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Profesor Patrocinante Dr. Ociel Muñoz Fariña Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos. Facultad de Ciencias Agrarias.
EVALUACIÓN E IMPLEMETACIÓN DE UNA METODOLOGÍA DE EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN POR HPLC DE MATAIRESINOL y SECOISOLARICIRESINOL PARA LA CARACTERIZACIÓN DE SEMILLAS DE VARIEDADES DE LINUM USITATISSIMUM L.
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico.
HÉCTOR ANDRÉS CID SILVA VALDIVIA – CHILE 2010
"Daría todo lo que sé, por la mitad de lo que ignoro." René Descartes (1596-1650) Filósofo y matemático francés.
Dedicada a Luisa y Paula por su incondicional amor.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco en primer lugar a el Profesor Ociel Muñoz Fariña, por confiar en mí y aceptarme como alumno tesista, por su apoyo y por entregarme las herramientas necesarias para el proceso de desarrollo de mi tesis. Quiero hacer partícipes en mis agradecimientos a los profesores informantes: Profesora María Adela Martínez y al Profesor Alejandro Romero Mella, por sus aportes en la corrección y evaluación de ésta tesis. Igualmente, quiero agradecer a todas los funcionarios de ICYTAL que colaboraron de alguna manera en el desarrollo de este trabajo. Me gustaría además agradecer a mis amigos por apoyarme en los momentos cuando necesité. Finalmente quiero dar las gracias a mi familia por su incondicional apoyo.
El financiamiento para el desarrollo de esta tesis fue obtenido del Proyecto FONDECYT numero 1080277: “FLAXSEED: CHILEAN AND FOREIGNER VARIETIES, ITS BIOACTIVE
PROPERTIES
DEVELOPMENT”.
CHARACTERIZATION
AND
USES
IN
FOOD
INDICE DE MATERIAS.
Capítulo
Página
1
RESUMEN.
1
1.1
SUMMARY.
2
2
INTRODUCCIÓN.
3
2.1
El lino y la linaza.
3
2.1.1
Descripción botánica general.
3
2.1.2
Historia.
3
2.1.3
Características macroscópicas de la semilla de lino.
5
2.1.4
Características de crecimiento y cultivo del lino.
6
2.1.5
Distribución mundial.
7
2.1.6
Usos actuales de la linaza y valoración comercial.
7
2.1.7
Composición de la semilla y propiedades nutricionales.
8
2.2
Los lignanos.
12
2.2.1
Distribución en la naturaleza.
12
i
2.2.2
Estructura y origen metabólico.
13
2.2.3
Los lignanos en la dieta y efectos benéficos para la salud.
14
2.2.4
Distribución estructural de los lignanos SDG y MATA en la
16
semilla de lino. 2.3
Métodos disponibles para caracterizar y cuantificar
20
lignanos. 2.4
Principios de cromatografía líquida.
21
2.5
Importancia de la validación de metodologías analíticas.
22
2.6
Hipótesis de trabajo.
24
2.7
Objetivos.
25
3
MATERIALES Y MÉTODOS.
27
3.1
Materiales y equipos.
27
3.2
Muestras.
29
3.3
Métodos.
30
3.3.1
Separación y cuantificación de lignanos por HPLC UV-
30
visible. 3.3.2
Preparación de la harina de linaza.
34
ii
3.3.3
Desgrasado de la harina de linaza por método de Soxhelt.
34
3.3.4
Determinación del porcentaje de humedad promedio de la
35
harina de linaza. 3.3.5
Determinación del porcentaje lipídico de la harina de linaza.
37
3.3.6
Método de extracción.
37
3.3.7
Separación y detección de lignanos por HPLC de detección
45
ultravioleta. 3.3.8
Evaluación del funcionamiento total de la metodología de
45
extracción. 3.3.9
Evaluación de las diferencias del contenido de lignanos
47
respecto a la variedad y lugar de cultivo. 3.3.10
Validación.
48
4
RESULTADOS.
54
4.1
Metodología evaluada.
54
4.1.1
Detección.
54
4.1.2
Separación cromatográfica de los patrones.
57
4.1.3
Método de extracción: adaptaciones y modificaciones.
65
4.1.4
Pruebas de funcionamiento de la metodología de
70
extracción. iii
4.1.5
Validación.
71
4.1.6
Porcentajes de humedad y lípidos de las semillas de lino de
75
las variedades en estudio. 4.1.7
Evaluación de las diferencias del contenido de lignanos,
75
respecto a la variedad y lugar de cultivo. 5
DISCUSIÓN.
86
5.1
Metodología evaluada.
86
5.2
Evaluación del contenido de lignanos en variedades de
90
semilla de linaza. 5.3
Conclusiones.
93
6
BIBLIOGRAFÍA.
96
7
ANEXOS.
103
iv
ÍNDICE DE FIGURAS.
Figura 1
Página Estructura de las moléculas que conforman el complejo que
18
contiene a SDG. 2
Estructura de la macromolécula de SDG.
19
3
Esquema general de un sistema de HPLC.
23
4
Estructura molecular de los estándares utilizados en el
31
desarrollo de la metodología de separación 5
Equipo Soxhlet para extracción de grasa.
36
6
Esquema resumen de la metodología de extracción en
39
estudio. 7
Sistema artesanal de evaporación por arrastre de vapor.
42
8
Sistema de extracción en fase sólida.
44
9
Espectros de máxima absorción de los estándares
55
utilizados para la separación cromatográfica de lignanos. 10
Cromatogramas de las pruebas de columnas.
11
Cromatogramas de las pruebas de mezclas de solventes.
59 60-61
v
12
Cromatogramas de pruebas de flujo para la mezcla de
63
solventes más óptima. 13
Cromatograma de separación de lignanos característico de
64
una muestra de semilla. 14
Gráfico de medias del contraste de hipótesis respecto al
77
contenido de SECO de las variedades de linaza en estudio. 15
Gráfico de caja y bigotes (Box and Wisker) del contraste de
79
hipótesis de las diferencias de concentración de SECO según año de cosecha para la variedad Celestina. 16
Gráfico de caja y bigotes (Box and Wisker) del contraste de
81
hipótesis de las diferencias de concentración de SECO de la variedad Carmine, según año de cosecha. 17
Gráfico de caja y bigotes (Box and Wisker) para el
82
contraste de hipótesis de las diferencias de concentración de SECO de la variedad CDC Bethune, según país de cosecha. 18
Gráfico de caja y bigotes (Box and Wisker) para el
84
contraste de hipótesis de las diferencias de concentración de SECO de la variedad CDC Sorrel, según país de cosecha.
vi
19
Gráfico de caja y bigotes (Box and Wisker) para el
85
contraste de hipótesis de las diferencias de concentración de SECO
de las cuatro variedades en ambos predios
experimentales.
ÍNDICE DE TABLAS.
Tabla 1
Página Valores de absortividad molar (ε), peso molecular y fórmula
56
molecular de los analitos en estudio. 2
Resumen de las curvas de calibración promedio de cada
73
analito. 3
Valores obtenidos para la sensibilidad, precisión y
74
exactitud.
ÍNDICE DE ANEXOS.
Anexo 1 2
Página Tablas de resultados estudio variedades SECO. Deducción del cálculo de concentraciones de SECO y
103 112
MATA en base seca.
vii
ABREVIATURAS.
Abreviatura
Nombre
ANOVA
Análisis de varianza simple
Ccα
Límite de decisión
Ccβ
Límite de cuantificación.
EDOL
Enterodiol
ELAC
Enterolactona
GAp-C
Ácido p-coumarico
GAF
Ácido ferúlico
HDG
Herbacitina diglucosido
HMGA
Ácido 3-hidroximetil-3-metilglutarico
LOD
Límite de detección.
LOL
Límite de linealidad
LOQ
Límite de cuantificación
MATA
Matairesinol
viii
SDG
Secoisolariciresinol diglucósido
SECO
Secoisolariciresinol
SPE
Solid Phase Extraction
ix
1.
RESUMEN.
La linaza presenta una considerable concentración de compuestos bioactivos, principalmente ácido alfa-linolénico, fibra dietética y lignanos. Esto ha provocado el interés en su uso en la formulación de alimentos. Para potenciar su cultivo y mostrar su potencial comercial, debe conocerse sus bondades nutritivas y el contenido de compuestos bioactivos en las variedades de semilla. En el presente trabajo, se comparan diferentes variedades de semilla, dos de origen nacional y otras dos extranjeras. La comparación se realizará con respecto al contenido de los lignanos matairesinol y secoisolariciresinol. Primeramente se analizaron semillas obtenidas desde su origen (Canadá y Chile) y luego se analizarán las semillas después de cultivarlas en dos localidades de la IX Región, Cajón y Gorbea, para conocer cual variedad es la más viable para su cultivo, respecto al contenido de lignanos. Para cuantificar estos compuestos, se evaluó e implementó una metodología de extracción y se desarrolló una metodología de cuantificación por HPLC-UV-visible. Los resultados de secoisolariciresinol, mostraron diferencias según origen de cultivo para cada variedad, mostrando concentraciones promedio para la variedad Carmine de 2,280; 10,515 y 9,018mg/g en su origen, en el predio de Cajón y en el predio de Gorbea respectivamente. En el mismo orden los resultados de la variedad Celestina fueron 4,931, 0,853 y 0,667mg/g. Para la variedad CDC Bethune fueron 3,814; 0,840 y 8,216mg/g. Finalmente la variedad CDC Sorrel mostró 2,642; 3,485 y 1,863mg/g. Matairesinol no fue detectado.
1
1.1. SUMMARY.
Flaxseed has a significant concentration of bioactive compounds, especially α-linolenic acid, dietary fiber, lignans and other polyphenols. That has led to to be use it in food formulations. To boost their consumption and to show its industrial commercial potential, we must know the nutritional benefits and bioactive compounds contents existing in seeds varieties. In the present work, four different seeds varieties are compared: two from Canada and two from Chile. The lignans matairesinol and secoisolarciresinol contents are compared between the different varieties.Firstly the seeds cultivated in their native countries (Canada and Chile) were analized. After that both group of seeds were cultivated in two different zones of IX region, Cajón and Gorbea, and later they were analized in their lignin contents to know their viability as potential food ingredients. In order to quantify these compounds, methodologies for extraction and for quantification have been evaluated and implemented in this work. The results of secoisolariciresinol, show differences for each variety, according the crop origin, shows average concentrations for Carmine variety of 2,280; 10,515 y 9,018mg/g in its origin, in the experimental soil Cajón and in the experimental soil Gorbea respectively. In the same order the results for Celestina Variety was 4,931, 0,853 y 0,667mg/g. The results for CDC Bethune variety was 3,814; 0,840 y 8,216mg/g. Finally CDC Sorrel variety shows 2,642; 3,485 y 1,863mg/g. Matairesinol wasn’t detected.
2
2.
INTRODUCCIÓN.
2.1. El lino y la linaza.
2.1.1. Descripción botánica general.
Linaza es el nombre que se le da a la semilla de la planta conocida como lino, cuyo nombre científico es Linum usitatissimum. Es una planta anual de hojas pequeñas, de una altura entre 30 y 120 cm. Produce comúnmente flores azul-celeste, todas de igual color en el mismo pie, y que fructifica en cápsulas que encierran semillas aceitosas, que van de un color dorado hasta el castaño. Posee tallos esbeltos, poco o muy ramificados (Ramella, 1944). De esta especie, existen una serie de variedades, las cuales pueden dividirse a grandes rasgos en dos grupos: lino textil, el cual presenta semillas pequeñas y un alto contenido de fibra en sus tallos; y el lino oleaginoso, conocido como linaza, el cual presenta semillas más grandes y donde la planta es menos fibrosa (Remussi,1951).
2.1.2. Historia.
El lino es una planta la cual se cree que proviene de las regiones del sudoeste de Asia, incluyendo la India, Sur de Afganistán y las regiones adyacentes de Bokhara, Kasmir, Persia y Asia menor. Esta zona habría dado origen a los linos de flores y semillas pequeñas. Otra región de donde se cree se originó, corresponde a ciertas zonas del
3
mar mediterráneo, en donde se localizarían linos de flores y de grandes semillas (Remussi, 1951).
Linum usitatissimum, el nombre científico usado para el lino dentro de la familia Linaceae, es muy descriptivo. De hecho, el nombre Linum proviene de la palabra celta “lin” que significa “hilo”, y el nombre usitatissimum proviene del latín y significa “muy útil”. El origen lingüístico ancestral del nombre de esta oleaginosa, da a comprender la importancia económica y social que ha tenido en la historia. Esto se refleja en el uso que se le ha dado a través de la historia, ya que se ha documentado que el cultivo del lino fue uno de los primeros en ser domesticados, hace unos 7.000 años antes de nuestra era. Además se han encontrado accesorios de vestir hechos de lino en la región del mar muerto, que datan de hace 6.000 años antes de nuestra era (Vaisey-Genser y Morris, 2003).
La línea cronológica suma y sigue acontecimientos en el uso de esta noble planta, la cual se disemina desde Asia menor a otros lugares del mundo, especialmente a Europa, donde llega a ser cultivada para una escala de consumo de la totalidad de los ciudadanos del Imperio Romano, por órdenes del emperador Carlomagno (anónimo, Flax Council of Canadá, 2009). En el periodo del renacimiento, el aceite de linaza se utiliza con fines artísticos como diluyente oleoso, uso que se le da aún en nuestros días. En el periodo de la colonización francesa a Norteamérica, los inmigrantes introducen el lino en dicha región, donde actualmente se concentra una buena parte de la producción mundial. Ya en el siglo XIX, la revolución industrial comienza, patentándose los pisos de
4
linóleo en la Gran Bretaña (Vaisey-Genser y Morris, 2003).
La invención de la desmotadora de algodón en el año 1.793, prevé el final de la dominación del lino en la producción de hilo y finalmente en el siglo pasado, en la década del 20, colapsa la industria del lino. (Vaisey-Genser y Morris, 2003).
Dentro de los últimos 30 años, se ha retomado el interés en la semilla de lino, debido al mayor conocimiento de sus propiedades como alimento (Hall et al., 2003).
2.1.3. Características macroscópicas de la semilla de lino.
La semilla posee apariencia ovoide, alargada, aplanada, con un borde filoso, con una de sus extremidades terminada en punta roma, algo oblicua; superficie brillante, y observada a la lupa se observan pequeñas hendiduras; tiene dos cotiledones aplanados, que constituyen la mayor proporción del embrión; este último está rodeado por las cubiertas de la semilla y por una delgada capa de endoesperma. La testa tiene una capa exterior que contiene la mayoría de la fibra soluble y dos interiores ricas en fibra y lignanos. Desde un punto de vista estructural, la testa, endoesperma y cotiledones representan el 22, 21 y 57%, respectivamente (Daun et al., 2003; Oomah, 2003).
