CAPÍTULO VI

FOLICULO ASPIRACIÓN Y COLECCIÓN DE OVOCITOS POR MEDIO DE ECOGRAFÍA – GUIADA TRANSVAGINAL EN ADULTOS

Autor:

Guillermo Brogliatti, DMV, MSC. Compañía PEREZ COMPANC República Argentina

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FOLICULO ASPIRACION Y COLECCION DE OVOCITOS POR MEDIO DE ECOGRAFIA-GUIADA TRANSVAGINAL EN ADULTOS APLICACIONES DE LA ULTRASONOGRAFÍA TRANSVAGINAL RESUMEN

Desde la década del '80 la ultrasonografia se ha utilizado para guiar agujas e instrumentos dentro de órganos en la cirugía mínima invasiva en seres humanos. Esta técnica ha alcanzado un gran desarrollo dada la baja invasividad, la alta repetibilidad y la seguridad (mínimo riesgo de infección). La aspiración transvaginal guiada por ultrasonografia para la colección de ovocitos, líquido folicular y células de la granulosa del folículo, se ha establecido como el procedimiento más común en equinos y bovino. Como también se ha demostrado posible en otras especies como llamas, bubalinos, cabras y otras. Pieterse y col, en 1985 desarrollaron los primeros trabajos de colección de ovocitos en los cuales la tasa de colección era alrededor del 30%. Con el paso del tiempo, el mejoramiento de la técnica y la manipulación de los ovocitos, las tasas de colección son de alrededor del 60% o 70%. Es un método de elección para la colección de ovocitos en programas de in vitro fertilización en bovinos. Esta técnica se puede realizar hasta dos veces semanales recuperando así una gran cantidad de ovocitos, potenciando la producción de embriones in vitro. Los transductores convexos son los más apropiados para abordar el ovario desde la vía transvaginal. Aparte de la colección de ovocitos o fluido folicular esta técnica nos permite inyectar liquido folicular, ovocitos u hormonas dentro del folículo o dentro del ovario para la investigación de la regulación local del ovario. La folículo aspiración eco gráfica por vía transvaginal también se ha desarrollado en animales prepúberes desde 1 mes de edad hasta las adultas. Esto permite trabajar en la utilización de animales a temprana edad y así acortar el intervalo generacional. La folículo aspiración eco gráfica transvaginal también ha sido utilizada como método de sincronización de las ondas foliculares del bovino adulto y las terneras, así como también en el equino (Bergfelt y col. 1994, 1996, Brogliatti y col 1996). La ablación de todos los folículos de > 5 mm indujo un incremento de la FSH circulante y la emergencia de una nueva onda folicular dos días despúes del procedimiento. Este método de folículo ablación se utilizo para sincronizar los celos de los bovino como también antes de iniciar los tratamientos de superovulación. El presente artículo considera brevemente la historia de la colección de ovocitos en la vaca, la técnica transvaginal en sí misma, los factores que influyen en el éxito de la recuperación transvaginal de ovocitos y otras aplicaciones futuras. La ultrasonografia guiada también puede ser utilizada como medio para canalizar arterias y venas. En un estudio canalizando la vena coccígea y dirigiendo el catéter por vía ultrasonografica se logró colocar éste en la vena cava caudal a la altura de la salida de la vena ovárica. Amniocentésis por vía transabdominal, han sido realizadas en yeguas preñadas con algunas causas de aborto. Sin embargo,

130 la amniocentesis por vía transvaginal ultasonografia-guiada se ha llevado a cabo sin mayores complicaciones en los bovinos (García et al. no publicado ). Otra de las aplicaciones de la ultrasonografia-guiada es para la obtención de biopsias de determinados órganos como útero e hígado. De todas maneras esta técnica todavía debe ser más depurada y adaptada a las necesidades de los animales domésticos. Una mas de las aplicaciones es la inyeccion de hormonas o factores en lugares localizados y poder así evaluar en el sitio de acción. Ejemplos de esto son la inyección de estradiol 17 B en el miometrio y en el ovario directamente (Bo et al., 1996) y la inyección de prostaglandina en el ovario o dentro del cuerpo luteo (Brogliatti et al., 1999).

