EVALUACION DEL EFECTO DE LA IMPLEMENTACION DE SISTEMAS SILVOPASTORILES Y PASTIZALES CONVENCIONALES SOBRE LA DIVERSIDAD BACTERIANA EDAFICA EN LA ECOREGION CAFETERA DE COLOMBIA

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TABLA DE CONTENIDO

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OBJETIVOS

1.1 1.2

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OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1 1

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INTRODUCCIÓN

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MARCO TEÓRICO

5

3.1 3.2 3.3 3.4

SUELO ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DEL SUELO DIVERSIDAD DE MICROORGANISMOS EDÁFICOS EFECTO DE ANTECEDENTES DE MANEJO, ACTIVIDADES AGRÍCOLAS, TIPO Y

5 6 8

3.4.1 PASTIZALES CONVENCIONALES Y SISTEMAS SILVOPASTORILES 3.5 MÉTODOS PARA LA EVALUACIÓN DE LA DIVERSIDAD MICROBIANA EDÁFICA 3.5.1 MÉTODOS NO DEPENDIENTES DE CULTIVO 3.5.2 RECUENTOS DIRECTOS POR EPIFLUORESCENCIA 3.5.3 TÉCNICAS MOLECULARES PARA ESTUDIOS DE DIVERSIDAD 3.5.3.1 Electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante (DGGE)

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HIPÓTESIS

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METODOLOGÍA

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CARACTERÍSTICAS FISICOQUÍMICAS DEL SUELO SOBRE LA DIVERSIDAD BACTERIANA

5.1 5.2 5.3 5.4 5.4.1 5.4.2 5.4.3 5.4.4 5.4.5 5.4.6 5.4.7

ÁREA DE ESTUDIO DISEÑO EXPERIMENTAL DESCRIPCIÓN Y RECOLECCIÓN DEL SUELO: MATERIALES Y MÉTODOS RECUENTO DE BACTERIAS POR EPIFLUORESCENCIA CON DAPI DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA: EXTRACCIÓN DE DNA: AMPLIFICACIÓN DEL 16SR(DNA) DGGE ÍNDICES DE DIVERSIDAD Y ANÁLISIS DE CLUSTER ANÁLISIS ESTADÍSTICO

23 23 24 25 25 25 25 26 26 26 27

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CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

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PRESUPUESTO

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BIBLIOGRAFIA

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iii

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1.1

OBJETIVOS

Objetivo General

Evaluar el efecto de la implementación de sistemas silvopastoriles y pastizales convencionales sobre la diversidad y actividad enzimática bacteriana edáfica en la Ecorregión Cafetera de Colombia y Valle.

1.2

Objetivos específicos

-Evaluar y comparar la diversidad bacteriana edáfica no cultivable en sistemas recientemente establecidos y antiguos en suelos de la Ecorregión Cafetera y Valle. - Determinar y comparar la actividad enzimática utilizando β-glucosidasa y ureasa en sistemas SSP recientemente establecidos y antiguos. -Correlacionar la diversidad bacteriana de los sistemas con algunas variables fisicoquímicas y actividad enzimática.

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INTRODUCCIÓN

En los últimos años el empleo de prácticas agrícolas ha implicado el reemplazo de coberturas vegetales nativas por sistemas de producción, lo cual ha generado cambios y alteraciones en los ecosistemas naturales, perturbando diferentes procesos ecológicos (Nannipieri et al., 2003). Los suelos agrícolas pueden sufrir procesos de degradación física como la erosión y compactación, degradación química debido a la acidificación, pérdida de nutrientes, contaminación con residuos industriales por el uso excesivo de plaguicidas y fertilizantes, degradación biológica por agotamiento de la materia orgánica (MO) y pérdida de biodiversidad (Girvan et al., 2003). La ganadería o pastizal convencional en América tropical está catalogada como la principal responsable del impacto ambiental que viven los ecosistemas naturales (Murgueitio, 2003). Este modelo no utiliza adecuadamente el suelo como el factor más importante y fundamental del proceso productivo, generando cambios y alteraciones a nivel fisicoquímico y biológico en el suelo. Estos cambios están directamente relacionados con la aplicación de altas dosis de fertilizantes químicos de rápida solubilidad, con los problemas inherentes que esto trae para la biota y la naturaleza misma del mismo. Es así como el empleo de prácticas inadecuadas de manejo agrícola en nuestro país ha incrementado la degradación de los recursos naturales. Por tal motivo, se ha implementado el uso de sistemas silvopastoriles (SPP) los cuales incluyen transformaciones que involucran el uso racional y adopción de prácticas agrícolas mejoradas. Estos sistemas, constituyen una modalidad de agroforestería que combinan en el mismo espacio plantas forrajeras, como gramíneas y leguminosas, con arbustos y árboles destinados a la