La semilla es inodora, de sabor oleoso y mucilaginoso, de 4 a 6mm de longitud y un diámetro medio de 2,5 a 3,5mm. Su color puede variar desde el blanco hasta diversos
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matices amarillos o bien castaños. Algunas pueden ser variegadas. A pesar de la creencia de que el color externo de la semilla es un indicador de ciertos compuestos de la linaza, no se han encontrado variaciones que sustenten que haya una diferencia entre ellas más allá de las causadas por las condiciones de cultivo. El peso de 1.000 semillas es de 5 ± 1g (Daun et al., 2003; Oomah, 2003).
2.1.4. Características de crecimiento y cultivo del lino.
El lino es una planta anual, de crecimiento variable según la variedad, la densidad de la planta, la fertilidad del suelo y la humedad. Es una planta principalmente autogama, pero entre un 0,3 a 2% de la polinización da naturalmente como resultado un cruzamiento. Los insectos son principalmente los agentes de cruzamiento. El ciclo de vida de la planta consiste en un periodo vegetativo de 45 a 60 días, un periodo de floración de 15 a 25 días y un periodo de maduración de 30 a 40 días. El estrés hídrico, las altas temperaturas y enfermedades pueden acortar cualquier periodo de crecimiento. El suelo debe estar firme, húmedo, procurando realizar una buena trilla para dejarlo limpio de basuras y pajas de otros cultivos. Su preparación comienza de la temporada de cosecha anterior, procurando un buen manejo de rotación de cultivo si se ha estado cultivando algún otro tipo de planta (Flax Council of Canadá, 2010).
Respecto a sus requerimientos nutricionales, el lino no tiene un crecimiento saludable cuando el suelo es de características de baja fertilidad, aun cuando teóricamente se utilicen las cantidades adecuadas de nutrientes inorgánicos como fertilizantes. Por lo
6
tanto, se debe tener conocimiento de las propiedades del suelo para adicionar los nutrientes (Flax Council of Canadá, 2010).
2.1.5. Distribución mundial.
Los lugares de cultivo dependen de que la zona geográfica presente las condiciones necesarias para el desarrollo. Actualmente se cultiva en 57 países, principalmente en países del hemisferio norte. Respecto de la semilla de lino cultivada para consumo, vale decir la linaza, según cifras oficiales entregadas por la Food and Agricultural Organization of United Nations (FAO), correspondientes al año 2007, los principales productores de linaza a nivel mundial corresponderían a Canadá con 633.500 ton producidas anualmente, seguido por China con 489.550, India con 168.000, Estados Unidos con 149.963 y Etiopía 108.222 ton. La producción chilena es muy pequeña, con tan solo 1.026 ton producidas, donde la mayoría de lo que se consume a nivel nacional, se importa desde Canadá (FAO, FAOSTAT®, 2009).
2.1.6. Usos actuales de la linaza y valoración comercial.
La semilla de linaza se destina principalmente para producir el aceite de linaza, que se utiliza mayormente para la producción de linóleos, en la formulación de finas pinturas oleosas y en algunas preparaciones de aceites comestibles. Se utiliza también en nutrición animal, dando mejores propiedades nutricionales en subproductos animales, como por ejemplo la leche de vaca, en donde el ácido α-linolénico pasa directamente a
7
la leche, enriqueciéndola con este ácido graso de gran valor (Flax Council of Canadá, 2010).
En la nutrición humana, el uso de la semilla de lino, se está consolidando en la cocina, en alimentos tales como mezclas de cereales para el desayuno, en harinas multigrano para preparaciones de pan, repostería en forma de galletas, wafles, snacks y otras preparaciones. También simplemente se consume la semilla junto con otros alimentos para mejorar la digestión (Flax Council of Canadá, 2010).
En el mercado chileno, buscando por la internet y revisando en góndolas de tiendas naturistas y de supermercados, se aprecia que el costo de venta al por menor de cada kilo de linaza va de los CLP$900 a los CLP$2.500. En Canadá, se observan precios por tonelada de semilla de lino por un valor de US$330 en mercado abierto. (Manitoba Agriculture, Food and Rural Initiatives, 2010).
2.1.7. Composición de la semilla y propiedades nutricionales.
A grandes rasgos, la linaza posee alrededor de un 40% de lípidos, un 30% de fibra dietética y un 20% de proteínas. Esta composición proximal varía considerablemente entre las variedades y según las condiciones ambientales en las que haya crecido la planta. En los cotiledones se encuentra el 87% de los lípidos y el 76% de la proteína de la semilla, en tanto que en el endoesperma reside sólo el 17% de los lípidos y el 16% de la proteína (Daun et al., 2003; Oohma, 2003).
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El detalle de la composición según grupo bioquímico es el siguiente:
Lípidos. El aceite, constituye el componente principal de la linaza (35 a 43 g/100g en base seca). Por años, el aceite ha sido el objetivo principal del procesamiento de esta semilla. Los cotiledones son el principal tejido donde es almacenado el aceite, el que está constituido principalmente por triacilgliceroles (98%) que se encuentran en forma de glóbulos de aceite. También en la fracción lipídica se encuentra un 0,9% de fosfolípidos y un 0,1% de ácidos grasos libres. Aunque la cáscara (testa) es relativamente pobre en lípidos (22%), su aceite es rico en ácido palmítico. En los cotiledones predomina el contenido de los ácidos α-linolénico, linoleico y oleico (Hall et al., 2006).
Es destacable que el ácido α-linolénico puede constituir hasta el 52% del total de ácidos grasos. Esto hace que se considere a la semilla de linaza como una de las más importantes fuentes de ácido α-linolénico en la naturaleza (Daun et al., 2003; Stavro et al., 2003 Hall et al., 2006).
Proteínas. El contenido de proteínas varía entre 22,5 y 31,6 g/100g en base seca. Las condiciones de procesamiento de la semilla (descascarado o desgrasado) afectan el contenido proteico del producto. La cáscara posee bajos contenidos de proteína, por lo que, la harina sin cáscara y desgrasada tiene un alto contenido proteico. Como en
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muchas otras semillas, el contenido de globulinas corresponde al tipo principal, llegando a un 77% del total de proteína presente, en tanto que el contenido de albúmina representa al 27% de la proteína total. La linaza es relativamente rica en los aminoácidos arginina, ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos de menor presencia son lisina, metionina y cisteína (Daun et al., 2003; Hall et al., 2006).
Hidratos de Carbono. La linaza contiene pequeñas cantidades de azucares solubles (1 a 2g/100g en base seca). La mayoría de los hidratos de carbono presentes, se encuentran contenidos en la fibra dietética. Se destaca de entre otros granos por ser una fuente rica en fibra dietética soluble e insoluble, la que en total puede llegar hasta un 28% del peso seco de la semilla. La relación entre fibra soluble e insoluble fluctúa entre 20:80 y 40:60. En la fracción soluble, se encuentra un hidrocoloide conocido como mucílago, que representa un 8% del peso de la semilla (Daun et al., 2003).
Componentes minoritarios. Entre los minerales, destaca el contenido de potasio, fósforo, hierro, zinc y manganeso. La semilla contiene además, vitaminas del grupo B. Como muchas semillas de tipo oleaginoso, contiene tocoferoles y tocotrienoles, estando muy relacionado su contenido con la presencia de ácido α-linolénico. También la mayoría de las variedades de linaza contienen esteroles como estigmasterol, campesterol y avenasterol; y carotenoides como luteína, β-caroteno y violaxantina (Hall et al., 2006).
10
Además la linaza tiene entre 0,8 y 1,3g/100g en base seca de flavonoides y lignanos, que se encuentran aproximadamente en 0,5 g/100g en forma esterificada, y de 0,3 a 0,5 g/100g están en la forma etérificada, existiendo variaciones importantes entre variedades y por las condiciones ambientales. Los ácidos fenólicos más abundantes en la harina de semilla descascarada son el ácido trans-ferúlico (46%), ácido trans-sinápico (36%), ácido p-cumárico (7,5%) y ácido trans-caféico (6,5%). La goma de linaza también puede tener cantidades considerables de ácidos fenólicos (Daun et al., 2003; Hall et al., 2006).
Una de las características más interesantes de la linaza es su contenido de lignanos. El compuesto de mayor interés es el secoisolaciresinol diglucosido (SDG), aunque también están presentes isolariciresinol, pinoresinol, mataresinol y otros derivados del ácido ferúlico (Daun et al., 2003).
Compuestos Antinutricionales. Dentro de este grupo tenemos el ácido fítico y los glúcidos cianogénicos como los más abundantes, aunque en la literatura no se han informado efectos nocivos provocados por el consumo de linaza (Hall et al., 2006). El ácido fítico representa entre el 60% y el 90% del contenido de fósforo presente en la semilla, siendo la principal forma de almacenamiento de este elemento y se estima que juega un importante papel en la viabilidad y vigor de la semilla (Daun et al., 2003).
11
Los glúcidos cianogénicos tienen la capacidad de liberar cianuro por hidrólisis ácida o enzimática. El efecto metabólico que tiene el consumo de glucósidos cianogénicos en los seres humanos depende de la cantidad consumida, la frecuencia de consumo, del estado nutricional y de salud del consumidor y de la presencia de otros componentes en la dieta que puedan interactuar con ellos. Cabe destacar que el uso de la linaza es habitualmente como ingrediente menor en preparaciones como el pan, bizcochos o cereales para el desayuno, por lo que los glúcidos cianogénicos no representan un problema para el consumo, especialmente porque luego del horneado no se ha detectado presencia de cianuro en ellos (Daun et al., 2003; Hall et al., 2006).
En la linaza, existen muy pequeñas cantidades de inhibidores de tripsina y no se ha detectado inhibidores de amilasas o hemaglutininas (Daun et al., 2003).
2.2. Los lignanos.
2.2.1. Distribución en la naturaleza.
Los lignanos se encuentran en variadas plantas, sobre todo en plantas alimenticias tales como el lino, la soja, el sésamo, el centeno, otras plantas del grupo de los cereales, bayas, berries, entre otras. Se encuentran en todas las partes de la planta, estando en algunas regiones anatómicas en más concentración que en otras. En el caso de la semilla de linaza, se encuentran mayoritariamente en las testas (Schwartz y Sontag, 2006; Thompson, 2003).
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2.2.2. Estructura y origen metabólico.
Los lignanos son metabolitos secundarios bioactivos no nutritivos. En la planta representan una función de protección contra fitopatógenos, como una respuesta frente al estrés y en la regulación del crecimiento. Son una de las mayores familias de fitoestrógenos, distribuidas en una amplia variedad de plantas (Schwartz y Sontag, 2006). Su estructura está constituida por un esqueleto dibencilbutano con diversos grados de hidroxilación. Además este grupo molecular presenta eterificaciones, esterificaciones, anillos furánicos y otras ciclaciones. La formación de los lignanos se genera a partir de la vía metabólica fenilpropanoidea, la cual involucra la formación de los aminoácidos tirosina (tyr) y fenilalanina (phe), donde la desaminación de la fenilalanina más otros procesos oxidativos de las enzimas del grupo Citocromo P-450, dan lugar a tres alcoholes aromáticos: coniferol, p-cumarol y sinapilol (Lewis et al., 2007).
Este grupo de compuestos se denominan monolignoles o bien se les conoce como derivados por sustitución del ácido cinaminico (Thompson, 2003; Lewis et al., 2007; Hu et al., 2007; Strujis et al., 2009).
Estos compuestos tienen una gran importancia en el ciclo vital de la planta, ya que su polimerización da lugar a la biosíntesis de lignina y su dimerización en lignanos. Estos monolignoles pueden condensar en todas las combinaciones posibles dando lugar a un esqueleto
dibencilbutano y
subsecuentemente sufrir
oxidaciones, reducciones,
13
deshidrogenaciones y reacciones de adición, dando lugar a la extensa variedad de estos compuestos, con al menos 2 isómeros ópticos para cada estructura (Thompson, 2003; Lewis et al., 2007; Strujis et al., 2009). Por el hecho de depender de la síntesis tyr/phe, la síntesis de lignanos se ve gobernada por necesidad metabólica de estos aminoácidos. (Lewis et al., 2007).
2.2.3. Los lignanos en la dieta y efectos benéficos para la salud.
Dada la distribución de estos polifenoles, podríamos inferir que con llevar una dieta de tipo mediterránea, se puede contar con un buen abanico de alimentos que proporcionen flavonoides, isofalavonas y lignanos. Para el caso de la linaza, es necesario consumir una cantidad mínima para apreciar los beneficios que esta otorga. Los efectos benéficos para la salud de lignanos, como el secoisolariciresinol diglucosido (SDG), residen en su capacidad antioxidante como secuestradores de radicales libres, típicos de la carga de estrés oxidatívo, las denominadas especies reactivas de oxigeno (ROS) (Rajesha et al., 2006; Hu et al., 2007).
Por otra parte, los lignanos, poseen similitud con el 17-β-estradiol, lo que les confiere propiedades de mimetismo esteroidal por ello se les considera fitoestrógeno. Este fenómeno ocurre no con los lignanos de la planta, sino que con derivados de estos (Rajesha et al., 2006; Hu et al., 2007).
14
Los lignanos de la planta son metabolizados en el intestino grueso humano por enterobacterias, dando lugar a derivados metabólicos conocidos como lignanos mamíferos (o enterolignanos), cuya estructura les permite funcionar como moduladores metabólicos, en diversos sistemas del organismo humano, gracias a un mimetismo esteroidal de carácter estrogénico y antiestrogénico (Rajesha et al., 2006; Hu et al., 2007).
Los efectos observados de esta modulación, son gracias a los lignanos enterolactona (ELAC) y enterodiol (EDOL), que corresponden a derivados del metabolismo de los lignanos matairesinol y secoisolariciresinol principalmente, los cuales son lignanos propios de la planta. Vale decir, que los lignanos vegetales no poseen el carácter de moduladores de tipo esteroidal en el organismo, por lo tanto, deben ser considerados nutricionalmente como prebióticos, ya que son un precursor de la molécula con la estructura de efecto nutracéutico (Bhathena y Velasquéz, 2002; Thompson, 2003; Hongyan et al., 2005; Giliani y Betz, 2006; Jungestrom et al., 2007; Sarinnem et al., 2007).
El modulador de esta respuesta es principalmente EDOL, ya que la mayor parte de los lignanos son convertidos a este último. Estos enterolignanos al pasar al torrente sanguíneo provocan diversos efectos de carácter beneficioso para la salud. De lo que se ha demostrado hasta ahora, el consumo de estos lignanos tiene relación con la prevención y control del crecimiento de algunas neoplasias de carácter maligna, tales como las neoplasias de mama, ya que la falta de estrógeno es un factor importante en
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la génesis de la enfermedad, la neoplasia coló-rectal y la neoplasia de próstata, ya que minimiza la angiogénesis. Además se ha demostrado que tienen un efecto reductor en la insulino-resistencia, relacionada con la obesidad, reduciendo la hiperinsulinemia, hiperlipidemia e hiperglucemia (Bhathena y Velasquéz, 2002; Thompson, 2003; Hongyan et al., 2005; Giliani y Betz, 2006; Jungestrom et al., 2007; Sarinnem et al., 2007).
