FORMATO 1 (Anexo No.2) CARTA DE AUTORIZACiÓN DE LOS AUTORES PARA LA CONSULTA, LA REPRODUCCiÓN PARCIAL O TOTAL, Y PUBLICACiÓN ELECTRÓNICA DEL TEXTO COMPLETO. (OPCIONAL)

Bogotá. D.C .. Fecha Marque con una X

D Tesis doctoral

Trabajo de Grado

Señores BIBLIOTECA GENERAL Cuidad Estimados Señores: El suscrito Jesús Arnoldo Daza Figueredo, con C.C. No. 6763394, autor del trabajo de grado titulado Diseño e implementación de un método de procesamiento y reconstrucción tridimensional de imágenes para microscopia presentado y aprobado en el año 2009 como requisito para optar al título de Magister en Ciencias Biologicas; autorizo a la Biblioteca General de la Universidad javeriana para que con fines académicos, muestre al mundo la producción intelectual de la Universidad javeriana, a través de la vis ibilidad de su contenido de la siguiente manera: •

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Permita la consulta, la reproducción, a los usuarios interesados en el contenido de este trabajo, para todos los usos que tengan finalidad académica, ya sea en formato CD-ROM o digital desde Internet, Intranet, etc., yen general para cualquier formato conocido o por conocer.

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Continúo conservando los correspondientes derechos sin modificación o restricción alguna; puesto que de acuerdo con la legislación colombiana aplicable, el presente es un acuerdo jurídico que en ningún caso conlleva la enajenación del derecho de autor y sus conexos.

De conformidad con lo establecido en el artículo 30 de la Ley 23 de 1982 y el artículo 11 de la Decisión Andina 351 de 1993, IILos derechos morales sobre el trabajo son propiedad de los autores", los cuales son irrenunciables, imprescriptibles, inembargables e inalienables. Firma, nombre completo y documento de identificación del estudiante

Jesús Anoldo Daza Figueredo c. c. &763394

NOTA IMPORTANTE: El autor y o autores certifican que conocen las derivadas jurídicas que se generan en aplicación de los principios del derecho de autor.

c. C. FACULTAD_ _ _ _ _ _ _ PROGRAMA CADÉMICO ----------------

FORMATO 2 {Anexo No.3} FORMULARIO DE LA DESCRIPCiÓN DE LA TESIS DOCTORAL O DEL TRABAJO DE GRADO TíTULO COMPLETO DEL TRABAJO DE GRADO: "Diseño e implementación de un método de procesamiento y reconstrucción tridimensional de imágenes para microscopia".

letos

Nombres Com letos esús Arnoldo

DIRECTOR (ES) TESIS DOCTORAL O DEL TRABAJO DE GRADO Apellidos Completos Nombres Completos Carlos Francisco Corredor Pereira

ASESOR (ES) O CODIRECTOR Apellidos Completos lareo

Nombres Completos Leonardo Rene

TRABAJO PARA OPTAR Al TíTULO DE: Magister FACULTAD:

PROGRAMA: Carrera _ Doctorado

Licenciatura _

Especialización

Maestría x

NOMBRE DEL PROGRAMA: Maestria En Ciencias Biologicas NOMBRES y APELLIDOS DEL DIRECTOR DEL PROGRAMA: Manuel Franco CIUDAD: BOGOTA AÑO DE PRESENTACiÓN DEL TRABAJO DE GRADO:OS de noviembre de 2009 NÚMERO DE PÁGINAS 74 TIPO DE ILUSTRACIONES:

DISEÑO E IMPLEMENTACIÓN DE UN MÉTODO DE PROCESAMIENTO Y RECONSTRUCCIÓN TRIDIMENSIONAL DE IMÁGENES PARA MICROSCOPÍA

JESUS ARNOLDO DAZA FIGUEREDO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS PROGRAMA DE POSGRADO

DISEÑO E IMPLEMENTACIÓN DE UN MÉTODO DE PROCESAMIENTO Y RECONSTRUCCIÓN TRIDIMENSIONAL DE IMÁGENES PARA MICROSCOPÍA

JESUS ARNOLDO DAZA FIGUEREDO

1

NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por los alumnos en sus trabajos de tesis. sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna� antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.

1 de febrero de 2�1�

DISEÑO E IMPLEMENTACIÓN DE UN MÉTODO DE PROCESAMIENTO Y RECONSTRUCCIÓN TRIDIMENSIONAL DE IMÁGENES PARA MICROSCOPÍA JESÚS ARNOLDO DAZA Fl7ERED U AP

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OlTedor7"P Direc tor

& E, f,JJ Leonardo Lareo., PhD Tutor

Jurado 1

.l urado 2

Jurado 3

Decana Académica

Director de Posgrado

Agradezco al creador del cielo y de la tierra quíen permitio que todo fuera posible. A mi esposa Betty Yolanda y mis hijos Zunny Tatiana y Omar Augusto porque son la fuente de mi inspiración. De modo especial doy mis sinceros agradecimientos a: mi director de Tesis Carlos Corredor Pereira y tutor Leonardo Lareo por sus orientaciones y seguimiento en el trabajo. Al ingeniero Oscar Chavarro por su colaboración en el diseño y programación del software implementado. A la Doctora Ángela Umaña por creer y colaborar con su apoyo en el acondicionamiento del Centro de Microscopía Electrónica durante su gestion como Decana Académica de la facultad de ciencias. A mis estudiantes colaboradores en el centro de microscopia quienes hicieron eco a mis pensamientos en voz alta� Ellos son: Isabel Moreno� Alexander Basallo� Alejandro Salamanca� José Dimate� Mauricio Sanabria y Jesús Penagos. Tambien un reconocimiento especial a mis compañeros y amigos Orlando Acevedo� Gerardo Moreno y Jemmy Mendieta quienes participaron activamente en este proceso. A ellos Muchas Gracias y que Dios los proteja. Jesús Daza F.

Índice general Introducción

1

Justificación

5

Objetivos

7

1. Estado del Arte

9

1.1. Trabajos biología celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

9

1.1.1. Descubrimiento de la célula animal y los microorganismos

10

1.1.2. Reconocimiento de la sinapsis neuronal . . . . . . . . . . .

10

1.1.3. Primeras imágenes tridimensionales reales. . . . . . . . . .

12

1.2. Microscopia electrónica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

13

1.3. Microscopía confocal

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

14

1.4. Otras técnicas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

18

1.4.1. Ecografía Doppler transcraneal: . . . . . . . . . . . . . . . .

18

1.4.2. Doppler Carotídeo:

18

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.4.2.1. Tomografía axial computarizada:

. . . . . . . . . .