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alimentación animal y a otros usos complementarios, como la producción de madera y frutos (Musalen, 2003; Girón, 2005). La implementación de SSP mantiene el equilibrio económico y ecológico del ecosistema generando nuevos servicios ambientales. Los SSP son considerados importantes depósitos de Carbono (C) que contribuyen a un mayor almacenamiento de de MO en el suelo (Sinclair, 1999). De igual forma los SSP estimulan la diversidad biológica, mejoran la cobertura vegetal, fertilidad del suelo, calidad y cantidad de forraje para el ganado, controlan la erosión, y generan una oferta de hábitat para la fauna silvestre (Buckley y Schmidt, 2003). Los microorganismos contribuyen a muchos servicios esenciales para los ecosistemas, especialmente en la formación de suelos, mantenimiento de procesos ecológicos como la descomposición de MO, fijación de nitrógeno (N2), disponibilidad de nutrientes por las plantas (Horner-Devine et al., 2003). Por esta razón los microorganismos cumplen un papel fundamental en la fertilidad del suelo. Adicionalmente, es conocido su gran potencial en el control biológico, recuperación de suelos degradados y contaminados mediante la detoxificación de contaminantes y restauración de los procesos y propiedades físicas, químicas y biológicas de los suelos (Parfitt et al., 2005). Los microorganismos constituyen parte importante del reservorio genético de la tierra con un gran potencial biotecnológico. En este sentido, la conservación de la diversidad genética de los mismos podría tener un considerable valor económico en el futuro (Cowan et al., 2005). De otra parte, son los primeros en reaccionar a cambios físicos y químicos en el ambiente convirtiéndose en importantes indicadores de calidad del suelo (Bandick y Dick, 1999). Sin embargo, a pesar de las importantes funciones que los microorganismos desempeñan, en Colombia es limitado el conocimiento sobre la presencia, distribución y función de la 3

diversidad bacteriana edáfica y el efecto que generan diferentes prácticas de manejo agrícola sobre su diversidad. El presente trabajo pretende continuar con el estudio en diversidad de microorganismos de suelos desarrollado dentro del proyecto de “Valoración de bienes y servicios ambientales de la biodiversidad para el desarrollo sostenible de paisajes rurales Colombianos, Complejo Ecorregional Andes del Norte (CEAN)” llevado a cabo por el Centro de Excelencia en Investigación y Estudios en Biodiversidad y Recursos genéticos (CIEBREG). El objetivo principal de este proyecto será evaluar el efecto de la implementación de SPP y pastizales convencionales sobre la diversidad bacteriana edáfica en la Ecorregión Cafetera y Valle. Para esto será indispensable el análisis de la comunidad bacteriana por medio de técnicas no dependientes de cultivo como el recuento directo por epifluorescencia y PCR-DGGE. Estos análisis podrán correlacionarse con algunos parámetros fisicoquímicos del suelo y actividad enzimática, particularmente de aquellas enzimas relacionadas con el ciclaje de nutrientes: C y N ofreciendo una visión más detallada sobre el estado y calidad del suelo, así como del efecto del tiempo de establecimiento de los SSP sobre la diversidad bacteriana no cultivable. Finalmente, el trabajo permitirá suministrar información acerca de patrones de distribución, en cuanto ubicación espacial de especies o comunidades bacterianas que podrían tener un interés biotecnológico, lo cual constituye un elemento básico para el desarrollo de estrategias de monitoreo, restauración ambiental, bioprospección y conservación.

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3.1

MARCO TEÓRICO

Suelo

El suelo es un recurso natural presente en la superficie terrestre, constituido por material mineral y orgánico disgregado. También es considerado un medio de soporte para el crecimiento vegetal y la base de todos los ecosistemas terrestres (Kennedy, 1999). En el suelo se llevan a cabo procesos como la descomposición de la MO, se desarrollan actividades agrícolas y ganaderas y es el lugar donde retornan los productos minerales de los ciclos biogeoquímicos (Dubey et al., 2005). El suelo bajo la influencia de organismos vivos evoluciona hasta formar un sistema complejo y heterogéneo. Su extrema complejidad resulta de múltiples interacciones entre parámetros que incluyen la textura, estructura, contenido de agua, pH, variaciones climáticas y la diversidad de las capacidades fisiológicas y metabólicas existentes en los microorganismos que lo componen (Kang & Mills, 2005). En la última década se han incrementado los trabajos relacionados con las comunidades microbianas edáficas, específicamente en el estudio de su papel fundamental en el soporte de las funciones y servicios ecosistémicos, especialmente en el mantenimiento de la estabilidad y conservación del suelo o aumento de la disponibilidad de nutrientes (Sun et al., 2004). Por este motivo, el análisis y la caracterización de la estructura de las comunidades microbianas resulta ser una herramienta indispensable para el seguimiento y predicción de los cambios en la calidad del suelo (Ranjard et al., 2000; Prosser, 2002).

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A pesar de la existencia de estos estudios, en Colombia es limitado el conocimiento sobre la presencia, distribución y función de la diversidad microbiana edáfica y su respuesta frente a las diferentes prácticas de manejo. Adicionalmente, la creciente preocupación por desarrollar posibles bioindicadores para el monitoreo de cambios en la calidad del suelo provocados por derrames de compuestos orgánicos e inorgánicos, contaminación por plaguicidas, procesos de erosión, incremento periódico del uso de fertilizantes químicos en la agricultura, han hecho que la investigación sobre la biota en suelos se convirtiera en un área prioritaria (Johnson et al., 2003).