2.2.4. Distribución estructural de los lignanos SDG y MATA en la semilla de lino.
En contraste con la mayoría de las plantas que poseen lignanos en forma libre, la situación de la semilla de lino es otra. El secoisolaciresinol, el más importante de los lignanos presentes en la linaza, se encuentra en la forma de diglucósido (SDG), estando mayoritariamente adosada a otras moléculas, formando macromoléculas de alto peso molecular de estas estructuras, de forma polimérica, con distintos niveles de prolongación. El SDG se encuentra formando enlaces ester con el ácido 3-hidroximetil3-metilglutarico (HMGA) y otros compuestos fenólicos como el glucósido del ácido pcoumarico (GAp-C) y el glucósido de ácido ferúlico (GAF). De igual manera que el SDG, la herbacitina diglucosido (HDG, un flavonoide) interactúa con las moléculas ya mencionadas de manera similar al SDG (Struijs et al., 2008; Yuan et al., 2008; Struijs., et al., 2009).
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Entonces tanto SDG como HDG son capaces de formar una cadena de HDG y/o SDG, en distintas combinaciones, por los enlaces ester formados con los ácidos mencionados anteriormente. Cabe recalcar que el HDG se encuentra en mucha menor cantidad que SDG, en una relación aproximada de 1 unidad de HDG por cada 11 de SDG. Las estructuras de las moléculas mencionadas se presentan en la figura 1. De esta manera, la cadena de lignano formada, tiene indistintamente HDG y/o SDG en alguna posición de la estructura de forma aleatoria, uniendo cada unidad de HDG o de SDG por un enlace éster con HMGA.
GAp-C y GAF se encuentran unidas directamente a SDG (o HDG). Una regla general de esta estructura, es que en la parte terminal de la molécula se encuentra generalmente presente GAp-C o GAF, o en su defecto HGMA. De lo anterior, se ha concluido que la extensión de la cadena de lignano está limitada por la cantidad de Gap-C y GAF en la biosíntesis de la macromolécula. Cabe destacar que la extensión del oligolignano varia de 1 a 7 unidades de SDG,o en su defecto alguna unidad de HDG. El promedio de extensión del oligomero es de 3 unidades de SDG. En la figura 2 se presenta la estructura general de este oligomero. (Struijs et al., 2008; Yuan et al., 2008; Struijs., et al., 2009).
El matairesinol se encuentra mayoritariamente en forma de monoglucósido, no formando una estructura tan compleja como la de SDG (Kraushofer y Sontag, 2002; Swchartz y Sontag, 2006; Thompson, 2003; Willfor et al., 2006).
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Figura 1. Estructura de las moléculas que conforman el complejo que contiene a SDG. a. SDG. b. HDG. c. ácido p-coumárico. d. ácido ferúlico y e. HGMA.
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Figura 2. Estructura de la macromolécula de SDG. a. Esquema de la estructura general de la macromolécula de SDG con sus constituyentes principales. Cada circulo representa una molécula de SDG (o bien alguna unidad de HDG); donde OA (ácido orgánico)=Gap-C o GAF. La unidad representada entre paréntesis puede tener un número de unidades que va de 0 < n < 6. b. Representación de la estructura promedio de la macromolécula, con 3 unidades de SDG.
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2.3. Métodos disponibles para caracterizar y cuantificar lignanos.
Los métodos de extracción existentes están diseñados en base al origen de la muestra. Esta puede ser alguna semilla, frutos secos, algún jugo digestivo, orina o bien plasma sanguíneo, lo que va a depender de los fines del estudio.
En este caso se trata de semilla. Los métodos de preparación de la muestra para la detección cromatográfica son muy variados y en general de elevado costo. Pero en todos los métodos es común la necesidad de liberar los lignanos de macro-complejos formados por polifenoles, glúcidos y otros ácidos orgánicos, rompiendo enlaces de tipo éster o bien liberándolos de alguna matriz de glúcidos a los cuales están adosadas (Millder et al., 2004; Thompson, 2006; Sontag y Scwhartz, 2006; Willfor et al., 2006).
Lo anterior se puede lograr a través de hidrólisis ácida o alcalina, dependiendo de la estructura de los lignanos que se desee extraer. Para obtener secoisolariciresinol sin glúcidos, se han descrito dos metodologías que destacan por sus buenos atributos analíticos: una hidrólisis enzimática y una hidrólisis ácida (Sontag y Scwhartz, 2006).
Los métodos para obtener una dilución final de la fracción de lignanos, pueden ser variados, pero como sugerencia de diversos autores, se considera óptimo el uso de la extracción en fase solida (SPE) para una fina separación. Los métodos para la detección y cuantificación son complicados, ya que estas moléculas son bastante similares lo que hace difícil su separación. Existen métodos de cromatografía de gases
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basados en las combinaciones GC-FID, GC-MS, GC-MS-SIM. Estos equipos son excelentes, pero de costo muy elevado. También hay metodologías en cromatografía líquida, con diversos métodos de detección tales como HPLC-MS, HPLC-DAD, HPLCDAD-MS, HPLC-MS/MS, HPLC-CEAD, HPLC-UV/vis. La mayoría son de costo considerable y el precio es reflejo de la potencia resolutiva, sensibilidad y prestaciones. La separación en columna se basa en el mismo principio para los métodos de detección por cromatografía de gases y lo mismo ocurre para el caso de cromatografía líquida, y es en este punto donde se ven grandes diferencias, en el tiempo que toma realizar el cromatográma de separación de la fracción de lignanos, donde se logran tiempos entre los 35 minutos a 1 hora, lo que idealmente debería ser más breve por el factor tiempo y los costos. (Millder et al., 2004; Thompson, 2006; Willfor et al., 2006).
2.4. Principios de cromatografía líquida.
El principio de separación de la cromatografía líquida, se basa en que los analitos a separar son movilizados a través de una fase móvil de estado líquido, en la cual las moléculas tienen distintos grados de solubilidad. Esta fase móvil, debe pasar a través de una matriz conocida como resina, que puede tener distintas propiedades, tales como ser polares, apolares, poseer carga neta o bien poseer ligandos específicos. Estas propiedades de la resina permiten que esta interactúe en diferente grado con las moléculas que pasan a través de ella, vale decir los analitos con la fase móvil, donde ésta generará más resistencia a la fase si las polaridades son de un carácter contrario. Así, el arrastre por la fase móvil de los analitos se ralentizará, y según la capacidad de
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cada analito de interactuar con la resina, se generará una separación. En el caso de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), la fase móvil atraviesa una fase estacionaria muy empaquetada, con un paso de fluido muy restringido, por lo cual debe inyectarse la fase móvil, por medio de una bomba que genere suficiente presión. En la figura 3 se muestra un diagrama general de un equipo de HPLC.
2.5. Importancia de la validación de metodologías analíticas.
La validación de un método es un requisito importante en la práctica de la química analítica. Sin embargo, se suele considerar a la validación de un método como una actividad que solamente se puede hacer en colaboración con otros laboratorios, y en consecuencia suele no realizarse. Sin embargo, la validación es la confirmación, mediante el suministro de evidencia objetiva, que se cumplen los requisitos para una utilización o aplicación específica de la metodología, para lo cual fue prevista.
Está implícito que los estudios para determinar los parámetros de aptitud del método, se hacen utilizando un equipamiento íntegramente funcional y que está correctamente calibrado. Además de que el operador es competente en ese campo de trabajo y tiene el conocimiento suficiente, por lo que es capaz de tomar decisiones apropiadas, a partir de las observaciones que le surgen en el transcurso del estudio de una metodología.
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Figura 3. Esquema general de un sistema de HPLC. Nota: no todos los sistemas son precisamente idénticos. Las flechas azules indican la dirección del flujo de la fase móvil. 1. Botellas con solventes. 2. Desgasificador de solventes. 3. Válvula de gradientes. 4. Tanque de mezcla para surtir fase móvil. 5. Bomba de alta presión. 6. Válvula inyectora en posición de inyección (en este punto entra la muestra). 6'. Válvula de inyección en posición de carga (cuando se carga la muestra). 7. Loop de muestra. 8. Precolumna (columna de resguardo). 9. Columna analítica (contiene fase estacionaria). 10. Equipo de detección (UV-Vis, Arreglo de diodos, IR, fluorescencia, etc.). En este punto puede haber más de un detector. 11. Ordenador/integrador (donde se convierte y procesa la señal analógica a digital; y se procesan los datos). 12. Desechos o bien colector de fracciones. Extraída de Meyer, 2004.
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Muchos de los parámetros de la aptitud del método que se asocian con la validación son de hecho evaluados, como parte del desarrollo de la metodología, y que debe realizarse en los siguientes casos: desarrollo de metodologías, al revisar un método ya establecido para mejorar o extenderlo a un nuevo problema, cuando el control de calidad indica que el método en uso está cambiando con el tiempo, cuando se usa un método ya establecido en un laboratorio diferente, con diferente analista o con diferente instrumental, o bien para demostrar la equivalencia entre dos métodos.
2.6. Hipótesis del trabajo.
Al comprender los beneficios que puede tener la linaza, y de la potencialidad de su utilización como materia prima en la formulación de alimentos, se hace necesario conocer cuáles son las variedades de linaza (sean estas nacionales o extranjeras) que poseen el mayor valor nutricional así como también cuales de estas variedades aportan los mayores contenidos de los compuestos que le confieren propiedades funcionales. Y de esta forma determinar cuál de las variedades es la más idónea para ser utilizada como ingrediente en la elaboración de alimentos. Además también es necesario evaluar si las variedades extranjeras resultan idóneas para su uso, y si éstas mantienen sus propiedades al ser cultivadas en suelos chilenos.
Según lo anterior, con el fin de satisfacer las necesidades de la línea de investigación, y de la presente tesis, se plantean las siguientes hipótesis:
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El contenido de los lignanos secoisolariciresinol y matairesinol es prácticamente invariable entre las variedades de Linum usitatissimum en estudio.
Las variedades de Linum usitatissimum extranjeras, cultivadas en suelos chilenos, presentan el mismo contenido de secoisolariciresinol y matairesinol que estas mismas cultivadas en su origen.
2.7. Objetivos.
Objetivos generales. Caracterizar variedades de semilla de linaza Chilenas y Canadienses, respecto a su contenido de los lignanos secoisolariciresinol y matairesinol.
Establecer si hay diferencia entre las variedades chilenas y canadienses cosechadas en el extranjero y en nuestro país, mediante el contenido de secoisolariciresinol y matairesinol.
Objetivos específicos Evaluar e implementar un método de extracción de los lignanos, secoisolariciresinol y matairesinol, desde la harina de linaza desgrasada.
Diseñar, evaluar, implementar y validar una metodología analítica, para la determinación de los lignanos secoisolariciresinol y matairesinol, mediante HPLC.
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Realizar un análisis estadístico para evaluar las diferencias del contenido de lignanos, respecto a la especie y lugar de cultivo.
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3.
MATERIALES Y METODOS.
3.1. Materiales y equipos.
Para la realización de este trabajo, todos los reactivos y solventes fueron grado analítico y superior. Fueron suministrados por Sigma-Aldrich®, EUA y Merck®, Darmstadt, Alemania principalmente.
Solventes grado HPLC: acetonitrilo (CH3CN), agua (H2O), metanol (CH3OH).
Solventes
grado
analítico:
metanol
(CH3OH),
etanol
(CH3CH2OH),
agua
desmineralizada, n-hexano.
Reactivos grado analítico: ácido clorhídrico (HCl) 37%.
Sales grado analítico: acetato de sodio trihidrato (CH3COONa·3H2O), hidróxido de sodio (NaOH) en granallas.
Patrones: secoisolariciresinol 5mg (95%), matairesinol 5mg (85%), enterodiol 5mg (95%) y enterolactona 5mg (95%) (Sigma-Aldrich, Fluka®).
Colecciones de enzimas: Cellulase from Trichoderma reesei >4 unidades/mg, β-glucosidase, from almonds 20 unidades/mg (Sigma-Aldrich, Fluka®).
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Material volumétrico: Tubos de centrífuga de 15 y 50mL, tubos de ultracentrifugación de 1,5mL, matraces aforados, probetas y vasos precipitados de diversos volúmenes para manejo de soluciones. Botellas claras o ámbar. Micropipetas de 20, 100, 1000 y 5000µL. Puntas de micropipetas.
Equipos: Equipo de HPLC conformado por: Detector UV-visible Merck-Hitachi® modelo LA-5300, bomba de HPLC de 3 canales Merck-Hitachi® modelo L-7110, inyector rheodyne® 7725 con loop de 20µL, software integrador Clarity® Data Apex®, jeringa de alta precisión Hamilton® 25µL, espectrofotómetro UV-visible PG Instruments T-70, desionizador y purificador de agua Millipore®, centrifuga para tubos de 50mL, centrifuga para tubos ultracentrifugación de 1,5mL, incubadora Biotek®, estufa, sonicador, balanza analítica, balanza de precisión, pH-meter, placas calefactoras con agitación magnética, shaker manual, molinillo con tamiz de tamaño de poro de 500µm., kit de sistema Soxhlet, refrigerador, kit de extracción en fase sólida (SPE) SUPELCO®, bomba de vacío de 1HP. Columnas SPE 500µg resina C18 Waters®. Columnas HPLC C8 250 mm x 5 mm x 4,5 µm, C18 150 mm x 5 mm x 4,5 µm y C18 250 mm x 5 mm x 4,5 µm. Todas Phenomenex®.
Otros materiales: papel filtro Whattman®, n°40, mem branas de nitrocelulosa Whattman® 0,45µm, embudos, kitasatos, gradillas para tubos, ice pack.
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3.2. Muestras.
Todas las muestras utilizadas para este trabajo fueron semillas de lino. Se utilizaron dos variedades de semillas de origen canadiense: CDC Bethune, CDC Sorrel. Estas semillas se importaron desde su origen, de la provincia de Saskatchewan, Canadá. Otras dos variedades de semillas son de origen chileno: Carmine y Celestina, estas variedades provienen de una colección perteneciente a Semillas Baer Ltda.
La selección de estas variedades fue según el criterio de los investigadores principales del proyecto FONDECYT, que financió este trabajo.
Estas semillas son de cosecha del año 2008 en su lugar de origen, pero además se agrega una muestra de Celestina del año 2007. Además, se usan como muestras semillas de las cuatro variedades antes mencionadas, cosechadas en enero de 2009 en predios experimentales de la empresa Semillas Baer Ltda. ubicados en las localidades de Cajón y Gorbea de la región de la Araucanía, Chile. Cada muestra corresponde a cuatro recolecciones de cada variedad, en distintos puntos de los predios experimentales. Esto da un total de 5 muestras de las variedades cultivadas en el origen y de 32 muestras de las variedades de los predios experimentales.
