REVISIÓN

Fisiopatología de la isquemia cerebral focal: aspectos básicos y proyección a la clínica C. Arango-Davila a, M. Escobar-Betancourt a, G.P. Cardona-Gómez b, H. Pimienta-Jiménez a PATHOPHYSIOLOGY OF FOCAL CEREBRAL ISCHEMIA: FUNDAMENTAL ASPECTS AND ITS PROJECTION ON CLINICAL PRACTICE Summary. Aim. To review the basic aspects of focal cerebral ischemia as a fundamental element in clinical practice and of neuroprotective strategies. Development. Ischemia triggers several different responses in nerve tissue which, according to the degree of energetic limitation, can be adaptive or lead to cell death due to necrosis or apoptosis. Establishing these processes is a complex task and the mechanisms involved have still not been fully explained; this is made more difficult by the fact that many of them are simultaneous and also because of the implications they may have, not only in cell death but also in the adaptation of the neurons that suffered ischemic stress and survived. We outline the foundations for understanding the physiopathological phenomena at work in ischemia: neuronal stress and death, and the reaction of the macroglial and microglial cells. This is also illustrated by original images from research into cell response to ischemia at a pre-clinical level in an experimental model of focal cerebral ischemia in rats, evaluated using, for example, hematoxylin-eosin and immunohistochemical techniques for several cell markers. Conclusions. Cell death in ischemia is a complex phenomenon that can have two different outcomes: necrotic death or apoptotic death. Basic knowledge of the pathophysiology of ischemia and of the response of microglial and macroglial cells is the foundation for elaborating neuroprotective-type strategies, which must not only be oriented towards preventing acute cell death, but also later modes of cell death or strengthening the surviving tissue. [REV NEUROL 2004; 39: 156-65] Key words. Apoptosis. Cerebral ischemia. Necrosis. Neuroprotection. Physiopathology.

INTRODUCCIÓN Las lesiones vasculares cerebrales son la primera causa de incapacidad permanente en los países industrializados y, por esta razón, originan altos costos sociales y financieros; además, es la tercera causa de muerte en el mundo [1]. Los procesos fisiopatológicos de la isquemia cerebral son el resultado de la secuencia de fenómenos celulares y moleculares a corto y largo plazo que confluyen en dos modalidades de muerte: la primera, relacionada directamente con el déficit energético, o muerte necrótica, y la segunda, que requiere de un adecuado suministro energético de la neurona y corresponde a la muerte celular programada o apoptosis. La comprensión de estos mecanismos es cada vez más amplia, y es el fundamento para el uso de estrategias neuroprotectoras de aplicación en la clínica. La presente revisión está dirigida a presentar las bases para la comprensión de los fenómenos fisiopatológicos en la isquemia: el sufrimiento y la muerte neuronal y la reacción de la macroglía y de la microglía. Se ilustra con imágenes originales la respuesta celular ante la isquemia a nivel preclínico en un modelo experimental de isquemia cerebral evaluado con técnicas como hematoxilina eosina y técnicas inmunohistoquímicas. FISIOPATOLOGÍA DE LA ISQUEMIA CEREBRAL FOCAL La obstrucción aguda de una de las mayores arterias cerebrales, como la arteria cerebral media (ACM), produce una inmediata Recibido: 12.01.04. Aceptado tras revisión externa sin modificaciones: 11.05.04. a

Centro de Estudios Cerebrales. Facultad de Salud. Universidad del Valle. Cali. b Grupo de Neurociencias. Escuela de Medicina. Universidad de Antioquia. Medellín, Colombia. Correspondencia: Dr. Hernán Pimienta. Universidad del Valle. Facultad de Salud. Calle 4B, n.º 36-00, San Fernando. Santiago de Cali, Colombia. Fax: 5 725 570 775. E-mail: [email protected].  2004, REVISTA DE NEUROLOGÍA

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reducción del flujo cerebral en el área de irrigación correspondiente (isquemia focal). La reducción del flujo sanguíneo no es homogénea en el sector afectado, y puede cambiar en minutos u horas, especialmente cuando se instaura la reperfusión [2]. La isquemia se torna grave en el denominado foco isquémico, mientras que en la periferia de éste se establece un anillo denominado área de penumbra, en el cual la disminución del flujo es menos grave, gracias a los aportes sanguíneos de las colaterales arteriales del tejido adyacente no isquémico [3]. El impacto de la isquemia cerebral depende de la gravedad y la duración de la reducción del flujo sanguíneo. Una isquemia poco grave pero prolongada produce cambios equivalentes a una isquemia corta y grave; sin embargo, se ha determinado que algunos fenómenos moleculares, como la inhibición de la síntesis proteica, son los mismos sin importar la duración de la isquemia [4]. Cuando la obstrucción arterial cesa, se desencadena una fase de incremento del flujo sanguíneo en el territorio isquémico que se ha denominado hiperemia postisquémica, ocasionada por la liberación de metabolitos vasoactivos, la disminución de la viscosidad sanguínea y el desencadenamiento de mecanismos vasodilatadores neurogénicos [5]. Esta hiperemia postisquémica va seguida de un periodo mas prolongado de hipoperfusión postisquémica dada por la obstrucción microvascular y la vasoparálisis (6]. La reperfusión postisquémica no se logra completamente; generalmente, quedan parches de tejido en los que no se vuelve a restablecer el flujo sanguíneo, lo que se ha denominado fenómeno de falta de reflujo y que es más destacado cuanto más prolongada sea la isquemia. Este fenómeno de falta de reflujo se corresponde con los sitios de necrosis tisular y es consecuencia de la confluencia de varios factores, como el incremento de la viscosidad sanguínea, la coagulación intravascular, la obstrucción microvascular por edema de podocitos, el edema endotelial y la obstrucción venosa [5,7]. Los infartos cerebrales se definen como áreas de necrosis que se desarrollan en sitios en los que se ha producido una is-