3.2

Actividad enzimática del suelo

Las enzimas son proteínas especializadas que se combinan con un substrato específico y actúan como catalizadores bioquímicos de una reacción (Maier et al., 2001). Los organismos y las plantas liberan constantemente enzimas al suelo por secreción y por lisis celular después de su muerte; un bajo porcentaje de estas proteínas quedan inmovilizadas y estabilizadas con los diferentes componentes de la fase sólida del suelo, como las arcillas, moléculas orgánicas y complejos organominerales (Askin & Kizilkaya, 2006). En el suelo estas enzimas son claves para la transformación de energía y reacciones en el ciclaje de los nutrientes. La mayor producción de enzimas extracelulares se le atribuye a microorganismos por su gran biomasa, su alta actividad metabólica y su corto ciclo de vida, en contraste con otros organismos que también las pueden liberarlas como plantas y animales (Bandinck y Dick, 1999). Para aproximarse al entendimiento de los ciclos biogeoquímicos y a los niveles de actividad microbiana responsables de estos procesos, se han evaluado varias actividades 6

enzimáticas del suelo. Gracias a ellas se puede determinar las reacciones bioquímicas que suceden dentro de este heterogéneo y complejo sistema (Acosta-Martinez et al., 2006). De otra parte, estas se encuentran estrechamente relacionadas con las principales propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo y son sensibles a los cambios generados por diferentes prácticas de manejo. Por este motivo la actividad enzimática permite monitorear el funcionamiento del suelo frente a diversas condiciones antropogénicas (Quilchano y Marañon, 2002). Son numerosos los estudios que han evaluado la actividad enzimática ampliado el conocimiento sobre el efecto de plaguicidas, herbicidas, tipo de cultivos y fertilización, entre otros, sobre la calidad de los suelos (Bending et al., 2002). Todo ello demuestra el interés sobre la actividad enzimática desde un punto de vista agronómico y ecológico. Resella y colaboradores (2004) determinaron en suelos contaminados por cadmio se registraron incrementos significativos en el contenido metabólico, lo que indica: condiciones de estrés de la microflora, descensos en la biomasa microbiana y en las actividades enzimáticas (fosfatasa alcalina, aril sulfatasa y proteasa). Así mismo, durante su estudio observaron cambios en las actividades de fosfatasa ácida, β-glucosidasa, ureasa, los recuentos totales de bacterias y la estructura de la comunidad bacteriana (utilizando técnicas PCR-DGGE). Lo anterior indica efectos nocivos sobre las funciones de la comunidad microbiana. Es posible que se produzcan adaptaciones fisiológicas a la presencia de metales pesados más que selección bacteriana. Estas adaptaciones conllevan una demanda de energía adicional que podría explicar la reducción en las actividades enzimáticas y el aumento en el contenido metabólico. El estudio de las enzimas del suelo particularmente oxidorreductasas e hidrolasas, ha experimentado un claro auge en los últimos años, debido fundamentalmente al papel que 7

desempeñan estas enzimas en la degradación de la MO y en el ciclaje de nutrientes como el nitrógeno (ureasa y proteasas), fósforo (fosfatasas) y carbono (β-glucosidasas) (Knight y Dick, 2004). La ureasa está involucrada en la hidrólisis de substratos tipo urea a NH3 y CO2 y participa activamente en la liberación de N inorgánico. Esta enzima es muy sensible frente a cambios en el contenido de N2 en suelo con relación a otro tipo de enzimas implicadas en el ciclaje de N (Klose y Tabatabai, 1999). Su actividad se determina midiendo el amoniaco formado en muestras incubadas por cortos periodos con el substrato. La tasa de hidrólisis, es decir su actividad, varia de acuerdo al tipo de vegetación, presencia de raíces de plantas, y disminuye con la profundidad (Bandick y Dick, 1999). De otra parte, las β-glicosidasas constituyen un grupo de enzimas involucradas en el ciclaje de C del suelo, la cual es indispensable en la degradación enzimática de materiales celulósicos (Busto y Perez, 2000). La β-glicosidasa anteriormente llamada celobiosa, es la enzima predominante de las glicosidasas presentes en el suelo, la cual participa en el último paso de la degradación de celulosa, la cual es el componente principal de los polisacáridos de las plantas. Esta enzima completa el proceso de hidrólisis catalizando el rompimiento de celobiosa para liberar 2 moles de glucosa por mol de celobiosa y, por lo tanto, regula el suministro de una importante fuente de energía para los microorganismos, incapaces de tomar directamente este azúcar (Turner et al., 2002).

3.3

Diversidad de microorganismos edáficos

Hoy en día los estudios de diversidad en el área de ecología microbiana representan una buena aproximación a la evaluación de la estabilidad y riqueza de un ecosistema, permitiendo una mejor comprensión de los mecanismos que dan origen a las funciones y 8

servicios ecosistémicos que prestan los microorganismos (Hunters, 1996). Colombia por sus características geográficas y ambientales goza de una gran diversidad biológica; sin embargo la constante presión selectiva ejercida por el hombre puede generar la pérdida de la misma, comprometiendo seriamente la conservación de los recursos biológicos, debido principalmente a la fragmentación y transformación de los ecosistemas originales, que conlleva la expansión de actividades forestales y agropecuarias (CIEBREG, 2006a). La diversidad edáfica proporciona una serie de beneficios ecológicos que contribuyen a favorecer el ciclaje de nutrientes y el flujo de energía, controlar el microclima y los procesos erosivos, y regular la síntesis y descomposición de compuestos orgánicos, entre otros (Ovreas y Torsvik, 1998). En los agroecosistemas, prácticas como el laboreo, el monocultivo, el uso de pesticidas y fertilizantes pueden llegar a reducir significativamente la diversidad biológica y alterar las características fisicoquímicas y enzimáticas (Girvan et al., 2005). Para proveer una comprensión de las relaciones complejas entre la diversidad microbiana y la funcionalidad del suelo, se deben considerar aspectos como: la complejidad biológica del suelo, los problemas para evaluar y estimar la diversidad microbiana correlacionándola con las funciones del suelo y el significado e interpretación de estas medidas. Estos estudios permitirán generar ideas y estrategias que permitirán crear un enlace entre la diversidad microbiana y las funciones del suelo (Nannipieri et al., 2003). La diversidad se expresa con valores numéricos y sin unidades, calculadas a partir de ecuaciones que integran características cuantitativas del sistema en estudio, dichas ecuaciones se conocen como índices ecológicos (Margalef, 1993). Los dos componentes principales de la diversidad de especies son su riqueza y la uniformidad o equitatibilidad. La riqueza de especies puede expresarse mediante relaciones entre el número total de 9

