji et al., 2005, Decaux et al., 2007).(38,52)

47

AUTEUR

N (N)

G (%)

A (%)

M (%)

ONG 1997

503

64,41

10,93

21,07

1182

51,09

16,41

25,04

4193

48,91

12,97

32,98

198 (164)

57,31

18,29

4,26

808 (787)

61,62

10,54

20,07

162(197)

53%

23%

13%

PAYS-BAS FINE 1985 FRANCE (PARIS HUREZ 1985 FRANCE (ANGERS, BREST ET POITIERS) MAKNITUNISIE (TUNIS) 1990 KYLE-USA 1989 NOTRE SERIE

Tableau VII : Distribution isotypique des gammapathies monoclonales selon les Séries(38)

Dans notre étude, les chaînes légères kappa sont prédominantes, avec près de 59% des cas dans la cohorte étudiée para port a les chaines légères lambda avec 49% et un rapport κ/λ plus élevé pour les IgG et les IgM que pour les IgA. Ceci concorde avec les données de la littérature (44,53). En effet, physiologiquement, les chaînes κ sont synthétisées en excès par rapport aux chaînes λ . Il parait donc tout à fait cohérent de retrouver une telle proportion.

48

41%

59%

lambda kappa

Figure (26) : Résultat de la distribution des chaînes légères.

49

Conclusion : Les Igm représentent un problème fréquent en pratique clinique. Leur étude isotypique est une étape indispensable dans la détermination de la classe de l’Ig et de sa chaine légère associée ou libre, des éléments utiles au diagnostic et au pronostic de la maladie causale. Elle doit compléter l’électrophorèse des protéines. Cette étude a été l’occasion de partager l’expérience d’unité d’immunologie/laboratoire central de l’Hôpital militaire Régional Universitaire de Constantine (HMRUC)en matière d’identification immunologique des immunoglobulines monoclonales et de discuter les résultats comparativement aux données de la littérature. Mené sur une cohorte de 197 cas d’Igm, ce travail nous a permis de confirmer certaines particularités :  La forte prévalence des Igm chez le sujet âgé avec une prédominance masculine remarquable,  La prédominace de l’isotype IgG et de la chaine légère κ par rapport à λ,  Les deux techniques d’isotypage utilisées en routine sont l’IF sur Hydrasys® et l’IS sur Capillarys®. Selon les résultats de notre étude nous avons constaté une bonne concordance entre les deux techniques ; cependant chaque technique présente des avantages et des inconvénients. En effet, l’IF permet de mettre en évidence la chaine lourde et la chaine légère libre ou liée de l’Igm, contrairement à l’immunosoustraction qui ne permet pas toujours de mettre en évidence des CLLm circulantes associée à l’Igm . Par ailleurs l’IS présente l’avantage d’être entièrement automatisé ce qui diminue considérablement les risques d’erreurs qui pourraient survenir par IF (technique semi automatisée). Il ressort de cette étude que l’IF et l’IS sont deux techniques Complémentaires, cependant l’IF reste la technique de référence cité dans de nombreuses recommandations dans le suivie des immunoglobulinopathies monoclonales.

50

Résumé : Titre : Expérience de laboratoire central /unité d’immunologie de l'HMRUC dans l’étude isotypique des immunoglobulines monoclonales Présenté par : boumahrat khaoula ,bouguerra imane,ghellab amira Mots Clés : Immunoglobuline monoclonale, Electrophorèse des protéines, étude isotypique , Immunofixation, Immunosoustraction Objectif : Le présent travail a pour objectif de partager l’expérience de l’unité d’immunologie du laboratoire central de l’HMRUC en matière d’identification immunologique des immunoglobulines monoclonales et de discuter les résultats comparativement aux données de la littérature. Matériels et Méthodes : Il s’agit d’une étude rétrospective réalisée au service d’immunologie de l’HMRUC, sur une période de 9 années et 4 mois (2010-2019). Nous avons récupéré puis analysé les données immunologiques d’une cohorte de 197 cas pour lesquels une électrophorèse des protéines sériques, urinaire et une étude isotypique ont été réalisés. Résultats : Sur les 197 électrophorèses des protéines sériques on a identifié 162 cas d’immunoglobulines monoclonales (82.2%) (35 cas manque de réactifs). La répartition selon le sexe trouve un sexe- ratio de 1.46, en faveur des hommes. La médiane d’âge est à 62 ans avec un pic de fréquence aux alentours de 60ans. Quand le pic d’allure monoclonale est bien individualisé, Il est principalement situé au niveau de la zone des γ-globulines (119 cas), suivi de la zone des beta-globulines + γglobulines avec 24cas. Nous avons enregistré une forte prédominance de l’isotype IgG soit 53%des cas. Les chaînes légères kappa semblent majoritaires pour les IgG et IgM, alors que pour les IgA, les chaînes lambda prédominent. Nous avons noté une concordance globale entre les deux techniques d’isotypage de 84%, et une discordance de 17%. On note une évolution considérable dans l’utilisation de l’immunosoustraction sur Capillarys® au laboratoire. Cependant l’immunofixation reste la technique de référence. !!

