XV III C ongreso Nacional de Ingeniería B ioquímica X V III N ational C ongress of B iochemical Engineering V II C ongreso Internacional de Ingeniería B ioquímica V II Inte rnational C ongress of B iochemical E ngineering X Jornadas C ientíficas de B iomedicina y B iotecnología Molecular X B iomedicine and Molecular Biotechnology Meeting

Clave: FER36PAT20111215 EVALUACION Y CINETICA DE CRECIMIENTO DE LACTOBACILLI UTILIZANDO FRUCTANOS DE AGAVE Anel Karina Bernal Martínez, Patricia Araceli Santiago García, Mercedes Guadalupe López Pérez DIRECCIÓN DE LOS AUTORES

Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional CIIDIR-IPN Oaxaca, Oax., 68030 y Depto. de Biotecnología y Bioquímica, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Campus Guanajuato, Irapuato Gto., 36500 México. CORREO ELECTRÓNICO [email protected]

XV III C ongreso Nacional de Ingeniería B ioquímica X V III N ational C ongress of Biochemical E ngineering V II C ongreso Internacional de Ingeniería B ioquímica V II International C ongress of Biochemical E ngineering X Jornadas C ientíficas de B iomedicina y B iotecnología Molecular X B iomedicine and Molecular B iotechnology Meeting INTRODUCCIÓN

MATERIALES Y MÉTODOS

Los prebióticos son ingredientes alimentarios no digeribles con efectos benéficos por su capacidad de estimular el crecimiento o la actividad de bacterias probióticas en el colon, y de este modo mejorar la salud del anfitrión. Estos a su vez son fermentados por probióticos que son microorganismos vivos con efectos beneficos para el anfitrión y para la mejora del equilibrio de la flora intestinal (Astiasarán y col. 2003). Dentro de los probióticos más populares se encuentran los del género: Lactobacillus, Streptococcus y Bifidobacterium (Chow, 2002). Los fructanos de agave son carbohidratos no digeribles y fermentables que por su estructura (Mancilla-Margalli y López 2006) son considerados como prebióticos. La extracción de los fructanos, es una alternativa para los productores de agave en Oaxaca, la producción es de 130,240 toneladas, del cual solo se cosecha el 27%, de modo que se cuenta con la disponibilidad de la materia prima para su obtención, además de su importancia como prebiótico.

Los fructanos utilizados se obtuvieron de Agave angustifolia Haw., de 8 años de edad, provenientes de Totolapan, Tlacolula Oaxaca.

OBJETIVO Evaluar la cinética y el crecimiento de cuatro cepas de Lactobacilli (Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. paracasei y L. rhamnosus), utilizando como fuente de carbono fructanos de Agave angustifolia.

Bacterias Cuatro cepas de Lactobacillus a) L. acidophilus LA-2 25302; b) L. casei LCC-1 53103; c) L. paracasei LPC-1 393 y d) L. rhamnosus LR 4356 fueron probadas como probióticas siguiendo el método reportado por Gibson y Wang (1994). Diseño experimental El experimento se estableció con un arreglo factorial 4x5x2. Los factores de estudio fueron: 1) Cuatro cepas de Lactobacillus; 2) cinco diferentes fuente de carbono: fructanos de A. angustifolia cadena larga (A), cadena corta (B) y totales (C) y dos tipos de inulina de achicoria Raftiline (RN) y Raftilose (RS) 3) la obtención de los fructanos de agave, fueron extraídos por dos métodos: convencionalmente (C): utilizando solución etanol-agua y secados por aspersión (100-80°C) y extraídos solo con agua (H) clarificado con carbón activado y secados por convección a 50°C. Identificación de fructooligosacáridos (FOS) y contenido de carbohidratos Se utilizaron placas de gel sílice para cromatografía en capa fina, para visualizar la separación de compuestos se utilizó un revelador específico para azúcares. En la placa de gel de sílice se aplicaron 10 µL de cada muestra