especies y el número total de organismos y es una medida del número de especies en una comunidad, pero no de cuántos individuos existen de una especie concreta (Gorelick, 2006). Por su parte, la equitatividad es una medida de la proporción de individuos dentro de cada especie e indica si existen poblaciones dominantes. La selección de los índices con un tamaño muestral significativo debe darse por parámetros establecidos que se ajusten a los objetivos de estudio y deben ser poco sensibles a pequeños cambios en los datos (Hawksworth, 1995). La estimación de la diversidad microbiana edáfica puede comprender la determinación de las abundancias totales, mediante técnicas como el conteo directo por epifluorescencia con DAPI, la determinación de las abundancias parciales de grupos funcionales, por medio de técnicas como el recuento en placa, así como la determinación de la riqueza de unidades taxonómicamente operativas (OTUs, por sus siglas en ingles), determinadas por medio de técnicas como: PCR-DGGE, que permiten obtener perfiles de comunidades microbianas (Christensen, et al., 1999; Randjard et al., 2000). Con los datos generados por las determinaciones anteriores, se pueden calcular índices de diversidad alfa como los de Shanon-Wiener y Margalef (Hill et al., 2003). Los índices pueden ser utilizados para realizar comparaciones a escala espacial por medio de las similitudes y diferencias de la riqueza de OTUs para cada unidad espacial y se pueden emplear índices de diversidad beta y gamma, calculados a partir de los valores de diversidad alfa (Magurran, 1983).

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3.4

Efecto de antecedentes de manejo, actividades agrícolas, tipo y características fisicoquímicas del suelo sobre la diversidad bacteriana

Son muchos los trabajos que se han realizado a nivel mundial destinados a evaluar el efecto de diferentes prácticas de manejo de la tierra, regimenes de cultivo y uso de distintas clases de pesticidas sobre las características fisicoquímicas, microbiológicas, enzimáticas y de vegetación en diferentes tipos de suelos. Sin embargo, se sabe poco sobre la diversidad microbiana presente en pasturas convencionales, y de las relaciones existentes entre las pasturas convencionales y SSP (recientes y antiguos). Algunos estudios indican que una significante porción de la biodiversidad original puede mantenerse dentro de este tipo de sistemas, si son diseñados y manejados apropiadamente (Nicol et al., 2004). Una de las estrategias para mantener y conservar la diversidad dentro de estos sistemas consiste en la promoción de SSP, los cuales además de producir forraje y frutas, proveer sombra para el ganado y promueven la conservación de suelos y el ciclaje de nutrientes (Nogueira et al., 2006). Los pastizales se caracterizan por tener un gran deposito de MO, cuyo contenido suple las necesidades de nutrientes para plantas y microorganismos, incrementan la agregación del suelo, limitan la erosión del suelo y promueven una mayor capacidad de intercambio catiónico y de retención de agua (Giraldo, 1994). Así, el mantenimiento de la MO y la calidad del suelo son factores claves en la sostenibilidad de este tipo de ecosistemas (Carney y Matson, 2005). Debido a que los microorganismos son los principales responsables de la transformación de la MO y el ciclaje de nutrientes, el efecto de las prácticas de manejo de los pastizales es mediado en gran parte por la biomasa microbiana. Por lo tanto, los microorganismos y su actividad pueden proveer un temprano

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indicio acerca del estado del suelo y el efecto de diferentes practica de manejo (McCaig et al., 2001) Ovreas y Torsvik (1998), evaluaron la estructura y diversidad de la comunidad microbiana en dos diferentes suelos agrícolas a través de 5 métodos que proveen información a diferentes niveles de resolución: PCR-DGGE, análisis de restricción del rDNA amplificado (ARDRA), Blotting y análisis de hibridización usando sondas especificas de grupo, recuento de células viables y BIOLOG. El estudio mostró que la comunidad bacteriana en suelos orgánicos es mucho más diversa que en suelos arenosos. Una explicación para esta diferencia puede atribuirse al amplio rango de substratos orgánicos encontrados en suelos orgánicos. Las perturbaciones junto con las rotaciones de cultivo, probablemente generaron sucesiones causando la inestabilidad en poblaciones bacterianas. Las comunidades poco estables se caracterizan por la dominancia de unos pocos organismos y consecuentemente tienen una baja diversidad (Jonhson et al., 2003). La combinación de ARDRA con el uso de sondas mostró que la dominancia de patrones entre los grupos filogenéticos de organismos difirió entre los dos suelos. Adicionalmente, los análisis de BIOLOG indicaron una mayor diversidad funcional en el suelo orgánico que en el arenoso, así como una mayor uniformidad en la distribución de los aislados entre los biotipos en el suelo orgánico. Ovreas y colaboradores (1998), realizaron un estudio evaluando los cambios de las comunidades en suelos agrícolas perturbados, por medio de aproximaciones fisiológicas y moleculares. El estudio mostró cambios en la actividad microbiana y en la estructura de la comunidad de suelos perturbados, indicando una disminución significativa en la diversidad bacteriana en relación con el control. Esto fue evidenciado con en el alteraciones en la

