UNIVERSIDAD IBEROAMERICANA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL PRODUCCION DE HORMONA DE CRECIMIENTO PRODUCCION DE HORMONA DE CRECIMIENTO La hormona del crecimiento, llamada también Somatotropina, es producida por la pituitaria anterior de humanos, y la hormona es secretada durante toda la vida de la persona. Químicamente es una proteína con una estructura molecular que consiste en una secuencia de 191 aminoácidos; su principal efecto es la estimulación del crecimiento del esqueleto y de todos los demás tejidos del cuerpo mediante la estimulación de la síntesis de proteínas y el rompimiento de ácidos grasos para proveer energía. La hormona del crecimiento estimula el hígado para producir somatomedins (hormonas secundarias) que poseen un efecto similar al de la insulina. El nivel de somatomedin se eleva progresivamente durante la niñez y alcanza su pico durante el crecimiento desmedido que ocurre en la pubertad. La deficiencia de la hormona del crecimiento es una de las muchas causas del enanismo. Cuando se realiza un tratamiento con la esta hormona humana, los niños afectados responden dramáticamente. Por décadas la disponibilidad de la hormona fue muy limitada debido a que se obtenía solamente de las pituitarias de cadáveres. En 1985 el uso natural de la hormona fue interrumpido en los Estados Unidos y en muchos otros países debido a la posibilidad de que la hormona transmitiera una enfermedad lenta causada por un virus fatal conocida como la enfermedad de Creutzfeldt−Jakob. Ese mismo año, por técnicas recombinantes de DNA, los científicos fueron capaces de producir la hormona del crecimiento humano biosintéticamente (la llamaron somatrem), asegurando un abastecimiento casi ilimitado de esta preciosa substancia. La somatotropina, hormona de crecimiento que ocurre naturalmente en animales, ha sido ampliamente estudiada y fue abriendo el camino para las investigaciones sobre la hormona del crecimiento humana. Desde principios de los años sesentas, se observó que los animales de ganadería pueden ser expuestos a muchos químicos usados para promover el crecimiento, el mejor aprovechamiento de los alimentos o para mejorar la aceptabilidad de la carne (ganado). A finales de la década el principal producto que se utilizaba era el diethylstilbestrol (DES), un estrógeno sintético utilizado para promover la ganancia de peso en el ganado. Esto se convirtió en un foco de atención cuando algunos residuos de DES se detectaron ocasionalmente en hígados de res. En los noventas se supo que el DES es un producto cancerígeno que se asocia con desórdenes reproductivos en humanos al ser administrado en grandes dosis, por lo cual su uso para el aumento de peso en el ganado se detuvo. A principios de los 80´s la somatotropina para bovinos (BST) y para porcinos (PST) han sido extensamente analizadas y han tenido que pasar por muchas pruebas. En 1984 la FDA determinó que la res para consumo de humanos a partir de ganado tratado con BST es segura por lo que desde entonces ha sido ampliamente usada. En 1987, Gordon K. Lee reportó que la tecnología para animales transgénicos podría ser utilizada para producir proteínas farmacéuticas en la leche. Esta tecnología ha avanzado desde ratones transgénicos hasta ganado y la leche derivó fármacos que ahora se han evaluado en tratamientos clínicos humanos. En los últimos años se ha desarrollado la tecnología para producir la hormona del crecimiento en un cultivo de células (en bioreactores) lo cual tiene ventajas como por ejemplo el bajo costo de producción, la relativa facilidad de hacerlo a gran escala y una menor inversión de tiempo.

