Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 2005, 24 (1), 175-187

Expresión de antígenos del virus de la fiebre aftosa en plantas transgénicas M.J. Dus Santos (1) & A. Wigdorovitz (2) (1) Instituto de Virología, Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias y Agronómicas, INTA-Castelar, C.C. 77, Castelar (1712), Buenos Aires, Argentina (2) Consejo Nacional e Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Avda. Rivadavia 1917, C.P. C1033AAJ, Buenos Aires, Argentina

Resumen El virus de la fiebre aftosa produce una de las enfermedades más temidas del ganado debido a su amplia distribución geográfica y a su naturaleza altamente contagiosa. La vacuna utilizada actualmente es polivalente y con virus inactivado. Las investigaciones relativas a la producción de vacunas antiaftosas están dirigidas hacia la obtención de vacunas de elaboración más fácil y económica y que eviten la manipulación de grandes cantidades de virus. El uso de plantas transgénicas como sistema de expresión de antígenos relevantes ha sido evaluado para la producción de vacunas. El grupo de trabajo de los autores ha trabajado con el virus de la fiebre aftosa como modelo para evaluar la posibilidad de utilizar plantas transgénicas como sistema de expresión de antígenos virales y para desarrollar vacunas experimentales. El objetivo de este trabajo es mostrar los resultados del grupo en la expresión de antígenos del virus de la fiebre aftosa en plantas transgénicas. Palabras clave Antígeno – Fiebre aftosa – Planta transgénica – Vacuna – Virus.

Introducción El virus de la fiebre aftosa produce una de las enfermedades más temidas del ganado debido a su amplia distribución geográfica y a su naturaleza altamente contagiosa. Actualmente no hay incidencia de la enfermedad en Europa, América Central y del Norte, pero la fiebre aftosa sigue siendo un grave problema en Sudamérica, Asia y África. Argentina no ha presentado focos de la enfermedad desde 2003, y tiene el estatus de país libre de fiebre aftosa con vacunación. No obstante, existe un riesgo de introducción de virus infeccioso debido a la proximidad geográfica con zonas endémicas. La infección por el virus de la fiebre aftosa induce una respuesta celular y humoral en el hospedador, siendo el elemento más importante de la respuesta la producción de

anticuerpos neutralizantes (AcN) específicos contra las proteínas estructurales del virus. La vacuna utilizada actualmente es polivalente y con virus inactivado, y aunque ha demostrado ser una herramienta eficaz para la prevención de la enfermedad, su producción es costosa y de alto riesgo debido a la manipulación de cantidades masivas de virus infeccioso que puede resultar en su diseminación (5). Por ello, las investigaciones relativas a la producción de vacunas antiaftosas están dirigidas hacia el logro de vacunas de elaboración más fácil, económica y seguras. Con ese fin, los autores han investigado el desarrollo de métodos alternativos de producción de vacunas antiaftosa, utilizando plantas transgénicas como vectores. Desde tiempos muy remotos se han utilizado las plantas como fuente de compuestos medicinales que han sido de

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gran utilidad desde el punto de vista sanitario. No obstante, nuevos desarrollos en biotecnología han vuelto a hacer pensar en las plantas como productos de utilidad terapéutica o preventiva. El uso de plantas transgénicas como sistema de expresión de antígenos relevantes ha sido ampliamente evaluado, dada la posibilidad de utilizar plantas modificadas genéticamente para la producción de vacunas (2, 6, 7, 16, 18, 23, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40). Se piensa que las vacunas a base de plantas serán más baratas y más fáciles de elaborar en grandes cantidades. Estas vacunas se podrían producir en países en desarrollo sin necesidad de instalaciones sofisticadas y costosas como las que se necesitan en la actualidad. Por otra parte, estas vacunas eliminarían el riesgo de virus contaminantes que conllevan las vacunas producidas en líneas celulares de mamíferos, ya que los posibles virus de plantas contaminantes no constituyen un peligro potencial ni para el hombre ni para los animales. Adicionalmente, las plantas transgénicas que expresen antígenos en sus tejidos comestibles podrían ser usadas como sistemas de producción de vacunas orales a muy bajo costo (2, 16, 18, 23, 35, 36, 39). La transferencia de genes a plantas se puede realizar por métodos directos, vectores virales y vectores bacterianos. Los métodos directos incluyen cocultivo con ácido desoxirribonucleico (ADN), electroporación, biolístico, microinyección, fibras de siliconas y siliconas. Los virus vegetales son vectores atractivos para la introducción de genes en plantas. Su principal ventaja radica en que están evolutivamente adaptados para expresar sus proteínas virales en la planta infectada. Se pueden construir genes quiméricos fusionando un fragmento de ADN que codifica para un epitope determinado a un gen de la cápside del virus de planta. El virus recombinante se utiliza para infectar plantas de modo que la replicación y propagación del mismo permiten la expresión transitoria de la proteína quimérica. Las partículas virales que expresan el epitope foráneo en su superficie se purifican a partir de las plantas infectadas. El sistema de transferencia de genes basado en la bacteria Agrobacterium tumefaciens es el más empleado para introducir ADN foráneo en plantas. Durante la infección por A. tumefaciens, un segmento de ADN llamado ADN de transferencia (ADN-T) es transferido desde la bacteria a la célula vegetal (Fig. 1) (42). El ADN-T contiene el gen de interés asociado a secuencias regulatorias y un gen marcador de selección que en general codifica para la resistencia a un antibiótico. La integración del ADN-T en el cromosoma vegetal ocurre por recombinación ilegítima, siendo el sitio de integración azaroso. El gen de interés es, entonces, establemente integrado en el cromosoma nuclear de modo que las