INTRODUCCIÓN

Uno de los objetivos mas importantes en los programas de mejoramiento genético es el de multiplicar ciertas características deseables que poseen animales superiores. En los machos esto se ha realizado por intermedio de la congelación de semen y la distribucción de gametas con ayuda de la inseminación artificial. En contraste, una limitada proporción de gametas femeninas se encuentran disponibles para programas de este tipo. La superovulación y transferencia de embriones son hoy en día las herramientas mas usadas para multiplicar rápidamente la genética de las hembras. Otra de las técnicas que se encuentra en constante perfeccionamiento en los últimos tiempos es lafertilización in vitro. Las condiciones de IVM (in vitro maduración), IVF (in vitro fertilización) y IVC (in vitro cultivo) de ovocitos obtenidos de los ovarios de hembras son cada vez mas exitosas y en un futuro muy cercano seran menos costosas (Lonney y col. 1994, Hasler y col 1995). Diferentes métodos de colección de ovocitos han sido desarrollados durante los últimos tiempos. En la mayoría de los laboratorios de investigación la fuente de ovocitos proviene de ovarios de matadero. Los ovocitos se pueden colectar por medio de simple aspiración con aguja y jeringa o la ayuda de una bomba de vacío o por medio de disección o slicing. Estos métodos de colección de ovocitos solo pueden ser utilizados en animales muertos o por ovariectomía siendo no repetible para un mismo animal. Técnicas quirúrgicas como laparoscopía y laparotomía también han sido utilizadas con la desventaja de ser muy costosas y requerir de un equipo complejo y anestesia del paciente (Holland y col. 1981, Reichenbach y col. 1993, Armstrong y col. 1993). Durante los años' 80 la técnica de ecografia-guiada se comenzo a utilizar como método de colección de ovocitos en mujeres. Primeramente se utilizó con el objeto de guiar una aguja de punción percutánea transabdominal (Lenz y col. 1987), mas tarde se la utilizó por vía transvesical (Wikland y col. 1984) o uretral (Parson y col. 1985)y finalmente por vía tranvaginal (Zimmer y col. 1991). Al igual que en los humanos la vía de elección en los equinos y bovinos es la transvaginal. Este método fue descripto por primera vez en bovinos por Pieterse y colaboradores en 1988, siendo actualmente el utilizado por la mayoría de los centros dedicado a la producción de embriones in vitro (Looney y col. 1994., Hasler y col. 1995).

El método de colección de ovocitos ideal debe cumplir los siguientes requisitos. No debe causar problemas en la fertilidad futura del animal involucrado, no debe decrecer el rendimiento ( ej:

131 producción de leche), no debe decrecer la calidad de los ovocitos colectados, debe ser simple y fácil de realizar con mínima infraestructura, debe ser altamente repetible, debe poseer mínima invasividad, debe estar dentro de las regulaciones para el bienestar de los animales. Los factores que controlan el resultado final de un sistema de recuperación de ovocitos pueden dividirse en dos categorías: 1 ) biológicos, tales como la estimulación hormonal previa a la punción del folículo y el momento del procedimiento en etapas particulares del ciclo estral, y 2) técnicos, tales como tipo de aguja y el vacío en la aspiración, dependiendo de los diferentes tipos de dispositivos de colección de ovocitos (OPU) utilizados. Ambos grupos serán discutidos en detalle más adelante.