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3.3. Métodos.
3.3.1. Separación y cuantificación de lignanos por de HPLC UV-visible.
Para lograr diseñar la separación cromatográfica, se utilizaron cuatro patrones de lignanos: los lignanos vegetales SECO y MATA, y otros dos lignanos mamiferos que corresponden a enterodiol (EDOL) y enterolactona (ELAC). Estos dos últimos compuestos corresponden a enterolignanos, que son productos de la transformación de SECO y MATA por microorganismos comensales del colon (los cuales fueron descritos en la sección 2.2.3 de este trabajo). Las estructuras de los cuatro analitos se presentan en la figura 4
La idea de agregar estos dos patrones adicionales, es la de lograr demostrar que la metodología de separación, tiene la capacidad resolutiva de separar moléculas muy similares, ya que estos enterolignanos no difieren demasiado en su estructura respecto a los analitos en estudio. Además se pretende, a petición de los investigadores principales del proyecto, lograr que esta metodología logre ser extendida al estudio de otros lignanos de la semilla de lino, o bien de productos de transformación bacterianos de SECO y MATA.
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Figura 4. Estructura molecular de los estándares utilizados en el desarrollo de la metodología de separación.
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Elección del equipo de detección adecuado.
Dentro de los métodos de cromatografía líquida, los autores recomiendan usar equipos de detección UV-visible con arreglo de diodos o con arreglo de electrodos como los más idóneos para la detección y cuantificación de lignanos. En el laboratorio de análisis de alimentos, se cuenta con un equipo de detección UV-visible de haz de luz simple, que si bien no es el recomendado es adecuado para el desarrollo de la metodología.
Elección de una longitud de onda para la medición.
Al analizar la estructura molecular, se aprecia que los lignanos presentan múltiples insaturaciones, por lo tanto, se espera que los lignanos absorban a una longitud de onda en el rango ultravioleta. Para encontrar la mejor longitud de onda a la que absorben los cuatro lignanos, se utilizan patrones de los analitos en cuestión: SECO (47,5µg/g), MATA (42,5µg/g), EDOL (47,5µg/g) y ELAC (47,5µg/g), generando un barrido en el rango ultravioleta (200 a 400nm) con un espectrofotómetro. Además se realiza una curva de calibración en el espectrofotómetro, para calcular el coeficiente de absortividad molar de cada molécula, según la ley de Beer-Lambert, con el fin de conocer sus propiedades espectroscópicas. La curva de calibración, se realiza con 5 diluciones más el blanco, con cubetas de cuarzo de camino óptico de 10mm, en 6 repeticiones. Cabe destacar que la bibliografía revisada no destaca que estos analitos muestren algún grado de fotoreactividad a este rango ultravioleta.
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Elección de fase estacionaria, fase móvil y otros parámetros para la separación de lignanos.
La separación de los analitos se prueba en columnas de fase reversa, C8 (cadenas lineales de 8 carbonos saturadas, enlazadas a la base de sílice, es decir, octil-silano) y C18 (también una cadena lineal carbonada saturada, adosada a la base de sílice pero de 18 carbonos, es decir octadecil-sílano).
Para seleccionar una columna, se separarán los patrones en mezcla, los cuales se encuentran en una concentración de 10,625µg/g para MATA y de 11,85 µg/g para SECO, EDOL y ELAC. Se prueba primero la funcionalidad de la resina C8 y C18 en una columna de 250mm, con una mezcla 60:40 CH3COONa 10mM pH 5/ACN a flujo de 1mL/min. Luego se prueba la separación en una columna de 150mm C18.
Una vez seleccionada la columna, se prueba con distintas mezclas de fase móvil. Las mezclas a utilizar se preparan en un rango de 60:40 a 75:25 de CH3COONa/ACN.
Las mezclas son preparadas a partir del tampón previamente preparado y de ACN grado HPLC, mezclados cuantitativamente en material volumétrico adecuado y desgasificados por 20 minutos en sonicador. Además, cuando se selecciona la proporción de la mezcla de solventes, se realiza una prueba de flujo de la fase móvil, variando este de 0,8 a 1,2mL/min.
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Finalmente se determina el orden de elusión de los analitos. Esto se logra determinando el tiempo de retención de cada patrón en cromatografías individuales.
3.3.2. Preparación de harina de linaza.
Es necesario que la semilla sea triturada para lograr un buen desgrasado y facilitar la extracción de los analitos. El tamaño de partícula obtenido, va a depender del equipamiento disponible para efectuar esta etapa. En el caso de esta metodología se realiza el proceso con un molinillo, con un tamiz de tamaño de poro de 500µm.
3.3.3. Desgrasado de harina de linaza por método de Soxhlet.
Deben eliminarse los lípidos de la harina preparada, ya que se pueden producir interacciones con los solventes a usar para las extracciones, saponificaciones por medio alcalino y otras reacciones no deseadas. Se elige el método de Soxhlet por su fácil implementación y su buena fiabilidad para extraer lípidos (Kou y Mitra, 2003). Para la muestra se usa papel filtro Whatman n° 40 de al menos 8 cm de diámetro y con la ayuda de corchetes, se hace un saco (figura 5a). En el saco se pesan 5g de la harina antes obtenida. Luego el saco es colocado en el equipo Soxhlet (figura 5b). Luego en el matraz se agregan 160mL de n-hexano grado analítico. Se destila por un período de 2 horas a unos 60 a 70ºC constantemente, usando una placa calefactora. Luego la harina desgrasada se lleva a sequedad, por una 1 hora a 60ºC, en estufa de convección.
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Estas temperaturas permiten una adecuada evaporación del solvente, obteniéndose harina de linaza seca y desgrasada.
3.3.4. Determinación del porcentaje de humedad promedio de la harina de linaza.
Para determinar la humedad se toma una muestra de semilla fresca, inmediatamente se tritura para transformarse en harina y se pesa cuantitativamente una masa de harina en papel filtro seco de masa conocida. Se lleva a una estufa y se seca por un período no menor a 1 hora a 60ºC, evitando posible degradación de las moléculas en estudio. Luego se determina la masa de harina seca. A esta última masa pesada, se le debe restar la masa seca del filtro. El porcentaje de humedad corresponderá a la diferencia entre la masa de harina, con la masa de harina seca multiplicado por 100. Este proceso debe realizarse al menos 3 veces para tener la media.
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Figura 5. Equipo Soxhlet para extracción de grasa. a. Disposición del filtro para extracción Soxhlet. b. Diagrama de un sistema Soxhlet. Extraído de Mitra, 2003.
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3.3.5. Determinación del porcentaje lipídico de la harina de linaza.
Se uso el método de Soxhlet de acuerdo a la metodología de Official Methods of Analysis A.O.A.C. (1990): se pesan 10 g de harina de linaza, luego se empaqueta en un capucho de papel filtro de masa conocida, luego se registra la masa de harina. Se seca el matraz de extracción por 30 minutos a 130 ± 2°C. Se pesa el matraz de extracción seco y se registra su masa. Se coloca el matraz de extracción en el sistema Soxhlet, el capucho con la muestra en el tubo de extracción y se adiciona el solvente, éter de petróleo, al matraz. Se extrae la muestra con el solvente por 2,5 horas. Una vez terminada la extracción se elimina el solvente por evaporación hasta que no se detecte olor a éter. Se seca el matraz con la grasa en estufa a 103 ± 2°C por 10 minutos, enfriar en desecador y pesar. Se registra esta masa. Luego se estima su masa de lípidos, restando a la masa del matraz con lípidos, el peso seco del matraz. Se obtiene el porcentaje de lípidos utilizando la masa de harina seca (AOAC, 1990).
3.3.6. Método de extracción lignanos.
Se utilizará la metodología de extracción descrita por Scwartz y Sontag (2006), la cual fue utilizada originalmente para determinar SECO, lariciresinol y pinoresinol, en distintos alimentos vegetales, pero no en linaza. Esta metodología fue modificada para la extracción simultánea de SECO y MATA. Debido a que ésta metodología debe ser implementada con varias adaptaciones, esta será descrita en cuatro etapas, pensadas siempre en la problemática de liberar las moléculas en estudio: Etapa I: liberación de
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lignanos glicosilados de redes poliméricas; Etapa II: Preparación de la muestra para digestión enzimática; Etapa III: Digestión enzimática de la muestra; Etapa IV: Obtención de la fracción de lignanos. En la figura 6 se presenta un esquema generalizado de la metodología de análisis de los lignanos en estudio, donde se destaca donde comienza y termina cada etapa
A continuación se presenta la metodología utilizada para la extracción de SECO y MATA. Las variaciones aplicadas respecto de la original y su análisis se presentan en la sección de resultados.
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Triturado en tamiz de 500µm.
Semilla de linaza.
Desgrasado por Soxhelt y secado de la semilla.
Harina desgrasada de linaza.
Harina de linaza. Determinación de lípidos en la semilla.
Determinación de humedad en la semilla.
0,1g de muestra
2°Regular pH con 1mL de tampón CH3COOH 0,1M.
Sónicar durante 30 min.
1°Neutralización del exceso de álcali.
Sónicar durante 3 horas.
Centrifugar a 5000rpm por 15 min.
Separación y cuantificaión de lignanos por HPLC de UV-visible.
Agregar 5mL de metóxido de sodio.
Eliminar exceso de metanol por arrastre de vapor.
Separar fracción de lignanos por SPE.
Mezcla de enzimas en 3mL de buffer CH3COOH 0,1M
Digerir por al menos 12 horas a 100 rpm en incubadora
Figura 6. Esquema resumen de la metodología de extracción en estudio.
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Etapa I: liberación de lignanos glicosilados de redes poliméricas.
El método consiste en pesar 0,1g de muestra de harina de linaza desgrasada en un tubo de centrífuga de 50mL. Se adiciona una alícuota de 5mL de una solución de metóxido de sodio (fresca). El metóxido de sodio se prepara pesando 0,7g de NaOH disolviéndolos en 100mL de matanol anhidro. Se lleva a sonicar por un periodo de 3 horas. El agua del sonicador no debe en ningún caso superar los 60ºC. Pasado el período de sonicación, se retira el tubo y se adiciona, una alícuota de 75µl de ácido clorhídrico (HCl) al 37% v/v, con el fin de neutralizar el exceso hidróxido (se utiliza ácido concentrado para no aumentar drásticamente el volumen). La concentración de HCl está calculada de manera de tener equivalencia con los moles de hidróxido de sodio (NaOH) agregados. Tomar el tubo y agitar brevemente con movimientos orbitales, procurando que la alícuota de HCl llegue a todos los sólidos en suspensión de manera uniforme. A continuación se adiciona a la muestra 1mL de tampón 0,1M de acetato de sodio a pH 5. El pH del tampón es el adecuado para que los lignanos se encuentren en un medio que los mantenga estables. El tubo se sonica nuevamente, por un periodo de 30 minutos. Se retira el tubo y se deja enfriar a temperatura ambiente. Una vez frío, se centrífuga a 5000rpm por un periodo de 15 minutos. Se transfiere el sobrenadante a un tubo similar.
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Etapa II: Preparación de la muestra para digestión enzimática.
Se implementa un sistema artesanal de arrastre de vapor, para la eliminación del metanol excedente que se encuentra presente en las muestras. Los tubos con muestra son mantenidos en el sistema por un período de al menos 4 horas para una eficaz eliminación. Es un sistema artesanal, muy fácil de armar y económico que se describe en la figura 7. Una vez evaporado todo el metanol, la muestra ya está en condiciones para la hidrólisis enzimática.
Etapa III: Digestión enzimática de la muestra.
Para la digestión debe prepararse una mezcla de celulasas, a partir de un preparado comercial de mezcla de celulasas y de β-glucósidasa. Según la cinética de reacción especificada para ambos preparados, correspondientes a 1µmol de glucosa liberada por minuto para ambos preparados comerciales y la cantidad de masa de muestra (100mg de harina desgrasada aproximadamente), se estima que la cantidad de masa de enzima necesaria del preparado de celulasas corresponde a 4mg, para obtener una cantidad de unidades no inferior a 16U/mg y una masa de 1mg del preparado de βglucósidasa para obtener 20U/mg, lo cual es suficiente para digerir la masa de muestra. Las condiciones de esta cinética de reacción se cumplen a 37ºC a un pH 5, que corresponde al pH del medio en el que se encuentra la muestra.
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Figura 7. Sistema artesanal de evaporación por arrastre de vapor. Se utiliza una bomba de pecera con capacidad de 1000L/h, adaptada con 10 salidas de aire, por medio de codos y tips de micropipeta. Los tubos se mantienen en una gradilla a temperatura ambiente mientras se realiza la evaporación. Una vez evaporado el metanol, se adiciona una alícuota de 3mL de tampón acetato de sodio 0,1M pH=5, para aumentar el volumen de la muestra.
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Los liofilizados se solubilizan en 1mL de tampón acetato de sodio 0,1M pH 5 y se adicionan esta mezcla a la muestra disuelta en 2mL del mismo buffer. La muestra adicionada con enzimas se lleva a una incubadora por un período de 12 horas, tiempo suficiente para que las enzimas digieran toda la masa. La incubadora debe mantenerse en agitación constante de 100rpm/min y a las condiciones de temperatura especificadas, es decir, 37ºC. Pasado el tiempo de digestión, se retira el tubo con la muestra de la incubadora y se deja enfriar a temperatura ambiente. El tubo presenta un tono amarillento con turbidez.
Etapa IV: Obtención de la fracción de lignanos.
Para obtener una fracción limpia para la determinación cromatográfica, se realiza una extracción en fase sólida (SPE), la cual consiste en ocupar una columna de SPE para una extracción en fase reversa (Waters Sep-pak® 500mg C18) con una mezcla de solventes para obtener la fracción de lignanos limpia. En la figura 8 se muestra una imagen que destaca los principales componentes del sistema de SPE. La solución con muestra se carga a la columna con ayuda de una bomba de vacío, hasta que se aprecie que haya pasado volumen por la resina y la frita, y se deja decantar para que interactúe con la resina. La mezcla de solventes que eluye la fracción de lignanos, contiene metanol y agua en proporción 80:20 v:v. La muestra eluida se transfiere a viales con tapa y se conserva refrigerado hasta la medición de los analitos en el equipo de HPLC.
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Figura 8. Sistema de extracción en fase sólida. Se muestran los principales elementos del kit a montar. El equipo de la fotografía tiene la capacidad de manejar hasta 24 muestras. Desde la salida del manifold se conecta una bomba de vació de 1hp de potencia. La presión máxima operacional es 20psi, por lo que es necesario controlar el nivel de vacío. Extraído de catálogo de productos SUPELCO®.