28 a l 30 de M a rzo del 2012 - Ixta pa-Z ihua ta nejo G uerrero , M éxico . e-m a il: co legio ibq@ hotm a il.co m

w w w .cm ibq.o rg.m x

XV III C ongreso Nacional de Ingeniería B ioquímica X V III N ational C ongress of Biochemical E ngineering V II C ongreso Internacional de Ingeniería B ioquímica V II International C ongress of Biochemical E ngineering X Jornadas C ientíficas de B iomedicina y B iotecnología Molecular X B iomedicine and Molecular B iotechnology Meeting utilizando los estándares de glucosa, fructosa, sacarosa, 1-kestosa, 1,1kestotetraose, 1,1,1-kestopentaose. La determinación de azúcares directos, totales y fructosa fueron realizados por métodos colorimétricos. Cinética de crecimiento Se utilizó el 1% de cada fuente de carbono y se disolvieron con caldo MRS (Man-Rogosa-Sharpe), el medio de cultivo y la fuente de carbono se esterilizaron en un autoclave marca Market Forge-Sterilmatic, posteriormente se inoculó el 1% de bacterias y se incubaron a 37 ºC en condiciones anaeróbicas, midiendo su crecimiento por densidad óptica a 600 nm, a diferentes tiempos; t=0, 2, 4, 6, 9,12, 15, 18, 24 y 30 horas.

El análisis estadístico fue realizado usando SAS para Windows versión 8. El procedimiento GLM y la prueba de Tukey fueron usados para determinar las diferencias significativas entre las poblaciones bacterianas usando los diferentes fructanos. Diferencias fueron consideradas significativas cuando P < 0.05. DESARROLLO

Fructanos

Bifidobacterias y lactobacilli

Lactato y succinato

Acetato, propionato

Fermentación

H2, H2S, CO 2 CH4

y

Biomasa

Crecimiento bacteriano El crecimiento bacteriano de Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. paracasei y L. rhamnosus, fueron evaluadas como cepas probióticas, siguiendo la metodología de Gibson y Wang (1994) con una concentración de 10 g/L de fructanos, Raftiline y Raftilose como única fuente de carbono. El crecimiento bacteriano fue medido por densidad óptica a 600 nm en un espectrofotómetro UV-Visible 1601 marca SHIMADZU y la ingesta de los fructanos por las bacterias fue evaluada midiendo los cambios de pH con un potenciómetro. Los resultados se reportan como el promedio de tres determinaciones independientes para cada caso. Análisis estadístico

Figura 1. Fermentación de fructanos RESULTADOS Y DISCUSION Identificación de fructooligosacáridos. La figura 2 muestra el perfil de una TLC de los fructanos de A. angustifolia utilizados. En ella se observa que en (AC) hubo mayor intensidad de la mancha en la base del cromatógrafo similares al estándar de inulina con un DP aproximado de 20 que en la muestra (AH), en el cual se observa también la presencia de fructanos de cadena corta o de menor grado de polimerización (DP) y con mayor intensidad fructosa y glucosa; este hecho se puede asociar a que hubo una hidrólisis mayor en (AH), debido al método de extracción utilizado y al ser

28 a l 30 de M a rzo del 2012 - Ixta pa-Z ihua ta nejo G uerrero , M éxico . e-m a il: co legio ibq@ hotm a il.co m

w w w .cm ibq.o rg.m x

XV III C ongreso Nacional de Ingeniería B ioquímica X V III N ational C ongress of Biochemical E ngineering V II C ongreso Internacional de Ingeniería B ioquímica V II International C ongress of Biochemical E ngineering X Jornadas C ientíficas de B iomedicina y B iotecnología Molecular X B iomedicine and Molecular B iotechnology Meeting secado por convección, comparado con (AC).

Figura 2. TLC de Fructano de cadena larga convencional (AC) y en agua (AH); fructano de cadena corta convencional (BC) y en agua (BH); fructanos totales convencional (TC) y en agua (TH). Estándares: F=fructosa; G=glucosa; S=sacarosa; 1-kestosa (DP3); 1,1 kestotetraose (DP4) y 1,1,1 kestopentaose (DP5) e inulina de achicoria.