ANIMALES, EQUIPOS y PROCEDIMIENTO Animales Las nuevas técnicas de reproducción asistida como la fertilización in vitro se comenzaron a utilizar para todas aquellas vacas problemas de alto valor genético. Las pacientes eran todas aquellas hembras en las que la superovulación no era posible por diferentes causas anatómicas (oviductos bloqueados, metritis persistentes) o causas fisiológicas (vacas viejas o refractarias a los tratamientos de superovulación). En vacas con buen estado de salud y de alto valor gen ético esta técnica se está comenzando a usar, dado que la colección de ovocitos se puede hacer hasta dos veces por semana. Es también posible realizar la colección de ovocitos de vacas preñadas durante el primer trimestre de la gestación sin trastorno alguno para el feto. Otra gran posibilidad son las vacas en el período de post parto. Los ovarios de estas dos últimas categorías poseen folículos que se podrían transformar en embriones transferibles. Las obtención de ovocitos / embriones de terneras prepúberes es una de las actividades más desafiantes con el objeto de acortar el intérvalo generacional en un programa de selección genética.

Equipo Un sistema para colección de ovocitos por ecografia tranavaginal consiste en 3 componentes: un equipo de ecografia con un transductor sectorial (de elección), una bomba de aspiración y un sistema de guía de aguja, conectado a un receptáculo colector de ovocitos. Existen hoy en el mercado una amplia gama de diferentes marcas de ecógrafos de tiempo real de imágenes de alta resolución en blanco y negro. Existen dos tipos de transductores; sondas lineales, que transmiten ondas de sonido en paralelo para dar una imagen plana, y sondas sectoriales, que presentan una imagen segmentaria del tejido. En ambos tipos, la frecuencia de las ondas de sonido transmitidas puede ser alterada: cuanto más alta sea la frecuencia, más superficiales serán las ondas de sonido que penetran el tejido por debajo, y más nítida será la imagen cuando está cerca del transductor. Cuanto más baja sea la frecuencia, más profundamente penetran las ondas de sonido. Un cabezal de transductor de 5 Mhz se considera generalmente lo suficientemente bueno para visualizar el tracto reproductor, utilizándose uno de 7.5 Mhz cuando los tejidos a ser examinados pueden ser traídos cerca de la sonda, por ejemplo para examinar los tendones en la pata de un caballo. No obstante, el tipo de sonda utilizada para OPU debe ser fabricada según un diseño específico, para permitir la manipulación de la aguja de punción desde el exterior, y colocar el transductor en contacto cercano con los ovarios. La imágen de la pantalla del ecógrafo es la utilizada para guiar la aguja de punción

132 dentro del folículo ovarico por lo tanto el transductor y el sistema de guía de aguja se fabrica como una unidad operacional individual. La aguja de punción es conectada a una pequeña bomba de vacío que permite que los contenidos de los folículos sean aspirados. Los Complejos Cumulus Ovocito son recogidos en un tubo plástico o directamente en un filtro de embriones. Diferentes tipos y formas de agujas de aspiración han sido utilizadas. Estas van desde las costosas agujas de 60 cm de longitud, de simple y doble lúmen hasta las simples agujas descartables. Una de las desventajas de las agujas es que estas se desafilan luego de 5 a lO animales haciendo más dificultosa esta técnica y el mantenimiento de la higiene o esterilización. Algunos nuevos equipos poseen un dispositivo de agujas descartables intercambiables que permiten el cambio de aguja entre animales siendo la tarea más simple, higiénica y de menor costo. La presión juega un rol fundamental en la calidad y el porcentaje de ovocitos colectados. Más exacto que presión de aspiración (mm de Hg) es cuantificar el flujo aspirado por minuto (ml/min). Esta es una medición muy fácil de realizar y adaptable a todos los mecanismos y bombas de colección.