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actividad de los oxidadores de metano y de metanol, así como en los diferentes perfiles obtenidos en el DGGE en los suelos evaluados. Las actividades agrícolas como el labrado, intercultivo, rotación, drenaje, uso de plaguicidas y fertilizantes y pastoreo tienen un efecto significativo, que en la mayoría de casos puede ser nocivo sobre los microorganismos edáficos (Sun et al., 2004). Las especies capaces de adaptarse a las prácticas agrícolas podrían tener una ventaja y establecerse como una nueva comunidad microbiana. En suelos ricos en materia orgánica, el número de substratos químicos diferentes podría ser alto. Las bacterias no se especializan en un solo substrato, pero su diversidad se relaciona con una mayor capacidad para emplear combinaciones de substratos bajo diferentes condiciones fisicoquímicas (Bolton et al., 1985; Girvan et al., 2005). Boddington y Dodd (2000), evaluaron el efecto de prácticas agrícolas sobre el desarrollo de hongos micorrícicos arbusculares nativos: específicamente sobre la densidad de esporas, riqueza de especies y tamaño extrarradical del micelio de hongos micorrícicos arbusculares. Los parámetros evaluados fueron reducidos en suelos disturbados en comparación con suelos no disturbados, concluyendo que las comunidades microbianas están directamente influenciadas por las prácticas de manejo. Degens y colaboradores (2000), realizaron un estudio para determinar los principales factores que influyen en la diversidad microbiana de suelos para predecir los efectos de uso reciente y manejo de suelos agrícolas sobre la diversidad edáfica. El objetivo principal fue determinar el efecto del manejo de la tierra sobre la diversidad catabólica y si estos están relacionados con el contenido de Carbono (C) orgánico en el suelo. Se determinó que el uso agrícola del suelo agota el contenido de C orgánico, causando una declinación en la diversidad catabólica de las comunidades microbianas presentes.

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McCaig et al (2001), evaluaron y compararon la diversidad microbiana de 3 tipos de vegetación y regímenes de manejos, en suelos de pasturas mejoradas, semi-mejoradas y no mejoradas por medio de PCR-DGGE. No observaron diferencias significativas entre los índices de diversidad de este tipo de suelos por medio de los perfiles de DGGE, aunque se observó una considerable variación espacial entre las replicas de las muestras. Sin embargo, las pasturas semi-mejoradas fueron menos diversas que las otras muestras de pastizales y tuvieron una más baja variabilidad entre grupos. Mogollon y Tremon (2004), en su estudio observaron variaciones significativas en la actividad ureásica del suelo, enzima que reside en su fracción orgánica, y por lo tanto se encuentra directamente relacionada con cambios en los niveles de MO. La alta correlación que existe entre la actividad ureásica y el contenido de carbono orgánico se basa fundamentalmente en que esta enzima se encuentra inmovilizada en la MO, es decir, adsorbida a las fracciones húmicas formando complejos orgánicos. Al producirse cambios en las prácticas de manejo de la tierra se genera un impacto ambiental sobre el suelo, específicamente sobre los niveles de MO, ocasionando un efecto negativo sobre la actividad biológica del suelo, y por ende sobre su fertilidad (Degens, 1998). En Colombia, se han venido desarrollando proyectos que tienen como prioridad la evaluación y valorización de alternativas silvopastoriles, que enfocan tres campos principales de servicios ambientales generados por estos: restauración de suelos degradados y conservación del agua, secuestro de carbono y conservación de la biodiversidad. Algunos estudios se han centrado en evaluar el impacto de sistemas de ganadería sobre las características físicas, químicas y biológicas de suelos en los Andes de Colombia (Sadeghian et al., 1999); se ha estudiado también el efecto del pisoteo de los animales en los sistemas ganaderos lo cual genera compactación de los suelos y modificándose la 14

relación suelo -aire- agua, y por lo tanto la diversidad biológica sufrió reducciones notorias (Murgueitio y Calle, 1999). Así mismo, se ha evaluado la actividad microbiana y se ha comparado frente a otro tipo de coberturas como guaduales y bosques, expresado como la cantidad del dióxido carbónico liberado por los microorganismos edáficos. Los resultados muestran que la actividad fue superior en guaduales y bosques, seguidos por cafetales tradicionales, conformando un grupo común con la ganadería extensiva, ceba intensiva y lechería intensiva sin existir diferencias entre ellas. La actividad promedia de este grupo fue 40% inferior al de los guaduales. Las correlaciones negativas y altamente significativas de esta variable con la densidad aparente y la resistencia a la penetración a los 20 cm del suelo mostraron claramente que la actividad de los microorganismos se ve drásticamente reducida por la compactación (Camero et al., 2000). Otros estudios han evaluado la diversidad de organismos (meso y macrofauna), la cual varió en forma notoria, de un ambiente u otro. Los guaduales y cafetales tradicionales presentaron una mayor diversidad de organismos (6.8 y 6.6 tipos de organismos diferentes, respectivamente), frente a los demás agroecosistemas. Los menores valores se observaron para ganadería intensiva de ceba (3.43 tipos), ganadería extensiva (2.091 tipos) y ganadería intensiva de leche (2.09 tipos). Estos resultados revelan de qué manera un ambiente propicio y con mayor diversidad florística puede favorecer el desarrollo de una más alta heterogeneidad de especies (Sadeghian et al., 2000). Sin embargo, es importante aclarar que actualmente no se cuenta con estudios en Colombia que hayan evaluado el efecto de este tipo de sistemas sobre la diversidad bacteriana edáfica no cultivable.