Cinética de crecimiento La figura 3 muestra las cinéticas de crecimiento de las cuatro cepas de Lactobacillus en fructanos de cadena larga de A. angustifolia extraídos de forma convencional y secados por aspersión a una temperatura de 100-80 ºC (AC). En ella observamos que cada cepa de Lactobacillus tuvo un comportamiento diferente con este susbtrato. L. rhamnosus, tuvo una fase lag más corta, teniendo una tasa de crecimiento específico ( =0.3256 h-1) mayor que los otros Lactobacillus, y un tiempo de duplicación menor (2.1288 h).

Tabla 1. Contenido de azúcares en los fructanos de A. angustifolia secos

Fructano

Carbohidratos totales mg/g

Reductores directos mg/g

Fructosa mg/g

AC

878.16

79.72

385

AH

726.21

135.25

280

BC

579.86

124.75

275

BH

511.01

90.79

410

TC

892.52

82.67

585

Se observa que la producción de azúcares libres se debió a la hidrolisis de los fructanos de cadena corta durante la extracción. Además de que la velocidad de formación de fructosa durante la hidrólisis depende de la longitud de la cadena para transformarse en fructosa.

Figura 3. Cinética de crecimiento de L. acidophilus (L.a); L. casei (L.c); L. paracasei (L.pc) y L. rhamnosus (L.r), utilizando como fuente de carbono (AC).

Utilizando los fructanos de alto DP extraídos en agua (AH), se observa que la cinética de crecimiento de las cuatro cepas de Lactobacillus, en donde L. acidophilus tuvo una fase exponencial con un coeficiente de determinación de r2=0.9752, lo que indica que el 97.52% de la variación en el crecimiento del lactobacilli se debió a la relación lineal que existe entre el tiempo de incubación y la fuente de carbono, la cual cómo

28 a l 30 de M a rzo del 2012 - Ixta pa-Z ihua ta nejo G uerrero , M éxico . e-m a il: co legio ibq@ hotm a il.co m

w w w .cm ibq.o rg.m x

XV III C ongreso Nacional de Ingeniería B ioquímica X V III N ational C ongress of Biochemical E ngineering V II C ongreso Internacional de Ingeniería B ioquímica V II International C ongress of Biochemical E ngineering X Jornadas C ientíficas de B iomedicina y B iotecnología Molecular X B iomedicine and Molecular B iotechnology Meeting podemos ver fue más eficiente para L. acidophilus. Con respecto a L. casei se encontró un r 2= 0.9520 ligeramente menor que para L. acidophilus pero muy similar a la de L. paracasei y L. rhamnosus los cuales tuvieron un coeficiente de determinación similar. El comportamiento de los lactobacilos usando como substrato (BH), fue similar para L. acidophilus y L. casei en la fase lag a diferencia del L. rhamnosus que resultó más corta que en las anteriores, en el caso de L. paracasei se encontró que la fase lag fue más larga que para L. rhamnosus (Fig.4). De la comparación de los substratos (BC) y (BH) el mejor crecimiento de estas bacterias fue con (BC), ya que el crecimiento de los lactobacilos en (BH) no tuvieron el mejor rendimiento como substrato probablemente por la deficiencia del método de secado y tal vez a una caramelización de los azúcares los cuales ya no puedieron ser utilizados

que no hubo diferencia significativa en los fructanos (BH y TH) además del estándar (RN). Raftilose (RS) resultó el mejor substrato, seguido de fructanos de agave de alto DP extraído en agua (AH) este probablemente porque fue hidrolizado más durante su extracción y secado, y por lo tanto incrementó la presencia de fructanos de DP corto, así como azúcares libres, que seguramente fueron consumidos primero por los lactobacilos antes de comenzar a degradar las cadenas ramificadas de los fructanos de agave.