Procedimiento Una vez que el animal ha sido inmovilizado en la manga se da una anestesia epidural utilizando 5 ml de lidocaína al 2%, esta es necesaria para superar la tensión excesiva durante las manipulaciones rectales. En Europa es común la premedicación del paciente con un sedante como 0:1 ml/100 kg. de peso corporal de clorhidrato de detomidina (10 mg/mI) intravenoso (Domosedan alfa, Smith Kline Animal Health Ltd. ). Además de su acción sedante, esta droga también relaja los intestinos, un efecto que puede ser reforzado por la administración intravenosa de hioscina-N-bromuro de butilo (Buscopan alfa, Boehringer Ingelheim). La vulva y el perineo son cuidadosamente limpiados y desinfectados para así proceder a introducir el transductor en la vagina del animal. Este también ha sido previamente higienizado y protegido por medio de un condón lubricado para evitar el contagio entre animales de distintos rodeo. El transductor es manipulado y avanzado hasta la parte más craneal de la vagina. La mano libre del operador se coloca por vía transrectal para localizar y traccionar los ovarios sobre la faz del transductor. Esta manipulación tiene por objeto colocar los folículos a punciónar en la línea de acción de la aguja de aspiración visualizada en el monitor. La línea de punción, que indica dónde debe ser ubicado el folículo para una punción exitosa. Preferentemente el mismo operador avanza la aguja de aspiración a travez de la pared vaginal insertandose dentro del folículo previamente identificado. El vacío en el tubo de colección se debe iniciar previo a la punción del folículo evitando de esta forma la pérdida del fluido folicular y el ovocito a la cavidad abdominal. Una vez que la aguja se encuentra dentro del folículo un movimiento de rotación "curettage" se puede hacer para lograr una total evacuación de los contenidos foliculares. Cuando un segundo folículo se encuentra adyacente al aspirado, la dirección del transductor es alterada ligeramente hasta colocar al segundo folículo en la dirección de la aguja. Este segundo folículo será puncionado sin tener que sacar la aguja del tejido ovárico. Al cambiar de ovario es recomendable retirar la aguja y hacer correr por ella líquido de colección o buffer fosfato salino (PBS). El líquido folicular es luego filtrado y enjuagado con PBS para decantar la sangre que dificulta la búsqueda de los ovocitos. El filtrado se coloca

133 suavemente en una caja de petri y los ovocitos son buscados con la ayuda de una lupa estereoscópica a un aumento de 40x - 120x. Los ovocitos localizados son lavados con medio de cultivo de tejidos TCM 199 y colocados en estufa de cultivo embrionario por un lapso de 24 horas hasta el momento de la fertilización. FACTORES QUE AFECTAN EL PORCENTAJE DE COLECCIÓN Presión de aspiración El porcentaje de ovocitos colectados por folículo punzado esta directamente relacionado con la presión de aspiración. La presión del vacío de aspiración es dependiente de la longitud y el calibre del tubo de colección y aspiración. Usualmente la presión puede ser controlada por una manómetro. Más preciso que la presión de aspiración (mm de Hg) es la velocidad del flujo colectado (medida en mV/min) siendo muy fácil de estandarizar antes de comenzar la aspiración. Diferentes presiones o velocidades de flujo fueron evaluadas en un mismo experimento con ovarios provenientes de matadero. Estas fueron de 11, 22, 33 y 60 mV/min. los resultados demostraron que la velocidad de 22 mVmin era la mas adecuada (Brogliatti y col., 1995), dando la mayor cantidad de ovocitos y manteniendo la calidad (número de capas de células de la granu!osa) Tabla 1 y 2. Tabla 1. Efecto de la presión de aspiración sobre la tasa de colección en ovarios de matadero Presión de aspiración (ml/min) Item 10 22 33 66 Número de ovarios 116 114 118 122 Número de folículos 1306 1186 1210 1202 Número de Ovocitos 326 466 364 307 Tasa de colección (%) 25 b 39. 30 ab 28 b ab Porcentajes con letras diferentes son significativamen Tabla 2. Efecto de la presión de aspiración sobre la calidad y morfología de los complejos cumulus ovocito de ovario de matadero. Presión de aspiración (ml/min) Clasificación de los Ovocitos 10 22 33 66 (%) (%) (%) (%) A(>4capas de celu1as granulosa) 15.8±l.6a 18.4±l.4a 3.3±l.0b 0.8±0.4c (39.1) (31.6) (7.2) (2.3) B (1-3 capas de celulas granulosa) 10.6 ±. 7a 14.7 ± 2.0a 7.1±4 ab 4.1±l.2 b (26.2) (25.2) (15.5) (10.7) C (denudados) 11.1±l.3c 21.9 ± 2.6b 32.7±l.9a 28.8±3.3a (27.2) (37.5) (72.0) (74.9) D (cumulus expandidos) 3.2±0.7 3.3±0.8 2.4±0.6 4.6 ±0.6 (7.5) (5.7) (5.3) (12.1) Total 40.7 58.3 45.5 38.4 (100)