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3.3.7. Separación y detección de lignanos por HPLC de detección Ultravioleta.
Según las concentraciones de lignanos que se obtengan, puede ser necesario diluir la muestra (alícuota desde eluato) en fase móvil. Las condiciones de separación y detección en HPLC para estos analitos son los siguientes: fase estacionaria catridge ODS C18 Luna Phenomenex© 250x4.6mm, 5µm de tamaño de poro. Fase móvil tampón acetato de sodio 10mM pH 5 / acetonitrilo (65:35, v:v). Volumen de inyección de 20µl. Flujo de 1mL/min. Temperatura ambiente (se recomienda sea controlada a 20ºC). Longitud de onda de 280nm. Tiempo de corrida del cromatograma de 23 minutos. Integración: software de integración Clarity©Data Apex.
3.3.8. Evaluación del funcionamiento total de la metodología de extracción.
Se realizan pruebas de todas las etapas, para apreciar que tan determinante es cada etapa de extracción en la recuperación de los analitos. Cada prueba se realiza en base a la medición de los analitos. Cada determinación se realiza tres veces. Las pruebas son las siguientes:
Una prueba de funcionamiento de la metanólisis, con una muestra sin el proceso de metanólisis.
Una prueba sin el proceso de eliminación de metanol.
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Una prueba del sistema de enzimas para probar su funcionalidad. Para esto se utiliza una muestra, sometiéndola al método con la mezcla de celulasas sin la enzima βglucósidasa, luego sin la mezcla de celulasas pero con la enzima β-glucósidasa y finalmente sin ninguna de las enzimas.
Una prueba la funcionalidad de la SPE, analizando por cromatografía el lavado de la columna, que se realiza con una mezcla de solventes consistente en metanol y agua en 80:20 v:v.
Una prueba de la metodología de extracción planteada en forma completa. Se procesa completamente, para apreciar el funcionamiento de todas las etapas en conjunto, esperando una cuantificación de SECO y MATA que se encuentre cercano al rango de concentraciones publicados.
Los rangos de concentración para semilla de lino a esperar, según la bibliografía revisada, pueden estar de manera representativa entre los 290 a los 13.000µg/g para SECO y 5,5 a 10,9µg/g para MATA en base seca. Estos rangos no son consensuales.
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3.3.9. Evaluación de las diferencias del contenido de lignanos, respecto a la variedad y lugar de cultivo.
Las muestras a analizar, corresponden a harina desgrasada y seca, y se determinan según la metodología implementada.
Se analizan las muestras de las cuatro variedades de cosecha 2008 (chilena y canadiense), más la variedad nacional celestina en su cosecha 2007. Estas muestras se analizan en triplicado. Además se analizan las cuatro variedades cultivada en los dos predios experimentales con cuatro replicas por zona de cultivo. Todas las muestras se analizan en triplicado, por lo que se realizan un total de 111 determinaciones.
Los resultados obtenidos para las variedades 2008, los resultados de celestina 2007 y los resultados de las variedades cultivadas en las localidades de Cajón y Gorbea (2009) son comparados, sometiendo los valores obtenidos a análisis estadístico. Las pruebas de contraste de hipótesis usadas son el análisis de varianza simple (ANOVA) junto con el test de Tukey HSD (diferencia honestamente significativa), siempre y cuando las dispersiones de los datos a comparar muestren normalidad y varianzas similares, vale decir, una diferencia entre media y su desviación de una dimensión similar, y una curtosis de carácter mesocúrtica.
Los intervalos de confianza a usar son de un 95% (1-β). Si los datos se dispersan de forma no normal, se utiliza contraste de hipótesis por la prueba de Kruskall-Wallis, la
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cual compara las medianas en lugar de las medias.
Para realizar los análisis estadísticos, se utilizó el software Statgraphics® 5.1 plus, de Statical graphics corporation.
3.3.10.
Validación.
En esta sección se trabaja con los procedimientos de validación ISO y IUPAC, para obtener en lo posible ambos requisitos de validación, con el fin de comparar los valores obtenidos con algunas metodologías publicadas, en las cuales se utilizan alguno de estos dos procedimientos. Los requisitos de validación dependen si se trata de un método cuantitativo o cualitativo, y si es confirmatorio o no. Esta metodología se considerará como método cuantitativo confirmatorio y se tratara como tal.
Determinación de los tiempos de retención.
Al momento de encontrar las condiciones cromatográficas adecuadas para la separación de los analitos en estudio, se comprueba que exista la adecuada repetibilidad del ensayo, para así definir un cromatograma de referencia con los tiempos de retención definitivos para cada analito y sucesivamente las bondades del método. Para lograr determinar los tiempos de retención definitivos, se debe repetir sucesivas veces la separación de los analitos y determinar cuál es el tiempo de retención que posee cada una de ellos. Para la determinación del tiempo de detección, se debe
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obtener una cantidad suficiente de datos de tiempo de retención para cada analito. Se calcula un rango de tiempo establecido por la media más la desviación estándar (SD). Mientras más datos se obtengan, naturalmente más representativo es el valor para el grupo de datos.
Especificidad.
Es la capacidad resolutiva de distinguir entre el analito y sustancias afines. Para este fin se utilizan los estándares de EDOL y ELAC. EDOL se relaciona estructuralmente con SECO y ELAC con MATA, como se mencionó en la introducción. Para que la separación sea considerada realmente resolutiva, las bandas de cada analito a separar no deben presentar un solapamiento superior al 10%. Esto se verifica repitiendo el ensayo de separación con las condiciones a definir sucesivas veces.
Curva de calibrado.
La curva de calibrado corresponde a una aproximación lineal de una dispersión de pares de datos, que nos permite asociar en forma directamente proporcional, la señal entregada por un equipo con la cantidad de sustancia (analito) que se está detectando. Para generar la curva de calibrado, se toman seis diluciones de los cuatro estándares en mezcla, más un blanco de muestra, que representen un posible rango de detección, Las seis diluciones utilizadas fueron: 11,9; 9,5; 7,6; 3,8; 1,9 y 0,95 µg/mL para SECO, ELAC y EDOL; y para MATA 10,6; 8,5; 6,8; 3,4; 1,7 y 0,85 µg/mL. Sumando el blanco de
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muestra, la curva de calibración está compuesta por siete puntos. La curva se realiza en las condiciones de separación obtenidas previamente, en seis repeticiones. Se obtiene una curva media con su coeficiente de determinación, su SD y su coeficiente de variación (CV).
El modelado de la curva es de regresión lineal, de la forma “y = m·x + y0”, donde y representa la respuesta del instrumento (área en mV·s) “m” corresponde a la sensibilidad (mV·s / (µg/mL)), “y0” (mV·s) representa el ruido instrumental y “x” corresponde a la concentración de analito (µg/mL).
Estabilidad del analito en solución.
Este es un tema relevante, ya que se ha observado que la falta de estabilidad del analito o de la matriz que contiene la muestra, genera un incremento dramático de la desviación del resultado de análisis. Además, debe comprobarse la estabilidad del patrón de calibración en la solución. Normalmente, la estabilidad del analito está debidamente caracterizada para diversas condiciones de almacenamiento. El control de las condiciones de almacenamiento debe formar parte del sistema habitual de acreditación del laboratorio.
Se espera que los patrones se mantengan en condiciones óptimas a temperaturas inferiores a 4ºC, en etanol y en obscuridad por tiempo indefinido, según las especificaciones del fabricante. Respecto a la estabilidad del analito en la matriz, para
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el caso de SECO y MATA, se mantendrá en óptimas condiciones (como se expuso en el apartado de extracción) a un pH cercano a 5, pero dados los cambios a pH alcalinos en la extracción esto debe ser comprobado en el montaje de la extracción.
Límite de detección (LOD) y límite de cuantificación (LOQ).
Corresponden a valores definidos por IUPAC que permiten distinguir una señal positiva del ruido instrumental. Son representativos de la sensibilidad instrumental. LOD corresponde a la concentración mínima que es capaz de generar una señal en el equipo que se está utilizando para la determinación. Se cuantifica al realizar repetidas veces una curva de calibrado. Se calcula tomando el intercepto de la curva de calibración en el origen, que se considera como el ruido instrumental, y a la media del valor obtenido se le suma la SD de la medición de la ordenada en el origen multiplicada por 3,3. Este factor está basado en la idea de que la varianza es constante en el intervalo comprendido entre ruido y la SD. El LOD representa estadísticamente la probabilidad de obtener un falso positivo de un 5% (α=0,05). LOQ corresponde a la mínima concentración de analito cuantificable con precisión y exactitud en una muestra. Se calcula multiplicando por 3 el valor LOD, vale decir 9,9 la desviación de la medición del intercepto de la ordenada en el origen. Estadísticamente representa la probabilidad de obtener un falso positivo de un 50% (β=0,5), para una muestra con una concentración igual a LOD.
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Límite de decisión (Ccα) y capacidad de detección (Ccβ).
Son los valores establecidos por la norma ISO 11843, que tienen prácticamente el mismo fin que LOD y LOQ. Ccα corresponde, según la definición ISO, al límite en el cual y a partir del cual se puede concluir con una probabilidad de error “α” que una muestra no es conforme. Dicho límite igualmente corresponde a una concentración mínima, que establece en este caso una probabilidad de un falso positivo de un 1%. Se obtiene con el mismo procedimiento que LOD, el valor del intercepto de una curva de calibración promedio, pero se le suma el SD del valor multiplicado por 2,33 (que representa un α=0,01 con una varianza constante en el intervalo del ruido a SD).
Ccβ por definición corresponde al contenido mínimo de la sustancia que puede ser detectado, identificado o cuantificado en una muestra, con una probabilidad de error β. Estadísticamente corresponde a la probabilidad de obtener un falso negativo en un 5%. Se procede analizando un blanco de muestra enriquecido con analito hasta el límite de decisión (ccα). Este blanco enriquecido pasa por todo el proceso analítico del método. El proceso se repite 20 veces. Se analiza y se calcula SD de la determinación. El resultado se obtiene sumando al límite de decisión la SD obtenida multiplicada por 1,64.
Ccα = y0 + 2,33*σ
Ccβ = Ccα + 1,64*σ
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Exactitud.
Para calcular la exactitud, en el caso de no existir patrones de referencia certificados para el analito en cuestión se recurre a la determinación de la “Recuperación”, para ello debe usarse un blanco de muestra adicionado de una cantidad conocida de analito, sometido al procedimiento analítico. Esto debe repetirse a lo menos 3 veces.
Precisión.
La precisión describe la reproducibilidad de los resultados, concordancia entre los valores numéricos de diferentes mediciones obtenidos analíticamente determinados en el mismo equipo bajo las mismas condiciones, se expresa habitualmente como el coeficiente de variación (CV).
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4.
RESULTADOS.
4.1. Metodología evaluada.
4.1.1. Detección.
Los espectros de absorción de los 4 estándares (SECO, MATA, EDOL y ELAC), arrojan máximos de absorción a longitudes de onda cercanas a 280nm. Los espectros obtenidos para los cuatro estándares utilizados en el desarrollo de la metodología de separación, se muestran en la figura 9.
Por lo tanto, se utiliza en definitiva una longitud de 280nm para la determinación de los analitos.
Se determinó el coeficiente de absortividad molar de los analitos, dando resultados a niveles prácticamente de igual magnitud. En la tabla 1 se muestran estos valores, más otros datos de interés de las moléculas en estudio.
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Figura 9. Espectros Espectros de máxima absorción de los estándares utilizados para para la la separación cromatográfica de lignanos. A. A. SECO; B. B. MATA; C. C. EDOL y D. D. ELAC.
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Tabla 1. Valores de absortividad molar (ε), peso molecular y fórmula molecular de los analitos en estudio.
ε (mol/L*cm)-1
SECO
MATA
EDOL
ELAC
3,945x10-4
4,177x10-4
3,445x10-4
2,516x10-4
362,42
358,39
302,36
298,33
C20H26O6
C20H22O4
C18H22O4
C18H18O4
Peso molecular (g/mol) Fórmula molecular
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4.1.2. Separación cromatográfica de los patrones.
Según la bibliografía revisada, en general las fases móviles utilizadas en métodos similares, sean separaciones isocráticas o en gradiente, ocupan la misma base de solventes: un tampón que va de pH 3 a 7, que puede estar en base a acetato o bien a fosfato, representando la fase acuosa; el acetonitrilo o el metanol, usados como solventes miscibles en agua, que reducen la polaridad de la mezcla. Para este fin, se decidió utilizar un tampón en base a acetato de sodio (CH3COONa) a una concentración de 10mM y a un pH de 5, ya que los lignanos al encontrarse en un medio de acidez moderada, están en un medio que proporciona una adecuada estabilidad (Kraushofer y Sontag, 2002; Swchartz y Sontag, 2006; Thompson, 2003; Willfor et al., 2006).
Como solvente apolar se decide utilizar acetonitrilo (ACN), por ser menos ácido que el metanol, confiriendo mayor estabilidad a los lignanos a separar. Las mezclas utilizadas se prepararon en el rango de 60:40 a 75:25 de CH3COONa/ACN. No se utilizaron mezclas de carácter más apolar, ya no se logra una retención suficiente para la separación de los analitos. Las preparaciones de fase móvil, se crearon pensando en generar una separación en forma isocrática, vale decir, sin la generación de gradientes de fase móvil. La separación isocrática permitió utilizar una bomba más básica, sin la necesidad de una bomba multicanal que realice las mezclas de solventes.
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Las pruebas de separación en columnas C8 y C18 de 250mm, mostraron que la columna C18 es la más adecuada para la separación de los analitos, ya que esta última presentó una mayor capacidad de separación de los analitos. Las pruebas con C18 de 150mm no mostraron una mayor ventaja frente a las de 250mm al apreciar los cromatogramas, ya que el largo de columna simplemente parece no ser el suficiente. Los cromatogramas correspondientes a estas pruebas, se presentan en la figura 10.
Por lo tanto, se decidió continuar con las pruebas de mezclas de solventes en la columna de fase reversa C18 de 250mm. La temperatura ambiente de todos los ensayos fluctuó entre 20±5ºC.
Se probaron las mezclas de fase móvil de CH3COONa/ACN en incrementos y decrecimientos proporcionales de un 3%, del rango 60:40 a 75:25 a flujo de 1mL/min. Se obtuvo una separación óptima de los cuatro patrones con una mezcla de 65:35 CH3COONa/ACN, eligiéndose ésta como definitiva, ya que no se observaron solapamientos de los picos superiores al 10% del área. Algunas de las mezclas de fase móvil probadas se presentan en la figura 11.
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Figura 10. Cromatogramas de las pruebas de columnas. Separación de los patrones en diversas columnas. a. Columna C8 de 250mm. b. Columna C18 de 250mm. c. Columna C18 de 150mm.