1.4.2.2. Resonancia magnética de imágenes:

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. . . . . . . .

20

1.4.2.3. Tomografía por emisión de positrones: . . . . . . .

20

1.4.2.4. Angiograma coronario.

20

. . . . . . . . . . . . . . . .

2. Metodología.

23

2.1. Diagnóstico y tipo de investigación. . . . . . . . . . . . . . . . . . .

23

2.2. Diseño metodológico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

24

2.3. Lista de chequeo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

26

I

ÍNDICE GENERAL 3. Resultados 3.1. De los equipos. . . . . . . . . . 3.2. De las muestras. . . . . . . . . 3.3. De la cámara fotográfica. . . . 3.4. Sobre la cámara . . . . . . . . 3.5. Interferencias ópticas . . . . . 3.6. Validación de la membrana . . 3.7. Hojuelas seriadas . . . . . . . 3.8. De la fijación de la membrana. 3.9. Arhivo y captura de imágenes 3.10. Reconstrucción 3D. . . . . . 3.11. Validación R 3D. . . . . . . . . 3.12. Cualidades Vitral . . . . . . .

ÍNDICE GENERAL

. . . . . . . . . . . .

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. . . . . . . . . . . .

29 29 31 34 36 39 41 43 44 49 50 53 54

4. Conclusiones.

59

5. Impacto del trabajo investigativo.

61

Bibliografía

63

II

Índice de figuras 1.1. Red Neuronal Dirección del impulso nervioso: . . . . . . . . . .

11

1.2. Neuronas Piramidales: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

11

1.3. Oocitos tecnología DIC:

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

13

1.4. Sinapsis Neuronal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

15

1.5. Ecografia: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

18

1.6. Eco Doppler Carotideo: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

19

1.7. Tomografía axial computarizada: . . . . . . . . . . . . . . . . . .

19

1.8. Imagenes de Resonancia Magnetica (IRM): . . . . . . . . . . . .

20

1.9. Tomografía por emisión de positrones: . . . . . . . . . . . . . .

21

1.10.Angiograma coronario:

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

21

2.1. Diagrama de flujo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

25

2.2. Diagrama causa efecto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

26

2.3. Mapa conceptual de correlación . . . . . . . . . . . . . . . . . .

28

3.1. Guia preparación de muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

32

3.2. Obtención cortes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

33

3.3. Piezas sistema de adaptación óptica . . . . . . . . . . . . . . . .

35

3.4. Ensamble sistema de adaptación óptica. . . . . . . . . . . . . .

37

3.5. Pantalla fosforescente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

37

3.6. Sistema de adquisición de imágenes digitales para MET. . . .

38

3.7. Imáges de Tardigrados observados en microscopía confocal .

40

3.8. Efecto del aceite de inmersión en la interfase óptica . . . . . .

41

3.9. Escaneo Laser del vidrio cubreobjetos.

. . . . . . . . . . . . . .

42

3.10. Interfase con membrana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

42

3.11. Caracterización espectral de la membrana: . . . . . . . . . . .

43

3.12. Cortes seriados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

44

III

ÍNDICE DE FIGURAS 3.13. 3.14. 3.15. 3.16. 3.17. 3.18. 3.19. 3.20. 3.21.

ÍNDICE DE FIGURAS

Membrana Polimérica (Formvar). . . . . . . . . . . . . . . . Aplicación de la membrana con un espécimen biológico. Citoesqueleto de astrocitos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diseño y elaboración de rejillas. . . . . . . . . . . . . . . . . Porta rejillas para microscopía óptica. . . . . . . . . . . . Reconstrucción en Z de un artrópodo. . . . . . . . . . . . . Raconstrucción tridimensional de ganglios . . . . . . . . . Recostrucción 3D con MET . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R 3D del cultivo celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

IV

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

46 46 47 48 48 50 55 57 58

INTRODUCCIÓN ¿Es posible construir un método de procesamiento y reconstrucción tridimensional de imágenes para la visualización de una sinapsis neuronal aplicando la microscopía electrónica de transmisión (MET)? La microscopía electrónica de transmisión permite obtener imágenes bidimensionales con marcadores de metales pesados posibilitando hacer tinciones para mejorar la definición de membranas y otros organelos celulares. Aunque el tamaño individual de los átomos metálicos utilizados no es detectable por MET ni por la microscopía de luz, su asociación con otros átomos sí brinda la posibilidad de visualizar una estructura completa. Esta propiedad manifiesta en el microscopio de transmisión nos permite aprovechar la herramienta para visualizar estructuras diferenciadas a partir de las cuales es posible obtener una reconstrucción tridimensional. Este principio óptico es la base para obtener información en primera instancia de la muestra en estudio. Si la misma información es obtenida en diferentes cortes consecutivos de la muestra, es de esperar que también se pueda hacer un seguimiento de la morfología estructural de la muestra en un tercer eje dimensional. Los trabajos realizados hasta ahora se habían centrado en emplear el microscopio electrónico de transmisión para obtener imágenes bidimensionales. Sin embargo, esta metodología no permite observar la estructura tridimensional de la muestra. Ante esta limitación, decidimos buscar un método para aprovechar la MET para lograr construir imagenes tridimensionales a nivel ultra estructural. El procedimiento seguido para la captura de la imagen de una muestra biológica se inicia seleccionando una sección del orden de 1cm2 de superficie y espesor entre 30 y 60 µm. A esta muestra se le hace una aproximación visual 1

