31

Extracción y caracterización parcial de pigmentos de hongos biodeteriorantes aislados de patrimonio documental cartográfico María P Marín 1, Luz Stella Villalba 2* y Catalina Arévalo 3

{

En el presente estudio se realizó la caracterización parcial de pigmentos producidos por hongos deteriorantes de material cartográfico patrimonial. Se trabajaron tres géneros de hongos: Penicillium Morfotipo 2, Chaetomium Morfotipo 1 y Stachybotrys Morfotipo 1; los cultivos se realizaron sobre papel y en medio líquido. Únicamente Penicillium Morfotipo 2 produjo el pigmento característico encontrado sobre el papel, bajo las condiciones de estudio, la caracterización parcial de este pigmento se realizó mediante espectrometría de masas por impacto electrónico y se observó que el pigmento está formado por una mezcla de dos derivados de antraquinona: “parietin” y “emodin”.

{

Palabras Clave: pigmentos, papel vegetal, microbiodeterioro, hongos biodeteriorantes, acervo documental.

Introducción

A lo largo de la historia de la humanidad, hechos de gran trascendencia han sido registrados sobre papel en libros, cartas, mapas y planos entre otros, y hoy forman parte importante de la memoria de nuestras ciudades.

Para preservar estos registros y evitar su deterioro con el paso del tiempo, entidades como el Archivo de Bogotá protegen los recursos documentales del Distrito Capital a través del acopio, la conservación y la organización de fondos y colecciones con valor de patrimonio documental para la ciudad (1). El acervo documental está expuesto a numerosos factores intrínsecos y extrínsecos de deterioro por reacciones fisicoquímicas y biológicas, evidentes a nivel macroscópico y estructural, dichas reacciones determinan la velocidad del deterioro y el estado de conservación de los documentos o unidades (2). Los factores intrínsecos están directamente relacionados con la composición de los materiales utilizados en la fabricación de los soportes (3).Dada

la naturaleza orgánica del acervo documental, se originan reacciones de degradación de las fibras naturales como la lignina y la celulosa. Estas reacciones son muy lentas y se manifiestan en los soportes con un amarillamiento leve sumado a la pérdida de resistencia del material (2). Los factores extrínsecos se pueden clasificar en cuatro grandes grupos: antropogénicos, desastres, ambientales y biológicos. Como (i) factores antropogénicos se cuentan las malas prácticas de limpieza y almacenamiento, además de la manipulación inadecuada de la unidad, (ii) entre los desastres se agrupan cualquier serie de eventos circunstanciales naturales ó humanos que sean de carácter súbito y devastador, (iii) los factores ambientales son inherentes al medio en el que se encuentra el soporte y son parámetros susceptibles de modificación para lograr condiciones estables para la conservación del material; entre estos encontramos la temperatura, la humedad relativa, la luz, los contaminantes atmosféricos y el material particulado y (iv) los factores biológicos principalmente los microorganismos y las sustancias secretadas (ácidos, micotoxinas y pig-

1y 3 Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ciencias. Departamento de Química. Bogotá, Colombia. 2 Villalba Corredor, Luz Stella MSc. Microbiología Ambiental - Universidad Nacional de Colombia. Actualmente responsable del Laboratorio de Ciencias del Centro de Conservación de la Biblioteca Nacional de Colombia

32 mentos, entre otros) por ellos, que afectan en gran medida el soporte y pueden ocasionar pérdida total de colecciones (3).

rium oxysporum, el amarillo verdoso del Penicillium notatum, el café opaco del Chaetomium globosum y el negro mate de algunos Aspergillus sp. (10, 11).

Los microorganismos son capaces de colonizar y degradar fácilmente los materiales constituyentes del patrimonio documental de un archivo o biblioteca, pues estos encuentran en el papel, la tinta y diferentes recubrimientos los nutrientes necesarios para su desarrollo. Esta acción microbiana tiene un doble efecto negativo en los soportes, por un lado se destruyen las fibras de celulosa que sirven como fuente de carbono y durante el metabolismo secretan sustancias orgánicas que aumentan su efecto deteriorante.

El propósito de la presente investigación fue caracterizar parcialmente los pigmentos, pues su conocimiento permite establecer procesos idóneos de intervención para el material documental con esta problemática. Para el desarrollo de la investigación se consideraron las siguientes fases: (i) inducción de la producción de pigmentos sobre muestras de papel vegetal y la realización de cultivos líquidos, (ii) extracción de los pigmentos obtenidos sobre papel vegetal utilizando diferentes solventes, (iii) purificación de los pigmentos obtenidos en los medios líquidos por medio de técnicas cromatográficas y (iv) análisis espectroscópico del pigmento purificado.