51

Summary : Title: Central Laboratory / Immunology Unit Experience of HMRUC in the Isotypic Monoclonal immunoglobulin Study Presented by: boumahrat khaoula, imane bouguerra, ghellab amira Keywords: Monoclonal immunoglobulin, Protein electrophoresis, isotype study, Immunofixation, Immunosubtraction Goal: The purpose of this paper is to share the experience of the Immunology Unit of the HMRUC Central Laboratory in the immunological identification of monoclonal immunoglobulins and to discuss the results compared to literature data. Materials and methods: This is a retrospective study conducted in the immunology department of the HMRUC over a period of 9 years and 4 months (2010-2019). We collected and analyzed the immunological data of a cohort of 197 cases for which serum protein electrophoresis, urine and an isotype study were performed. Results: Of the 197 electrophoresis of serum proteins, 162 were identified monoclonal immunoglobulin (82.2%) (35 cases lack of reagents). The sex distribution finds a sex ratio of 1.46, in favor of men. The median age is 62 with a peak frequency around 60 years. When the monoclonal peak is well individualized, it is mainly located at the γ-globulin zone (119 cases), followed by the beta-globulin + γ-globulin zone with 24cases. We noted a strong predominance of the IgG isotype is 53% of cases. Light kappa chains seem to be the majority for IgG and IgM, whereas for IgA, lambda chains predominate. We noted an overall agreement between the two isotyping techniques of 84%, and a discrepancy of 17%. There is considerable evolution in the use of immunosubtraction on Capillarys® in the laboratory. However, immunofixation remains the reference technique. !!

52

Références bibliographiques : 1- J-C. H. Immunologie fondamentale : 2e cycle des études de médecine, de pharmacie et d'odontologie. EEf, editor1999. 2- LAROUSSE. immunoglobuline ou anticorps http://www.larousse.fr/2016 2016 [consulté le 07/10/2016]. 3- P P. Le système immunitaire. DB S, editor2003. 4- Institut Pasteur Paris F SA. Cours d'immunologie générale et de sérologie de l'Institut Pasteur. In: C. D. U. ee, editor. 5- GA. H. Biochimie humaine : introduction biochimique à la médecine interne. . De Boeck université. Paris B e, editor1996. 6- Ferrand-poulain. Immunoglobulines, L’essence de la vie "elodie-bio-2-04102006. html2006 04/10/2006 [consulté07/10/2016 ]. 7- Plasmocytes : morphologie, synthèse des immunoglobulines http://hematocell.univ-angers.fr/index.php/enseignement-delhematologiecellulaire/leucocytes-et-leur-pathologie/97-plasmocytesmorphologiesynthese-des-immunoglobulinesdécembre 2011 [consulté 8- (Ferrand-poulain. Immunoglobulines, L’essence de la vie " http://docslide.fr/documents/immunoglobulines-lessence-de-la-viepatrunoelodie-bio-2-04102006.html2006 04/10/2006 [consulté07/10/2016]) 9- synthese et structure des immunoglobulines / guy gorochov/Service d’ImmunologieA Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière 10- les immunoglobulines et leurs fonctions / Marie-Nathalie Kolopp-Sarda MCUPH Laboratoire d’Immunologie, Centre de Biologie Lyon Sud, Octobre 2009 le 07/10/2016]. 11- AdRslDelTdA. Néphrologie. FHdF T, editor1992 12- Adaptive Immunity: Specific Defenses of the Host http://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio225/chap17/Adaptiv e_Immunity3. [consulté 07/10/2016]. 13- Roitt I. Immunologie Médicale. Paris: Maloine.2002 ; 33-46 14- Jean-Paul Fermand AD B-NP, Liliane Intrator, Jacques Bienvenu, Jean-Louis Preud'homme.