Reconstrucción 3D

Introducción

inicial, conocida como panorámica, la cual nos permite seleccionar y orientar el área de interés, es decir, aquella zona de mayor probabilidad de presencia de botones sinápticos. Una vez ubicada la zona de interés de un área cuadrada de 3 mm de lado aproximadamente, se procede a realizar una segunda imbibición en resina poliéster para dotarla de un soporte que facilite su manejo y corte. Hecho esto, con ayuda de un bisturí o cuchilla, procedemos a delimitar la sección de trabajo definiendo una pirámide trapezoidal donde la base inferior tiene lados paralelos de 600 y 1000 µm (≈ 1 mm) de longitud aproximadamente y con área mucho mayor que la base superior. A esta muestra con forma piramidal de sección trapezoidal se le hace un corte en secciones transversales muy delgadas de modo que se obtengan películas con espesores entre 60 y 80 ηm. Este tipo de corte es el que denominamos corte seriado y es también el procedimiento que más tarde permitirá hacer la reconstrucción tridimensional de la muestra. Para el montaje de la muestra se utilizan membranas poliméricas de formvar con espesor de 60 nm que resultan resistentes al impacto de un haz de electrones. Esta propiedad fue aprovechada en el trabajo montando los cortes, tanto para microscopia de luz como para MET, sobre las membranas formvar con lo cual se logró eliminar totalmente el vidrio del porta objeto que genera refracción al hacer la lectura de la muestra. Existen equipos que pueden efectuar cortes seriados, a partir de los cuales también se puede realizar la reconstrucción tridimensional de la muestra, sólo que este proceso está limitado a muestras de tamaños grandes, del orden de milímetros, con lecturas por métodos ecográficos o de resonancia de rayos X. Otros equipos pueden realizar esta misma tarea con la ayuda del rayo laser para muestras de tamaño muy superior, del orden de 350 nm, a los obtenidos y analizados por microscopía electrónica de transmisión. En el mercado nacional existen sistemas de montaje de rejillas para microscopía electrónica de transmisión caracterizado por su mesh, número de cuadros por unidad de área, usualmente entre 100 y 400 cuadros por cm2 . Cuando se emplea este tipo de montaje las barras que constituyen la rejilla interfieren en la captura de información hacia la obtención de una imagen. Nuevamente, este problema motivó el diseño y construcción de un sistema de rejilla de único agujero, mesh 1; este proceso se realizó con técnicas de serigra2

Introducción

Reconstrucción 3D

fía y fotomecánica de modo que la muestra pudiera ser sostenida tan sólo por los extremos y el montaje no afectara la lectura de la muestra. Este sistema tiene la virtud adicional de poderse multiplicar continuamente formando un porta-rejillas de hasta 56 muestras simultáneas, de modo que hace posible la visualización, continuada e independiente, de una muestra con cualquier tipo de técnica de microscopía de luz. La irregularidad en los cortes, tanto en espesor como en uniformidad del área, hizo que se diseñara y construyera un sistema electrónico de corte el cual contó con un software de alta confiabilidad y precisión que permitió obtener un sistema controlado en los cortes requeridos. Las hojuelas obtenidas por cortes de la cuchilla de vidrio o diamante quedan suspendidas en la poceta llena de agua con que cuenta en la parte superior la misma cuchilla. Esto hace posible que se puedan recuperar las hojuelas. Ellas se mantienen unidas una tras otra en forma de cadena de películas trapezoidales. Al parecer, por razones electrostáticas, los trapecios se van organizando de modo que cada lado paralelo mayor busca uno menor y tienen un color plateado debido al mínimo espesor que estas alturas poseen; el color de las hojuelas son una manifestación del espesor que tiene la muestra en cada caso. Paralelamente se realizó la preparación de la rejilla de único orificio, mesh 1, colocando sobre su superficie una membrana de soporte que es la encargada de recoger la cadena de películas trapezoidales obtenidas. Así, las hojuelas organizadas que están flotando en agua, por efecto de la tensión superficial, son recogidas por la rejilla tapizada con membrana, que en este momento se encuentra sumergida. Con ello, ahora se puede secar la muestra para ser finalmente introducida en el MET para su observación. Una de las exigencias primarias para la obtención de buenas imágenes es el estado de la pantalla fosforescente, la cual debe ser muy uniforme y no presentar problemas de densidad o de intensidad de la película fotosensible. En el caso de este trabajo, una de las acciones que hubo necesidad de realizar fue la adecuación de la pantalla, por cuanto su estado inicial no permitía la obtención de buenas imágenes debido al maltrato mecánico al que había sido sometida. Montada la rejilla de orificio único, mesh 1, en el holder, es decir, el portarejillas del MET, procedimos a ubicar el sector de interés, la sinapsis neuronal, ajustando el equipo para obtener la mejor definición de la imagen y comenza3

Reconstrucción 3D

Introducción

mos a realizar la captura de las imágenes sucesivas del mismo sector en cada una de las hojuelas. Para la obtención de las microfotografías, cuadrados del orden de 6 a 20 µm de lado con un aumento de 50000X, se emplea una cámara CMOS que ofrece igual o mejor resolución que las fotografías obtenidas por revelado, las cuales dependen de la granulosidad y homogenización de la película fotosensible. La cámara CMOS (Metal oxido semiconductor complementario) posee un fotodetector formado por tres capas de oxido de silicio sensible a las longitudes de onda rojo, verde y azul (Sistema RGB de su abreviatura en ingles) que están dispuestas una bajo la otra, de tal modo que un haz incidente es capturado por una unidad fotosensible de la capa correspondiente. El dispositivo sensor de las camaras CCD (Dispositivo de carga complementaria) está organizado por triadas de tres tipos de fosforo (RGB), en el mismo plano, Luego un rayo de luz incidente es capturado por el punto de la triada correspondiente, lo que implica la perdida de información de los dos puntos restantes. Para evitar que la luz proveniente del exterior interfiera con el haz de electrones que incide sobre la pantalla fluorescente del microscopio, adaptamos una camara digital acoplada al microscopio en forma tal que se mantuviera la oscuridad necesaria exclusivamente al interior del mismo y que facilitara su monitoreo exterior mediante sistemas computarizados dotados con tarjetas de video. Esto se realizó adaptando un vidrio protector perforado de modo que el objetivo óptico diseñado se constituyera en el contacto directo con la pantalla. En la última etapa del proceso se diseño, elaboró, desarrolló e implementó un software para realizar la reconstrucción tridimensional de imágenes provenientes de las micrografías electrónicas de las hojuelas seriadas ya tratadas. A través de todo el proceso investigativo se pretendió aprovechar el equipo disponible y buscar mejorar los procesos comercialmente estandarizados en busca de una mayor eficiencia y profundidad en la caracterización de las muestras biológicas. Cada problema se constituyó en estímulo para generar soluciones económicas y eficientes y contó con la participación de estudiantes de pregrado y posgrado que pusieron el mayor interés para que todo el proyecto investigativo se desarrollara como un conjunto armónico y estructurado.

4

Justificación En la Facultad de Ciencias de la PUJ se contaba con equipos que presentaban grandes deficiencias al momento de pretender realizar una imagen microscópica de alguna muestra. Esto se veía reflejado tanto en el alcance de los equipos como en el estado técnico de los mismos. Por otro lado, el protocolo empleado para realizar el examen de las muestras era muy limitado tanto en las posibilidades de su análisis, como en la información que se podía extraer a partir de su implementación. Un tercer elemento motivador para la realización del trabajo de investigación fue el alto costo en que se incurría cuando se trataba de obtener una sencilla imagen de alguna de las muestras: a los altos costos de los reactivos utilizados había que sumarle el costo de funcionamiento de los equipos, el costo intrínseco por la exigencia de un ”software” propio y especializado, y el costo implícito por la necesidad de contratar expertos externos para realizar cualquiera de las pruebas. Entonces, se plantea una propuesta de solución y desarrollo de una metodología nueva en la detección de información bidimensional obtenida por MET y a partir de ésta, diseñar e implementar una técnica de reconstrucción tridimensional de imágenes que aporte al campo de la óptica y al desarrollo de la investigación física y biológica.

