OBTENCION DE LINEAS CELULARES PRODUCTORAS DE LAS 1SOFORMAS DE 2 0 Y 2 2 KD DE LA HORMONA DEL CRECIMIENTO HUMANO

QUE CON OPCION AL TITULO DE MAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN BIOLOGIA MOLECULAR E INGENIERIA GENETICA

O.F.B. ROCIO ORTIZ LOPEZ

MONTERREY. N.Lv,

NOVIEMBRE DE 1992

1020071209

OBTENCION DE LINEAS CELULARES PRODUCTORAS DE ISOFORMAS DE 20 Y 22kDa DE LA HORMONA DEL CRECIMIENTO HUMANO

T E S I S QUE CON OPCION AL TITULO DE

MAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN BIOLOGIA MOLECULAR E INGENIERIA GENETICA

PRESENTA

ROCIO ORTIZ LOPEZ

Monterrey, N.L., Noviembrebre de 1992

T - t /

C

/

FONDO TESIS

24061

"OBTENCION DE LINEAS CELULARES PRODUCTORAS DE LAS ISOFORMAS DE 20 Y 22kDa DE LA HORMONA DEL CRECIMIENTO HUMANO" Por: ROCIO ORTIZ LOPEZ El comité de tésis:

Dra. Herminia G.^Mart

;

Rodríguez

J U

Dr/a. Mai Martha Guerrero de Viader.

Dr.Ju^io S^púlveda Saavedra

u Dr. Jesús Zacarías Villarreal Pérez.

Aprobó : r-

c w . Dr. Mario Césaj Salinas Carmona Secretario de las Ciencias Básicas Sub-dirección de Investigación y Estudios de Postgrado Facultad de Medicina de la U.A.N.L.

Este trabajo de tésis se realizó en la Unidad de Laboratorios de Ingeniería y Expresión Genéticas del Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Nuevo León, bajo la asesoría del Dr. Hugo A. Barrera Saldana y con la co-asesoría de la Dra. Herminia G. Martínez Rodríguez.

DEDICATORIA

S?/ s?

rfe/f&jrte

^ f / - J/ *//*

MJW/rSWXXto" ¿torSMfar'*

¿te

AGRADECIMIENTOS: Al Dr. H. Barrera, mi director de tésis, quien con su caracter me enseñó a discernir por mi misma y a templarme el espíritu en este mundo de la ciencia donde además del conocimiento, la paciencia y la entrega son necesarios para continuar la búsqueda infinita. A Hugo, la otra parte del Dr. Barrera, por su apoyo en muchos de los tiempos difíciles. Gracias.

amistad y

A la Dra. Herminia Martínez Rodríguez, por su asesoría en este trabajo y sobre todo por el interés que muestra para sus alumnos. A mi comisión de tésis, por sus valiosas sugerencias. A la Dra. Martha Guerrero, además de su interés, sugerencias y su tiempo, gracias por su comprensión.

sus

Al Dr. Guillermo Elizondo, director del Centro Internacional de Biología Molecular y Celular, A.C. por su apoyo económico y moral otorgado. Al Dr. Juan Pablo Martínez Soriano, por su amistad y ayuda. Al Laboratorio de Endocrinología del Hospital Universitario "José Eleuterio González", por su colaboración en las pruebas de radioinmunoensayo. Al Dr. Antonio Luna trabajo fotográfico.

por su

gran disposición

y excelente

Al Dr. Mario César Salinas, al Dr. Jesús Zacarias Villarreal y al Lic. Armando Nájera, por su valiosa ayuda en los trámites para la presentación de mi examen. A mis primeros compañeros de laboratorio: Diego, Alfredo, Jaime, Paty, Manuel, Kiwi, Rosy y especialmente Vitorio, de quienes guardo un especial recuerdo. A los de aquí (que están o que pasaron por aquí) : Augusto por supuesto (mi cachaco preferido), Ata (el gran ser), Jorge (el buen George), Eddy, Norma, Carmen, Lolita, Zavala {el compañero), Déctor (el príncipe Jaroch), Mario (el pollo), Chapis (mi estimada), a Ruy, Catty, Roberto, Jorge, Víctor, Leslie, Laura, Angela y Ana, porque finalmente uno termina queriéndolos mucho.