De la microflora deteriorante reportada en la literatura, los hongos prevalecen sobre otros tipos de microorganismos como las bacterias, debido a que estas necesitan de sustratos con una alta actividad de agua (aw) para su desarrollo (4). Particularmente, los hongos han desarrollado mecanismos de adaptación que les facilitan la síntesis de una gran variedad de sustancias complejas a partir de un simple suministro de Carbono y Nitrógeno. Entre sus productos de síntesis se encuentran no solo proteínas celulares y materiales de reserva, también producen metabolitos secundarios como ácidos orgánicos, pigmentos, antibióticos y micotoxinas (5). Dentro de los agentes biodeteriorantes encontrados en bibliotecas y archivos alrededor del mundo, son aproximadamente 234 especies de hongos de 84 géneros diferentes que habitan en los diversos materiales como pergamino, cuero, pegantes y papel. Entre los moradores mas comunes están los géneros Alternaria, Fusarium, Chaetomium y Penicillium entre muchos otros (6, 7,8). Como manifestaciones del proceso de biodeterioro, se presenta un grupo de indicadores, los más frecuentes son las manchas coloreadas, las cuales se observan con frecuencia en los libros y documentos, estas suelen ser producidas por pigmentos excretados por los hongos durante su crecimiento. Estas manchas son características y de diferentes colores, texturas y tonalidades (9). Ejemplos claros de pigmentos son el rosa pálido que excreta el Fusa-

MATERIALES Y MÉTODOS Microorganismos A partir del banco de cepas de hongos filamentosos del Laboratorio de Física, Química y Biología del Archivo de Bogotá, se seleccionaron 3 géneros de mayor frecuencia de aislamiento: Penicillium Morfotipo 2, Chaetomium Morfotipo 1 y Stachybotrys Morfotipo 1, para inducir la producción del pigmento deteriorante sobre el papel y en medio líquido. Los microorganismos conservados en agua, se sembraron en Agar Papa Dextrosa (PDA) pH 5.5 y se incubaron a 28ºC durante 7 días. Obtención de los pigmentos sobre papel vegetal Selección del papel vegetal: las probetas (fragmentos) de papel vegetal se seleccionaron de planos descartados de los fondos, luego del estudio de valoración documental. Producción de pigmentos sobre papel vegetal: Luego de seleccionados los planos se cortaron 15 probetas de 3cm x 3cm y se esterilizaron a 121ºC y 15 psi durante 20 minutos. A partir de cultivos jóvenes de los aislamientos de Penicillium Morfotipo 2, Chaetomium Morfotipo 1 y Stachybotrys Morfotipo 1, se sembraron de cada uno cinco plugs sobre Agar PDA pH 5.5 por caja. Posteriormente en cada punto de siembra se colocó un fragmentos del papel vegetal previamente esterilizado, de tal manera que los microorganismos se encontraran a lo largo de la

33 interfase papel – agar. Estos medios se incubaron a una temperatura de 28 ºC y humedad relativa 100% (8).

controlando por conductimetría. Posteriormente, el pigmento se eluyó con etanol al 96% (1L) y llevando a sequedad el extracto en un rotavapor (12).

Extracción de los pigmentos obtenidos sobre papel vegetal

Finalmente, el sólido obtenido se redisolvió en metanol, se separó por CC sobre Sephadex LH20 (600 x 50 mm), eluyendo con metanol a un flujo de 1 mL/min. Las fracciones recogidas se agruparon de acuerdo a su coloración y se concentraron a presión reducida almacenándose a 4°C.