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Las enfermedades en las que se utiliza la hormona del crecimiento humano son: • Insuficiencia de la hormona del crecimiento: Es una condición causada por la deficiencia natural de la hormona del crecimiento. Sin tratamiento los niños alcanzan una altura de 130 cm a la edad de 18 años comparado con un normal crecimiento de 162 cm. Si el tratamiento es inicializado en una etapa temprana, se puede obtener un crecimiento muy cercano al normal. • Síndrome de Turner: Es un defecto genético asociado con la corta estatura. Éste síndrome afecta a niñas solamente. Es causado por el defecto de uno de los cromosomas X. • Insuficiencia Renal Crónica: El retraso del crecimiento es visto comúnmente como una manifestación clínica de la progresiva insuficiencia renal crónica en niños. Desde que la diálisis y los transplantes mantienen los hígados de más niños con falla del estado renal, la estatura corta se ha convertido en un problema prominente. La deficiencia de la hormona del crecimiento en adultos es tratada con debido cuidado en una cirugía de la pituitaria o con la administración de la hormona efectuada desde la niñez. Existen varios métodos para la producción de la hormona de crecimiento humana (hGH) pero los principales son por medio de animales transgénicos aunque también es posible obtenerla de microorganismos recombinantes como puede ser E. coli. Cuatro de los métodos utilizados son: • BIORREACTORES. Producción de la Hormona de Crecimiento a partir de animales transgénicos de granja (ej. caballos, ganado, oveja). • Extracción de la hormona a partir de la sangre Este método además de ser poco práctico porque implica estar extrayendo la sangre de algún animal transgénico para obtener una sola proteína, proporciona muy pequeñas cantidades del producto deseado y resulta ser muy costoso puesto que la sangre extraída requiere de todo un proceso de purificación. • Secreción y extracción de la hormona de la leche Por medio de éste método también se ha intentado obtener la hormona del crecimiento pero sin que se afecte la integridad física del animal o del microorganismo cada vez que es necesario extraerla (ej. microorganismos recombinantes y extracción de la hormona a partir de la sangre). Esto se puede llevar a cabo insertando la información genética, en el DNA de animales de ganado como vacas y cabras (entre otros), para que se produzca la hormona del crecimiento humana o cualquier otra proteína en la leche de éste tipo de animales en grandes cantidades sin afectar su metabolismo de manera. Pero tiene un gran inconveniente que es la purificación de la proteína lo cual hace que el costo se eleve puesto que la leche contiene una gran variedad de proteínas no deseadas a demás de lípidos, etc. que dificultan la separación. • Secreción y extracción de la hormona de la orina Como una de las formas más novedosas para obtener la hGH (aunque todavía le falta perfeccionarse) se ha logrado utilizar la vejiga de los animales de ganado como biorreactores de manera que éstos desechen la hormona por la orina, lo que requiere la síntesis del producto dentro de la vejiga para tener una secreción directa de ésta. Una de las partes de la vejiga (bladder urothelium) produce y expresa en la parte superficial de su punta un grupo de membranas, formadas por proteínas, conocidas como uroplakins las cuales se piensa que funcionan como una barrera permeable y como un estabilizador físico de la punta superficial urothelial región que se ha trabajado recientemente con ratones (uroplakin II = UPII) para expresar el gene de la hGH que además tiene consecuencias fácilmente detectables. 2

El método se basa en la microinyección de la UPII−hGH transgénico en huevos fertilizados de ratón continuando con la misma teoría que en los casos anteriores se modifica la información genética original del animal, posteriormente se espera al nacimiento de éstos y posteriormente se observa que en la orina se encuentra presente concentración significativa de la proteína deseada en éste, la hormona del crecimiento, que se purifica obteniéndose grandes cantidades de éste producto. Una de las principales ventajas que presenta éste método con respecto a los anteriores es el hecho de que la purificación se vuelve un proceso muy simple puesto que la orina contiene prácticamente una nula cantidad de lípidos (no es necesario purificación específica para estos) y con respecto a proteínas también es baja la concentración por lo que los costos se reducen en gran manera, otra de las ventajas es que la cantidad neta obtenida de la hGH es mucho mayor que la que se obtiene de la leche y de la sangre por medio de biorreactores ya que aunque en una sola producción de leche se puede obtener más proteína, ésta forma está muy limitada a las hembras en cierto rango de edades y en ciertos períodos de tiempo dependiendo de la especie. En cambio la hormona obtenida por medio de la orina aunque en menores cantidades puede extraerse de continuo a partir del nacimiento del animal sin importar su sexo, su edad e inclusive su especie por lo que ha resultado ser un gran avance en la ciencia además de que es obvio que no se le causa ningún daño físico al biorreactor en el momento de la extracción contrario al método de extracción de la hormona de la sangre. Diagrama de Flujo: • Producción de la Hormona de Crecimiento