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quemia grave. Su morfología es variada y puede consistir en infartos isquémicos o hemorrágicos. El infarto hemorrágico es consecuencia de la reperfusión postisquémica y puede ocasionarlo la reapertura de la luz arterial, la obstrucción parcial de la arteria o el suministro de sangre proveniente de otros vasos que irrigan el tejido necrótico. La isquemia grave se asocia con áreas de infarto completo con necrosis tisular, edema e inflamación; con el transcurso de las horas, el tejido se licua y se generan soluciones de continuidad. A este fenómeno se le denomina necrosis colicuativa (Fig. 1a, a’). FISIOPATOLOGÍA MOLECULAR DE LA ISQUEMIA La isquemia cerebral desencadena una secuencia de fenómenos moleculares a corto y largo plazo que se inician con el fracaso energético relacionado con la interrupción de los procesos de fosforilación oxidativa y el déficit en la producción de trifosfato de adenosina –ATP– (Fig. 2). La interrupción de los gradiantes iónicos transmembranales debido a fallos en la bomba de sodiopotasio ATPasa y otras bombas iónicas dependientes de energía son el punto fundamental relacionado con los mecanismos fisiopatológicos de la isquemia y, especialmente, de la muerte celular en el foco isquémico cuando la obstrucción vascular se prolonga durante unos minutos [8]. Las neuronas y las células gliales se despolarizan exageradamente por la entrada de sodio, cloro, calcio y agua al citoplasma [9]; además, sale potasio, lo que produce un incremento inusitado de potasio extracelular [10]. El fracaso energético y los cambios iónicos asociados ocasionan un incremento de glutamato, una hiperexcitación de los receptores glutamatérgicos de N-metil-D-aspartato (NMDA) ionotróficos y metabotróficos, y de los receptores del ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA), lo que confluye en un incremento aun mayor de la concentración de calcio intracelular (Fig. 2) [6,11,12]. Este incremento de calcio intracelular no depende exclusivamente de la activación de receptores de glutamato, sino de la estimulación de canales de calcio dependientes de voltaje [13]. La hiperexcitación ocasiona el fenómeno de despolarización perinfarto, la cual incrementa el gasto energético, especialmente cuando la membrana intenta repolarizarse [3,14,15]. El incremento de calcio, junto con la acidosis y la despolarización perinfarto, contribuyen a la iniciación del daño; más tarde, la inflamación y la activación de fenómenos apoptóticos contribuyen a incrementar la lesión [6,16]. Durante la isquemia y, especialmente, durante la reperfusión se generan radicales libres, entre los que se incluye el monóxido de nitrógeno (NO). Estas moléculas altamente reactivas se producen en los estados iniciales y tardíos de la isquemia cerebral mediante mecanismos fisiopatológicos diferentes: en primer lugar, se producen especies reactivas de oxígeno por el metabolismo del ácido araquidónico y la NO sintasa neuronal (nNOS); en estados intermedios, los radicales libres de oxígeno son el aporte correspondiente a la infiltración de neutrófilos en el área isquémica, y en estados más tardíos interviene la síntesis y activación de las enzimas NO sintasa inducible (iNOS) y la cicloxigenasa-2 (COX-2) [17,18]. La isquemia cerebral desencadena una serie compleja de sucesos moleculares, entre los cuales se encuentra la activación y expresión de genes. Algunos de estos fenómenos parten de la reacción inmediata de la neurona al daño [19], otros se asocian a procesos celulares que determinan el destino próximo de la

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neurona afectada [20] y otros coordinan los mecanismos de reparación de la neurona y los tejidos [21,22]. Entre los fenómenos de transcripción genética reconocidos durante el proceso isquémico se encuentran la activación de genes de expresión rápida (IEG) [19], la inducción de genes de proteínas de choque térmico (HSP) [20], la activación de genes relacionados con citocinas proinflamatorias y moléculas de adhesión celular [23], la inducción de genes de las enzimas iNOS y COX-2 [17], la inducción de genes de productos relacionados con la muerte celular programada [24] y la inducción de genes relacionados con factores de crecimiento [21,22]. Muchos otros procesos tienen una repercusión en el daño final al tejido por la isquemia. Entre éstos se encuentran la liberación de citocinas [25,26], la activación de proteasas de serina [27], la diferente vulnerabilidad a la isquemia de algunos grupos neuronales (por ejemplo, el sector CA1 del hipocampo, las láminas III y V de la corteza y el estriado son más sensibles a la isquemia) [28,29] y los fenómenos de tolerancia isquémica desencadenados por episodios previos de isquemia (precondicionamiento) [30]. MUERTE CELULAR EN LA ISQUEMIA CEREBRAL La muerte celular en la isquemia puede suceder de dos maneras. La más común, descrita en los tratados clásicos, es la muerte necrótica, también denominada oncosis o necrofanerosis (Fig. 1a, a’) [31,32]. Resulta del fracaso energético agudo, con pérdida de la morfología celular y, finalmente, lisis con desencadenamiento de procesos inflamatorios [33,34]. Por otro lado, puede observarse la muerte apoptótica o muerte celular programada, en la cual se activan mecanismos intracelulares dependientes de energía que llevan a una degradación regulada de la célula, que, más tarde, es eliminada por células fagocíticas sin desencadenar reacción inflamatoria [16,35,36]. En la isquemia cerebral aguda se dan los dos tipos de muerte celular, pero en la fase aguda hay confusiones, debido a que el proceso necrótico puede ocasionar también la activación de enzimas proteolíticas características de la vía apoptótica. Cada vez contamos con más evidencias del desencadenamiento de mecanismos apoptóticos de aparición subaguda y otros más tardíos que permiten explicar la muerte celular días o meses después de la lesión (Figura 1b, b’) [37,38,39,40,41]. La liberación del citocromo c de la mitocondria como respuesta a la despolarización isquémica y la acumulación de calcio intramitocondrial hace posible la formación del complejo citocromo c-proteína proapoptótica BAD-APAF (factor asociado a la apoptosis). Este complejo es capaz de activar las caspasas y otras proteasas de cisteína encargadas de la fase efectora de la apoptosis, responsables directas de la muerte neuronal por su capacidad de digerir proteínas vitales para la célula, como proteínas de reparación del ácido desoxirribonucleico (ADN), proteínas reguladoras de la apoptosis y proteínas estructurales del citoesqueleto [16,35,36]. Tras la isquemia cerebral focal experimental se ha encontrado inducción de genes y factores proapoptóticos, como los factores de necrosis tumoral (Fas y Apo-2L) [42], el receptor de muerte TR3 [43], el factor nuclear-κB [44] y el gen ligado a la apoptosis 2 (ALG2, del inglés apoptosis-linked gene 2) [45]; además, se detecta la expresión de factores antiapoptóticos, como la proteína Bcl-ω [46], el factor de crecimiento tumoral β1 (TGF-β1, del inglés tumor growth factor) [47], el factor α de transformación y crecimiento (TGF α, del inglés transforming growth fac-