5

Reconstrucción 3D

Justificación

6

Objetivos General: Diseñar y evaluar un método de procesamiento y reconstrucción tridimensional de imágenes para microscopía electrónica de transmisión, con desarrollos propios, a partir de los recursos existentes en el Laboratorio de Microscopía Electrónica de la Pontificia Universidad Javeriana.

Específicos: Identificar las caracterísiticas de los equipos existentes en el Laboratorio de Microscopía Electrónica de la PUJ y analizar su potencial aplicación en el proceso de reconstrucción tridimensional de imágenes, 3D. Identificar las características de los procesos estandarizados de preparación de muestras, procesos ópticos, captura de imágenes y manejo de la información. Optimizar el proceso técnico de adquisición de imágenes digitales para los diferentes equipos de microscopía. Optimizar un sistema de realización de cortes sucesivos y obtención de hojuelas seriadas ultrafinas. Diseñar, desarrollar e implementar un software para generar volúmenes tridimensionales a partir de las imágenes bidimensionales obtenidas de cada corte de la muestra en estudio.

7

Reconstrucción 3D

Objetivos

8

Capítulo 1 Estado del Arte 1.1.

Primeros aportes de la óptica a la biología celular.

Con el descubrimiento de la microscopia de luz la humanidad se abre paso para entender el universo y en especial la constitución de la materia. Galileo Galilei (1564-1662) fué al primero a quien se le acreditó el uso científico de las lentes al hacer observaciones astronómicas. Entre los años de 1591 y 1608, el físico holandés Zacharias Jensen construyó el primer microscopio compuesto, con magnificaciones de apenas 10 a 20 veces, constituido por varias lentes que permitieron corregir las aberraciones esférica y cromática [7]. Posteriormente Johannes Kepler (1571-1630) diseñó un microscopio compuesto en el cual el objetivo y el ocular eran convexos a diferencia de los anteriores; éste es el prototipo de los microscopios actuales. Es Anthony van Leeuwenhoek (1632-1723) quien, al observar la textura de telas en un negocio de tejidos, se interesa por el aspecto que tenían las cosas cuando las veía bajo aumento, comienza a trabajar en el tallado de los vidrios para mejorar las imágenes que observaba, logrando mejoras en la amplificación de las imágenes hasta en 270 veces. Diversos tipos de materiales pasaron por sus microscopios (musgos, leche, agua, abejas, entre otros), siendo el primero en observar microorganismos en aguas estancadas, en 1675.[11]. 9

1.1. TRABAJOS BIOLOGÍA CELULAR CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE

1.1.1.

Descubrimiento de la célula animal y los microorganismos

El médico ingles Robert Hook da a conocer, en 1665 en su obra -MICROGRAFÍA1 , la estructura celular de los seres vivos. En 1773, el microscopista danés Otto Muller consiguió distinguir suficientemente bacterias, microorganismos que clasificó en dos tipos: bacilos (que significa “pequeños vástagos”) y espirilos (por su forma espiral).[11]. Las observaciones las realizó con microscopia en dos dimensiones. Es en 1875, cuando el anatomista italiano Camillo Golgi, logró establecer el método de tinción para neuronas completas y especificas[15]. Con un método que permitió contar y diferenciar los tipos de células del tejido nervioso, el contemporáneo de Golgi, el médico Santiago Ramón y Cajal fué quien reveló que se trataba de un aparente sistema nervioso organizado por células separadas bien definidas. (Ver la figura 1.1 en la página siguiente). Describió cuidadosamente la morfología de las diferentes estructuras del cerebro y como se interconectan entre ellas.[14]. “En 1887 Ramón y Cajal quedó fascinado por las técnicas de coloración histológicas puestas a punto por Golgi y emprendió una serie de investigaciones sobre el sistema nervioso que le condujeron a establecer que las neuronas son células independientes que se comunican entre sí por contacto en contra de la teoría establecida del reticularismo.” [15]. Figura ( 1.2 en la página siguiente).

1.1.2.

Reconocimiento de la sinapsis neuronal

Los procesos iniciales para entender la conducción del impulso nervioso y la comunicación entre neuronas, se basan en modelos experimentales con preparaciones histológicas de fibras simples aisladas del nervio ciático del especimen de rana adulta R. temporaria y R. Esculenta y el axón gigante de calamar Loligo forbesi practicados por Huxley y Stämpfly en 1949. Son modelos de nervio animal con diametros entre 450 y 550 µm, condición que facilitó su diferenciación y comprobación de la transmisión del impulso saltatorio. [8]. Otros trabajos realizados por esta epoca, miden el potencial producido en la juntura 1

http://archive.nlm.nih.gov/proj/ttp/flash/hooke/hooke.html. Consulta: junio 24 de 2009, 7:00 a.m.

10

CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE 1.1. TRABAJOS BIOLOGÍA CELULAR

Figura 1.1: Red Neuronal Dirección del impulso nervioso: Revisión de Ramón y Cajal sobre la dirección del impulso nervioso, señalado con flechas, y modelo axón-dendrítico de conexiones de células en la corteza cerebral. El detalle morfológico de la neurona es representado, incluyendo ramas dendríticas y espinas, el cuerpo y el árbol-axonal. Dendritas y cuerpo reciben entradas de muchas células vía terminal de arborización de axones colaterales. Imagen obtenida del artículo .... la revista “Single neurone models: Oversimple, complex and reduced Ivan Seveg Dept of Neurobiology institute of life sciences, Hebrew University, Jerusalen.1992. Vol 15, pg 414.

Figura 1.2: Neuronas piramidales sometidas a tres ticiones diferentes: a)Neurona serve

la

teñida compleja

con

H-E.

400X,

ramificación

b)La

dendrítica.

misma C)La

neurona misma

con

neurona

la

Técnica

con

la

de

Cajal.

técnica

de

100x. Golgi.