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Figura 11. Cromatogramas de las pruebas de mezclas de solventes. Pruebas en distintas proporciones de tampón acetato : acetonitrilo. a. 60:40. b. 63:37. c. 65:35.
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Figura 11 (continuación). Cromatogramas de las pruebas de mezclas de solventes. Pruebas en distintas proporciones de tampón acetato : acetonitrilo. d. 70:30. e. 73:27.
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Ya seleccionada la mezcla, se probó el factor del flujo, el cual demostró que con un flujo 1mL/min, ocurre la separación óptima respecto a la variable tiempo. Los cromatogramas de las pruebas de flujo se muestran en la figura 12.
En definitiva, se determina que la más óptima separación de los cuatro patrones, es en forma isocrática, con una columna C18 de 250mm, una mezcla de solventes CH3COONa/ACN 65:35 v:v, a un flujo de 1mL/min y a una temperatura de 20±5ºC.
El orden de elusión de los analitos, corresponde a SECO, EDOL, MATA y finalmente ELAC, el cual se conoció al solapar los cromatogramas independientes de cada analito sobre la línea base del cromatograma. El tiempo de corrida de la muestra corresponde a un periodo de 23 minutos, siendo suficiente para limpiar la columna y dejarla disponible para un nuevo análisis.
Las ecuaciones utilizadas para el cálculo de concentraciones en base seca de SECO y MATA, con su deducción, se presentan en el Anexo 2.
Además, como referencia, se presenta en la figura 13 un cromatograma de la separación y cuantificación de los lignanos vegetales, característico de una muestra de semilla.
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Figura 12. Cromatográmas de pruebas de flujo para la mezcla de solventes más óptima. a. Mezcla 65:35 a un flujo de 0,8mL/min. b. Mezcla 65:35 a un flujo de 1mL/min c. Mezcla 65:35 a un flujo de 1,2mL/min.
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Figura 13. Cromatográma de separación de lignanos característico de una muestra de semilla. En el cromatograma se muestra la posición teórica de SECO y MATA, según los tiempos de separación determinados a través de los estándares. Además se destaca la posición de SECO en la muestra. Matairesinol no fue detectado.
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4.1.3. Método de extracción: adaptaciones y modificaciones
Para evaluar de manera adecuada la metodología de Schwartz y Sontag (2006), se hizo un razonamiento de cómo se enfrenta el problema de la liberación de SECO con la metodología, y si la forma de tratar la muestra para obtener SECO era extensible para extraer MATA. Es importante exponer estas temáticas, ya que se puede comprender que tan importante es cada etapa, y si es necesario modificarlas o no. En esta sección se expone este razonamiento, para cada una de las etapas definidas, en las que la disposición SECO y MATA en la matriz biológica se ha cambiado.
Etapa I: liberación de lignanos glicosilados de redes poliméricas.
Para romper los enlaces éster que conforman la macromolécula de lignano, debe realizarse una hidrólisis. La hidrólisis puede ser ácida o alcalina. Según la bibliografía revisada, varios autores describen que SDG no es estable en medios ácidos, ya que este se transforma en secoisolariciresinol anhidro, por lo que se descarta la vía por hidrólisis ácida, por ser destructiva para la molécula en estudio. Para el caso de la hidrólisis alcalina, los enlaces éster son hidrolizados, pero subsiste un problema con los grupos hidroxilo formados en ambos productos de hidrólisis, ya que al existir alguna reducción precipitada del pH del medio, se generan reasociaciones aleatorias (conocidas como “artefactos”) en una porción de las moléculas anteriormente hidrolizadas, generando un error en la medición de este analito (Kraushofer y Sontag, 2002; Swchartz y Sontag, 2006; Thompson, 2003; Willfor et al., 2006).
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Pero los lignanos glicosilados son estables en medios moderadamente alcalinos, por lo que como alternativa, se realiza la hidrólisis de los enlaces ester con metóxido de sodio, ya que el grupo metilo ayuda a mantener la estabilidad de la molécula sin glúcidos. De esta manera se previene la reorganización de los productos de hidrólisis ya mencionados (Kraushofer y Sontag, 2002; Swchartz y Sontag, 2006; Thompson, 2003; Willfor et al., 2006).
Afortunadamente, el matairesinol se encuentra mayoritariamente en forma de monoglucósido, no requiriendo mayores consideraciones estructurales al momento de pensar en su liberación por medio de una saponificación (Kraushofer y Sontag, 2002; Swchartz y Sontag, 2006; Thompson, 2003; Willfor et al., 2006).
Entonces, siendo el método de elección el de la saponificación por metanólisis, y teniéndose todo el material necesario para reproducirlo, esta fase del procedimiento se utiliza sin modificaciones respecto de la metodología planteada.
Etapa II: Preparación de la muestra para digestión enzimática.
En este punto del proceso de extracción, se tienen lignanos mayoritariamente glicosilados y en un ambiente que los mantiene estables, ya que el pH ha sido regulado por medio de un tampón de acetato de sodio. Debido a que el fin de este método de extracción de lignanos, es obtenerlos en forma de agluconas, vale decir lignanos libres de glúcidos, se debe preparar la muestra para la hidrólisis de los enlaces ester de los
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glúcidos. Según lo expuesto en la sección anterior, una hidrólisis ácida sería dañina para nuestros lignanos en estudio, y ya que las hidrólisis de glúcidos se realizan en caliente, deben utilizarse otros recursos (Kraushofer y Sontag, 2002; Swchartz y Sontag, 2006; Setchell et al., 1999).
En este punto, según lo expuesto por los autores, si bien es necesario hidrolizar los glúcidos para obtener las agluconas, debe evitarse el generar un medio destructivo para los lignanos. La solución al problema es realizar una hidrólisis por medio de enzimas, como la β-glucoronidasa o la β-glucosidasa, pero hay que considerar otros factores que inciden en la obtención de los lignanos libres. Cabe recordar que en la etapa anterior, se utiliza una preparación de metóxido de sodio. La generación del metóxido, contiene metanol en exceso, por lo que después de las hidrólisis, la muestra contiene una considerable cantidad de metanol. Este metanol debe extraerse, para que así las enzimas logren funcionar. Para este objetivo, se decide eliminar de forma alternativa a la de Schwartz y Sontag (2006), el metanol de las muestras. Schwartz y Sontag eliminan el metanol por evaporación, a través de burbujeo de nitrógeno. Como no se cuenta con este equipamiento en el laboratorio, se pensó utilizar una alternativa económica: eliminar por un sistema de arrastre de vapor, soplando con aire tomado de la atmósfera. Esto permite que el metanol se evapore, siendo este proceso muy lento, pero es una alternativa inmediata y que subsana la falta de un rotavapor o del sistema de burbujeo de nitrógeno, con un tiempo de al menos 4 horas para una eficaz extracción. Es un sistema artesanal, muy fácil de armar y económico se describió anteriormente en la figura 7.
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Etapa III: Digestión enzimática de la muestra.
Para mejorar la eficiencia de la extracción, se debe degradar lo más posible la fibra, ya que los lignanos se encuentran principalmente en las testas de la semilla. Cierta fracción de lignanos queda atrapada en estas redes de polisacáridos, por lo que digerirlas a fracciones más pequeñas, promueve a la exposición de éstos, aumentando la eficiencia de su extracción. (Kraushofer y Sontag, 2002; Swchartz y Sontag, 2006; Setchell et al., 1999).
El uso de enzimas permitirá obtener una extracción con un nivel de pérdida más reducido. Estas enzimas a utilizar son pertenecientes a un subgrupo de las hidrolásas, denominadas celulasas. Cabe describir cuales son las enzimas del grupo de las celulasas que se utilizan en esta metodología y cómo funcionan. Las celulasas comprenden un grupo de enzimas cuya reacción general es hidrolizar los enlaces entre dos monosacáridos de configuración D, en su forma de hemiacetal, o bien entre un monosacárido no reductor (Mathews et al., 2002).
La β-glucosidasa (β-D-Glucósido hidrolasa) está dentro de este grupo y tiene la capacidad de hidrolizar los enlaces entre el carbono alfa de un monosacárido no reductor y otra glucosa, o bien un ácido orgánico. Esta enzima es la que permitirá eliminar los sacáridos de SDG para transformarlo a SECO. El mismo caso para el glucósido de matairesinol a MATA (Mathews et al., 2002; Ovando-Chacón y Waliszewski, 2005; Kraushofer y Sontag, 2002).
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Para digerir las fibras, se utilizan otras enzimas de la familia de las celulasas, la endo β1,4-glucanasa y la exo β-1,4-glucanasa, las que en conjunto y en sinergismo, reducen la celulosa a fibras más cortas, luego a oligosacáridos y posteriormente a celobiosa. Finalmente la β-glucosidasa transforma la celobiosa a glucosa. (Mathews et al., 2002; Ovando-Chacón y Waliszewski, 2005; Kraushofer y Sontag, 2002).
Esta es la etapa que requiere más tiempo del proceso de extracción, ya que es bastante el material que el grupo de enzimas debe digerir, además que los tiempos de digestión son prolongados. Entonces, se seleccionaron extractos liofilizados de enzimas de la familia de las celulasas. Una es una mezcla que contiene dos endo-β-1,4glucanasa y dos exo-β-1,4-glucanasa, procedentes del hongo Trichoderma reesei, el cual ha sido utilizado por muchos años como fuente de celulasas. Como esta mezcla de celulasas no contenía β-glucósidasa, se adquirió un liofilizado de la enzima βglucosidasa. Estas celulasas no eran las mismas utilizadas en el procedimiento original, pero según lo aquí planteado, estas enzimas son una alternativa equivalente que debieran cumplir el mismo objetivo. Los tiempos de digestión y temperatura, no fueron los mismos que los utilizados por Schwartz y Sontag (2006), ya que las enzimas utilizadas no fueron exactamente las mismas, por lo que se usaron tiempos acorde a la actividad de cada una de las enzimas.
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Etapa IV: Obtención de la fracción de lignanos.
La SPE se realizó de la misma manera que la de los autores, ya que tiene un gran poder de separación y se contaba con toda la implementación necesaría.
4.1.4. Pruebas de funcionamiento de la metodología de extracción.
La muestra de semilla de lino de la variedad Celestina 2007 sometida al protocolo completo arrojó para SECO, un valor de 3,01602mg/g en base seca. Para el caso de MATA, este compuesto no se logra detectar. Este fue investigado a través de los ensayos, anteriormente planteados, a la que se somete cada etapa que se presentan a continuación.
En la ausencia de la etapa de metanólisis no se detecta SECO ni MATA, por lo tanto es una etapa determinante.
La ausencia de la eliminación de metanol es muy influyente en la actividad enzimática, cuantificándose un valor de SECO de 1,05772mg/g, que significa una caída en la detección de SECO en aproximadamente de un 64,93%. No logra detectarse MATA.
La ausencia de la enzima β-glucósidasa no muestra detección alguna de SECO y MATA.
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La ausencia de la mezcla de enzimas celulasas muestra resultados bajos para SECO, 1,90009mg/g, lo que implica una caída de un 37% del analito. Nuevamente no logra detectarse MATA.
El lavado de la columna de SPE, analizado, no muestra la presencia de SECO ni MATA, por lo que el sistema opera muy bien. Curiosamente el sometimiento de un blanco de muestra enriquecido con los analitos, sometido al método completo, muestra una buena recuperación para SECO y MATA. Estos resultados se presentan en la sección de resultados de la validación.
En definitiva, no se logro adaptar y extender la metodología de Schwartz y Sontag para la cuantificación de MATA. Se discutirán las posibles causas de esto en la sección de discusiones.
4.1.5. Validación.
Determinación de los tiempos de retención.
Al construir la curva de calibración, se determinó la media del tiempo de retención de cada analito en 6 diluciones y en 6 repeticiones cada una, mostrando bajas desviaciones. El tiempo de retención de SECO fue de 5,37 ± 0,03 minutos, el de EDOL fue de 7,28 ± 0,06 minutos, el de MATA fue de 15,05 ± 0,15 minutos y finalmente el de ELAC fue de 18,47 ± 0,34 minutos. Con estos tiempos de retención se considerara una
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señal correspondiente al analito. En los cromatogramas con los que se realizaron las curvas de calibración, no se apreció grado alguno de solapamiento entre los picos de señal de los analitos, determinando que la especificidad del método es óptima.
Curva de calibración.
Las curvas de calibración mostraron una buena linealidad. Los resultados del ensayo se resumen en la tabla 2. Con los resultados, se obtienen las ecuaciones para el cálculo de la concentración de los analitos.
Sensibilidad, precisión y exactitud.
Estos parámetros fueron determinados para SECO y MATA, ya que son los analitos que finalmente se desea cuantificar.
Los límites definidos por IUPAC (LOD y LOQ) y los limites definidos por ISO (Ccα y Ccβ), no presentan una diferencia dramática entre sí y puede compararse la metodología implementada con cualquiera de las publicadas. El límite de linealidad (LOL), definido por IUPAC, no logró ser determinado, ya que no se contó con un patrón con la concentración que permita saturar al detector, pero debido a los bajos coeficientes de absortividad molar, difícilmente alguna muestra sature la señal. La precisión y exactitud, comunes en ambas normativas fueron determinadas. Los resultados de estos parámetros, se presentan en la tabla 4.
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Tabla 2. Resumen de las curvas de calibración promedio de cada analito. y0 (mV·s) corresponde al intercepto en el eje de las ordenadas, m (mV·s·µg/g-1) a la pendiente y r2 al coeficiente de determinación.
EDOL
SECO
MATA
ELAC
Media
SD
Media
SD
Media
SD
Media
SD
y0
-0,001
1,02
0,845
0,194
2,178
0,576
1,542
0,000
m
4,809
0,181
2,763
0,085
4,752
0,173
3,048
0,118
r2
0,965
0,011
0,992
0,003
0,987
0,005
0,986
0,011
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Tabla 3. Valores obtenidos para la sensibilidad, precisión y exactitud. ND = no determinado.
SECO
MATA
LOD (µg/g)
0,70
0,40
LOQ (µg/g)
2,10
1,12
LOL (µg/g)
ND
ND
CCα (µg/g)
0,50
0,28
CCβ (µg/g)
0,55
1,60
Precisión (CV%)
5,00
5,30
Recuperación (%)
101,34
97,88
74
4.1.6. Porcentajes de humedad y lípidos de las semillas de lino de las variedades en estudio.
Los valores de los porcentajes promedio de lípidos, en las variedades de semillas en su origen y en cultivo experimental, fueron entregados por el investigador principal de esta línea de investigación. Los valores van de un 38,78% a un 44,74%. Estos valores se corresponden con los rangos publicados. Los valores del porcentaje de humedad corresponden a valores que van de un 5,7% a un 11,6% en las variedades en estudio.
Los valores de humedad y lípidos son presentados en forma tabulada en el anexo 1. Se presentan los valores de las variedades en su origen juntos y los valores de predios experimentales por separado según variedad.