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Figura 2. Secuencia de los principales eventos fisiopatológicos como consecuencia de un infarto cerebral. Obsérvese que el incremento intracelular de calcio está implicado tanto en los fenómenos de muerte neuronal necrótica como en los fenómenos de muerte celular programada o apoptosis.

sugerimos el inhibidor de la PKC Ro320432 como un agente de interés terapéutico [55].

Figura 1. a) Lesión cerebral focal experimental en el territorio de la arteria cerebral media en ratas y su aspecto anatomopatológico tras tinción con hematoxilina-eosina. a’) Después de 72 horas de la lesión. Obsérvense la cavitación por lisis tisular, los núcleos picnóticos y la cariolisis. b) Inmunohistoquímica para la proteína efectora de la apoptosis caspasa 3. b’) Se observan neuronas piramidales inmunoreactivas a la caspasa 3, evidencia del desencadenamiento de mecanismos relacionados con la apoptosis. c) Disminución de la inmunorreactividad a la MAP2. c’) Fragmentación de microtúbulos en el área adyacente al infarto cerebral. Obsérvese la poca inmunorreactividad del cuerpo celular, la amputación dendrítica y la fragmentación de microtúbulos. 40×. Laboratorio de Isquemia Cerebral Experimental, Centro de Estudios Cerebrales, Universidad del Valle. Cali, Colombia, 2003.

tor α) [48], la eritropoyetina [49] y el factor de crecimiento asociado a la insulina I (IGF-1, del inglés insulina-like growth factor I) [50,51]. La capacidad de una neurona de expresar uno u otro de estos factores está relacionada con su vulnerabilidad específica a la isquemia y a la muerte necrótica o apoptótica. Se ha descrito que en circunstancias de isquemia cerebral, el exceso de glutamato disminuye el efecto neuroprotector del IGF-I [52,53]. El glutamato ocasiona una disminución de la sensibilidad del receptor neurotrófico para el IGF-I debido a la fosforilación de este receptor a través de una compleja vía bioquímica que culmina con la activación secuencial de la proteincinasa A (PKA) y la proteincinasa C (PKC) [54]. Asimismo, según nuestros últimos resultados [55], mediante un modelo experimental de isquemia cerebral en ratas, se logró una disminución significativa del total del infarto (50%) mediante la administración de un inhibidor selectivo de la PKC, el Ro320432. Teniendo en cuenta el efecto neurotrófico del IGF-I [56], se plantea que la interrupción de las señales intracelulares del IGF-I por causa del exceso de glutamato puede constituir una ruta que contribuye a la lesión excitotóxica. Por ello,

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RESPUESTA DE LA NEURONA ANTE LA ISQUEMIA: ÉNFASIS EN EL CITOESQUELETO En el cerebro adulto ocurren, permanentemente, cambios adaptativos en la estructura y la función de las neuronas. Estos cambios, que corresponden a la denominada plasticidad cerebral, están implicados en procesos como el aprendizaje y la memoria y, además, desempeñan un importante papel en la recuperación del sistema nervioso ante diferentes tipos de lesión [57,58]. El citoesqueleto de la neurona es uno de los principales elementos relacionados con su morfología y su plasticidad. Está constituido por microfilamentos (7 nm), filamentos intermedios (10 nm) y microtúbulos (24 nm). Estas estructuras son fundamentales, tanto en la morfogénesis como en el mantenimiento de la estructura de la neurona, y cumplen, además, funciones de transporte de macromoléculas y orgánulos a través del soma y las prolongaciones neuronales. Los microtúbulos están constituidos por unidades de α y β tubulina ensambladas de forma intercalada de tal manera que forman un largo y flexible cilindro de 24 nm de diámetro, el cual tiene su origen en el centro de organización microtubular (COM) cerca del núcleo neuronal y se dirige a la periferia del soma o a las dendritas. Los microtúbulos tienen un polo estable (–) en el COM y un polo dinámico (+) en la periferia de la neurona, especialmente en las dendritas. Este polo dinámico se debate permanentemente entre el ensamblaje y el desensamblaje, fenómeno que puede repercutir en la arquitectura de la neurona. Una larga serie de proteínas de la familia MAP2/τ, denominadas proteínas asociadas a microtúbulos 2 (MAP2) son en gran parte responsables de la polimerización, estabilidad y organización de las unidades de tubulina α y β que constituyen los microtúbulos [59,60]. El ensamblaje de los microtúbulos consta de una fase de nucleación y una fase de elongación:

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(extracelular signal regulated kinases) y la GSK3 (glicogen synthase kinase 3), que fosforilan residuos de los sectores RII y PRD, pueden cambiar las características espaciales de la molécula de MAP2 y modificar su susceptibilidad a las enzimas o su relación con otras proteínas, además de disminuir la capacidad de fomentar el ensamblaje de los microtúbulos (Fig. 3). En general, se considera que la fosforilación de diferentes sitios de la MAP2 puede modificar diferentes aspectos del ensamblaje de los microtúbulos; C A M B I O S C O N F O R M AC I O N A L E S INTERACCIÓN CON TUBULINA es decir, ciertos residuos fosforilados po– Incrementa la carga negativa – Disminuye la unión de la MAP2 a la tubulina drían fomentar la nucleación, mientras – Disminuye la interacción – Cambia la susceptibilidad a las enzimas que otros residuos facilitarían la elonelectrostática con tubulina – Altera la localización subcelular – Disminuye la unión con tubulina – Modifica la interacción con otras proteínas gación [71]. Así como la estabilidad de los microtúbulos del citoesqueleto se encuentra Figura 3. Aspectos moleculares de la proteína MAP2 y los cambios más comunes ocasionados por efecto de las proteincinasas (ver texto). RII: subunidad reguladora II; CD: dominio central; PRD: comprometida por el efecto de las proteindominio rico en prolina; BD: dominio de unión a tubulina; PKC: Ca2+/Phospholipid-dependent pro- cinasas sobre las proteínas de la familia tein kinase; PKA: cAMP-dependent protein kinase; CAMKII: Ca2+/calmodulin-dependent protein MAP2/τ, las fosfatasas producen un efeckinase II; ERK: extracelular signal regulated kinases; GSK3: glicogen synthase kinase. to opuesto de desfosforilación y, por tanto, fomentan la estabilidad de los microtúdurante la nucleación, la MAP2 fomenta la formación de díme- bulos [72,73]. Las fosfatasas, como la PP1, la PP2A, la PP2B ros de tubulina, y durante la elongación, facilita el ensamblaje (calcineurina) y la PP2C se encuentran en alta concentración en de los dímeros. el cerebro y con una importante relación con el citoesqueleto de Las MAP2 presentan una secuencia de 32 aminoácidos en la neurona y con la MAP2 [74,75,76]. Se sabe que la calcineuel extremo amino terminal que corresponde a un sector regula- rina es abundante en las espinas dendríticas y las densidades dor (RII) [61]; además, en el extremo carboxilo terminal se postsinápticas y tiene la capacidad de desfosforilar indistintaobservan tres o cuatro secuencias repetidas de 18 aminoáci- mente las secuencias fosforiladas en la MAP2 por la PKA y la dos, separadas por secuencias de 13 a 14 aminoácidos, que co- CAMKII [77,78]. rresponden a los dominios de unión a la tubulina (TBD) [62]. La fosforilación y la desfosforilación son las principales Justo antes de los TBD se encuentra un dominio rico en proli- maneras en las que las MAP2/τ responden a las señales extracena (PRD) que también ejerce una función reguladora de la lulares [72,73,79]. La dinámica funcional de la MAP2 está MAP2 (Figura 3) [63]. determinada en gran parte por los puntos de fosforilación de la Las MAP2 interactúan con la región carboxilo terminal de molécula, y no tanto por la cantidad de fosfato ligado (Fig. 3). la tubulina a través del TBD; esta asociación produce estabili- Un exceso de fosforilación o un exceso de desfosforilación disdad de la relación de las unidades de tubulina entre sí y dismi- minuye la unión de la MAP2 a los microtúbulos [80]. nuye la flexibilidad del microtúbulo [64]. Los cambios en el La alteración del equilibrio entre cinasas y fosfatasas podría PRD modifican la unión de la MAP2 con los microtúbulos y guardar relación con el cambio en el estado de fosforilación del fomentan su estabilización [65,66]. Las MAP2 establecen unio- citoesqueleto y las consecuentes manifestaciones patológicas nes con la actina a través del TBD, y esta relación puede modi- [81]. Se considera que cambios transitorios en el estado de fosficar la estabilidad de los microtúbulos [67]. También pueden forilación de las MAP2/τ podrían inducir modificaciones en la establecer uniones con otros neurofilamentos a través de un reorganización de la terminal postsináptica sin cambios evidendominio de unión a neurofilamentos que parece ser diferente al tes en la morfología de la neurona, y que variaciones prolongadas TBD [68,69,70]. en la fosforilación podrían generar modificaciones grandes del La MAP2 presenta una alta proporción de sitios suscepti- citoesqueleto y desencadenar cambios morfológicos claros [71]. bles de unirse al fosfato (46 moles de fosfato por mol de proteíLos cambios en el ensamblaje de los microtúbulos y en la na), ya que es el sustrato de muchos tipos de proteincinasas inmunorreactividad de las MAP2/τ se han convertido en un (Fig. 3). Esto la hace muy sensible a diferentes vías de transduc- importante y sensible indicador de respuesta neuronal al daño ción de señales intracelulares. En general, el efecto que tienen isquémico [45,82,83,84,85,86]. Esta sensibilidad viene dada las proteincinasas al fosforilar la MAP2 consiste en una dismi- principalmente por los cambios dendríticos, por lo que constitunución de su capacidad de interacción con la tubulina; por tan- ye un método de abordaje de la plasticidad cerebral estructural to, fomentan el desensamblaje de los microtúbulos. Las protein- [45,85]. Durante las primeras horas tras la isquemia se observa cinasas más relacionadas con este fenómenos son la PKC (Ca2+/ una disminución de la inmunorreactividad de la MAP2 en el phospholipid-dependent protein kinase), la PKA (cAMP-depen- área perinfarto (Fig. 1c, c’) la cual tiende a recuperarse con el dent protein kinase) y la CAMKII (Ca2+/calmodulin-dependent paso de los días. Se considera que estos cambios están relacioprotein kinase II), las cuales fosforilan aminoácidos principal- nados con mecanismos compensatorios y de reparación [83,84]. mente en el TBD. Por otra parte, las proteincinasas del grupo de Congruentemente con este hallazgo, se ha encontrado que la las PDPK (proline directed protein kinases), como la ERK PKC presenta una activación excesiva después de la isquemia, y