Para la extracción de los pigmentos del papel se utilizaron los siguientes solventes: i) 1,4-Dioxano y ii)  N,N  -  Dimetilformamida, de acuerdo con el reporte de Szczepanowska y Lovett, 1992 (8) . A cada fragmento de papel vegetal de las cajas de Petri se le retiró el exceso de micelio por raspado con un escalpelo y se introdujo en un erlenmeyer de 100mL que contenía 5mL de solvente; estos permanecieron en agitación a 150rpm por un periodo de 24 horas. Posteriormente los extractos crudos y el papel se evaluaron por inspección visual y se tomaron registros fotográficos. Determinación de las condiciones óptimas y medio de cultivo para la obtención de los pigmentos a partir de cultivos líquidos Con el fin de establecer el medio de cultivo y las condiciones a las cuales se producen los pigmentos para cada género se consideraron los siguientes medios: (a) caldo Czapeck (NaNO3 0.2%, KH2PO4 0.1%, MgSO4 0.05% y solución de elementos traza 1% [Mo, Mn, Fe y Zn]) en ausencia de luz a 25ºC y sin agitación, (b) caldo Czapeck en presencia de luz a temperatura ambiente y 150 rpm; (c)  caldo Sabouraud-Glucosa 2% (Merck) en presencia de luz a temperatura ambiente y 150 rpm y (d) caldo Carboximetilcelulosa 1% p/v (Sigma Chemical Co.) en presencia de luz a temperatura ambiente y 150 rpm. Purificación del pigmento obtenido en medio líquido Después de 7 días el cultivo inicialmente fue filtrado con una gasa previamente esterilizada para eliminar el micelio presente. Posteriormente, el sobrenadante se filtró en un equipo de vacío con una membrana Milipore de 0.22mm (Nitrato de celulosa) para eliminar las esporas presentes en el extracto. El extracto obtenido se cargó en una columna empacada con resina Amberlita XAD-2 (300 x 50 mm) eluyendo con agua (2L) a un flujo de 1mL/min,

Caracterización parcial del pigmento obtenido en medio líquido La caracterización parcial del pigmento se realizó por espectrometría de masas en modo impacto electrónico y RMN 1H. El EM-IE fue obtenido en un equipo Shimadzu modelo QP-5050A con un voltaje de ionización de 70eV, detectando iones positivos con m/z entre 50 y 400. El espectro de RMN 1H se registró en un equipo Bruker Avance 400 (400 MHz para RMN 1H) empleando como solvente CDCl3 (99,5%). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Obtención y extracción de pigmentos a partir de papel vegetal Durante la primera etapa de la investigación se pretendía producir los pigmentos sobre papel vegetal a partir de los tres aislamientos de hongos seleccionados, pero como se muestra en la Figura 1, no hubo producción aparente de pigmento en los cultivos de Chaetomium Morfotipo 1 y Stachybotrys Morfotipo 1, probablemente debido a que el papel vegetal fue tratado en su momento para la técnica de reproducción planimétrica conocida como diazotipia, la cual utilizaba una serie de compuestos entre ellos ácidos y vapores amoniacales, que puede afectar el crecimiento, así como la producción de pigmentos de los microorganismos (13, 14). Por otra parte, del cultivo a partir de Penicillium Morfotipo 2 (Figuras 1 y 2) se observó producción significativa del pigmento amarillo fluorescente; este género fúngico presenta una gran facilidad de adaptación y capacidad metabólica representada en sus enzimas lo que le permite utilizar una gran diversidad de sustratos y crecer rápidamente (15). (Figura 2)

34 Como no se observó producción aparente de pigmentos en los cultivos de Chaetomium Morfotipo 1 y Stachybotrys Morfotipo 1, no se realizaron ensayos de extracción a los fragmentos de papel vegetal colocados sobre los medios de cultivo. La extracción del pigmento producido por Penicillium Morfotipo 2 sobre el papel vegetal, se realizó con N,N-dimetilformamida y 1,4-dioxano (8). En este caso, más que el tiempo de contacto con el solvente es fundamental el tipo de interacción que presenta el pigmento con el mismo. Los resultados mostraron que con N,N-dimetilformamida se logra una mayor extracción que la que se alcanza con 1,4-dioxano (Figura 3), por lo cual se puede concluir que el pigmento es de naturaleza polar debido a su afinidad con la N,N-dimetilformamida. Por otra parte, la cantidad de pigmento que se extrajo de los fragmentos de papel vegetal no era detectable por los equipos utilizados en espectroscopía, razón por la cual se decidió inducir la producción de los pigmentos en medios de cultivo líquidos. (Figura 3). Determinación de las condiciones óptimas y medio de cultivo para la obtención de los pigmentos en cultivos líquidos En los cultivos de los tres morfotipos de hongos inoculados en caldo Czapeck e incubados durante 15 días a 25ºC, en ausencia de luz y sin agitación se observó un crecimiento muy lento de los morfotipos Chaetomium Morfotipo 1 y Stachybotrys Morfotipo 1 sin producción aparente de pigmento y para el cultivo de Penicillium Morfotipo 2 se observó crecimiento lento y producción de una mínima cantidad del pigmento amarillo. Simultáneamente, se variaron las condiciones de incubación de caldo Czapeck , y se encontró que en un tiempo de incubación de 7 días a temperatura ambiente, en presencia de luz y con agitación a 150rpm(Figura 4), los aislamientos de Chaetomium Morfotipo 1 y Stachybotrys Morfotipo 1 no presentan cambios con respecto al ensayo mencionado anteriormente, incluso después de una semana más de incubación. Por otra parte, en el cultivo de Penicillium Morfotipo 2 se observó crecimiento acompañado de una gran producción de pigmento amarillo fluorescente. En los cultivos de los hongos filamentosos Chaetomium Morfotipo 1 y Stachybotrys Morfotipo 1 inocu-