3.4.1

Pastizales convencionales y sistemas silvopastoriles

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Los pastizales son terrenos con una masa vegetal herbácea apropiada para el alimento del ganado, caracterizados por poseer suelos fértiles, que albergan una gran biodiversidad y que contribuyen al balance de gases en la atmósfera (Weibull y Ostman, 2003). De otra parte, los SSP, son asociaciones de pastos, árboles maderables o frutales con animales, con o sin la presencia de otro tipo de cultivos. Su práctica se realiza a diferentes niveles, desde las grandes plantaciones arbóreas-comerciales con inclusiones de ganado como complemento a la agricultura de subsistencia (Young, 1997). Algunas interacciones entre los componentes del SSP son capaces de modificar las características del mismo: la presencia del componente animal cambia y puede acelerar algunos aspectos del ciclaje de nutrientes; si la carga animal es alta, la compactación de los suelos puede afectar el crecimiento de árboles y otras plantas asociadas; las preferencias alimenticias de los animales pueden afectar la composición del bosque, los árboles proporcionan un microclima favorable para los animales (sombra) y los animales pueden participar en la diseminación de las semillas, lo cual favorece la germinación (Musalen, 2003). Las condiciones geomorfológicas y climáticas en la Ecorregión Cafetera, así como los sistemas de uso y manejo han tenido una marcada influencia sobre las características físicas, químicas y biológicas de los suelos. Esta región, es uno de los lugares donde muchas prácticas inadecuadas de manejo y cambios en el uso de la tierra, sumados al efecto de los factores ambientales han modificado el paisaje original en los últimos años (CIEBREG, 2006a). Por este motivo, la transformación de tierras de pastoreo en cultivos o en plantaciones de árboles exóticos es la causa principal de la disminución de la superficie del pastizal. De igual forma el sobrepastoreo, la quema, la invasión de plantas foráneas y el

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inadecuado uso de plaguicidas y fertilizantes han afectado estos sistemas (Botero et al., 1999). Por otro lado, el gran reto de la ganadería moderna consiste en incrementar la producción de carne y leche en forma acelerada y sostenible, de tal manera que permita suplir la demanda de la población y que, además, garantice la conservación de los recursos naturales y del medio ambiente. Se ha postulado que los SSP responden en parte a los problemas de deforestación y degradación de los ecosistemas y a la sostenibilidad de la ganadería. Los árboles fijadores de nitrógeno (leguminosas) aparecen como una alternativa para evitar la reducción de N del suelo e intensificar en forma sostenible la producción de proteína de origen animal (Connant et al., 2001). Sin embargo, a pesar de la importancia de los pastizales convencionales como depósitos de C, el uso de prácticas tradicionales como quemas, labranza convencional, incrementan la actividad microbiana y los procesos oxidativos actividades consideradas como fuentes significativas de pérdida de C del suelo. De igual forma esto conduce a la pérdida de fertilidad, incrementando la emisión de gases de efecto invernadero, alteración de características fisicoquímicas y consecuente pérdida de diversidad (Griffiths et al., 2003).

3.5

Métodos para la evaluación de la diversidad microbiana edáfica

La selección de los métodos para valorar la diversidad depende de factores tales como el tipo de ambiente a evaluar, sus características, los requerimientos propios de cada microorganismo y los objetivos de la investigación. De acuerdo a esto, se pueden seleccionar una o más técnicas para el estudio de la comunidad bacteriana, las cuales se 17

dividen en métodos dependientes y no dependientes de cultivo (Janssen et al., 2002). Cuando se emplea una combinación de estas dos metodologías se pueden reducir los sesgos y limitaciones que tienen cada una por separado, proporcionando una mejor comprensión de la estructura de las comunidades microbianas y por ende de la biodiversidad de un ambiente en particular (Lipthay et al., 2004).

3.5.1

Métodos no dependientes de cultivo

Durante el último siglo el estudio y la identificación de los microorganismos se basó en técnicas de aislamiento y cultivo. Estos habían sido caracterizados tradicionalmente por su fenotipo, es decir, por el conjunto de propiedades celulares observables, como su morfología, propiedades fisiológicas o metabólicas y estructura de sus componentes celulares (Maier et al., 2000). Sin embargo, la necesidad de cultivarlos para poder identificarlos limitó la comprensión y estimación de la diversidad microbiana real (LaurentMartin et al., 2001) Sin embargo, más del 90% de los microorganismos en los ambientes naturales no pueden ser cultivados empleando las técnicas tradicionales (McCaig et al., 2001). Adicionalmente, no siempre es posible obtener cultivos puros de ciertos grupos de microorganismos porque dependen de las actividades de otros microorganismos o porque no se conocen las condiciones adecuadas para su crecimiento (Ranjard et al., 2000). Los métodos independientes de cultivo basados en la subunidad ribosomal rRNA han sido utilizados en diferentes estudios de ecología microbiana, y han proporcionado información genética y fisiológica a partir de colonias puras o a partir de la extracción directa de la matriz ambiental (Zhou et al., 1996).

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3.5.2

Recuentos directos por epifluorescencia

La cuantificación del número total de bacterias se considera como una de las mediciones más importantes para comprender la dinámica de las comunidades bacterianas edáficas. La microscopia de epifluorescencia acoplada al uso de colorantes como el naranja de acridina, 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), y/o el isotiocinato de fluoresceína (FITC) han sido ampliamente utilizados para el recuento directo de bacterias en numerosos ambientes (Maier et al., 2001). Estos colorantes reciben el nombre de fluorocromos, sustancias que tienen la propiedad de emitir un fotón a una longitud de onda determinada cuando son excitados por un fotón incidente de una longitud de onda característica (Amman et al., 1995). Esta técnica poseen la ventaja de permitir el recuento total de microbiano, teniendo en cuenta organismos tanto viables/ cultivables, no viables, y los viables no cultivables, lo cual genera una ventaja frente la técnica tradicional de recuento en placa (Yu et al., 1995.).