(http://histología.bigthicketdirectory.net/unidad6a/nissl.htm :consulta, junio 06 de 2009. 10:00 a.m.) )

11

Ob100X

1.1. TRABAJOS BIOLOGÍA CELULAR CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE de dos celulas diferentes, en las fibras múscular y neural y muestran resultados de conducción eléctrica causadas por liberaciones de acetil colina en el sitio de union. Se comprobó entonces la transmisión neuromuscular,[16], y fué la primera aproximación de la sinapsis neural a partir de mediciones electrofisiológicas con participación de sustancias químicas. Por consiguiente en el sitio de union se presentan dos tipos de comunicaciones del impulso nervioso, una electrica y otra química, siendo esta última la de nuestro interes. Hacia 1950, se mostró la óptica con imágenes bidimensionales provenientes de microscopios compuestos que alcanzaron los 2000 aumentos.2 A causa de los limites de longitud de onda puestos por la luz , no fue posible realizar profundizaciones en alta resolución.

1.1.3.

Primeras imágenes tridimensionales reales.

El desarrollo de la microscopía de luz o de campo claro, que se habia estancado desde 1875, recuperó su dinamismo hacia 1930 con los trabajos de diferentes investigadores quienes utilizaron las propiedades de los objetos traslucidos. Estos materiales, al ser estimulados, generan respuestas detectables en el microscopio. La actividad paralela de disciplinas físicas y biológicas contribuyó a la creación de herramientas para el trabajo de los investigadores, en su tarea de reconocimiento, tanto de las estructuras translucidas como de las opacas. Esto se puso de manifiesto en la observación de la sinapsis de la placa motora y en la detección otros niveles de organización biológica, desde asociaciones moleculares hasta relaciones de tejidos, sistemas y órganos [2]. Fue Fritz Zernike, profesor de física de la Universidad de Groningen, quien sentó las posibilidades de aplicación de la investigación básica en óptica teórica con respuestas prácticas a la observación de espécimenes traslucidos al microscopio de luz sin utilizar métodos de tinción. La información de la imágen que es captada por el ojo humano es la información proveniente de la amplitud de la onda luminosa; en la misma onda existe informacion del especimen que no puede ser vista directamente: es la información presente en la fase de 2

Ernest Abbe controyó con el equipo de Carl Zeiss el ultra-microscopio, que consistió en utilizar una fuente de iluminación diferente a la luz día. Revista Bohemia. 42(20): 24-28, 112-114 La Habana, 1950. http://bvs.sld.cu/revistas/his/cua_89/his118901.htm. Consulta: julio 3 de 2009: 5:00 p.m.

12

CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE

1.2. MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

Figura 1.3: Oocitos tecnología DIC: Oocitos primarios de almeja de olas, Spissuela Solidissima, en óptica Contrast diferencia de interferencia (DIC). Los gradientes de sombra en la imagen indican las regiones de rápido cambio del camino óptico en la célula. Foto tomada de (Murphy 2002).

las ondas luminosas. Para capturar la información presente en la fase de las ondas de luz cuando éstas atraviesan una muestra, se introdujo el concepto de objetos de amplitud, los que permiten el paso directo de luz, y objetos de fase los que retienen parte del haz incidente al variar la frecuencia. Al detectar ambas informaciones, no solo se contaba con la información de la amplitud de la onda sino también de la fase de la onda. Para obtener la información de fase, trabajos ópticos desarrollados por el grupo de colaboradores del laboratorio de Karl Zeiss en Jena 1942, en los que aplicaron esta teoría, obtuvieron un microscopio de contraste de fase (FCM), primera aproximación a una imagen tridimensional bajo la apariencia de relieve. Los trabajos realizados con esta tecnología transformaron la investigación de la biología y medicina. Aún con esta técnica, los avances sobre resolución no son los mas deseados. Entre los principales exponentes de la técnica tenemos a: Benett et al (1951), Francon (1961), Slayter (1976), Slayter y Slayter (1992) y Pluta(1989). [12].

1.2.

Aparición de la microscopía electrónica.

Con el auge de la microscopia electrónica en la década de los 60, se intentó medir el radio de un átomo y así poder validar los modelos atómicos hasta el momento propuestos; los resultados no fueron los mas alentadores. Sin 13

1.3. MICROSCOPÍA CONFOCAL

CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE

embargo, este esfuerzo con el que se pretendía explicar el microcosmos desde la intimidad del átomo, sirvió para alcanzar tres logros importantes: El primero fué el perfeccionamiento de equipos de microscopía electrónica de transmisión (MET), con robustas fuentes de poder (alta tensión); con ellos se gana en amplificación de las imágenes, puesto que la longitud de onda del haz de electrones depende de la diferencia de potencial aplicada al equipo y, adicionalmente, se dotan los equipos con mejores componentes electrónicos de control y se obtienen las lecturas deseadas con mayor resolución (Agar, A. W., 1991). Un segundo aporte fué el desarrollo de técnicas y protocolos químicos que contribuirían a la preparación de muestras, específicamente en procesos de fijación, tinción y contrastación. Y el tercer aporte fue la identificación de ultra estructuras y seguimiento de cadenas de señalización de rutas metabólicas, por métodos de marcaciones inmunocitoquímicas, los cuales sólo se presentan en forma estandarizada hasta el año de 1977 [9]. Sin embargo, aún con la eficiencia de los marcadores metalicos y los logros obtenidos en resolución inferiores a 1 nm, unicamente fué posible obtener imagenes bidimensionales.

1.3.

Usos de la microscopia láser confocal.

Más adelante, hacia 1980, con el mejoramiento de la óptica de confocalidad se consiguieron aumentos del orden de 4000 o 5000 veces. A este punto de magnificación, las condiciones internas del instrumento ponen el limite a su avance, esto debido a las características físicas de funcionamiento generadas por la longitud de onda del espectro visible, 350 a 750 nm. La microscopía láser confocal es una nueva técnica de observación microscópica que está logrando excelentes resultados en diversas ramas de la ciencia ( medicina, biología, materiales, geología, etc). Su éxito se debe a las indudables ventajas que ofrece frente a la microscopía óptica tradicional (imágenes de mayor nitidez y contraste, mayor resolución vertical y horizontal, entre otros) y, sobre todo, a la posibilidad de obtener “secciones ópticas” de la muestra con adquisiciones de datos de imagen punto a punto, lo que permite su estudio y reconstrucción tridimensional. “ Si bien se han llevado a cabo algunos trabajos 14

CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE

1.3. MICROSCOPÍA CONFOCAL

Figura 1.4: Microfotografía electrónica de la sinapsis neuronal: Imágenes de la sinapsis neuronal obtenidas en un microscopio electrónico de transmisión a 60.000X. Se observan las vesículas en la terminal nerviosa del axón presinaptico. a) sinapsis neuromuscular en rana adulta. b) sinapsis de núcleo interpeduncular adulto c),d),e) junciones neuromusculares de músculo intercostal en rata día embrionario 14, (d)17, e(19). Barra 0.5µm. Microfotografias obtenidas: Synaptic structure and development the neuromuscular juntion. Zach. Hall and Joshua R. Sanes. Departament of Physiology university of California, San Fransisco. Vol 73 pg 100,102.