lados en caldo Sabouraud – Glucosa 2% e incubados durante 15 días a Temperatura ambiente, en presencia de luz y con agitación 150rpm(Figura 4) el color del medio no fue modificado aparentemente por la producción de pigmentos, aunque se apreció la formación de la estructura micelar. Por otra parte, para el género Penicillium Morfotipo 2 incubado a las mismas condiciones se observó una gran producción de micelio, sin presencia evidente del pigmento. En caldo Carboximetilcelulosa 1%, bajo las mismas condiciones del cultivo en Sabouraud – Glucosa 2% (Figura 4) no se observó crecimiento ni producción de pigmentos para los morfotipos fúngicos evaluados. Los microorganismos Chaetomium Morfotipo 1 y Stachybotrys Morfotipo 1, no crecieron de forma óptima en ninguno de los medios de cultivo estudiados posiblemente por a las altas exigencias de nutrientes requeridas por estas dos especies. Según reportes previos realizados por Andersen y Nissen (16), estos hongos crecen en medios con actividades de agua superiores a 0.9 y necesitan altos contenidos de celulosa debido a su fuerte actividad celulolítica, sin embargo, estas no son las únicas condiciones, pues algunas especies necesitan de un medio específico que contenga vitaminas y otros compuestos adiciónales para su óptimo desarrollo (16, 17, 18). A partir de estos ensayos se concluyó que el caldo Czapeck a temperatura ambiente, en presencia de luz y con agitación a 150rpm por siete días, presentó las mejores condiciones para el crecimiento y producción del pigmento de Penicillium Morfotipo 2. Este resultado coincide con lo obtenido por otros investigadores, que reportan como medio de cultivo óptimo el Czapeck (17) (15) (Figura 4). Caracterización del pigmento obtenido en medio líquido El espectro de masas del aceite amarillo aislado mostró la presencia de dos iones en m/z 284 y m/z 270, indicando la presencia de al menos dos componentes. La mezcla se analizó por CGAR-EM, usando una columna DB-1, sin que se pudieran separar, por lo anterior fue necesario hacer el análisis del espectro de la mezcla en el que se reconoció un compuesto mayoritario (1) y un compuesto (2) como el minoritario.

35 Compuesto 1. El espectro de masas del pigmento mostró un ión molecular en m/z 284, correspondiente a una fórmula C16H12O5 indicando 11 grados de instauración. Además, se observaron fragmentos en m/z 255 que corresponde a la pérdida de CHO a partir del ion molecular [M-CHO]+ que indica la presencia de un carbonilo en la molécula, en m/z 241 correspondiente a la pérdida de CH3 y CO a partir del ion molecular [M-CO-CH3]+ que indica la presencia de un metilo y un carbonilo, y en m/z 213 correspondiente a la pérdida de C2H2O a partir del fragmento m/z 255 [M-CHO-C2H2O]+ esto indica la presencia de un metoxilo aromático (Figura 5). Todo este análisis indica que el compuesto es de tipo fenólico con grupo metóxido sustituyente. Una búsqueda en la base de datos Wiley indicó que este compuesto podría ser “parietin” (1,8-dihidroxi6-metil-3-metoxiantraquinona). En el espectro de RMN 1H se observa la presencia de una señal en 2,16 (singlete), atribuible a un metilo sobre anillo aromático, un singlete en 3.48, correspondiente a los protones de un metoxilo, y una serie de señales entre 7.16 y 7.76 atribuibles a los protones de antraquinona. Estos resultados coinciden con reportes previos para la molécula “parietin”, no obstante, la baja calidad del espectro de RMN 1H, por la presencia de impurezas, no permitió identificar inequívocamente al compuesto antes propuesto (Figura 5). Compuesto 2. El espectro de masas del pigmento mostró un ión molecular en m/z 270 consistente con una fórmula C15H10O5 con 11 grados de insaturación. Adicionalmente, se observaron fragmentos en m/z 242 por la pérdida de CO a partir del ion molecular [M-CO]+ que indica la presencia de un carbonilo en la molécula, en m/z 241 correspondiente a la pérdida de CHO a partir del ion molecular [M-CHO]+ esto también indica la presencia de un carbonilo en la molécula, y en m/z 213 correspondiente a la pérdida de CO a partir del fragmento m/z 241 [M-CHO-CO]+ ó de la perdida de CHO a partir del fragmento m/z 242 [M-CO-CHO]+ esto indica la presencia de dos carbonilos (Figura 6). Este análisis muestra que el compuesto es también de tipo fenólico. Una búsqueda en la base de datos Wiley indicó que este compuesto podría ser “emodin” (1,3,8-trihidroxi-6-metilantraquinona). En el espectro de RMN1H se observa la presencia de una