Cahier

de

formation

biologie

medicale

:immunoglobulines

monoclonales. BIOFORMA, editor2013.

53

15- D. G. Introduction aux techniques utilisées en biochimie : Immunodiffusion et immunoelectrophorèse http://www8.umoncton.ca/umcm-gauthier_didier/siitub/iddies.html20 juin 2007 [consulté le 20/11/2016]. 16- Decaux O, Cazalets-Lacoste C, Cador-Rousseau B et al. Gammapathie monoclonale de signification indéterminée: suivi évolutif de 51 patients âgés de plus de 70 ans. Rev Med Interne 2002; 23: 751-8. 17- Grosbois B, Decaux O et al. Gammapathies monoclonales et myélome multiple : Quelles nouveauté ?quelles perspectives ? La revue de médecine interne 2007 ; 28 :677-681. 18- Lapulus E, Chevailler A et al. Diagnostic biologique d’une Immunoglobuline monoclonale. Revue Française de laboratoire 2007, 327:67-74. 19- (Wainsten.,2012,

Référentiel

Onco-hématologie.,2014,

Touaoussa

.,2015

,Wainstenet al.,2012) 20- Bouatay A, Hizem S, Ben Youssef Y et al. Myélome multiple: aspect clinique, diagnostic biologique et pronostic. Immuno-analyse & Biologie Spécialisée. 2013;28(1):30-35. 21- Alexanian R, Goeken JA, Keren DF, Kyle RA, Tomar RH, Gorevic PD. Monoclonal GuidelinesPanel.: http://www.dokkyomed.ac.jp/dep-k/cli-path/aaasuper/ppframe.htm 22- Andrès E. Conduite a tenir devant une gammapathie monoclonale (gm).2013 /1-2. 23- Les gammapathies monoclonales de signification indéterminée Ann. Med. Interne, 2002,153, n° 7, pp. 459-466 24- KYLE RA, RAKJUMAR SV: Monoclonal gammopathies of undetermined significance. Hematol Oncol Clin North Am, 1999; 13: 1181-202. 25- ZANDECKI M, GENEVIEVE F, JEGO P, GROSBOIS B : Les gammapathies monoclonales de signification indéterminée. Rev Med Interne, 2000 ; 21 : 1060-74. 26- Les IM : Etude épidémiologique, biochimique et étiologique d’une cohorte de 214cas. 27- International Myeloma Foundation .Comprendre l’eléctrophese avec le support de la société Sebia .2011 ; 28- Forte FA, Prelli F, Yount WJ, Jerry LM, Kochwa S, Franklin EC, et al. Heavy chain disease of the gamma (gamma M) type: report of the first case. Blood. 1970;36(2):137-44.

54

29- Beauvillain C, Jeannin P, Renier G, Chevailler A. Immunoglobulines monoclonales : méthodes diagnostiques en 2011. Revue Francophone des Laboratoires. 2011; 2011(433):55-62. 30- Tsieh Sun YYL, Thomas Degnan. Study of Gammopathies with Immunofixation Electrophoresis. American Journal of Clinical Pathology. 1979; 72(1):5-11. 31- (guide sebia.,2010) 32- Bossuyt X, Bogaerts A, Schiettekatte G, Blanckaert N. Detection and classification of paraproteins by capillary immunofixation/subtraction. Clinical Chemistry. 1998;44(4):760-4. 33- Bossuyt X, Schiettekatte G, Bogaerts A, Blanckaert N. Serum protein electrophoresis by CZE 2000 clinical capillary electrophoresis system. Clinical Chemistry. 1998;44(4):749-59. 34- I. SADCS. Une immunoglobuline M monoclonale invisible sur le profil d'électrophorèse capillaire. John Libbey Eurotext. 2008;66(4),:465-9.