3.5.3

Técnicas moleculares para estudios de diversidad

El estudio de diversidad bacteriana por medio de técnicas moleculares basadas en el rDNA, ha permitido realizar investigaciones más completas y detalladas de la diversidad y riqueza de especies en diferentes tipos de ecosistemas, proporcionando información sobre la composición y estructura de las comunidades bacterianas. Por este motivo, estas técnicas, pueden ser adecuadas para evaluar el impacto de los factores ambientales sobre la

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diversidad, así como para el diseño de marcadores con fines de diagnostico, e identificación de bacterias cultivables y no cultivables (Fromin et al., 2002).

3.5.3.1 Electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante (DGGE)

Recientemente las técnicas de huella genética han sido usadas para estudiar comunidades microbianas complejas, estimar la diversidad y obtener una representación relativa

de OTUs presentes en las comunidades microbianas de un ecosistema en

particular. Dentro de las técnicas de huella genética de uso más frecuente, esta la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante DGGE (por sus siglas en inglés denaturing gel gradient electrophoresis), la cual presenta ventajas como: alta resolución filogenética y sensibilidad, bajos costos, rapidez y alto número de muestras que pueden ser procesadas por día en relación a otro tipo de técnicas moleculares (Gelsomino et al., 1999., Muyzer & Smalla, 1998). El DGGE es una técnica en la cual los fragmentos de DNA amplificados por PCR se someten a una electroforesis en gel de poliacrilamida bajo condiciones de desnaturalización progresiva (urea y formamida). El poder de separación de este tipo de electroforesis se basa en que el comportamiento de desnaturalización del DNA está determinado de manera importante por la secuencia de nucleótidos. Al correr el DNA en el gel, la molécula se mantiene como doble cadena hasta que alcanza la concentración o temperatura desnaturalizante, reduciendo su movilidad en el gel (Muyzer, 1999). Los productos de PCR generan una única banda en el gel de agarosa, pero realmente constan de secuencias diferentes de genes rRNA 16S. Estas diferencias pueden ser evidenciadas por medio del DGGE. En teoría, cualquier gen de rRNA que se encuentre en 20

el DNA total de la comunidad puede ser amplificado por PCR y resuelto en un gel DGGE, ya que en este tipo de análisis cada banda en el gel es considerada representativa de la comunidad y la intensidad de las bandas es tomada como un reflejo de la abundancia de esa secuencia en la comunidad (Shafer & Muyzer, 2001). En particular, es posible que diferentes especies generen una misma banda por lo que los estimados de diversidad sean subestimaciones, por lo que lo ideal es hacer estimaciones de diversidad relativa entre comunidades y considerar “filotipos” u OTUs en lugar de especies. Se pueden estudiar moléculas de DNA de hasta 700pb de longitud con la característica de llevar acoplada una cola artificial muy rica en GC (añadida a uno de los primers en posición 5’), con el objeto de evitar la completa desnaturalización del DNA (Muyzer et al., 1993).

21

4

HIPÓTESIS

Hipótesis 1. El tiempo de establecimiento de los SSP tiene un efecto significativo sobre la diversidad bacteriana edáfica. Hipótesis 2: El establecimiento de SSP tiene un efecto significativo sobre la diversidad bacteriana edáfica. Hipótesis 3: Los antecedentes de prácticas de manejo de suelos y algunas variables fisicoquímicas y enzimáticas pueden ser correlacionadas con la diversidad bacteriana.

22

5

5.1

METODOLOGÍA

Área de estudio

El estudio se desarrollara en la Ecorregión Cafetera específicamente en la cuenca hidrográfica del río la Vieja y en el departamento del Valle. En este ultimo se tendrán en consideración SSP con más de 10 años de antigüedad.

5.2

Diseño experimental

La estandarización de las técnicas para extracción de DNA, determinaciones enzimáticas del suelo y PCR-DGGE se realizarán empleando suelos provenientes de la Ecorregión Cafetera. Para el estudio se realizará un evento de muestreo durante el año 2007; se seleccionarán 2 SSP y 2 pastizales convencionales así como 2 bosques poco intervenidos que servirán como control para un total de 6 sitios para la Ecorregión Cafetera y 6 sitios para el departamento del Valle. Se tomarán 3 muestras compuestas por cada sistema y bosque, para un total de 36 muestras. La caracterización inicial incluirá un análisis fisicoquímico y granulométrico de los suelos en un laboratorio analítico de referencia (textura, contenido de materia orgánica, carbono total, nitratos, amonio, fósforo disponible y pH). Todos los análisis a nivel microbiológico, molecular y de actividad enzimática serán realizados por duplicado (n=2). Para la descripción de la diversidad microbiana en los pastizales y SSP

se

determinarán las abundancias totales mediante conteo directo por epifluorescencia y la 23

riqueza de OTUs, mediante los perfiles obtenidos en el DGGE. Con los datos generados por éstas determinaciones, se calcularán los índices de diversidad alfa (α) (cálculo de índices de Shanon-Wiener) para cada sistema y control. Asimismo, para las comparaciones espaciales se analizarán las similitudes y diferencias de la riqueza de OTUs y se determinaran los índices de diversidad beta (β) y gamma (δ) a partir de los valores de diversidad alfa.