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que el grado de activación depende de la duración de dicha isquemia; como se mencionó anteriormente, la PKC limita la capacidad de interacción de la MAP2 con la tubulina, por lo cual promueve el desensamblaje de los microtúbulos [87]. Como señalamos anteriormente, según nuestros resultados, un inhibidor selectivo de la PKC, el Ro320432, actúa como agente neuroprotector en circunstancias de isquemia focal [55]. Aunque hemos relacionado este resultado con la desinhibición de la función del receptor neurotrófico IGF-I, se podría especular que la inhibición farmacológica de la PKC también podría tener repercusión en la protección del citoesqueleto neuronal, evitaría así el desensamblaje de los microtúbulos y, por tanto, facilitaría la reacción al estrés y la supervivencia ante el daño isquémico. Es interesante señalar que la estimulación de algunos subtipos de receptores glutamatérgicos NMDA incrementa la desfosforilación de las MAP2 por activación de fosfatasas como la calcineurina y la PP1, que influyen sobre la reorganización y estabilización del citoesqueleto [88,89]. Se plantea que la tubulina soluble despolimerizada abunda en las espinas dendríticas y en las densidades postsinápticas; la desfosforilación de estas unidades de tubulina desencadenada por la activación de los receptores de glutamato favorecería la formación de microtúbulos y modificaría, de esta manera, la reorganización local del citoesqueleto postsináptico [90]. Se ha comunicado que la estimulación glutamatérgica desencadena un incremento de la concentración de ARNm para MAP2, lo que hace pensar que el glutamato tiene repercusión, no sólo sobre la fosforilación de la MAP2, sino también sobre la biosíntesis y la concentración de la proteína MAP2 [91,92]. Las anteriores observaciones son congruentes con nuestros datos recientes [93], en los cuales se muestra, mediante un modelo de isquemia cerebral experimental focal, una respuesta de hiperfosforilación de la proteína asociada a microtubulos τ y un incremento significativo en la asociación de la τ con la subunidad 2/3 del receptor de glutamato AMPA en el hipocampo. Teniendo en cuenta el efecto neuroprotector de los estrógenos [94], las ratas fueron tratadas con 17-β-estradiol. Esto evitó la hiperfosforilación de la τ, lo que generó un efecto de resistencia al estrés isquémico y de neuroprotección [93]. Se ha planteado que la activación de la calpaína y la subsiguiente degradación del citoesqueleto es un indicador sensible de la respuesta celular al daño [85,95,96,97]. La calpaína es una proteasa de cisteína que se activa con la presencia de calcio, abunda en las dendritas y se ha implicado en procesos de remodelación neuronal, potenciación a largo plazo y crecimiento neurítico. El incremento significativo de calcio que se produce durante una isquemia cerebral desplaza el rango de acción de la calpaína de un estado fisiológico a un estado patológico, ocasiona la degradación proteolítica de la MAP2 y, por tanto, perturba la estabilidad del citoesqueleto [85,97]. La fosforilación de la MAP2 disminuye su sensibilidad a la calpaína [98,99], lo cual es un proceso cuidadosamente regulado. Se ha encontrado que existe una relación entre la activación de los receptores glutamatérgicos NMDA y la proteólisis de los microtúbulos mediada por calpaína. Al antagonizar los receptores de NMDA durante una isquemia cerebral focal experimental, se observa una tendencia a la preservación de la inmunorreactividad de los microtúbulos y una reducción de la capacidad de hidrólisis de la calpaína, lo que muestra el vínculo entre ésta, la excitotoxicidad y la proteólisis microtubular [100].

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Se concluye que la proteína asociada a los microtúbulos (MAP2) es esencial en las interacciones del citoesqueleto neuronal, confiere estabilidad a los microtúbulos y, por ende, se requiere para preservar la morfología y la conectividad neuronal. Tiene relación con importantes cascadas bioquímicas de reacción intracelular y extracelular, lo que la hace particularmente sensible a las alteraciones ocasionadas por la lesión cerebral. Durante la isquemia cerebral y después de ella experimenta cambios en su expresión y su conformación que pueden reconocerse con técnicas inmunohistoquímicas mediante anticuerpos específicos. Se constituye, pues, en un sensible marcador de sufrimiento neuronal y representa un modelo de reorganización estructural y sináptica (Fig. 1c, c’). DESPOLARIZACIÓN PERINFARTO Y DEPRESIÓN PROPAGADA El área adyacente al foco isquémico presenta unas características fisiológicas y fisiopatológicas especiales y se denomina área de penumbra. Es un sector inestable, en el cual hay una disminución del flujo sanguíneo (hasta 20 mL/100 g/min) y en el que aún están preservados el metabolismo energético y la integridad de la membrana celular. En el área de penumbra, el incremento de potasio extracelular procedente del foco isquémico facilita el proceso de despolarización perinfarto, el cual es similar a la despolarización anóxica pero puede ser reversible de forma espontánea; sin embargo, la despolarización perinfarto puede contribuir al crecimiento del foco isquémico y la muerte celular [3,101,102]. En este sector pueden ocurrir fenómenos más tardíos de muerte celular programada, cambios en las propiedades de las neuronas, activación de la microglía y reacción inflamatoria [16,103,104]. Entre los cambios neuroquímicos se ha destacado la reducción hasta en un 60% de los receptores GABAA [104]. Otro suceso significativo desde el punto de vista neurofisiológico consiste en el establecimiento, poco después de la lesión isquémica, de la denominada depresión propagada (spreading depression). Este fenómeno se ha relacionado con el incremento de potasio extracelular y la consecuente activación de la red astrocítica, la cual ejerce un mecanismo de tamponamiento espacial, mediante el desplazamiento de potasio del sector isquémico a otros sectores de la corteza. La depresión propagada es un mecanismo bien conocido que consiste en una alteración transitoria de los gradiantes iónicos que genera unas ondas lentas de despolarización que viajan a través de la corteza cerebral a una velocidad de 1,5 a 7,5 mm/min. La presencia de estas ondas se ha relacionado con daño en el área de penumbra, pero no tiene relación con daño en el tejido normal [105]. ACTIVACIÓN DE LA MACROGLÍA La isquemia cerebral focal ocasiona una bien conocida respuesta de activación de la macroglía, no sólo en el sector focal y el área de penumbra, sino también en sectores alejados del foco isquémico (Fig. 4) [106]. El término gliosis, o reacción glial, se usa para indicar cambios estructurales y fisiológicos de los astrocitos y la microglía como respuesta a lesiones traumáticas, isquémicas o infecciosas en el sistema nervioso. Dichos cambios pueden ser temporales o desencadenar reorganizaciones estructurales definitivas, en cuyo caso se usa el término cicatriz glial. Sin embargo, la cicatriz glial no se forma exclusivamente a