35- Maud J. Immunoglobuline monoclonale et myélome. Devenir et suivi des du immunoglobulines monoclonales, nouveaux aspects diagnostiques et thérapeutiques myélome. Revue du rhumatisme 2008;75(4):53 36- Lemieux-Blanchard É. Gammapathie monoclonale de signification indéterminée un pic pas si insignifiant ! Le Médecin du Québec. 2014;49(3). 37- Vekemans M-CC, Jo Doyen, Chantal Michaux, Lucienne Gammapathies monoclonales de signification indéterminée Louvain 38- S. Makni RZ, M.R. Barbouch, Kh. Ayed,M. Moalla et L. Zakraoui. Gammapathies monoclonales en Tunisie. Rev Fr Transfus tt6mobiol. 1990;33:31-8. 39- S. Mseddi-Hdiji SH, M. BenAyed , N. Tahri , M. Elloumi , S. Baklouti,J. Hachicha , M.S. Krichen, Z. Bahloul , H. Masmoudi. Gammapathies monoclonales en Tunisie : analyse épidémiologique, immunochimique et étiologique d’une série de 288 cas. Pathologie Biologie. 2004;53:19–25. 40- Von A. OBERDORFER KS, H.-J. LANGE und A. NEISS. Zur Verteilung von Paraproteinämien nach Geschlecht und Alter der Patienten, Paraprotein-Klassen, Subklassen und -Leichtketten-Typen. Z Klin Chem Klin Biochem. 1973;11:51-64. 41- Anne Cairoli MAD. Myélome multiple: diagnostic et perspectives thérapeutiques. Forum Med Suisse. 2013;13(38):746-51.

55

42- Azaïs I. Conduite à tenir devant une gammapathie monoclonale. La Lettre du Rhumatologue. mai 1999;252 43- Anne-Sophie G. Etude rétrospective sur les gammapathies monoclonales dépistées à Nantes depuis 25ans (cohorte de 7500 patients ) Université de Nantes Faculté de Pharmacie; 2008. 44- O. Decauxa PR, A. Ruellandc, L. Estepad, R. Leblaya, B. Grosboisa. Épidémiologie descriptive des gammapathies monoclonales. Expérience d’un centre hospitalier général et d’un service de médecine interne de centre hospitalier et universitaire. La Revue de médecine interne. 2007;28(670-676). 45- Ommari A. Les gammapathies monoclonales de signification indéterminée. Analyse épidémiologique et biochimique (Expérience du laboratoire de biochimie de l'HMIMV- Rabat). Faculté de Médecine et de pharmacie; 2011. 46- HAS. Tumeur maligne, affection maligne du tissu lymphatique ou hématopoïétique Myélome multiple. Institut national du cancer. 201 47- Richard Sheng Poe Huang DAO, Ashok Tholpady,Brian N. Chang, Amitava Dasgupta, Andy Nguyen, and Amer Wahed. High False- Positive Rate for Monoclonal Gammopathy Using Capillary Electrophoresis (CAPILLARYS 2) Alone. Journal of Clinical Laboratory Analysis 2014;28:42-6 48- Aurore Labruyère HP. Élaboration et validation d’un référentiel de prescription et de décision en cas de pic monoclonal. 2011;22 ( 97):68-74. 49- Gammapathies monoclonales http://www.memobio.fr/html/immu/im_el_gmo.html [consulté le15/03/2017]. 50- Rajkumar RAKSV. MONOCLONAL GAMMOPATHIES Of UNDETERMINED SIGNIFICANCE. Rev Clin Exp Hematol September 2002;6.3. 51- COFER. Item 126 : Immunoglobuline monoclonale. Collège Français des Enseignants en Rhumatologie2010-2011. 52- Frédérique Retornaz IP, Caroline Franqui,Luc Benezech,Philippe Halfon, Frédérique Rousseau,Michelle Merlin,Catherine Molines. Conduite à tenir devant la découverte d’un pic monoclonal à l’électrophorèse des protéines. Ann Gerontol 2010 3 15-21.

56

53- O. Decaux P, Rodon A , Ruelland L et al .Epidemiology of monoclonal gammopathy in a general Hospital and a University Internal Medicine Department. La Revue de médecine interne. 2007 ; 670-676. 54- Rishi K. Wadhera M, and S. Vincent Rajkumar, MD. Prevalence of Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance: A Systematic Review. Mayo Clin Proc. 2010;85(10):933-42.

57