(100)

(100)

abc Proporciones con letras en común no son significativamente diferentes (P10 mm. Aunque el refuerzo de inhibina casi duplicó el número de folículos aspirados, números similares de ovocitos fueron recuperados resultando en índices de recuperación menores. En los grupos de control y tratados con PMSG, no hubo diferencia en la distribución de folículos con diferentes tamaños, el número de folículos adecuado para aspiración y el número total de ovocitos colectados. Meintjens y colegas trataron 2 grupos de 10 vacas preñadas con 40 o 20 mg FHS, comparado con 10 vacas de control preñadas, y un cuarto grupo que incluía 10 vacas en mitad de ciclo tratadas con 40 mg de FSH, sirvieron como controles no-preñadas. La colección de óvulos se realizó en todas las vacas a las 12 horas de la última inyección de FSH o de placebo. Los índices de recuperación y el porcentaje de ovocitos viables fueron los más elevados en los grupos tratados con 40 mg. Los índices de clivaje fueron significativamente más elevados en las vacas preñadas, comparadas con los animales no preñados. Looney y colegas (1994) trataron las vacas donantes que tuvieron un bajo nivel de actividad ovárica con 4-5 mg de FSH dos veces por día durante 3 días, previos a la recuperación de ovocitos. Los ovarios fueron punzados una vez por semana, variando los intervalos entre dos sesiones consecutivas de OPU de 4-11 días. El tratamiento aumentó significativamente el número de folículos aspirados (8.9 vs. 12.3) y ovocitos recuperados (6.2 vs. 8.6). Las donantes tratadas con FSH produjeron significativamente más embriones grado 1-2 por sesión (1.38) que los animales no tratados (0.96), lo que resultó en más gestaciones.