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ven el avance axonal, mientras que el condroitinsulfato y el queratansulfato interfieren con el desplazamiento axonal [110]. Los proteoglicanos los secretan los astrocitos a la matriz extracelular, donde interactúan con la laminina para producir su efecto. Durante la lesión isquémica, los astrocitos incrementan la síntesis y la liberación de sustancias neurotróficas, como el factor de crecimiento neuronal, el factor de crecimiento fibroblástico y la neurotrofina 3 [109] e incrementan la esteroidogénesis [111]. La producción de estos factores por los astrocitos es mayor cuanto más cerca se encuentren de la lesión focal. Como se sabe, estos factores foFigura 4. Astrocitos reactivos en un sector de la corteza occipital ipsilateral a la lesión isquémica focal experimental en ratas (b) marcados con anti-GFAP. Nótese la hipertrofia del soma y el mentan la supervivencia de las neuronas, de incremento en el número y extensión de las prolongaciones al comparar con la corteza occipi- los propios astrocitos y de la microglía. tal contralateral (a). 40×. Laboratorio de Isquemia Cerebral Experimental, Centro de Estudios En conclusión, se puede observar que hay Cerebrales, Universidad del Valle. Cali, Colombia, 2003. múltiples estrategias mediante las cuales la macroglía, especialmente los astrocitos, enexpensas de los astrocitos, sino que en su conformación particifrentan la lesión isquémica y se preparan para facilitar la reparapan otros tipos de células, como fibroblastos y células epiteliación del tejido. En condiciones normales, se evidencia un sisteles. La cicatriz glial es una nueva barrera que aísla al sistema ma neuroprotector ágil, que interviene en los ámbitos molecunervioso del entorno y permite el restablecimiento del ambiente lar, celular e histológico. neuronal. Los astrocitos reactivos se caracterizan morfológicamente ACTIVACIÓN DE LA MICROGLÍA por un aumento de tamaño (hipertrofia) y un incremento en el número y extensión de sus prolongaciones (Fig. 4b). Se pueden La microglía es un grupo de células de origen mesodérmico, observar a partir de las primeras seis horas de la lesión isquémiderivadas de los monocitos sanguíneos que emigraron en fases ca. El incremento de la proteína acídica glial fibrilar (GFAP), precoces del desarrollo embriológico hacia el sistema nervioso. que corresponde a un tipo de filamento intermedio específico de Las células microgliales, que se asimilan a los macrófagos de la los astrocitos, se ha establecido como uno de los marcadores sangre, se consideran inmunomoduladoras. Expresan un antígemás sensibles para observar la reacción astrocitaria [107]. La no que corresponde al complejo principal de histocompatibiliactivación de los astrocitos en la isquemia puede ser consecuendad (MHC) que permite detectar estas células mediante técnicas cia directa del fracaso energético. El incremento de glutamato, inmunohistoquímicas y diferenciarlas de otras células del sisteATP y potasio extracelular son factores que, en conjunto o indema nervioso (Fig. 5) [112]. Durante la isquemia cerebral, las pendientemente, desencadenan la reactividad de los astrocitos células microgliales se activan más rápidamente que los astrocien los sectores adyacentes a la lesión. Más tardíamente intervietos y participan en procesos de inflamación y reparación del sisnen la liberación de citocinas y los factores de crecimiento neutema nervioso adulto. Tienen capacidad fagocítica y durante su ronal [108]. La depresión propagada se asocia a la reactividad actividad liberan diferentes tipos de sustancias, como la enzima de astrocitos en sectores alejados del foco isquémico [105]. elastasa, algunos radicales libres oxidativos y citocinas proinflaLos astrocitos forman en el sistema nervioso un sincitio que matorias o antinflamatorias, como las interleucinas 1, 3, 5 y 6, el actúa como un tamponador espacial de potasio. Se propone que factor de crecimiento neuronal, el factor de transformación y durante la isquemia hay un traslado de potasio del sitio donde se crecimiento y el factor de necrosis tumoral [34,113]. encuentra en altas concentraciones a otros sitios, y de esta maLas características morfológicas de la microglía varían de nera se controla en parte la hiperexcitabilidad neuronal en el acuerdo a su estado funcional. En el caso de la isquemia, depenárea de penumbra. Otra de las funciones importantes atribuidas de del grado de afectación del tejido. El inmunofenotipo dado a los astrocitos deriva de su capacidad de recaptar neurotranspor el marcaje del antígeno MHC permite identificar los simisores y metabolizarlos. Desempeñan un importante papel en guientes tipos [2, 34]: la recaptura de glutamato y, de esta manera, pueden hacer dis– Microglía ramificada o microglía de reposo (Fig. 5a). Se caminuir la excitotoxicidad. Se ha observado que tras la isquemia racteriza por presentar un cuerpo celular pequeño y un aumenta significativamente la recaptura de glutamato por los núcleo contenido en un citoplasma estrecho. Tiene una gran astrocitos y aumenta la síntesis, la concentración y la actividad cantidad de prolongaciones ramificadas delgadas de las que de la glutamina sintetasa [109], enzima que transforma el glutaemergen en ángulo recto prolongaciones similares a espinas mato en glutamina. de corta extensión. En la sustancia blanca, especialmente en Los astrocitos secretan a la matriz extracelular sustancias el cuerpo calloso, estas células se observan alargadas sicon capacidad de fomentar o inhibir el crecimiento axonal. De guiendo el curso de las fibras nerviosas y presentan menos esta manera, hacen posible el redireccionamiento del creciprolongaciones. miento del cono axonal y la reparación de las lesiones. La tena– Microglía activa (Fig. 5b). Son células que han cambiado su cina y la janusina inhiben el avance del axón en crecimiento; los inmunofenotipo, pero que aún no desempeñan la función de proteoglicanos, especialmente el sulfato de heparina, promuemacrófagos. Se observan en sitios donde la afectación is-