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plantas resultantes expresan el antígeno foráneo en todos o algunos de los tejidos vegetales. Las plantas así obtenidas pueden ser utilizadas para la extracción y purificación del antígeno o como alimento directo. El grupo de los autores ha utilizado el virus de la fiebre aftosa como modelo para evaluar la posibilidad de usar plantas transgénicas como sistema de expresión de antígenos virales y para el desarrollo de vacunas experimentales. El objetivo de este trabajo es mostrar los resultados obtenidos en la expresión de antígenos del virus de la fiebre aftosa en plantas transgénicas.

Evaluación de la utilización de plantas transgénicas para la expresión de antígenos Inicialmente se utilizó la proteína VP1 para evaluar la posibilidad de usar plantas modificadas genéticamente como fuente de producción de antígenos. La proteína estructural VP1 posee los epitopes responsables de la inducción de anticuerpos neutralizantes (AN) y ha resultado un inmunógeno efectivo al ser expresada en sistemas procariotas y eucariotas (10, 15, 21, 41). Se ha demostrado que la inmunización con VP1 o péptidos sintéticos que representan parte de su secuencia aminoacídica induce una protección frente al desafío viral, tanto en el modelo murino como en el hospedador natural (5). El vector utilizado para la incorporación de los genes foráneos en el genoma vegetal (pROK-VP1) es un plásmido binario que contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) para dirigir la expresión constitutiva de los genes de interés. También contiene un marcador seleccionable (nptII) el cual permite la selección de las plantas transformadas en un medio que contiene kanamicina. Tanto el gen viral como nptII se ubican en la región del plásmido denominada ADN-T (Fig. 1). Utilizamos el método de A. tumefaciens para transformar plantas de Arabidopsis thaliana (especie modelo para la generación de plantas transgénicas), en papa y en alfalfa (forrajera por excelencia para la obtención de carne, leche y lana). En las tres especies estudiadas, se evaluó la presencia de la proteína VP1 recombinante por método inmunoenzimático (ELISA). Aproximadamente, el 10% de las plantas de A. thaliana, 65% de papa y el 60% de las plantas de alfalfa fueron claramente positivas. Estas plantas se utilizaron para inmunizar ratones con extractos crudos por la vía parenteral. Todos los animales inmunizados desarrollaron una fuerte y específica respuesta inmune. El efecto protectivo de la VP1 producida en plantas fue evaluado mediante el desafío de los ratones inmunizados con virus infeccioso. Los animales vacunados con las

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Kpn I

Sac I

Sma I

BamH I

ADN-T

TGA

ATG

RB NOSpro

nptll

NOSter

CaMV 35S

VP1

LB NOSter Eco R I

pROK-VP1

Sma I

BamH I

Pst I

Sph I

Hind III

Xba I

ADN-T

TGA

ATG

RB NOSpro

nptll

NOSter

β-glucuronidasa

CaMV 35S

LB NOSter

Sst I

Eco R I

p135-160

pBI121-p135-160-β-GUS Sma I TCT AGA GGA TCC CCG GGT GGT CAG TCC CTT ATG Xba I

Bam H I

Kpn I

Sac I

Xho I

Sca I

Stu I

Spe I

Sma I

BamH I

ADN-T

TGA

ATG

RB NOSpro

nptll

NOSter

CaMV 35S

P1-3C

LB NOSter Eco R I

pROK-P1-3C

ADN-T: ácido desoxirribonucleico de transferencia

Fig. 1 Esquemas de los vectores binarios utilizados

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plantas que expresban la VP1 resultaron protegidos, mientras que los controles inmunizados con plantas que expresaban un gen no relacionado resultaron infectados con virus de la fiebre aftosa (Cuadro I).