136 Experimentos similares fueron llevados adelante. Se trató a vacas de carne ciclando (A) y vacas preñadas (B) con 40 mg de FSH, pero aquellas en el grupo A recibieron 25 mg de PGF2alfa en el momento de la séptima inyección de FSH, mientras que alas del grupo B se les dio un volumen igual de solución salina. Las vacas preñadas no recibieron ni FSH ni PGF2alfa y sirvieron como grupo de control (C). Los ovocitos fueron colectados quirúrgicamente por punción de los folículos durante el primer trimestre de preñez y expuestos a Fertilización In Vitro. El número promedio de folículos observados por ovario 12 horas luego del tratamiento con FSH fue similar para ambos tratamientos A y B (8.1 y 7.7 respectivamente), pero sus números de folículos fueron más elevados comparados con los controles (1.1). Stubbings y Walton (1992) compararon el número de folículos adecuados para punción en vacas no estimuladas sometidas a OPU dos veces por semana, con ganado en los cuales los ovocitos fueron recuperados una vez por semana, siguiendo tratamiento con 400 mg de FSH. El número promedio de folículos disponibles para punción cada semana no difería significativamente entrelas vacas estimuladas (14.2-+1.9) y las no estimuladas (15.7-+3.3). En un experimento llevado a cabo en la Universidad de Saskatchewan, Canada; se indujo superestimulación a 38 vaquillonas adultas con FSH (Foltropin) durante 3 días y otro grupo con FSH más la inyección de una dosis de LH (Lutropin) 12 horas antes de la colección se encontraron diferencias significativas en las tasas de colección. El tratamiento con LH incremento el número de ovocitos colectados por folículo aspirado o punzado (54% sin LH versus 66% con LH). La calidad de los ovocitos también se alteró, en el grupo sin LH solamente tuvo el 3% de cumulus expandidos mientas que en el grupo con LH se encontraron el 18% de los cumulus expandidos. La cantidad de ovocitos con calidad A (más de 4 capas de células) y B (de 1 a 3 capas de células) no fue alterada entre los grupos con y sin LH (35% v s 31%) y (45% v s 42%) respectivamente. Se concluye que los resultados de la estimulación de ovarios con PMSG o FSH son inconsistentes, aunque frecuentemente se registra un efecto positivo en el crecimiento folicular. Es incierto si estos folículos extra contienen ovocitos de buena calidad. Los tratamientos con FSH pueden inducir asincronía entre la maduración del ovocito y su folículo circundante o entre la maduración nuclear y citoplasmática (Betteridge y col., 1989), resultando en índices reducidos de desarrollo (Beokin y col., 1994). Por otra parte, existe un efecto positivo de FSH, en la proporción de folículos con un diámetro >- 6 mm, la calidad de los ovocitos recuperados después de sacrificar al animal y los números de blastocitos viables en desarrollo. Finalmente, algunos investigadores cuestionan el uso de la estimulación hormonal. Kruip y colegas (1994) manifestaron que la OPU es una técnica que puede ser aplicada, sin utilizar hormonas, en todas las situaciones donde se presentan folículos con un diámetro mayor de 2 mm. Pieterse y colegas (1999) también concluyeron que la OPU repetida es posible en vacas no estimuladas, con buenos índices de recuperación de alrededor de 50-60% como resultado. Se debe tener en cuenta el crecimiento de las ondas foliculares y el momento del ciclo estral del paciente para detenninar el día de punción para así obtener calidad y cantidad de ovocitos para la fertilización in vitro.

137 Tipo de aguja de colección Diferentes tamaños y tipos de agujas han sido utilizados para aspirar folículos por la vía transvaginal. Se ha observado que al cambiar el tamaño de la aguja las tasas de recuperación no se alteraban significativamente pero si la calidad de los ovocitos. Al utilizar agujas de menor calibre (16G) los ovocitos se denudaban en mayor facilidad. Las agujas de doble lumen, en las cuales se puede inyectar líquido al folículo al mismo tiempo que se aspira produciendo un lavado del folículo se ha incrementado la tasa de colección hasta en un 20 y 30 % en humanos y equinos. Estas agujas son muy costosas haciendo la técnica más complicada y lenta. No se han encontrado diferencias significativas en la tasa de recuperación de ovocitos al incrementar el tamaño de la ajuga. El tamaño más comúnmente utilizado es de 18 G y 19 G. Se recomienda que las agujas sean de vicel corto así al punzar el folículo se minimiza la posibilidad de perder el líquido folicular. Los equipos más modernos han cambiado el sistema de alocación de aguja y transductor permitiendo la utilización de agujas descartable. De esta manera el cambio de agujas entre animales es simple y económico como también permite probar distintos diámetros y biseles.