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quémica es subletal. Se ven como células abultadas con un cuerpo celular grande y prolongaciones cortas y gruesas. La microglía se activa en el lapso de la primera hora de la lesión isquémica. – Microglía reactiva (Fig. 5c). Se observa en el área necrótica o cerca del foco isquémico. Las células desempeñan su papel de macrófagos, son esféricas, pequeñas, con características ameboides y no presentan ramificaciones. Se observan en la lesión isquémica en el lapso de las primeras seis horas y aumentan su número de forma importante hasta las 24 horas.

Figura 5. Modificaciones en el inmunofenotipo de células microgliales marcadas con anti MHC a las 72 horas postisquemia cerebral experimental en ratas; a) células microgliales en reposo localizadas lejos del foco isquémico; b) células microgliales activas cerca de la lesión; c) células microgliales reactivas en el borde de la lesión, ejerciendo su función fagocitaria. 40×. Laboratorio de Isquemia Cerebral Experimental, Centro de Estudios Cerebrales, Universidad del Valle. Cali, Colombia, 2003.

El papel de la microglía en las lesiones isquémicas del sistema nervioso depende del estado y grado de resolución de la lesión isquémica. Durante las primeras horas y los primeros días, la microglía puede facilitar la muerte y la destrucción de las células nerviosas por la liberación de agentes como el factor de necrosis tumoral α, el monóxido de nitrógeno, el peróxido de hidrógeno y los aniones superóxido; sin embargo, más tardíamente, la microglía puede fomentar la supervivencia de las células y la reparación de los tejidos por la síntesis de factores de crecimiento como las interleucinas 1 y 3 y los factores de crecimiento celular, que estimulan la astrogliosis y la supervivencia neuronal. FUNDAMENTOS DE LAS ESTRATEGIAS EN NEUROPROTECCIÓN En los últimos años se ha progresado de forma importante en el conocimiento de sustancias que actúan en diferentes puntos de las cascadas que conllevan a la muerte por necrosis o por apoptosis y que interfieren con estos procesos prolongando la vida de la neurona [55,93]. Estos fármacos aparecen promisorios como estrategia de neuroprotección y son el sustrato para estudios en animales de experimentación y estudios clínicos en el humano. Iadecola [2] ha propuesto diferentes momentos en las estrategias neuroprotectoras, dependiendo del evento molecular sobre el que se interviene. Neuroprotección primaria La neuroprotección primaria se produce cuando se utiliza un fármaco que incrementa la resistencia de la neurona al daño isquémico, hipóxico, excitotóxico o metabólico. Los antagonistas de receptores de glutamato, los bloqueadores de canales de calcio, los bloqueadores de canales de sodio, los inhibidores de la NO sintasa neuronal, los antagonistas del factor activador de plaquetas y las sustancias fijadoras de radicales libres tienen la capacidad de disminuir el daño cerebral si se instauran rápidamente en los momentos iniciales de la lesión. Neuroprotección secundaria La neuroprotección secundaria se refiere a la intervención farmacológica que interfiere con los procesos patogénicos que se desencadenan después de que se ha instaurado la lesión isquémica, hipóxica, excitotóxica o metabólica. Estos procesos más tardíos son responsables de la muerte neuronal de forma necrótica o apoptótica. En este grupo, se incluyen sustancias que pueden

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disminuir la muerte necrótica tardía, como los inhibidores de enzimas inductoras de inflamación como la NO sintasa inducible o la cicloxigenasa-2, y sustancias que bloquean las citocinas proinflamatorias. Las sustancias inhibidoras de enzimas efectoras de la apoptosis, como los inhibidores de las proteasas de cisteína, los inhibidores de la proteína proapoptótica BAD, y la inhibición del factor asociado a la apoptosis disminuyen la muerte celular programada. Neuroprotección terciaria La neuroprotección terciaria se dirige a potenciar la capacidad de recuperación del tejido nervioso previamente lesionado y disminuir la diasquisis. En este sentido, se han utilizado medicamentos que incrementan la disponibilidad de aminas biógenas como los inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina, inhibidores selectivos de la recaptación de noradrenalina o las anfetaminas. El mecanismo mediante el cual estas sustancias mejoran la plasticidad neuronal y la recuperación del tejido aún no se ha dilucidado. Los factores tróficos, como el factor de crecimiento de fibroblastos, el factor de crecimiento endotelial y la eritropoyetina, entre otros, han incrementado la recuperación después de una lesión cerebral, no sólo por su capacidad de neovascularización, sino también por un efecto trófico directo sobre la neurona a través de genes que facilitan la reparación y supervivencia de la neurona. CONCLUSIONES La isquemia desencadena en el tejido nervioso una serie de respuestas que, dependiendo del grado de limitación energética, pueden ser adaptativas o llevar a la muerte celular por necrosis o por el desencadenamiento de mecanismos de muerte celular programada. El establecimiento de estos procesos es complejo y los mecanismos se encuentran en vías de dilucidación. Especial dificultad ofrece la simultaneidad de muchos de ellos y las implicaciones que cada uno de ellos puede tener, no sólo en la muerte celular, sino en la adaptación de aquellas neuronas que sufrieron el estrés isquémico y sobrevivieron. Lipton [114], en un intento de sistematizar y simplificar los mecanismos implicados en la muerte de la neurona por isquemia, señala cuatro etapas en el proceso de muerte neuronal. La primera etapa, denominada de inducción, incluye los cambios iniciados por la isquemia y la reperfusión, como la disminución del ATP, la inhibición del transporte electrónico, la disminución del pH, el incremento del calcio, la liberación de glutamato, el

