EVALUACIÓN DEL EFECTO DEL OZONO Y DE LA RADIACIÓN ULTRAVIOLETA SOBRE LA ESTRUCTURA Y VIABILIDAD DE HUEVOS DE HELMINTOS Ma. Neftalí Rojas Valencia y Teresa Orta de Velásquez Instituto de Ingeniería, UNAM, Ciudad Universitaria. Apdo. Postal 70-472, Coyoacan 04510, México, D.F. Tel: 622-33-20 ext. 14, Fax 616-21-64

RESUMEN

Como parte de un estudio sobre diversos métodos de tratamiento y desinfección de las aguas residuales para reusarse en el riego, se evaluó experimentalmente el efecto del ozono (O 3) y de las radiaciones ultravioleta (UV) sobre la estructura y viabilidad de los huevos de helminto, bajo diferentes tiempos de contacto (5, 10, 15, 20, 25 y 30 min, con tres repeticiones cada uno) en medio líquido y exposición directa. Se utilizaron muestras sintéticas preparadas con una suspensión de huevos recientemente extraidos de una hembra grávida de Ascaris suum. Los huevos después de haber sido ozonados o en su caso expuestos a radiaciones UV fueron observados y posteriormente incubados, en obscuridad a 26 °C durante 21 días (al igual que el testigo que no fue expuesto ni al ozono ni a las radiaciones UV), para ver si se habia afectado la viabilidad de los huevos en los diferentes tiempos de contacto. Los resultados obtenidos bajo condiciones de ozonación y radiaciones UV en medio líquido y exposición directa muestran que dichos desinfectantes no ocasionan ningún efecto sobre la estructura y viabilidad de los huevos fértiles de A. suum ya que se observarón larvas móviles dentro del huevo y su eclosión, al igual que en el testigo.

INTRODUCCIÓN En nuestro país la reutilización segura de las aguas residuales en agricultura es una necesidad urgente ya que dichas aguas contienen agentes patógenos como virus, bacterias, protozoarios y huevos de helmintos que producen infecciones gastrointestinales, por lo que su reciclaje para riego agrícola presenta un riesgo potencial para la salud pública. Por ello se ha tenido que estudiar la posibilidad de aplicar sistemas de tratamiento eficientes y desinfectantes efectivos, que produzcan efluentes con calidad bacteriológica y helmintológica requerida para riego según la normatividad mexicana. Dentro de los agentes químicos que han sido empleados como desinfectantes de las aguas residuales se encuentra el cloro (hipocloritos y cloraminas), y otros compuestos como

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bromina, iodo, fenol, alcoholes, metales pesados, jabones, detergentes sintéticos, compuestos de amonio,y varios ácidos (como el clorhídrico, nitríco, acético y sulfúrico). Si bién el empleo de dichos desinfectantes han sido efectivos para eliminar bacterias y virus entre otros microorganismos, no lo son para los huevos de helmintos (parasitos intestinales, que ocupan los primeros lugares dentro de los problemas de salud pública en México), ya que los huevos sobreviven muy bien bajo las sustancias mencionadas y otras inhóspitas similares (Odda, 1987; Schmidt y Roberts, 1981; Schmidt y Roberts, 1984; Shephard, 1987 y Orta et al., 1990). Por lo que respecta al estudio de otros desinfectantes más potentes, como el ozono y las radiaciones ultravioletas, el primero se ha considerado desde hace muchos años como un desinfectante eficaz, agente bactericida y un oxidante químico poderoso tanto en reacciones orgánicas como innorgánicas (Tebbut, 1990; Orta et al., 1995). Por otra parte las radiaciones UV han mostrado tener efectos fotoquímicos sobre el material génetico de bacterias y virus, las investigaciones más recientes se han enfocado a estudiar la inactivación y tiempos de reactivación de bacterias, virus y quistes de protozoarios (Harris et al., 1987 y Mechsner et al., 1991). Hasta la fecha no se han encontrado datos en la literatura sobre acción que ejercen estos desinfectantes sobre los parásitos intestinales presentes en las aguas residuales. De aquí que en este estudio se evaluó experimentalmente el efecto del ozono y las radiaciones UV sobre la estructura y viabilidad de los huevos de helmintos.