Efecto del estatus folicular y la frecuencia de punción Varios estudios han mostrado que la técnica OPU es altamente repetible. Pieterse y colegas punzaron todos los folículos > -3 mm o en los días 3-4, 9-10 o 15-16 del ciclo estral en 21 vacas durante un período de tres meses. Los folículos fueron clasi:ficados de acuerdo con el tamaño; F1 con un diámetro de 3-5 mm, F2 6-10 mm y F3 > lO mm. El fluido en cada folículo fue colectado en forma separada y examinado para chequear la presencia de un ovocito. La influencia de la etapa del ciclo en OPU repetido fue estudiada utilizando una combinación de detección de estro y muestras de progesterona sérica. El número total promedio de folículos punzados por ciclo estral fue de 12.6+ -0.3. Un número más elevado de folículos fue punzado en los días 3-4 comparado con las otras dos etapas del ciclo estral. Los índices de recuperación fueron similares en los diferentes días de punción, siendo el índice general de 55%, y para los diferentes grupos de diámetros de folículos de 59% (F1), 55% (F2) y 43% (F3), indicando que se recuperaron más ovocitos de folículos más pequeños. Concluyendo la cantidad de foliculos presentes en el ovario a un determinado día del ciclo estral estará dada directamente por el crecimiento y estatus de la onda folicu1ar. Así también el tamaño de los folículos y la calidad de los ovocitos a colectar. Van der Schans y col. (1991), investigaron la influencia de la frecuencia de punción en los resultados de OPU. Las vacas fueron estimuladas con un tratamiento de PMSG de 500 UI semanales, sin importar la etapa del ciclo y el momento de la punción. Un número mayor de folículos (46.0 vs. 25.3) fué punzado y se recuperaron más Complejos Cumulus Ovocito (18.8 vs. 10.8) cuando los ovarios fueron punzados dos veces por semana en lugar de una. La frecuencia de colección no afectó ni el número de folículos aspirados (25.3 vs. 23) ni el número de Complejos Cumulus O/ovocito colectados (10.8 vs. 9.4) por sesión.

138 Diferentes frecuencias de aspiración de folículos fueron examinadas por. En un grupo, la aspiración de folículos tuvo lugar a intervalos de 48 horas durante un período de 65 días; en un segundo, los intervalos fueron de 96 horas. Durante el experimento, el número de folículos aspirados en el grupo 2 aumentó, mientras que permaneció similar en el grupo 1. En el primer grupo, el porcentaje de ovocitos morfológicamente intactos decreció significativamente, mientras que se mantuvo constante en el grupo 2. Los índices de recuperación fueron de 38.1% y 31.4% en los grupos 1 y 2 respectivamente. Estos resultados muestran que es posible aspirar folículos repetidamente en la misma vaca a intervalos cortos, con un aumento significativo en el número de folículos como resultado, probablemente por la ausencia del efecto inhibitorio de un folículo dominante, el que no se puede desarrollar debido a la alta frecuencia de punción. Gibbons y col. (1994) recuperaron ovocitos punzando 2 grupos de vacas una vez o dos veces por semana. Para examinar si la frecuencia de aspiración folicular influenció el índice de recuperación, la punción ovárica comenzó en los días 3-4 del ciclo y continuó por cinco semanas. Durante cada sesión, se punzaron todos los folículos con un diámetro >2 mm. El número de ovocitos recuperados fué el mismo en ambos grupos, 6.8 ovocitos por sesión para aquellos colectados una vez y 6.3 para aquellos colectados dos veces. Se recuperaron más ovocitos de vacas en un grupo donde tuvieron lugar dos colecciones por semana en lugar de una. Los resultados de Fertilización in Vitro subsiguiente no mostraron diferencias entre los dos grupos. Concluyeron que en una operación de OPU comercial, podían producirse más embriones transferibles con 2 sesiones por semana. No hay informes de complicaciones posteriores a la punción, ni siquiera después de la OPU repetida. Pieterse y col. (1991)no encontraron adherencias en su experimento, ni en el examen rectal ni después de ser sacrificado el animal. OPU no pareció tener ningún otro efecto en la fertilidad de la donante. La variación en el diseño experimental hace dificil comparar resultados obtenidos de grupos diferentes, y el uso de estimulación hormonal previa a la colección de óvulos complica aún más la evaluación del método. No obstante, hay un acuerdo general de que un esquema con 2 sesiones colectoras de ovocitos por semana tiene un efecto positivo en el número final de blastocitos cultivados. Debe asumirse que el folículo dominante es extirpado durante cada sesión cuando se punza una vaca dos veces por semana, estimulando de esta forma una onda adicional para que crezcan folículos más pequeños (Armstrong y col. 1994). Además, la ausencia de un folículo dominante cuando se inicia un tratamiento de superovulación también da una producción de embriones significativamente más alta en la Transferencia de Embriones clásica. En un experimento que llevamos a cabo se compararon la tasa de colección (número de ovocitos colectados/ número de folículos punzados) y la morfología de los ovocitos proveniente de folículos dominantes y folículos subordinados en el día 3 y 5 de la onda folicular. El número de folículos dominates no fue significativamente diferente entre los días 3 y 5; mientras que si varió el diámetro de estos folículos. El número de folículos subordinados fue significativamente menor hacia el día 5 mientras que el diámetro promedio aumentó en los del día 5. Finalmente no se comprobó diferencia alguna en la tasa de colección entre el estatus folicular (dominantes versus subordinados) y el día de la onda folicular (Dia 3 versus Dia 5). Los ovocitos colectados de los folículos subordinados en el día 5 fueron de cumulus expandido (p6 mm)* 2.0 ± 0.4 21.6 ± 0.2 Número de folículos aspirados 1.6 ± 0.3 19.2 ± 0.2 Número de ovocitos colectados 0.4 ± 0.6 7.2 ± 0.2 Porcenta.je de colección 25% 37 % * solo los folículos de 6 mm de díametro fueron aspirados