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FISIOPATOLOGÍA DE LA ISQUEMIA

incremento de ácido araquidónico y la activación de genes que permiten la síntesis de citocinas y de enzimas para la producción de radicales libres. Estos cambios permiten la activación de cinco eventos nocivos que Lipton denomina perpetradores del daño y que incluyen: la acción perjudicial de los radicales libres, la activación de la calpaína, la activación de las fosfolipasas, la activación de la poli-ADPribosa polimerasa y la activación de las vías apoptóticas. La segunda etapa la induce la presencia de los perpetradores e incluye las alteraciones a largo plazo de las macromoléculas o de metabolitos importantes. La tercera etapa está relacionada con los efectos perjudiciales a largo plazo de las alteraciones de las macromoléculas y los cambios metabólicos, que definen una alteración en la función celular y en la estructura que incluyen cambios en la membrana

celular, la mitocondria, el citoesqueleto, la síntesis proteica y la actividad de las cinasas. Por último, la cuarta etapa consiste en la progresión de los cambios bioquímicos y morfológicos hacia la muerte celular. El conocimiento de estas etapas se encuentra en continua investigación y aún se desconocen muchos aspectos, especialmente de las últimas dos fases. Las estrategias neuroprotectoras se fundamentan en el conocimiento detallado de cada una de estas etapas, y se busca reconocer eventos claves para una intervención farmacológica o física que pueda limitar el daño neuronal y facilite la recuperación. Posiblemente, en este intento deba intervenirse sobre varios procesos, debido a la gran complejidad del cuadro fisiopatológico, para lo cual es necesario definir cada una de las intervenciones como neuroprotección primaria, secundaria o terciaria.

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FISIOPATOLOGÍA DE LA ISQUEMIA CEREBRAL FOCAL: ASPECTOS BÁSICOS Y PROYECCIÓN A LA CLÍNICA Resumen. Objetivo. Revisar los aspectos básicos de la fisiopatología de la isquemia cerebral focal como fundamento de la clínica y de estrategias neuroprotectoras. Desarrollo. La isquemia desencadena en el tejido nervioso varias respuestas que, dependiendo del grado de limitación energética, pueden ser adaptativas o llevar a la muerte celular por necrosis o por apoptosis. El establecimiento de estos procesos es complejo y los mecanismos se encuentran en vías de dilucidación; especial dificultad ofrece la simultaneidad de muchos de ellos y las implicaciones que puedan tener, no sólo en la muerte celular, sino en la adaptación de aquellas neuronas que sufrieron el estrés isquémico y que sobrevivieron. Se muestran las bases para la comprensión de los fenómenos fisiopatológicos en la isquemia: el estrés y la muerte neuronal, y la reacción de la macroglía y de la microglía. Se ilustra con imágenes originales procedentes de la investigación sobre la respuesta celular ante la isquemia en un ámbito preclínico, en un modelo experimental de isquemia cerebral focal en ratas, evaluado con técnicas como hematoxilinaeosina e inmunohistoquímica para varios marcadores celulares. Conclusiones. La muerte celular en la isquemia es un fenómeno complejo que puede darse en dos modalidades: muerte necrótica o muerte apoptótica. El conocimiento básico de la fisiopatología de la isquemia y de la respuesta de la microglía y la macroglía es el fundamento para plantear estrategias de tipo neuroprotector, las cuales no sólo deben ir dirigidas a evitar la muerte celular aguda, sino también modalidades de muerte celular más tardías, o a fortalecer el tejido superviviente. [REV NEUROL 2004; 39: 156-65] Palabras clave. Apoptosis. Fisiopatología. Isquemia cerebral. Necrosis. Neuroprotección.

FISIOPATOLOGIA DA ISQUEMIA CEREBRAL FOCAL: ASPECTOS BÁSICOS E PROJECÇÃO À CLÍNICA Resumo. Objectivo. Rever os aspectos básicos da fisiopatologia da isquemia cerebral focal como fundamento da clínica e de estratégias neuroprotectoras. Desenvolvimento. A isquemia desencadeia no tecido nervoso várias respostas, que, dependendo do grau de limitação energética, podem ser adaptativas ou levar à morte celular por necrose ou por apoptose. O estabelecimento destes processos é complexo e os mecanismos encontram-se em vias de esclarecimento; oferecendo especial dificuldade a simultaneidade de muitos deles e as implicações que possam ter, não só na morte celular, mas também na adaptação daqueles neurónios que sofreram o stress isquémico e que sobreviveram. São apresentadas as bases para a compreensão dos fenómenos fisiopatológicos na isquemia: o stress e a morte neuronal, e a reacção da macroglia e da microglia. Ilustram-se com imagens originais, procedentes da investigação sobre a resposta celular perante a isquemia a nível pré-clínico num modelo experimental de isquemia cerebral focal em ratas, avaliado com técnicas como hematoxilina-eosina e imuno-histoquímica vários marcadores celulares. Conclusões. A morte celular na isquemia é um fenómeno complexo que pode resultar em duas modalidades: morte necrótica ou morte apoptótica. O conhecimento básico da fisiopatologia da isquemia e da resposta da microglia e da macroglia é o fundamento para planear estratégias de tipo neuroprotectoras, as quais não devem apenas ser dirigidas a evitar a morte celular aguda, mas também modalidades de morte celular mais tardias, ou fortalecer o tecido sobrevivente. [REV NEUROL 2004; 39: 156-65] Palavras chave. Apoptose. Fisiopatologia. Isquemia cerebral. Necrose. Neuroprotecção.

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