señal en 2,16 (singlete), atribuible a un metilo sobre anillo aromático y una serie de señales entre 7.16 y 7.76 atribuibles a los protones de la antraquinona presentes en los carbonos 2, 4, 5 y 7. Estos resultados coinciden con reportes previos para la molécula “emodin”, sin embargo, no fue posible identificar contundentemente el compuesto propuesto, debido a la calidad del espectro de RMN 1H, por la presencia de impurezas (Figura 6). Con este análisis, así como la comparación con la base de datos Wiley fue posible aproximarse a la identificación de los componentes principales del pigmento amarillo fluorescente producido por Penicillium Morfotipo 2, microorganismo deteriorante del patrimonio documental (“parietin” y “emodin”). El cromatograma obtenido por CGAR-EM, no mostró evidencia de la existencia del pigmento, aunque se obtuvieron señales correspondientes a impurezas presentes en la fracción inyectada. Atribuimos que la ausencia de señales correspondientes al pigmento se deben a que la técnica de separación no es la indicada para esta clase de compuestos, que por su alto peso y alta polaridad son determinados comúnmente por CLAE (Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia) (19, 20, 21, 22).

36

Conclusiones En el presente trabajo se logró la producción del pigmento amarillo fluorescente de Penicillium Morfotipo 2, (indicador característico en material documental con biodeterioro), sobre fragmentos de papel vegetal obtenidos de los fondos documentales del Archivo de Bogotá y en cultivos líquidos. Está investigación es el primer estudio en el país de caracterización preliminar de pigmentos biodeteriorantes y es de gran importancia en la disciplina de la restauración y conservación de material documental, pues se logró la extracción de los pigmentos producidos sobre papel utilizando N,N-dimetilformamida; lo anterior permite una alternativa de tratamiento para papel afectado por esta patología. Con respecto a la producción de pigmentos en los cultivos líquidos, se encontró que en caldo Czapeck incubado durante siete días a temperatura ambiente, en presencia de luz y con agitación a 150rpm, Penicillium Morfotipo 2 creció y produjo cantidad significativa de pigmento, mientras que los otros dos morfotipos de hongos no crecieron ni produjeron pigmentos. Finalmente, el análisis espectroscópico del extracto purificado, permite sugerir la existencia de una mezcla de dos derivados de antraquinona (“parietin” y “emodin”) como componentes principales del pigmento producido por Penicillium Morfotipo 2. El componente parietin se ha referenciado con actividad anti fúngica para el moho de la cebada y el pepino y hace parte de ciertos líquenes, ofreciendo protección contra los rayos ultravioletas al alga simbionte. Para el caso del emodin, es ya conocida su acción en la terapia anti cáncer. Lo anterior determina perspectivas de investigación en este campo para el uso de los pigmentos fúngicos en farmacología.

AGRADECIMIENTOS Los autores desean expresar sus agradecimientos al grupo de investigación Estudio y Aprovechamiento de Productos Naturales Marinos y Frutas de Colombia, en especial al profesor Leonardo Castellanos por su valioso aporte y asesoría durante el desarrollo de la investigación.

37

Figura 1. Producción de pigmentos sobre papel vegetal en Agar PDA incubados a 28ºC durante 7 días. De izquierda a derecha: Penicillium Morfotipo 2, Chaetomium Morfotipo 1 y Stachybotrys Morfotipo 1.

Figura 2. Anverso de la caja de Petri de Penicillium Morfotipo 2 cultivado para la producción de pigmento sobre papel vegetal en Agar PDA

Figura 3. Extracción de los pigmentos producidos sobre papel vegetal con 1,4-dioxano y N,N-dimetilformamida (DFM).

38

Figura 4. Cultivos líquidos evaluados para la producción de pigmentos de hongos filamentosos deteriorantes: Czapeck, Sabouraud y Carboximetilcelulosa 1%(CMC).

Figura 5. Propuesta de fragmentación del primer compuesto bajo EM de impacto electrónico.

Figura 6. Propuesta de fragmentación del segundo compuesto bajo EM de impacto electrónico.