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La superstimulación ovárica no resolvió el problema de inmovilización del ovario pero si incremento el número de folículos ? de 6 mm de díametro y consecuentemente la cantidad de folículos a punzar. Los ovarios fueron localizados mas facilmente en los animales superestimulados, al igual que en las terneras de 1 mes de edad. Masas pequeñas altamente ecogénicas fueron detectadas dentro de los folículos 24 horas despues de la folículo aspiración y se mantuvieron presentes por 3 o 4 días. Algunos autores en otras especies han diagnosticado la luteinización del folículo y la producción de progesterona. En las terneras de 6 meses de edad estas masas fueron analizadas e interpretadas como hematomas intrafoliculares dado que no produjeron progesterona circulante comparadas con los animales control (no aspirados) (Brogliatti y col., 1995).

CONCLUSIONES Como hemos observado, la folículo aspiración transvaginal por ecografia guiada es posible en terneras prepuberes. Algunos de los datos a destacar son las modificaciónes del transductor . Este no esta comercialmente disponible y las modificaciónes deben realizarse por un experto. Las imágenes obtenidas fueron satisfactorias en las dos posiciones y edades. Los diferentes planos y ángulos de examinación para la localización de los folículos y posterior punción fue alcanzada luego de un tiempo de trabajo y aprendizaje. El técnico debe familiarizarse con la imágen en sí y con la metodología a seguir durante la examinación. Agujas de excelente filo son indispensables en este procedimiento de mano libre o "free hand". Otra de la consideraciones a tener cuenta es la inmovilización del paciente durante este procedimiento. Esta técnica debe refinarse con el paso del tiempo y en el futuro se debe prestar atención al mejoramiento de la tasa de colección, como así tambien la calidad de estos ovocitos para desarrollar embriones in vitro. Tratamientos con hormona LH y el uso de agujas de doble lumen son propuestas para mejorar la tasa de colección. En resumen, la ecografia guiada transvaginal para la colección de ovocitos es un método no invasivo, repetible y no complicado que no compromete la fertilidad posterior del animal. Lograr embriones por fertlización in vitrode terneras prepúberes es una meta ambiciosa que en un futuro puede ser muy útil en los programas de selección genética.

147 BILBIOGRAFÍA !

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