4.1.7. Evaluación de las diferencias del contenido de lignanos, respecto a la variedad y lugar de cultivo.
Como no fue posible cuantificar MATA de las muestras con la metodología planteada, se realiza esta evaluación sólo para SECO.
Comparación de las variedades de semillas en su origen.
Nos permitirá apreciar las concentraciones de SECO en sus condiciones locales.
75
Según las pruebas estadísticas, existe una diferencia estadísticamente significativa al contrastar todas las variedades entre sí. El gráfico de medias de las cuatro variedades se presenta en la figura 14.
La variedad que presenta el mayor contenido de SECO resultó ser la variedad chilena Celestina, que presentó una concentración media de 4,931mg/g, seguida de la canadiense CDC Bethune (Bethune) con 3,814mg/g, la canadiense CDC Sorrel (Sorrel) con 2,642mg/g y la chilena Carmine con 2,279mg/g.
76
Figura 14. Gráfico de medias del contraste de hipótesis respecto al contenido de SECO de las variedades de linaza en estudio (n=4). Las muestras corresponden a la cosecha 2008 en su origen. Se utilizó ANOVA junto con prueba de Tukey para el contraste de hipótesis (95% intervalo de Tukey HSD).
77
Comparación variedad de semilla Celestina en su suelo de origen, según año de cosecha.
Se comparó una cosecha 2007, una cosecha 2008 y dos cosechas 2009 de cada predio experimental (Cajón y Gorbea) de la variedad chilena Celestina, para denotar si existe alguna influencia estacional o de otros factores del suelo sobre el contenido del lignano. La gráfica de caja y bigotes que compara las cosechas se presenta en la figura 15.
Se apreció una gran diferencia, mostrando medias de 3,016mg/g para Celestina 2007, 4,931mg/g para Celestina 2008, de 0,852mg/g para Celestina Cajón 2009 y de 0,667mg/g para Celestina Gorbea 2009. Se infiere que existen diferencias significativas según cada año de cosecha pero no respecto a la diferencia de suelos de cada predio experimental.
Comparación variedad de semilla Carmine en su suelo de origen según año de cosecha.
Esta variedad chilena para su cosecha 2009, en ambos predios experimentales, presenta una alta concentración de SECO. Estas concentraciones de 10,051mg/g para Carmine Cajón y de 9,018mg/g para Carmine Gorbea, presentan a su vez una diferencia estadísticamente significativa.
78
Figura 15. Gráfico de caja y bigotes (Box and Wisker) del contraste de hipótesis de las diferencias de concentración de SECO según año de cosecha para la variedad Celestina (n=4). Las muestras corresponden a las cosechas 2007 y 2008 en su origen, y su cosecha en ambos predios experimentales. Se utilizó contraste de hipótesis de Kruskall-Wallis para el contraste de hipótesis (95% intervalo de Tukey HSD).
79
La cosecha 2008 presentó un valor notablemente más bajo de 2,279mg/g de SECO. La gráfica de caja y bigotes se presenta en la figura 16.
Comparación variedad de semilla CDC Bethune según país de cultivo.
Esta variedad canadiense muestra curiosamente una media superior para su cultivo en el predio experimental de Gorbea, respecto de la media que presenta su cultivo correspondiente a su nación de origen, y ocurre el caso contrario con la cosecha de Cajón.
Las diferencias obtenidas para ambos predios experimentales chilenos son intrigantes, ya que son demasiado amplias, hecho que denota atención y un análisis más profundo.
Los valores de las medias obtenidos para estas cosechas fueron 3,814mg/g para la cosecha en suelo canadiense, 0,840mg/g para el predio de Cajón y 8,216mg/g para el predio de Gorbea. El porque de esta diferencia es desconocido. La gráfica de caja y bigotes se presenta en la figura 17.
80
Figura 16. Gráfico de caja y bigotes (Box and Wisker) del contraste de hipótesis de las diferencias de concentración de SECO de la variedad Carmine, según año de cosecha (n=3). Las muestras corresponden a la cosecha 2008 en su origen, y su cosecha en ambos predios experimentales. Se uso prueba de Kruskall-Wallis para el contraste de hipótesis (95% intervalo de Tukey HSD).
81
Figura 17. Gráfico de caja y bigotes (Box and Wisker) para el contraste de hipótesis de las diferencias de concentración de SECO de la variedad CDC Bethune, según país de cosecha (n=3). Las muestras corresponden a la cosecha 2008 en su origen, y su cosecha en ambos predios experimentales. Se utilizó ANOVA junto con prueba de Tukey para el contraste de hipótesis (95% intervalo de Tukey HSD).
82
Comparación variedad de semilla CDC Sorrel según país de cultivo.
Esta variedad canadiense presentó una gran dispersión, por lo cual para el contraste de hipótesis debe compararse únicamente a través de las medianas. En la figura 18 se presenta la gráfica de caja y bigotes para el análisis. Al comparar las medianas, se estima que existe diferencia estadísticamente significativa para la concentración de SECO en la cosecha de Gorbea y las cosechas 2008 y de Cajón. La cosecha 2008 y la cosecha de Cajón no mostraron diferencias significativas. El contraste de hipótesis para las cosechas de esta variedad, dice que hay diferencia de contenido de SECO entre país de cultivo para esta variedad. Los valores de las medias para cada cosecha son 2,642mg/g para la cosecha 2008, 3,485mg/g para Cajón y 1,863mg/g para Gorbea.
Comparación de las diferencias de las cuatro variedades en ambos predios experimentales.
Las cuatro variedades cultivadas en los predios experimentales de Cajón y Gorbea, mostraron que la variedad Carmine fue la que presentó un mayor contenido de lignanos, seguida de las variedades Canadienses CDC Bethune, CDC Sorrel y finalmente Celestina. En la figura 19 se muestra un gráfico de caja y bigotes que muestra la comparación. Los resultados de CDC Bethune como se mencionaba en su estudio independiente, son algo discrepantes.
83
Figura 18. Gráfico de caja y bigotes (Box and Wisker) para el contraste de hipótesis de las diferencias de concentración de SECO de la variedad CDC Sorrel, según país de cosecha (n=3). Las muestras corresponden a la cosecha 2008 en su origen, y su cosecha en ambos predios experimentales. Se usó prueba de KruskallWallis para el contraste de hipótesis (95% intervalo de Tukey HSD).
84
Figura 19. Gráfico de caja y bigotes (Box and Wisker) para el contraste de hipótesis de las diferencias de concentración de SECO de las cuatro variedades en ambos predios experimentales (n=3). Se usó prueba de Kruskall-Wallis para el contraste de hipótesis (95% intervalo de Tukey HSD).
85
5. DISCUSIÓN.
5.1. Metodología evaluada.
El método de extracción probado, corresponde a una parte de una metodología de determinación del contenido de lignanos, que involucra HPLC con detección por arreglo de diodos (Schwartz y Sontag, 2006). Esta metodología se diseñó para la determinación de los lignanos isolariciresinol, lariciresinol y secoisolariciresinol (SECO), en distintos tipos de plantas alimenticias, tales como esparrago, poroto, sésamo, zanahoria y otros productos. La linaza no era uno de los productos a los cuales estaba destinada esta metodología, pero provenía de una variación de una metodología anterior de los autores (Schwartz y Sontag, 2002), la cual se diseñó para determinar SECO, ácido p-coumarico y ácido ferúlico, que son parte de la macromolécula de lignano (estructura descrita en la sección 2.2.4) presente en linaza.
Isolariciresinol y lariciresinol son lignanos que se encuentran en una mucha menor proporción de la cantidad de lignanos de la semilla (Schwartz y Sontag, 2006). Igualmente habría sido interesante haber extendido esta metodología al estudio de estos lignanos, pero habría sido necesario contar con los patrones correspondientes para su estudio.
El contenido de MATA es aún menor que el contenido de isolariciresinol y lariciresinol en la semilla (Milder et. al, 2005), pero debido a la escasa cantidad de estudios del
86
contenido de este lignano, se decidió intentar extender esta metodología de extracción para su determinación.
La determinación de SECO con la metodología evaluada fue satisfactoria, lográndose un cromatográma bastante breve para este tipo de moléculas y con buenos atributos analíticos. La metodología de extracción y cuantificación aquí planteada, requiere un tiempo de extracción largo de aproximadamente dos días, lo que nos dice que se trata de una metodología que debe utilizarse para analizar varias muestras simultáneamente, lo que dependerá del analista y del equipamiento disponible. El máximo número de muestras tratadas por la metodología fue de seis muestras en triplicado de forma simultánea, es decir, 18 viales.
La determinación de MATA con la metodología evaluada no arrojo resultados para las muestras de harina de linaza desgrasada, pero se obtuvo una buena separación cromatográfica y una buena recuperación de los blancos enriquecidos con el patrón MATA, por lo que podemos decir que la metodología de extracción de Schwartz y Sontag (2006), no logró ser ampliada a la extracción de MATA, para cuantificarlo en linaza, pero el método de separación y detección por HPLC de UV-visible desarrollado fue exitoso. Si bien este hecho puede llevar a que finalmente se desista en la medición de este analito, con una metodología de estas características, existen razones para pensar que este fallo sólo es un tropiezo analítico superable del tratamiento de la muestra. Las concentraciones de MATA se encuentran a una magnitud de concentración en promedio 1000 veces menor que la de SECO, por lo cual si la
87
muestra está sujeta a pérdidas en el procedimiento de extracción, el cual cabe recordar que cuenta con un número significativo de etapas, sería muy significativa para MATA.
Como se pudo apreciar en los ensayos de validación, los límites instrumentales obtenidos nos indican que el equipo es capaz de detectar y cuantificar el rango de concentraciones de analito a esperar, por lo que finalmente el problema no es el detector, sino que es algún contratiempo en la metodología de extracción. Cabe recordar que los límites de detección y cuantificación definidos por ISO, al igual que los de IUPAC, están diseñados para tener un error mínimo de falso positivo y falso negativo, para discernir si la señal representativa de un compuesto, corresponde realmente al analito y no a un ruido.
Según las pruebas a las que fue sometida la metodología de extracción evaluada, las pruebas realizadas con un blanco de muestra enriquecido únicamente con los patrones, sometidas al procedimiento analítico completo, daban resultados satisfactorios de recuperación para MATA e igualmente para SECO. Pero las pruebas de cuantificación de SECO y MATA en la semilla, nunca dieron resultados satisfactorios para MATA, y el mismo caso ocurrió con las pruebas realizadas a las etapas individuales de la extracción, lo que indica que todas las etapas de la metodología de extracción son determinantes.
Según la bibliografía revisada, MATA es lábil a pH alcalino (como el de una metanólisis) pero a un muy bajo nivel de transformación (a 7-hidroximatairesinol), por lo que la
88
extracción en medios alcalinos moderados con la ayuda de métodos mecánicos como la sonicación, ayudan a su liberación de la goma y otros polisacáridos con los que pudiese interactuar, aumentando la eficiencia de extracción, lo que compensa la pérdida por la transformación generada en el medio alcalino (Milder et.al. 2005). Esto ya puede considerarse una pérdida, a un nivel desconocido para la metodología evaluada.
Una explicación razonable de la posible pérdida de MATA puede ser la siguiente: considerando la estructura de la semilla, la cual está constituida por varios tipos de polisacáridos, varios de los cuales son constituyentes de fibras y gomas, y sumando el hecho de que estos lignanos son atrapados por estas redes moleculares de azucares (que son de naturaleza polar, ya que son polialcoholes al igual que los lignanos), podríamos pensar de que el hecho de haber utilizado ciertas enzimas de la familia de las celulasas, vale decir las enzimas que hidrolizan enlaces β 1-4 entre 2 glucosas o una glucosa y un ácido orgánico, puede no haber sido suficiente para destruir las redes poliméricas que atrapan a estas moléculas. Cabe recordar que, como se mencionó en la sección 2.1.7., la fracción libre de hidratos de carbono en la semilla, es de tan solo el 2%, y la fibra puede llegar a un 28% del peso seco de semilla, concentrada principalmente en las testas de la semilla, que es donde más se concentran los ácidos orgánicos presentes en la semilla, lo cual nos indica que esto es un importante factor en la liberación de los lignanos.
De hecho las enzimas utilizadas para la hidrólisis enzimática (endo β-1,4-glucanasa, la exo β-1,4-glucanasa y la β-glucosidasa) no son capaces de destruir otros polisacáridos
89
tales como la amilosa y la amilopectina, que son constituyentes del almidón y poseen enlaces glucosídicos del tipo α 1-4 y α 1-6 respectivamente. Mismo caso ocurre con la hemicelulosa, que presenta enlaces de tipo α además de los de tipo β, y de estructuras aún más complejas como la goma, que necesitan un conjunto de enzimas más complejo para degradarla sinérgicamente (Badui S., 1999).
Lo anterior podría explicar la pérdida de MATA, la cual se hace muy significativa. Mismo caso puede explicar pérdidas en SECO, pero con una significancia mínima, ya que SECO se encuentra concentrado en promedio 1000 veces más que MATA. Otro hecho que puede sumar error, fue el tamaño de partícula dado por el tamiz del molino con el que se preparó la harina de linaza. Este tamiz poseía un tamaño de partícula de 500µm, lo que puede no ser suficiente para lograr una homogeneidad de las muestras, obteniendo por el simple azar menos partículas de testa, que es donde se encuentran principalmente los lignanos. También se puede considerar un enmascaramiento en la detección por otros compuestos presentes en la fracción de lignanos y que absorban a 280nm, lo que provoca que no se vea un pico del analito a su tiempo de retención teórico.
5.2. Evaluación del contenido de lignanos en variedades de semilla de linaza.
Finalmente el estudio sólo se realizó con SECO, ya que como se expuso anteriormente, no fue posible cuantificar MATA en muestras de semillas. Pese a ello, con el estudio del contenido de SECO, se puede describir muy bien el potencial de cada variedad de
90
semilla como fuente de lignanos, ya que el SDG es el que representa el mayor contenido del total de los lignanos, y finalmente es el compuesto con mayor efecto benéfico como antioxidante y de mimetismo esteroidal que los demás lignanos.
Los resultados para SECO de la cosecha 2008 de las cuatro variedades de semillas en estudio, mostraron resultados bastante reveladores respecto a su contenido de lignanos, diferenciándose con claridad que la variedad nacional Celestina (CE) fue la que mostró ser una mayor fuente de lignanos, según su origen. De cualquier manera, se apreció que todas las variedades en estudio son una buena fuente de lignanos, ya que el contenido de todas las variedades es de orden porcentual.
La comparación de las semillas nacionales según año de cosecha para la variedad Celestina, muestra resultados interesantes, ya que se compararon tres años de cosecha
y
se
obtuvieron
contenidos
promedios
muy
diferentes,
siendo
considerablemente bajas para la cosecha 2009 en ambos predios experimentales. El porqué de estas diferencias no es posible explicarlo hasta este momento, ya que faltan antecedentes para explicar el por que se obtiene más o menos SECO de estos suelos.