por fermentación a altas densidades de E. coli recombinante 4 Este método se basa en la utilización de E. coli k802 como el lugar de hospedaje para el plásmido recombinante que contenga la información de producción de la hGH (pSSM). Se hace una inoculación de la misma en un medio LB (polipeptona 10 g/l, extracto de hongo no filamentoso 5 g/l y cloruro de sodio 5 g/l) a un pH ajustado a 7, se le da como fuente de carbono glicerol en vez de glucosa, para disminuir el tiempo de fermentación y evitar que produzca subproductos como el acetato que inhibe su crecimiento. Las semillas de E. coli cultivadas se transfieren a un tanque que contiene 200 ml de el medio LB con 100ðg/ml de concentración de ampicilina donde se hace una incubación durante toda la noche a 37°C y 220 rpm en un agitador orbital. El contenido total de este tanque se utiliza para inocular el fermentador que contiene un medio con 45 g de KH2PO4; 256g de NaHPO4 * 12H2O; 15 g de NH4Cl; 7.5 g de MgSO4 * 7H2O; 0.5 g de CaCl2; 7.5g de NaCl; 750 g de triptona; 375 g de extracto de hongo no filamentoso y 121 de agua de osmosis inversa que se agregó al medio para un proceso batch de duración aproximada de 10 horas a 37°C y pH controlado de 7.2, oxígeno disuelto controlado por medio de la incrementación de la agitación desde 300 rpm hasta 600rpm, seguidas de adiciones de mezclas de aire y oxígeno puro de 1 vol/vol/min (flujo total) para mantener relativo oxígeno disuelto sobre el 20% de saturación. Todo esto se llevó a cabo con una alimentación batch de fermentación de soluciones consistentes de triptona 200 g/l; extracto de hongo no filamentoso 100 g/l; glicerol 21 y 21 de agua de osmosis inversa agregada a la solución. Inicialmente se alimentó a una velocidad de 2ml/min 50% de glicerol. Después de 2 horas se elevó a 5 ml/min y de 6 horas en adelante se mantuvo la velocidad de 5 ml/min pero en vez de glicerol se añadió la solución anteriormente mencionada para mantener la alta densidad de la fermentación. Finalmente, se extrae la hormona de crecimiento acumulada de manera intracelular. Este método ha sido desarrollado para mejorar la productividad y dar ventajas tales como reducción de volumen, bajos costos de producción y bajos costos de inversión en equipo.

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Los mayores beneficios de la biofarmacéutica sobre el cultivo de células (utilización de microorganismos recombinantes) son los bajos costos de producción, y la relativa facilidad de utilizar una escala más grande. Sin embargo, la producción de animales transgénicos de granja requiere una inversión considerable de tiempo. Diagrama de Flujo: * * SITUACIÓN ACTUAL EN MÉXICO Existen varias marcas de medicamentos que contienen la Hormona del Crecimiento Humana en México y son usados para el tratamiento de personas con deficiencia de esta hormona presentando un nivel bajo de crecimiento; además de estar relacionada con la restauración de la masa muscular, la reducción de la grasa corporal, el aumento de energía, la normalización de la presión arterial y un mejoramiento de la función inmune entre otros. Este medicamento se da por inyección en un músculo o bajo la piel. Usualmente se aplica tres veces a la semana. Para mejores resultados debe de ser usado exactamente como se prescribió. En cada caja de ampolletas se encuentra un instructivo en donde se señala la mejor manera de aplicarse, los efectos secundarios que pudiera tener (como dolores de cabeza, fatiga o dolor del músculo). También se mencionan las precauciones que se debe tener dependiendo del historial médico (si padece de alergias, diabetes, o en el embarazo) y que en caso de perder una dosis, no se debe de aplicar dos veces para ponerse al corriente con el tratamiento. La Hormona del Crecimiento Humana se puede adquirir en farmacias bajo el nombre de Humatrope. Esta solución inyectable de ADN recombinanate se presenta en ampolletas de 13.3 unidades y posee un valor de $1,416 o de 4 unidades con un precio de $506. También se puede conseguir vía Internet bajo el nombre de Protropin, Nutropin, PRO hGHTM, mostrandose una larga explicación del producto anexa. Una onza de Protropin se consigue en 75 USD y una caja de PRO hGH en 89 USD, tres por 259 y cinco por 419 USD. Se entrevistó a un doctor experto en endocrinología en el Hospital Médica Sur quien nos informó que la hormona del crecimiento si es una alternativa conveniente para el tratamiento del enanismo desde la edad en que se detecta, así como para problemas musculares y osteoporosis entre otros en personas de edad avanzada principalmente. Esta Hormona se emplea de manera indistinta en hombres o mujeres. Conclusión La hormona del crecimiento humana resultó ser una muy buena alternativa para tratar las enfermedades mencionadas, en base a la información obtenida en endocrinología en el Hospital Médica Sur, ya aproximadamente en el noventa por ciento de los casos tratados se obtienen los resultados esperados. Estamos conscientes de que uno de los grandes impedimentos tanto para que se recete así como para que se continúe su tratamiento es el alto costo del producto. Al haber realizado este trabajo nos pudimos dar una mejor idea de lo que la producción de un producto biotecnológico involucra, así como sus ventajas sobre otros métodos de obtención. Bibliografía: 4

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