MATERIALES Y MÉTODOS Dado que en México la ascariasis es la parasitosis de mayor incidencia, además de tener distribución cosmopolita y que las formas infectivas de Ascaris son sumamente resistentes a las condiciones ambientales adversas, se seleccionó a este helminto como modelo en nuestro estudio. Sin embargo, para disminuir el riesgo de infección durante su manipulación se decidió utilizar la variedad Ascaris suum, debido a que es específicamente infectante para cerdos y no para humanos, aún cuando es morfológicamente indistingible de la variedad lumbricoides de humanos (Schmidt y Roberts, 1984).

Obtención de la suspensión de huevos de Ascaris suum (A. suum) Se recolectarón hembras de A. suum del rastro de Zumpango, Estado de México. Las hembras fueron trasladadas al laboratorio en solución salina isotónica, en el laboratorio se sometierón a disección para extracción de los úteros grávidos, de los cuales se extrajerón los huevos por molienda y lavados con solución salina isotónica. Con esta suspensión se iniciaron pruebas para determinar el efecto del ozono y de las radiaciones ultravioleta sobre la estructura y viabilidad de los huevos de helmintos.

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Preparación de experimentos para evaluar el efecto del ozono sobre la estructura y viabilidad de los huevos de helmintos Se prepararon muestras testigo (por triplicado) en un recipiente de plástico de 2 litros, de la siguiente manera: se añadió 1 litro de solución salina isotónica más 0.1 ml de una suspensión de huevos (aproximadamente 500 huevos) se homogenizó con la ayuda de un agitador magnético y se dejó en agitación sin ozonar el mismo tiempo de contacto al que se sometieron las muestras tratadas con ozono (5, 10, 15, 20, 25 y 30 min). Paralelamente a las muestras testigo se realizaron pruebas de desinfección en medio líquido (por burbujeo) y exposición directa de ozono (a partir de aire enriquecido con oxígeno), variando tiempos de contacto en un generador de O3 para laboratorio "Trailigaz, LABO 76".

Pruebas de desinfección con ozono de huevos de A. suum en medio líquido Las muestras en medio líquido sometidas al generador de ozono (fig. 1), a diferentes tiempos de contacto, se prepararon así: en un recipiente de plástico de 2 litros, se le añadió 1 litro de solución salina isotónica más 0.1 ml de una suspensión de huevos (aproximadamente 500 huevos), se homogenizó con la ayuda de un agitador magnético e inmediatamente se paso a un sistema continuo de ozonación mediante burbujeo y se les aplicó un flujo constante de gas "O3" durante 5, 10, 15, 20, 25 y 30 minutos (con 3 repeticiones por cada tiempo). Para todos los casos, el flujo de ozono a la salida del generador se mantuvo constante en 0.61 l/min. aplicando una concentración promedio de 31.3 mg O3/l en fase gas.

Figura 1. Sistema continuo de ozonación en laboratorio. Después de haber sido sometidas las muestras a diferentes tiempos de contacto con azono, así como el testigo sin ozonar, se aplicarón dos métodos para concentrar los huevos y para poder observarlos en el microscopio y ver si el ozono causaba algún efecto sobre la estructura de los huevos de A. suum. Método para concentrar los huevos de helmintos Las muestras con huevos de Ascaris suum después de haber sido ozonadas se pasaron solamente por un filtro de membrana de 47 mm de diámetro y poros de 8.0 mm, aplicando vacío máximo de 40 cm Hg; al termino se lavaron las paredes del recipiente que se metió al ozonador y el embudo de filtración con solución salina isotónica y se pasaron estos lavados por el mismo filtro.