15

1.3. MICROSCOPÍA CONFOCAL

CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE

en los que se ha aplicado la microscopia confocal al estudio de las neuronas impregnadas por la técnica de Golgi para su reconstrucción tridimensional, esta tecnología ha sido poco explotada aún para este propósito”.[15] Aunque el principio de la microscopía confocal surgió hace varias décadas (Minsk, 1957) los primeros microscopios basados en esta técnica mostraron su validez en 1968, con trabajos descritos por (Petran., et al). Y su aceptación con avanzados desarrollos ha tenido lugar solo hasta hace unos pocos años con la inclusión de los láseres y de los mini computadores. La mayor parte de las muestras observadas con microscopía óptica convencional son traslúcidas. Si una muestra es opaca o si la superficie de reflexión no se encuentra perfectamente pulida, para ambos casos, la luz interacciona con la muestra a varias profundidades por lo que la imagen que llega al observador presenta áreas borrosas. Debido a que la luz reflejada procedente de zonas fuera del plano de enfoque, produce un efecto de degradación con perdida de contraste y resolución de la imagen. El principio de la microscopía confocal consiste en eliminar la luz reflejada o fluorescente que proviene de los planos fuera de foco. Para ello se ilumina una pequeña zona de la muestra y únicamente se deja pasar el haz luminoso que proviene del plano focal, eliminándose los haces procedentes de los planos inferiores y superiores mediante una apertura conocida como pinhole (Boyde, 1988). En la microscopía electrónica de transmisión, el análisis también se realiza sobre un plano focalizado, que a diferencia del plano explorado con el microscopio confocal, se obtiene por medio de un corte físico con cuchilla y no por el metodo de escaneo láser como lo hace el microscopio confocal. La técnica de microscopía electrónica posibilitó mejorar la magnificación y la resolución de las imágenes. Sin embargo es de considerar que, obtener ganacias en magnificación implica una perdida de resolución y a la inversa. En la década de los años 40, se iniciaron los trabajos con aplicaciones de microscopía electrónica de transmisión, MET, y de escaneo electrónico, SEM. El principio de funcionamiento de estos equipos no depende de la longitud de onda de los fotones.Por el contrario, es dependiente de la longitud de onda de los electrones, caracteristica física que varia con el potencial aplicado a los electrones para ser acelerados, es decir, que su cota superior para la resolución, depende solamente de la diferencia de potencial que le podamos aplicar 16

CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE

1.3. MICROSCOPÍA CONFOCAL

al sistema. Especificamente para el microscopio de barrido SEM, se llegó obtener aumentos hasta 30000X y resoluciones de 100 a 200 nm. Para la misma época el desarrollo del MET permitió resoluciones inferiores a 1 nm y aumentos superiores a 106 . Esta ventaja del microscopio de transmisión brindó una oportunidad para ser aprovechada en este trabajo de reconstrucción tridimensional de una sinapsis neural. Últimamente, el desarrollo tecnológico ha permitido tener resoluciones del orden de 1 Å para equipos de microscopía de fuerza atómica y microscopios de efecto túnel. Equipos que condicionan su actividad unicamente en adquirir la información superficial de la muestra. [4][6] La aplicación de estos avances en la tecnologia de instrumentos y equipos ópticos, se ha conjugado con un desarrollo paralelo en tecnicas para la investigacion de la biología celular, hasta llegar a reconocer ultraestructuras. Contribuciones adicionales provenientes de los desarrollos de la biología celular y que tambien son de interes para nuestro estudio, son las reconstrucciones volumétricas de un espécimen. En 1968, se logró reconstruir tridimensionalmente una imagen a partir de algorítmos matemáticos, [3]. Trabajo que dió aportes significativos para que posteriormente fueran utilizados en procesos de adquisición y analisis de imágenes mediante fotografías, inicialmente analógicas y posteriormente digitales, con captura directa de imágenes producto de un mejor ensamble de los equipos de microscopía. Paralelamente con el desarrollo de los equipos, también se ha mejorado en el proceso mismo de tratamiento de muestras, objeto de estudio, que impulsa el desarrollo de múltiples técnicas de adquisición y análisis de imágenes. Para obtener imagenes, sobre las que posteriormente se realiza el analisis, se han desarrollado tecnicas basadas en efectos logrados por campos magnéticos, electricos y de sonido. Entre ellos podemos citar: ecografia Doppler transcraneal, Doppler Carotideo, tomografía axial computarizada, resonancia magnética, tomografía por emisión de positrones y angiograma Coronario. 17

1.4. OTRAS TÉCNICAS.

A)

CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE

B) Figura 1.5: Ecografia:

A) ventana sónica transcraneal, Según la ventana utilizada se van a poder registrar diferentes arterias cerebrales. B) Corresponde a la distancia entre la superficie del transductor o sonda y la arteria localizada, midiéndose esta en milímetros y se determina al chocar el ultrasonido mandado por la sonda desde la superficie con los hematíes del flujo sanguíneo del vaso, siendo este el punto o area donde se origina la señal doppler denominado “Volumen de muestra”. En la mayoria de los aparatos la insonación es registrada desde el punto medio del volumen de muestra. http://www.eccpn.aibarra.org/temario/seccion7/capitulo127/capitulo127.htm, Consulta: Junio 05 de 2009, 5:00 p.m.

1.4.

Otras técnicas para obtener imágenes tridimensionales

1.4.1.

Ecografía Doppler transcraneal:

Es un exámen de diagnóstico seguro que proporciona una visión interior del cerebro, no visible directamente. Produce imágenes de dos o tres dimensiones usando ondas electromagneticas y ultrasónicas, emitidas en ecos hacia la fuente que los produjo. Apareció en 1982 y muestra la hemodinámica y la velocidad de del flujo sanguíneo intracerebral.3

1.4.2.

Doppler Carotídeo:

El eco Doppler de las arterias carotídeas en el cuello, investiga mediante el ultrasonido el interior de las arterias, la calidad de las paredes y si existen placas con anormal deposito de calcio y colesterol. Como se puede observar en la imagen ( 1.6 en la página siguiente), estas placas pueden restringir el flujo sanguíneo al cerebro o romperse y embolizar bloqueando el flujo sanguíneo en 3

http://www.eccpn.org/temario secccion7/capitulo127/capitulo127.htm

18

CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE

1.4. OTRAS TÉCNICAS.

Figura 1.6: Eco Doppler Carotideo: Un estudio indoloro con Eco Doppler Preventivo puede identificar esta amenaza y permitir actuar a su médico. http.//www.cardiomedic.com.pe/01_arteriografiacarotidea.html., consulta, junio 05 de 2009, 5:00 p.m.