protección frente a las secreciones gástricas. De modo que, cuando esta barrera finalmente se rompe en el intestino, las células gradualmente liberan el antígeno, el cual es captado por las células M. Está bien documentado que las vacunas comestibles a base de plantas inducen una respuesta inmune sistémica y de mucosas (2, 13, 17, 18).

Evaluación de la utilización de plantas transgénicas como inmunógenos orales Muchos agentes infecciosos colonizan o invaden membranas epiteliales; éstos incluyen bacterias y virus que se transmiten en comida o agua contaminada o por contacto sexual. Para ser efectivas contra estas infecciones, las vacunas deberían estimular el sistema inmune de mucosas a fin de producir inmunoglobulina A (IgA) secretoria en superficies de mucosa tales como el epitelio intestinal y respiratorio. En general, la respuesta inmune en mucosa es más efectiva cuando la inmunización se realiza por vía oral que parenteralmente. En comparación con la vía intraperitoneal, la inmunización oral requiere una mayor masa de antígeno para generar una respuesta inmune. El reconocimiento del antígeno por las células M es el primer paso para la inducción de una respuesta inmune en mucosas. Estas células se ubican en tejidos linfoides de las mucosas tales como las placas de Peyer. Así, las células M vehiculizan el antígeno a los tejidos adyacentes donde las células presentadoras de antígeno procesan y presentan el antígeno, activando, con ayuda de las células T “helper”, a células B.

El grupo ha utilizado plantas de alfalfa que expresan la VP1 para evaluar su efectividad como inmunógeno oral. Es importante destacar que, cuando se alimentó a ratones con hojas frescas de dicha alfalfa, estos animales desarrollaron una respuesta inmune sistémica al virus de la fiebre aftosa la cual resultó protectora frente a la descarga con virus infeccioso por la vía parenteral, siendo ésta la primera vez que un antígeno expresado en plantas, que no pertenece a un microorganismo que habita el tracto digestivo, induce protección en un modelo animal. La elección de la especie vegetal para evaluar la producción de antígenos recombinantes constituye un punto crítico que se ha de evaluar, especialmente cuando se piensa en la posibilidad de una vacuna de administración oral. En este sentido, la planta debería poder comerse cruda para evitar la desnaturalización del antígeno durante la cocción y tener naturalmente un alto contenido proteico para permitir un elevado nivel de expresión del transgen. En el área veterinaria, las plantas forrajeras utilizadas para el pastoreo constituyen un blanco óptimo para desarrollar vacunas animales a base de plantas transgénicas. En particular, en Argentina, la alfalfa constituye una de las principales fuentes de forraje para la obtención de carne,

Los antígenos expresados en plantas tienen la ventaja de sobrevivir al transporte a través del estómago, ya que la pared celular de las células vegetales proporciona

Cuadro I Evaluación del efecto protectivo de los antígenos del virus de la fiebre aftosa producidos en plantas, mediante desafío de ratones inmunizados con virus infeccioso Planta utilizada para la inmunización y vía de administración

ISN (a)

Porcentaje de protección (b)

Ref.

Arabidopsis thaliana – pROK VP1 (n = 14), i.p.

ND

100

6

A. thaliana – pROK (n = 6), i.p.

ND

0

6

Alfalfa – pROK VP1 (n = 20), i.p.

ND

80

38

Alfalfa – pROK VP1 (n = 8), oral

ND

75

38

Alfalfa – pROK (n = 6), i.p.

ND

0

38

Alfalfa – pROK (n = 6), oral

ND

0

38

Papa – pROK VP1 (n = 26), i.p.

ND

87

7

Papa – pROK (n = 10), i.p.

ND

0

7

Alfalfa – pBI121VP-β-GUS (n = 10), i.p. Alfalfa – pBI121 (n = 10), i.p. Alfalfa – pROK P1.3C (planta A) (n = 13), i.p.

1,95 ± 0,16