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Se colocó la membrana sobre la pared interna de un vaso de precipitados y se raspo perfectamente con una espátula; se lavo la membrana y la espátula con solución salina, recibiendo todos los lavados en el mismo vaso e inmediatamente se colocó una gota del concentrado en cada uno de cinco portaobjetos y se observaron los huevos en un microscopio óptico para ver si se presentaba alguna alteración en la estructura de los mismos. Pruebas de desinfección con ozono de huevos de A. suum en exposición directa Se sometieron los huevos de A. suum a exposición directa (en un sistema similar a la figura 1 con la modalidad que en este caso no se utilizo medio líquido) de la siguiente manera: una gota (aproximadamente 500 huevos) de la suspensión de huevos recientemente extraídos fue colocada en un porta objetos, la gota se distribuyó homogeneamente y se metió hasta el fondo de un matraz de quitazato y se ozono aplicando una dosis constante de 60 mg O3/l en fase gas, con un difusor de O3 muy cercano al portaobjetos, durante 5, 10, 15, 20, 25 y 30 minutos (con 3 repeticiones por cada tiempo). La muestra testigo se preparó igual que la tratada, sólo que se dejó al aire libre por un lapso de tiempo igual al que se metieron al ozonador las muetras tratadas. Después de observar si el ozono provocaba algún efecto o no, a la estructura de los huevos de A. suum tanto en medio líquido como exposición directa, los huevos fueron incubados por 21 días (al igual que el testigo que no fue expuesto al ozono) en ácido sulfúrico 0.1 N, para ver si se habia afectado la viabilidad de los huevos, según lo recomendado por la técnica de incubación in vitro de la US EPA, (1992). Preparación de experimentos para evaluar el efecto de las radiaciones UV sobre la estructura y viabilidad de los huevos de A. suum Para evaluar el efecto de las radiaciones UV se siguieron igual que para el ozono dos pruebas: Pruebas de desinfección con radiaciones UV de huevos de A. suum en medio líquido La primera prueba consistió en mezclar (por duplicado) aproximadamente 3,000 huevos (0.5 ml de una suspensión de huevos recientemente extraidos de una hembra grávida de A. suum) en 20 litros de agua de la llave. Una de las suspensiones se dejo bajo agitación magnética y en luz natural, esta correspondio a la muestra testigo. La segunda suspensión se metio a desinfectar (en un generador de luz ultravioleta "URMINUS") bajo radiación UV a una longitud de onda de 254 nm, entre lámparas de arco de mercurio-argón y tubos reflectores de metal pulido durante 10 minutos, este mismo procedimiento se siguió, para los tiempos de exposición de 15, 20 y 30 minutos. Al emplear solamente agua de la llave y la suspensión de huevos de helmintos, se aseguró que no hubiera turbidez y que los huevos estuvieran expuestos libremente a la radiación.

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Las muestras con huevos de A. suum después de haber sido sometidas a radiaciones ultravioleta se les aplicó el mismo método para concentrar los huevos de helmintos, empleado en los análisis de ozono.

Pruebas de desinfección de huevos de A. suum por radiaciones UV en exposición directa Se sometieron los huevos de helmintos a la acción desinfectante de los rayos UV a exposición directa de la siguiente manera: una gota (aproximadamente 500 huevos) de la suspensión de huevos recientemente extraídos fue colocada en un porta objetos, la gota se distribuyó homogeneamente y se metió al equipo de radiación ultravioleta a una longitud de onda de 254 nm sin ningún medio líquido, durante 10, 15, 20, 25 y 30 minutos (con 3 repeticiones para cada tiempo). Los huevos después de haber sido expuestos a radiaciones UV, tanto en medio líquido como exposición directa fueron observados y posteriormente incubados en obcuridad a 26 °C durante 21 días (al igual que el testigo que no fue expuesto a las radiaciones UV), para ver si se habia afectado la viabilidad de los huevos en los diferentes tiempos de contacto. Los criterios para determinar si un huevo permanecia viable o no después de ser ozonado o en su caso expuestos a las radiaciones UV fue la movilidad de las larvas dentro del huevo y la eclosión de las mismas después de incubarlas in vitro.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los resultados obtenidos en este trabajo fueron los siguientes: Los resultados obtenidos al pasar inmediatamente las muestras ozonadas (en los diferentes tiempos de contacto por un filtro de membrana de 47 mm de diámetro y poros de 8.0 mm), e inmediatamente observadas, mostraron que algunos huevos de A. suum, presentaban vacuolación en el citoplasma, destrucción de una porción de la parte externa de la cubierta protéica, perdida de la cubierta externa y desintegración del huevo por completo (fig. 2), por lo que se pensó inicialmente, que el ozono si provocaba efectos sobre los huevos de helmintos. Debido a que también se observaron una buena cantidad de huevos íntegros (fig. 3) después de todos los tratamiento con ozono, se procedio a verificar el efecto sobre su viabilidad (ya que los huevos viables son los que determinan la capacidad de un huevo de desarrollarse asta etapa infectiva), para ello se incubaron (según la US EPA, 1992) y se observaron cada ocho días durante un mes y medio, hasta comprobar si se llegaban a formarse larvas después de aplicarles el desinfectante.