Figura 5. Crecimiento de L. acidophilus. Valores con letras diferentes fueron significativamente diferentes (P 0.05). D.O a 600 nm

2

L.a L.pc

1.5

L.c L.r

1

0.5 0

0

10

20 hr Tiempo,

30

40

Figura 4. Cinética de crecimiento de L. acidophilus (L.a); L. casei (L.c); L. paracasei (L.pc) y L. rhamnosus (L.r), utilizando como fuente de carbono (BH).

Efecto de los fructanos de agave sobre el crecimiento de Lactobacilli El crecimiento del L. acidopilus se muestra en la figura 5, en ella se observa

L. acidophilus con el susbstrato (BC) tuvo un buen crecimiento (DO=1.3532) y con (BH) un crecimiento de OD=1.2667. Esto concuerda con estudios realizados por (Biedrzycka y Bielecka, 2004; Roberfroid y col. 1998) en que los fructanos de cadena corta son mejor utilizados como fuente de carbono para las bifidobacterias y lactobacilos. Santiago y López (2009) reportaron mayor crecimiento de L. acidophilus en fructanos de A. angustifolia de cadena corta resultando el mejor tratamiento que

28 a l 30 de M a rzo del 2012 - Ixta pa-Z ihua ta nejo G uerrero , M éxico . e-m a il: co legio ibq@ hotm a il.co m

w w w .cm ibq.o rg.m x

XV III C ongreso Nacional de Ingeniería B ioquímica X V III N ational C ongress of Biochemical E ngineering V II C ongreso Internacional de Ingeniería B ioquímica V II International C ongress of Biochemical E ngineering X Jornadas C ientíficas de B iomedicina y B iotecnología Molecular X B iomedicine and Molecular B iotechnology Meeting los estándares (Raftiline y Raftilose Synergy 1), sin embargo en los fructanos de cadena larga el crecimiento de esta bacteria resultó por debajo de los fructanos de cadena corta y de los de tipo comercial. El resultado obtenido del crecimiento del L. acidophilus, se puede comparar con las cinéticas anteriores para esta misma bacteria, el cual coincide en que fue el lactobacilo que mayor crecimiento tuvo en cada substrato utilizado con respecto a las otras cepas. Los fructanos de agave evaluados fueron degradados por el L. acidophilus, seguramente por enzimas β-fructosidasa, el cual se ha encontrado en el genoma de algunas cepas de Lactobacillus (Makras y col. 2005). Para el caso del crecimiento de L. casei (Fig. 6) utilizando los fructanos de A. angustifolia fue en general menor que el presentado por L. acidophilus, L. paracasei y L. rhamnosus.

Figura. 6. Crecimiento de L. casei

Para el crecimiento del L. paracasei, el mejor substrato considerado por el efecto que tuvo en el crecimiento de esta bacteria es el AH, (DO=1.0395), otro substrato en el que hubo también mayor crecimiento fué el de cadena corta BC,

(DO=0.9247), estos fructanos resultaron mejor fuente de carbono que los estándares Raftiline y Raftilose. En cuanto a los fructanos BH y TH no hubo diferencia significativa, lo mismo con los fructanos AC y Raftiline. CONCLUSIONES El método de extracción y secado tuvo un efecto significativo en el contenido de fructanos de cadena corta. De la cinética de crecimiento observamos que dependiendo de la capacidad de cada lactobacilli se lleva a cabo su duplicación. A mayor contenido de fructanos de cadena corta se incrementa el crecimiento de las cepas de lactobacilli. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Mancilla-Margalli NA, López MG. 2006. Journal of Agricultural and Food Chemistry 54, 7832-7839 Gibson GR, Wang X. 1994. Food Microbiology 11, 491-498 Biedrzycka E, Bielecka M. 2004. Trends in Food Science and Technology 15: 170175 Makras L, Van Acker G, De Vuyst L. 2005. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 71, 11: 6531-6537. Santiago GP, López MG. 2009. Dynamic Biochemistry, Process Biotechnology and Molecular Biology 3.

28 a l 30 de M a rzo del 2012 - Ixta pa-Z ihua ta nejo G uerrero , M éxico . e-m a il: co legio ibq@ hotm a il.co m

w w w .cm ibq.o rg.m x