La situación de la variedad Carmine es muy diferente, mostrando un contenido casi cuatro veces mayor al año anterior en ambos predios experimentales.
La comparación de la variedad extranjera CDC Bethune, cultivada en suelos canadienses y chilenos, mostró ciertas discrepancias, ya que comparando el contenido
91
de lignanos cuantificado para el cultivo en su origen, mostró un menor contenido para SECO en Cajón y prácticamente el doble en Gorbea. Esto puede deberse a algún error en la preparación de la harina, como se discutió en la sección anterior, o bien existe alguna diferencia entre los suelos de Cajón y Gorbea que genere esta diferencia. El porque de estas diferencias no es posible de explicar hasta este momento, ya que faltan antecedentes de la cosecha.
La comparación de la semilla extranjera CDC Sorrel, cultivada en suelos canadienses y chilenos, mostró diferencias significativas de contenido al ser cultivadas en suelos nacionales.
Al comparar simultáneamente los resultados de ambos predios experimentales de todas las variedades, se aprecia que independiente de las condiciones, la variedad nacional Carmine, desarrolló el mayor contenido de SECO (y por ende de lignanos), lo que lleva a pensar que si se repiten las mismas condiciones de desarrollo para la planta, esta variedad sería la recomendada para su cultivo, con el fin de producirla como materia prima para la formulación de alimentos funcionales.
Por el hecho de no contar con los estudios de suelo y de las condiciones ambientales, tales como pluviometría y temperatura, no es posible explicar el porqué de estas diferencias. Entonces es necesario contar con estos estudios agronómicos, para lograr generar un modelo que establezca una relación del contenido de lignanos con las variables controlables de cultivo, a lo que debe ser sumado un estudio de sus atributos
92
nutricionales y demás atributos funcionales, para así determinar con total certeza, si el cultivo de cierta variedad de semilla es viable o no para su utilización como materia prima, y establecer cuál es el potencial comercial de cada variedad para esta finalidad.
5.3. Conclusiones.
La metodología de separación por HPLC de UV-visible desarrollada, presentó una buena separación de los lignanos vegetales matairesinol y secoisolariciresinol, y los enterolignanos enterodiol y enterolactona, con los atributos analíticos suficientes para detectar y cuantificar matairesinol y secoisolariciresinol. La metodología desarrollada correspondió a una de menor coste, frente a otras divulgadas.
La metodología de extracción evaluada logró ser implementada, con varias adaptaciones para extraer secoisolariciresinol exitosamente de las cuatro variedades de semilla de linaza en estudio, pero no logró ser extendida a la extracción de matairesinol.
No se logró el objetivo de cuantificar matairesinol con la metodología planteada, ya que la extracción de matairesinol, no permitió recuperar contenidos a niveles detectables. Se postula que la causa de este fenómeno, es la insuficiente degradación de polisacáridos de la testa.
Pese a que no se logró cuantificar matairesinol, la cuantificación de secoisolariciresinol es suficiente para evaluar si las variedades presentan diferencias en el contenido de
93
lignanos, según si el cultivo se realiza en su lugar de origen o en suelos extranjeros. Esto ya que secoisolariciresinol es el lignano de representa un mayor contenido de este grupo de moléculas en la semilla de lino, a niveles incluso porcentuales.
La comparación de las cosechas anuales de variedades nacionales, muestra diferencias significativas del contenido de lignanos, lo que quiere decir que debe de estudiarse la influencia de las variables de cultivo.
La hipótesis de que todas las variedades de semilla de lino contienen la misma cantidad de lignanos es rechazada, ya que se observaron diferencias estadísticamente significativas entre todas las variedades.
La hipótesis de que las variedades extranjeras cultivadas en su origen tienen un contenido invariable en suelos nacionales es rechazada, ya que el contenido de las variedades CDC Bethune y CDC Sorrel si mostró diferencias estadísticamente significativas entre los suelos canadienses y nacionales.
Según los resultados obtenidos en este estudio, se recomendaría la utilización de la variedad nacional Carmine para su cultivo, ya que presentó un mayor contenido de lignanos frente a las demás variedades, en las mismas condiciones de cultivo.
Debe contarse con otros estudios, como los de valor nutricional y de otros atributos funcionales, para confirmar con total certeza, cual variedad merece mayor atención
94
como fuente de nutrientes y de compuestos bioactivos, que le confieran un mayor valor económico, y así potenciar su comercialización en el mercado chileno.
95
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7. ANEXOS.
Anexo 1. Tablas de resultados estudio variedades SECO.
Tabla de resultados estudio de variedades cultivadas en su origen.
VARIEDAD
MASA (g) LIPIDOS (%) HUMEDAD (%) [SECO]
MEDIA
CV (%)
(µg/g)
CARMINE (2008)
CELESTINA (2007)
CELESTINA (2008)
CDC BETHUNE (2008)
CDC SORREL (2008)
0,109
41,52
6,00
2198,64
0,101
41,52
6,00
2278,09
0,101
41,52
6,00
2362,50
0,104
41,44
9,50
2996,07
0,108
41,44
9,50
2949,55
0,103
41,44
9,50
3102,45
0,100
41,40
9,80
5169,25
0,105
41,40
9,80
4807,33
0,104
41,40
9,80
4816,38
0,107
39,03
5,70
3705,12
0,101
39,03
5,70
3737,18
0,101
39,03
5,70
4001,09
0,108
44,74
6,85
2500,72
0,102
44,74
6,85
2861,52
0,103
44,74
6,85
2563,03
2279,74 0,04
3016,02 0,03
4930,99 0,04
3814,46 0,04
2641,76 0,07
103
Tabla de resultados estudio de variedades en predios experimentales variedad Carmine.
VARIEDAD MASA(g) LIPIDOS (%) HUMEDAD (%) [SECO]
MEDIA
CV (%)
9397,36
0,08
(µg/g) CARMINE CAJON 12/1
CARMINE CAJON 12/2
CARMINE CAJON 12/3
CARMINE CAJON 12/4
0,101
39,13
5,70
10090,14
0,105
39,13
5,70
9436,50
0,102
39,13
5,70
8665,46
0,104
39,13
5,70
11839,27
0,105
39,13
5,70
9736,92
0,110
39,13
5,70
9268,17
0,104
39,13
5,70
10415,82
0,101
39,13
5,70
12968,05 11495,32 0,11
0,102
39,13
5,70
11102,10
0,105
39,13
5,70
11138,19
0,105
39,13
5,70
11055,02 10885,16 0,03
0,104
39,13
5,70
10462,28
10281,45 0,13
104
Tabla de resultados estudio de variedades en predios experimentales variedad Carmine (continuación).
VARIEDAD MASA (g) LIPIDOS (%) HUMEDAD (%) [SECO]
MEDIA
CV (%)
(µg/g) CARMINE
0,101
39,07
6,30
9290,08
GORBEA
0,103
39,07
6,30
9569,75
22/1
0,101
39,07
6,30
10139,12
CARMINE
0,108
39,07
6,30
9580,78
GORBEA
0,106
39,07
6,30
7565,63
22/2
0,102
39,07
6,30
9495,33
CARMINE
0,104
39,07
6,30
7968,24
GORBEA
0,109
39,07
6,30
8677,47
22/3
0,108
39,07
6,30
8632,50
CARMINE
0,104
39,07
6,30
8446,97
GORBEA
0,105
39,07
6,30
8989,98
22/4
0,104
39,07
6,30
9861,82
9666,32 0,04
8880,58 0,13
8426,07 0,05
9099,59 0,08
105
Tabla de resultados estudio de variedades en predios experimentales variedad Celestina.
VARIEDAD
MASA (g) LIPIDOS (%) HUMEDAD (%) [SECO] MEDIA
CV (%)
(µg/g) CELESTINA 0,111
39,01
11,60
1590,76
CAJON
0,103
39,01
11,60
1990,42 1817,67 0,11
11⁄1
0,107
39,01
11,60
1871,82
CELESTINA 0,102
39,01
11,60
307,86
CAJON
0,100
39,01
11,60
399,13
11⁄2
0,102
39,01
11,60
345,19
CELESTINA 0,100
39,01
11,60
262,87
CAJON
0,104
39,01
11,60
253,58
11⁄3
0,103
39,01
11,60
300,95
CELESTINA 0,103
39,01
11,60
895,44
CAJON
0,100
39,01
11,60
854,84
11⁄4
0,102
39,01
11,60
1154,48
350,73
0,13
272,47
0,09
968,25
0,17
106
Tabla de resultados estudio de variedades en predios experimentales variedad Celestina (continuación).
VARIEDAD
MASA (g) LIPIDOS (%) HUMEDAD (%) [SECO] MEDIA
CV (%)
(µg/g) CELESTINA 0,103
38,78
6,90
1329,12
GORBEA
0,105
38,78
6,90
1232,08 1274,47 0,04
21/1
0,108
38,78
6,90
1262,20
CELESTINA 0,102
38,78
6,90
1325,40
GORBEA
0,103
38,78
6,90
1258,17 1289,05 0,03
21/2
0,102
38,78
6,90
1283,58
CELESTINA 0,102
38,78
6,90
83,52
GORBEA
0,106
38,78
6,90
83,77
21/3
0,106
38,78
6,90
50,24
CELESTINA 0,110
38,78
6,90
26,68
GORBEA
0,102
38,78
6,90
40,96
21/4
0,106
38,78
6,90
31,60
72,51
0,27
33,08
0,22
107
Tabla de resultados estudio de variedades en predios experimentales variedad CDC Bethune.
VARIEDAD
MASA (g) LIPIDOS (%) HUMEDAD (%) [SECO] MEDIA
CV (%)
(µg/g) CDC BETHUNE 0,101
44,71
5,70
1181,34
CAJON
0,102
44,71
5,70
1149,95 1257,17 0,13
13⁄1
0,106
44,71
5,70
1440,23
CDC BETHUNE 0,103
44,71
5,70
1525,75
CAJON
0,105
44,71
5,70
1237,59 1409,73 0,11
13⁄2
0,101
44,71
5,70
1465,85
CDC BETHUNE 0,102
44,71
5,70
184,17
CAJON
0,102
44,71
5,70
185,25
13⁄3
0,101
44,71
5,70
141,50
CDC BETHUNE 0,102
44,71
5,70
528,28
CAJON
0,103
44,71
5,70
472,98
13⁄4
0,104
44,71
5,70
569,11
170,31
0,15
523,46
0,09
108
Tabla de resultados estudio de variedades en predios experimentales variedad CDC Bethune (continuación).
VARIEDAD
MASA (g)
LIPIDOS (%)
HUMEDAD (%)
[SECO]
MEDIA
CV (%)
7728,32
0,03
9381,50
0,06
7435,31
0,10
8500,38
0,07
(µg/g) CDC BETHUNE
0,106
41,63
5,70
7747,82
GORBEA
0,104
41,63
5,70
7469,61
23/1
0,104
41,63
5,70
7967,55
CDC BETHUNE
0,109
41,63
5,70
9014,93
GORBEA
0,109
41,63
5,70
9067,49
23/2
0,103
41,63
5,70
10062,09
CDC BETHUNE
0,107
41,63
5,70
7984,29
GORBEA
0,102
41,63
5,70
6584,68
23/3
0,101
41,63
5,70
7736,96
CDC BETHUNE
0,111
41,63
5,70
8263,67
GORBEA
0,105
41,63
5,70
8063,24
23/4
0,101
41,63
5,70
9174,23
109
Tabla de resultados estudio de variedades en predios experimentales variedad CDC Sorrel.
VARIEDAD
MASA (g) LIPIDOS (%) HUMEDAD (%) [SECO]
MEDIA
CV (%)
(µg/g) CDC SORREL
0,104
42,40
7,20
1845,08
CAJON
0,105
42,40
7,20
1723,15
14/1
0,101
42,40
7,20
2054,29
CDC SORREL
0,104
42,40
7,20
6004,92
CAJON
0,110
42,40
7,20
5659,58
14/2
0,101
42,40
7,20
6090,00
CDC SORREL
0,111
42,40
7,20
3631,84
CAJON
0,107
42,40
7,20
4233,34
14/1
0,101
42,40
7,20
4088,01
CDC SORREL
0,106
42,40
7,20
2085,69
CAJON
0,105
42,40
7,20
2063,20
14/4
0,104
42,40
7,20
2335,93
1874,17 0,09
5918,17 0,04
3984,40 0,08
2161,61 0,07
110
Tabla de resultados estudio de variedades en predios experimentales variedad CDC Sorrel (continuación).
VARIEDAD
MASA (g) LIPIDOS (%) HUMEDAD (%) [SECO] MEDIA
CV (%)
(µg/g) CDC SORREL 0,106
40,62
6,50
7328,56
GORBEA
0,103
40,62
6,50
7223,99 7150,82 0,03
24/1
0,104
40,62
6,50
6899,92
CDC SORREL 0,104
40,62
6,50
49,24
GORBEA
0,105
40,62
6,50
42,54
24/2
0,107
40,62
6,50
46,37
CDC SORREL 0,102
40,62
6,50
155,53
GORBEA
0,105
40,62
6,50
191,49
24/3
0,107
40,62
6,50
180,29
CDC SORREL 0,105
40,62
6,50
76,87
GORBEA
0,103
40,62
6,50
85,24
24/4
0,109
40,62
6,50
74,25
46,05
0,07
175,77
0,10
78,78
0,07
111
Anexo 2. Deducción del cálculo de concentraciones de SECO y MATA en base seca.
SECO (µg/g) =
fd•(área + 0,001)•(mV·s)•100•(g) _ 4,809•(µg/g) •(mV·s)•(Masa de muestra (g))•(100-% humedad) -1
SECO (µg/g) =
103,972•(área+0,001)•(µg/g)•(g) _ (Masa de muestra (g))•(100-%humedad)
MATA (µg/g)=
fd•(área–2,178)•(mV·s)•100•(g) _ 4,752•(µg/g) -1•(mV·s)•(Masa de muestra (g))•(100-%humedad)
MATA (µg/g) =
105,219•(área–2,178)•(µg/g)•(g) (Masa de muestra (g))•(100 - % humedad)
_eee
Donde fd=5 corresponde al factor de dilución de la alícuota de 20µL correspondiente al volumen de inyección. Vale decir si el volumen de elusión es de 5ml, el cual contiene toda la masa de sustancia y el volumen de inyección representa “n” µg de sustancia por g (un valor de concentración interpolado en la curva de calibración, según el área obtenida), entonces asumiendo una densidad de 1g/mL del volumen de elusión podemos decir que el valor obtenido de la medición representa una quinta parte de la masa contenida en el volumen de elusión. Por lo tanto al multiplicar por 5 se obtiene la masa de analito total en el volumen de elusión (muestra).
112