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Figura 2. Huevo de Ascaris suum no viable, en donde se observa la perdida de la cubierta externa y la desintegración completa al ponerlo en contacto con el ozono por 30 minutos. Figura 3. Huevo de Ascaris suum sin ningún daño aparente después de ver estado expuesto al ozono por 30 minutos. Por lo que respecta a los resultados de las radiaciones UV se observo que apesar que la longitud de onda de 253 nm es considerada muy fuerte para la inactivación microbiana no muestra daños aparentes sobre los huevos de A. suum, podría ser que hubiera algún daño fotoquímico del ADN Y ARN como en otros casos, sólo que no se tuvo la infraestructura para evaluar si se presentaba este efecto, por lo que lo más conveniente fue evaluar el efecto sobre la viabilidad de los huevos. Después de una observación exhaustiva (mes y medio), se pudo constatar que las alteraciones provocadas por el ozono sobre los huevos de A. suum (como la pérdida de la cubierta externa, vacuolación en el citoplasma y destrucción de una porción de la parte externa de la cubierta protéica) sólo se presentaban en los huevos no viables ya que los huevos viables se mantenian íntegros y llegaron a formar larvas (fig.4) aunque en un período mayor a los 21 días, por lo que se podría decir que la embrionación se retardo por el empleo de los desinfectantes, más no destruyo a los huevos viables ya que al final de la embrionación las larvas eclosionaron (fig. 5) aún después de haber sido expuestos al ozono y las radiaciones ultravioleta por 30 minutos tanto en medio líquido como exposición directa. Figura 4. Huevo de Ascaris suum en fase larval móvil (ozonado por 30 minutos) observado después de un més y medio de incubación. Figura 5. Eclosión de un huevo de Ascaris suum (expuesto a radiaciones ultravioleta por 30 minutos) observado después de un més y medio de incubación. Según Rogers (1958) y Clark (1981) cuando un huevo se desarrolla hasta su fase larval y la larva eclosiona aún después de que se le agrege cualquier desinfectante químico quiere decir que esta viable y en este caso se demuestra que el ozono y las radiaciones UV no les causa efecto alguno a los huevos viables. La resistencia extraordinaria a los desinfectantes químicos, desecación y penetración de sustancias polares es el resultado de la capa de lípidos de la cubierta de los huevecillos de helmintos. Al menos en Ascaris, esta capa esta compuesta del 25 % de proteínas y 75 % de ascarósidos. Los ascarósidos son glucósidos muy interesantes y únicos (compuestos con azúcar y alcohol unidos por un puente glucosídico). En los ascarósidos, el azúcar es ascarilosa (3, 6-didesoxy- L - arabinohexosa), y los alcoholes son una serie de manoles y dioles secundarios que contienen de 22 a 37 átomos de carbono. Los ascarósidos hacen que la cubierta del huevecillo sea virtualmente impermeable a todas las sustancias que no sean solventes de lípidos (Hinck, 1972;Schmidt y Roberts, 1981; Schmidt y Roberts, 1984).

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Es de suma importancia recalcar que la concentración de ozono de 31.3 mg/l y la de 60 mg/l en fase gaseosa empleadas en este trabajo, serían rápidamente fatales para conejillos de india y para el humano, por lo que es necesario continuar con este tipo de investigaciones sobre estos indestructibles parasitos intestinales hasta que se logre encontrar, la manera de destruirlos y así disminuir los riesgos de infección.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES Los resultados muestran que el ozono y las radiaciones ultravioleta no ocasionan ningún efecto sobre la estructura y viabilidad de los huevos fértiles de helmintos aún exponiendolos durante 30 minutos a los desinfectantes, ya que se observarón larvas móviles dentro del huevo y su eclosión, al igual que en el testigo. Aunque los huevecillos viables son extremadamente resistentes a la desinfección por ozono y a las radiaciones ultravioleta, la embrionación se retarda por dichos factores. Los resultados obtenidos son la respuesta de huevos de Ascaris suum (parasito intestinal de cerdo), debido a que las respuestas son diferentes según el tipo de microorganismo, no es conveniente generalizar los resultados observados, para todas las especies de helmintos, ya que posiblemente en otras especies si se presente algún efecto sobre los huevos por el empleo de dichos desinfectantes, es algo que faltaría probar. Es importante determinar la viabilidad de los huevos de helmintos después de aplicar cualquier tipo de desinfectante ya que esta característica es la que demuestra que un huevo tiene vida o no y por lo tanto si el desinfectante es efectivo o no.

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