5.3

Descripción y recolección del suelo:

Para la recolección de las muestras de suelo se seleccionaran 3 cuadrantes representativos (3 x 3 m), ubicados al menos a 30 m de los bordes, en cada uno de los sistemas y controles. Cada cuadrante será muestreado en cada uno de los vértices y puntos medios de las líneas del cuadrante para un total de 9 puntos a partir de los cuales se recolectara una muestra compuesta por cuadrante. Para extraer las muestras de suelos se emplearan barrenos aproximadamente a 15 cm de profundidad. Las muestras serán dispuestas en un plástico grueso donde se homogenizaran y mezclaran. Se tomaran ~500g de muestra para la realización de análisis fisicoquímicos (pH, nitratos, amonio, materia orgánica, porcentaje de humedad y peso seco), recuentos directos de microorganismos por epifluorescencia con DAPI, determinación de la actividad enzimática (betaglucosidasa y ureasa), y estudios moleculares (PCR-DGGE). Las muestras se depositaran en bolsas whrilpack® resellables estériles debidamente rotuladas (fecha, hora, sistema, No. de cuadrante) y se conservaran en nevera (4-6ºC) hasta su análisis.

24

5.4

Materiales y métodos

5.4.1

Recuento de bacterias por epifluorescencia con DAPI

El número total de células presentes en el suelo serán contadas por tinción con DAPI. La extracción de los microorganismos de suelos se realizará por agitación orbital a 200 rpm por 15 min empleando solución salina (0.85%) (La Torre, 2007). La tinción y esquema de conteo se realizara siguiendo el protocolo estandarizado en USBA (Vela, 2007).

5.4.2

Determinación enzimática:

Para la determinación de la actividad de la ureasa (660nm) y la Beta-glicosidasa (410nm) se seguirán los protocolos descritos por Kandeler & Gerber (1988) y Turner et al., (2002), respectivamente.

5.4.3

Extracción de DNA:

Se seguirá el procedimiento de extracción directa de DNA de la matriz de suelo desarrollado por Zhou et al., (1996). Para la purificación del DNA se empleara el protocolo descrito por Krsek y Wellington (1999) con adición de polivinil-polipirrolidona (PVPP) y purificación en columnas spin® y Sephadex®.

25

5.4.4

Amplificación del 16Sr(DNA)

Las muestras se procesaran por duplicado, y se utilizaran los iniciadores 341f GC (CCT ACG GGA GGC AGC AG) y 907r (CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT) específicos para bacterias, los cuales ya han sido empleados en estudios de diversidad microbiana en diferentes ecosistemas y en la USBA (Casamayor et al., 1999; Krsek, 1999; Cytryn, 2003). Durante el PCR se realizará una denaturación inicial de 7 min a 94°C, 35 ciclos con 1 min de denaturación a 94°C, 1 min de anillamiento a 54°C y 2 min de extensión a 72°C y un ciclo final de extensión a 72°C por 10 min (Krsek et al., 1999).

5.4.5

DGGE

El DGGE será llevado a cabo en un Dcode Universal Mutation Detection System (Bio-Rad). Cantidades iguales del producto de PCR (~600 ng) serán cargadas en el sistema. El gel de poliacrilamida se realizara a un 6% de acrilamida-bisacrilamida (37.5:1 al 40% ;p/v), Una vez establecido el gradiente este será corrido durante 16h a 100V y 60°C. Los geles serán teñidos con SYBR Gold y serán analizados en el programa Gel-Doc (Bio-Rad).

5.4.6

Índices de diversidad y análisis de cluster

Cada una de las muestras será analizada por duplicado para determinar las bandas que son encontradas en ambas replicas, aquellas bandas que solo sean detectadas en una sola de las replicas no serán tenidas en cuenta para el análisis. La homología entre patrones de muestras será calculada utilizando el índice de similitud de Jaccard: J:100(c/(a+b+c)),

26

haciendo uso del programa SPSS, en la formula a corresponde al numero de bandas de la muestra A, b el numero de bandas de la muestra B y c el numero de bandas que se encuentran en común entre las muestras A y B. Este índice permite establecer similaridades/disimilaridades con datos de presencia o ausencia de bandas. Igualmente se emplearan técnicas de clusters unweighted pair group method with arithmetic mean (UPGMA, por sus siglas en ingles) con el objeto de identificar las muestras que generan patrones similares.

5.4.7

Análisis estadístico

Inicialmente se verificara si los datos siguen o no una distribución normal. Aquellos datos que no sigan una distribución normal, serán normalizados utilizando el logaritmo base 10. Para determinar las diferencias significativas entre los sistemas y controles evaluados se realizara inicialmente un ANOVA. Para evaluar el efecto del establecimiento de SSP sobre las variables fisicoquímicas, microbiológicas y enzimáticas se realizara un análisis de componentes principales (PCA), empleando el programa estadístico SPSS, versión 12 (Girvan et al., 2005).

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6 2007/2008 Revisión bibliografía Estandarización de protocolos Muestreo Análisis fisicoquímicos Análisis moleculares Determinación enzimática Primer Informe Análisis de resultados Informe final

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Jul

Agos Sept

Oct Nov Dic Ener

Feb Marz Abr May

Jun Jul

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7

Rubros

Personal Uso de equipo propio Materiales y Reactivos Salidas de Campo Total

PRESUPUESTO

Banco de la Republica No financiable por banco de la republica No financiable por banco de la republica $ 17’000 $ 3,000 $ 20’000

Fuentes Contrapartida 1

Contrapartida 2

$ 4,329

$ 61’473 $4,300

$65’773

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8

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