B)

A)

Figura 1.7: Tomografía axial computarizada: A) Infarto de la arteria cerebral media como forma de presentación de la tuberculosis miliar (Middle cerebral artery ischemic stroke presentation of miliar tuberculosis B. Zalba Etayo, B. Obón Azuara, I. Gutiérrez Cía, B. Villanueva Anadón, R. Ridruejo Sáez Servicio de Medicina Intensiva. Hospital Clínico Universitario. Zaragoza B)Exámen normal de TAC de cabeza con medio de contraste intravenoso. Las imágenes no son comparables, No es posible sacar conclusiones por comparación de las imágenes. Solamente los radiólogos calificados deben interpretar las imágenes. http://www.radiologyinfo.org/sp/info.cfm?pg=headct, consulta: junio 26 de 2009, 10:00 a.m.

una arteria cerebral causando un accidente cerebro vascular de diverso grado. Esta complicación es actualmente la tercera causa de muerte en países como Estados Unidos de América.4 1.4.2.1.

Tomografía axial computarizada:

Son diagnisticos que combinan un equipo de rayos x especial con computadoras sofisticadas para producir múltiples imágenes o visualizaciones del interior del cuerpo.5 4 5

http://www.cardiomedic.com.pe/01_arteriografiacarotidea.html htpp://radiologyinfo.org/sp/info.cfm?pg=headct

19

1.4. OTRAS TÉCNICAS.

CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE

Figura 1.8: Imagenes de Resonancia Magnetica (IRM): IRM significa imágenes por resonancia magnética. La IRM es un procedimiento indoloro que usa imanes potentes y ondas radiales para construir imágenes del cuerpo. Se crea un campo magnético alrededor, enviando ondas que forman una imagen de la región específica. http://www.neurochirurgie-zwolle.nl/grap/MRI_fMRI.jpg

1.4.2.2.

Resonancia magnética de imágenes:

La resonancia magnética (IRM) es un procedimiento que combina imanes grandes con radiofrecuencias y usa una computadora para producir imágenes detalladas de los órganos y las estructuras internas del cuerpo. La IRM se utiliza a menudo: para examinar tejidos blandos como el corazón, el cerebro, el hígado, entre otros.6 1.4.2.3.

Tomografía por emisión de positrones:

La tomografía por emisión de positrones (PET) es un tipo de procedimiento de medicina nuclear que mide la actividad metabólica de las células de los tejidos del cuerpo. Es utilizada frecuentemente por los oncólogos, los neurólogos, los neurocirujanos, y los cardiólogos. 7 1.4.2.4.

Angiograma coronario.

Es una técnica radiográfica que inspecciona cavidades internas del corazón y arterias usando un colorante para medir el flujo y presión en las arterias 6 7

http://www.neurochirurgie-zwolle.nl/grap/MRI_fMRI.jpg http://www.healthsystem.virginia.edu/uvahealth/adult_radiology_sp/pet.cfm

20

CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE

1.4. OTRAS TÉCNICAS.

Figura 1.9: Tomografía por emisión de positrones: Con 2-(18F)-fluro-2-deoxi-D-glucosa (FDG-PET) que detecta una imagen tumoral en el páncreas en un paciente con pancreatitis cronica (PC). (http://www.intramed.net/contenidover.asp?contenidoID=40537) ¡Revisión! Pancreatitis crónica: diagnóstico y tratamiento, 28 MAY 08 Dres. DiMagno MJ, DiMagno EP. Angiografia: Es una técnica radiográfica que inspecciona cavidades internas del corazón y arterias usando un colorante para medir el flujo y presión en las arterias coronarias. http://www.texasheartinstitute.org/HIC/Topics_Esp/Diag/diangio_sp.cfm, Consulta: junio 08 de 2009, 8:00 a.m.

Figura 1.10: Angiograma coronario: La

flecha

indica

una

obstrucción

en

la

arteria

coronaria

derecha.

http://www.texasheartinstitute.org/HIC/Topics_Esp/Diag/diangio_sp.cfm, Consulta: junio 06 de 2009, 8:00 a.m.

coronarias.8 De la discusión anterior se desprende que, los procesos desarrollados hasta ahora han posibilitado la reconstrucción tridimensional de macro estructuras,y de manera muy tímida, y menor a la posibilidad de reconstrucción de imágenes en el orden de la resolución permitida por el MET, [3],como lo hemos aplicado para la reconstrucción tridimensional de la sinapsis neuronal.

8

http://www.texasheartinstitute.org/HIC/Topics_Esp/Diag/diangio_sp.cfm

21

1.4. OTRAS TÉCNICAS.

CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE

22

Capítulo 2 Metodología. 2.1.

Diagnóstico y tipo de investigación.

La reconstrucción tridimensional de una muestra, objetivo central del trabajo, exigió para su desarrollo llevar a cabo algunos procesos anteriores. Inicialmente fue necesario evaluar los equipos disponibles, su funcionamiento, alcances y limitaciones; luego, se llevó a cabo una revisión bibliográfica acerca de los métodos de preparación de muestras, su ubicación en los diferentes tipos de microscopios, el proceso óptico de captura de las imágenes, la magnificación y resolución obtenidas a partir de cada uno de ellos y cada característica que presentaba el método específico analizado. Simultáneamente, se realizó una revisión bibliográfica sobre el proceso óptico de captura de imágenes, con el objeto de determinar el tipo de cámara más adecuado a las necesidades del proceso. Los altos costos inherentes a la consecución de un Laboratorio de Microscopía llevaron a ingeniarnos un método de corte de muestras con características muy similares a las generadas por los equipos comerciales automáticos. Esto también exigió el diseño de una metodología de trabajo que permitiera obtener hojuelas suficientemente delgadas y uniformes con lo cual pudieramos estar seguros que una reconstrucción tridimensional, 3D, sí correspondía a la estructura de la muestra. Esta etapa exigió también la revisión bibliográfica acerca de controladores de velocidad para motores y la realización de un proyecto de investigación para la elaboración de un software de control de velocidad de corte de la muestra, proyecto éste que también permitió la elaboración de tarjetas electrónicas de control para independizar los 23

2.2. DISEÑO METODOLÓGICO

CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA.

