ORGANICA CHELEX PAPEL FTA OTRAS Extracciones basadas en estuches QIAamp, GeneClean, etc.
Pueden depender en Protocolos de LAB Tipo de muestra
Preparación de Muestra Extracción de ADN Orgánica Extracción por Chelex Extracción de ADN utilizando papel FTA Estuches QIAamp para separar ADN Equipo basados en robótica pueden requerir otros métodos
EXTRACCION ORGANICA DE ADN PHENOL / CHLOROFORM / ISOAMYL ALCOHOL (PCI) PRODUCE ADN DE ALTO PESO MOLECULAR CONSUME MUCHO TIEMPO QUIMICOS PELIGROSOS MULTIPLES TRANSFENCIAS (posibles errores)
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EXTRACCION ORGANICA DE ADN COLOCAR MUESTRA EN EL TUBO AÑADA SDS (detergente) Y PROTEINASE K ROMPE LAS CELULAS (SDS) ROMPE LAS PROTEINAS (Proteinase K)
AÑADA FCI => Fenol “ disuelve” proteínas y lípidos Particiona macromoléculas basedo en propiedades hidrofóbicas e hidrofílicas Cloroformo aumenta la densidad de fase del fenol Alcohol Isoamyl disminuye la espuma
ADN MAS SOLUBLE => EN FASE ACUOSA
RECUPERACION DE ADN Hay que ‘limpiar’; diferentes maneras de hacer esto
EXTRACCION POR CHELEX 1991 Laboratorios Bio-Rad RESINA QUELANTE REMUEVE MAGNESIO (INACTIVA NUCLEASAS DE ADN) ENLAZA LOS DESPERDICIOS DE LA CELULA UTILIZE SOLO CON PCR (cadena sencilla)
EXTRACCION POR CHELEX AÑADA MUESTRA AL TUBO AÑADA AGUA Y SOLUCION AL 5% DE CHELEX 100°C PARA ROMPER CELULAS DESTRUIR PROTEINAS
ADN ES DENATURADO A CADENAS SENCILLAS UTILIZE SOBRENADANTE DIRECTAMENTE EN PCR
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EXTRACCION CON PAPEL FTA™ PAPEL ALMACENAJE A BASE DE CELULOSA CONTIENE QUIMICOS PREVIENE ACTIVIDAD DE NUCLEASA E INHIBE CRECIMIENTO BACTERIANO
ESTABLE A TEMP AMBIENTE POR AÑOS UTILIZE PARA MUESTRAS DE SANGRE O SALIVA DE VICTIMAS O SOSPECHOSOS
Tecnología FTA® Rompe células y membranas de organelos -Físicamente Atrapa Acidos Nucleicos (ADN & ARN)
Preserva y Proteje Acidos Nucleicos -Previene Daño por radicales libres/UV -Previene Daño Enzimático -Inhibe crecimiento de hongos y bacterias
Provee Seguridad al Usuario -Inactiva Potenciales Viruses Peligrosos
Preparación de ADN Rápida y Eficiente
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FTA: Forma de Archivo Costo Efectiva Convencional
versus
FTA
240 Tarjetas = 240 muestras Temp de almacenaje = Temp ambiente 240 Tubos = 240 muestras* Temp de almacenaje= -200C 10 Platos = 240 muestras Temp de almacenaje = -200C
Costo $75/gabinete de archivo
Costo $2,000/congelador/año
Archivado a Temperatura Ambiente Perfil de STR de sangre archivada en 1989 y analizada en 2003
100
120
140 6 Blue
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
Blood-B-Pro 4000 3000 2000 1000
6 Green Blood-B-Pro 1500 1000 500
• Muestras archivadas en ambientes diferentes, selladas en sobre de aluminio
6 Yellow Blood-B-Pro 2000 1500 1000 500
• Proceso normal de colección de muestra 6 Red
Blood-B-Pro
• 10 µL de reacciones de Profiler™ añadido a muestras, 24 ciclos
600 400 200
EXTRACCIÓN DE PAPEL FTA™ Sangre o saliva seca en papel FTA Células se ROMPEN al contacto UTILIZE “rotera” para añadir MUESTRA al TUBO LAVE para remover HEME y otros inhibidores de PCR Añada “roto” DIRECTAMENTE a reacción de PCR
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EXTRACCIÓN DE PAPEL FTA™ CUANTIFICACIÓN NO es necesaria Cantidad de muestra consistente Resultados consistentes
CUANTIFICACIÓN DE ADN ESENCIALES PARA ANÁLISIS POR PCR MUY POCO ADN CAUSA TOO DECAIMIENTO DE ALELOS O FLUCTUACIONES ESTOCÁSTICAS DEMASIADO ADN CAUSA DATA FUERA DE ESCALA
MÉTODOS INICIALES NO MUY SENSITIVOS O ESPECÍFICOS ABSORBENCIA A 260 nm TINCIÓN CON BROMURO DE ETIDIO Cuantificación comparada a marcador estándar
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Cuantificación por "Slot Blot" Procedimiento Común Específico para primates Ha sido modificado para utilizar quimioluminiscencia en vez de radioactivida Puede detectar cantidades menores que nanogramos Puede detectar ADN de cadena doble y cadena sencilla
CUANTIFICACIÓN DE ADN CUANTIFICACIÓN POR "SLOT BLOT" ESPECÍFICO PARA ADN HUMANO O DE PRIMATE D17Z1 RADIOACTIVO COLORIMÉTRICO QUIMIOLUMINISCENTE
CUANTIFICACIÓN DE ADN CAPTURAR ADN GENÓMICO EN MEMBRANA DE NILÓN AÑADIR PRUEBA D17Z1 INTENSIDAD DE LA MUESTRA COMPARADA A ESTÁNDARES SENSITIVA A ~ 150 pg DE ADN o 50 copias de ADN genómico
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Ventajas
Slot Blot Desventajas
Puede ser sensitivo Reemplaza radioactividad Puede detectar cadenas sencillas y ADN parcialmente degradado. Cantidad dada es sólo de ADN humano
Estándares de Calibración 20 ng 10 ng 5 ng 2.5 ng 1.25 ng 0.63 ng
Consume tiempo Labor intensiva
Muestras Desconocidas
~2.5 ng
Estándares de Calibración 0.63 ng 1.25 ng 2.5 ng 5 ng 10 ng 20 ng
Fluorometría *Utilizar un fluorocrome como Hoechst 33258 o PicoGreen -- aumento en emisión a 458 nm cuando enlazado a ADN de doble cadena *Tiene poca afinidad para ADN de cadena sencilla o ARN --se enlaza al surco menor, rico en A-T *Muestra es comparada a curva estándar de ADN cuya concentración es conocida --utilize estándar con composición similar para lecturas más precisas
Cuantificación de ADN por espectrofotometría Concentración de ADN puede ser determinada midiendo la absorbancia a 260 nm (A260) en un espectrofotómetro utilizando una cubeta de cuarzo Medidas tomadas a una A260 deben leer entre 0.1 y 1.0. Una absorbancia de 1 unidad a 260 nm corresponde a 50 µg de ADN por ml
A260 = 1 50 µg/ml
Pureza de ADN: Proporción A260/A280 *Proporción indica pureza/presencia de contaminantes que pueden absorber luz UV (proteínas, etc.) *ADN puro tiene una proporción de 1.7-2.0 --en buffer ligeramente alcalino, pH 7.5
*Fenol absorbe a 270-275 nm (similar a ADN) --imita alta pureza y producción --aumenta el valor A260