procesos de corte y presión. Finalmente, se realizó también una revisión bibliográfica encaminada a la obtención de información sobre los programas de computador empleados para la reconstrucción de volúmenes a partir de la captura de imágenes bidimensionales obtenidas en cada hojuela. Este proceso llevó a la construcción de un programa propio obtenido a partir de la utilización de diferentes programas de software libre con el cual se logró la reconstrucción final. Todo este proceso exigió también su convalidación; ésta se llevó a cabo desarrollando inicialmente un entrenamiento sobre el proceso de captura de imágenes de especímenes conocidos para luego ser comparadas con las obtenidas a partir del proyecto de investigación. También al final, para comprobar la validez del software de reconstrucción tridimensional elaborado a través del proyecto, se editaron las imágenes obtenidas de las hojuelas para formar un archivo en columna (stack) de imágenes para posteriormente aplicarle el programa VITRAL, producto del grupo de trabajo, y así obtener una imagen tridimensional animada, proceso conocido como renderización. Para posibilitar la comparación de reconstrucciones tridimensionales se optó por recuperar imágenes individuales a partir de una animación creada desde un microscopio confocal. Estas imágenes individuales, que no requieren edición porque ya salen formando un archivo en columna de imágenes, fueron sometidas al mismo programa VITRAL obteniéndose la reconstrucción tridimensional idéntica a la reportada por el fabricante. Este proceso fue aplicado a diferentes muestras corroborando las bondades y efectividad del software creado.

2.2.

Diseño metodológico

Las actividades planteadas en el numeral anterior condujeron a la elaboración de un diagrama de flujo que nos permitiera visualizar el proyecto en conjunto y separar cada una de las actividades y proyectos a desarrollar en cada etapa del proceso. Esta forma de trabajo tuvo como resultado la elaboración de una lista de chequeo para verificación. El diseño metodológico se fundamentó en el método de Pareto (figura 2.2 en la página 26) para identificar el origen de los problemas, haciendo posible individualizarlos para poderlos resolver separadamente. Según este planteamiento 24

CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA.

2.2. DISEÑO METODOLÓGICO

Figura 2.1: Diagrama de flujo El diagrama señala los pasos a seguir en el reconocimiento del estado de los equipos y el recorrido que debe tener una muestra, para que apartir de la misma sea posible extraer hojuelas seriadas con sus respectivas imagenes para la posterior recontrucción tridimensional.

el 100 % de problemas existentes dependen de un 20 % de las causas posibles que los originan; a partir de aquí lo que se busca es identificar aquellas causas efectivas que impiden la solución de los problemas, con lo cual podemos dar solución a una situación. Esto nos lleva a la generación de una lista de chequeo que verifique la superación de los problemas identificados. Como resultado de este diseño metodológico se encontró que las dificultades para el desarrollo del proyecto se manifestaban en las condiciones humanas presentes en el momento, en las adaptaciones locativas, en el estado de los equipos y en los procedimientos de preparación de muestras y carencia de software para captura y análisis de imágenes, además de los problemas económicos. Luego de secuenciar jerárquicamente las situaciones problema sobre equipos, muestras, camaras y software ellos se transformaron en el eje conductor y metodologico para desarrollar esta investigación. El diagnóstico así realizado facilitó la elaboración de un diagrama de flujo con el cual se visualizara todo el proceso y sirviera de guía de análisis de las etapas del proceso. Complementario con el método de Pareto se empleó el método de Causaefecto, también conocido como espina de pescado figura 2.2 en la página siguiente, mediante el cual se busca identificar todas las causas que producen un efecto en la solución del problema. Así, se posibilita el análisis de la inci25

2.3. LISTA DE CHEQUEO

Figura 2.2:

CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA.

Diagrama causa efecto:

El diagrama causa efecto es el resultado del diagnostico para conseguir la reconstrucción tridimensional de imagenes a diferentes niveles con los instrumentos existentes en el Centro de Microscopía Electrónica de la Pontificia Universidad Javeriana.

dencia que la solución de cada problema pueda tener sobre la solución total de la situación. Al aplicar este método al proyecto de investigación se obtuvieron resultados muy similares y complementarios a los obtenidos mediante el método de Pareto. Cabe anotar que este trabajo de investigación tiene como fundamento un tipo de investigación experimental centrada en conceptos básicos de la óptica, el desarrollo tecnológico y aportes pedagógicos visualizados en las diferentes etapas de investigación. Esto permite definirlo como un trabajo de investigación básico experimental (Zorrilla, 1993).

2.3.

Lista de chequeo

Los resultados de la etapa de diagnóstico se resumen con la siguiente lista de chequeo1 : 1. Identificar el tipo de equipo existente en el laboratorio y evaluar su posible aplicación en la reconstrucción tridimensional, 3D. 2. Determinar el tamaño de las posibles muestras y el método de preparación más adecuado que, de acuerdo con las limitantes del equipo, se 1

http://www.geocities.com/WallStreet/Exchange/9158/indicete.htm

26

CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA.

2.3. LISTA DE CHEQUEO

pueden tratar a lo largo del trabajo de investigación. 3. Identificar el tipo de cámara fotográfica de mayor resolución y que mejor se adecuara al presupuesto para la captura de imágenes. 4. Evaluar la posibilidad de adecuar la cámara obtenida en los microscopios de MET y de Campo Claro o de luz. 5. Buscar generar alternativas que permitan la eliminación de interferencias ópticas debidas a elementos diferentes al espécimen. 6. Realizar pruebas de captura de imágenes con microscopio confocal buscando mejorar la resolución y fidelidad de la imágen para validar el método propuesto en el numeral anterior. 7. Desarrollar un método para mejorar el proceso de corte de muestras para obtener hojuelas más delgadas con el mismo espesor y ángulo de corte. Evaluar la posibilidad de realizar estos cortes con ayuda de controladores electrónicos para mejorar la calidad de los cortes. 8. Determinar el método más apropiado para fijar la membrana en el soporte, de modo que ella pueda sostener la hojuela en estudio. 9. Identificar el proceso más adecuado para la captura de imágenes y la formación del archivo en columna o stack de fotografías. Determinar la necesidad de emplear un marcador para fijar un sistema de referencia. 10. Desarrollar el software para acoplar el stack de fotografías como una reconstrucción tridimensional. 11. Validar el proceso de reconstrucción tridimensional desarrollado comparando sus resultados obtenidos con procesos ya reconocidos.procesa 12. Identificación de cualidades complementarias del programa VITRAL cuando se emplea en la reconstrucción tridimensioal de otras muestras biológicas.

27

2.3. LISTA DE CHEQUEO

CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA.

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