A Diana y a Claudio, por todas las batallas sostenidas (a favor o en contra nuestra?), por los apoyos morales, por las travesuras (muchas, incluyendo la última), por los pleititos, por aquéllos dias de seminario, por las alegrías, en fin, por todas las cosas que hacen a los amigos. A todas las maestras y maestros del departamento de Bioquímica. A las secretarias: Mirthala, Leonor, Chelita, Gladys y Rosy, por su buena disposición y ayuda. A Raúl y a Lalo, al Sr, Aroon, Dn. Ponchito y a Dn Pedro, mi

Sflfifi0'

I N D I C E LISTA DE ABREVIATURAS LISTA FIGURAS Y TABLAS RESUMEN

i ii 1

INTRODUCCION 1.

2.

3.

LA HORMONA DEL CRECIMIENTO HUMANO. 1.1. Actividad biológica de HGH 1.2. Síntesis y regulación fisiológica 1.3. Estructura y aspectos bioquímicos 1.4. Aspectos moleculares 1.5. Potencial farmacológico de HGH 20kDa y perspectivas para su producción

14

El MODELO CHO/MTX/DHFR 2.1. Elementos del modelo CHO/DHFR/MTX 2.2. Características de la amplificación

17 19

ANTECEDENTES PARTICULARES

22

OBJETIVOS E HIPOTESIS

3 5 6 7

24

MATERIAL Y METODOS 1.

ESTRATEGIA GENERAL DEL TRABAJO

25

2.

ORIGEN DEL MATERIAL Y LOS REACTIVOS

28

3.

ORIGEN DEL MATERIAL BIOLOGICO

29

4.

METODOS

30

4.1. PRIMERA FASE: Clonación de los ADNcs de HGH 20 y 22kDa en el plásmído pNUT

30

4.2. SEGUNDA FASE: Transfección, selección y amplificación. 4.2.1. Cultivo de células 4.2.2. Ensayos de la enzima cloranfenicol-acetiltransferasa 4.2.3. Determinación de los niveles de toxicidad de MTX en la línea celular CHODG44 4.2.4. Transfección y selección de células CHO/DHFR( + ) 4.2.5. Estrategia de amplificación con dosis crecientes de MTX 4.2.6. Estrategia alternativa de amplificación...

32 32 33 33 34 35

4.2.7. Detección de HGH 4.2.8. Estandarización del Western Blot 4.3. TERCERA FASE: Análisis de la expresión e integración de los ADNcs de HGH20 y 22kDa mediante la RCP 4.3.1. Estandarización de la RCP 4.3.2. Análisis de la expresión de los ADNcs de HGH20 y 22kDa 4.3.3. Análisis de la integración y establecimiento del número de copias por genoma, de los minigenes de 20 y 22kDa en las Células CHODG44

35 36

37 38 40

41

RESULTADOS Y DISCUSION 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Los plásmidos pNUTHGH20kD y pNUTHGH22kD Ensayo de CAT en la línea celular CHODG44 Ensayos de toxicidad del MTX en la línea celular CHODG44 Expresión de HGH detectada por RIA Expresión de HGH detectada por Western blot Estandarización de la RCP Análisis por RCP de la expresión de los ADNcs transfectados Análisis de la integración de los ADNcs Determinación del número de copias

44 49 51 51 56 57 58 60 60

CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

66

BIBLIOGRAFIA

71

LISTA DE ABREVIATURAS ADN ADNc

Acido desoxirribonucleico ADN complementario al ARN mensajero ARN Acido ribonucleico ARNm ARN mensajero CAT Cloranfenicol acetil transferasa CHODG44.. Línea celular de Ovario de Hámster Chino, deficiente de la DHFR BGH Hormona del crecimiento bovino DHFR Enzima dihidrofolato reductasa dhfr Gen para DHFR DMEM Medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco GH Hormona del crecimiento GHRH Hormona liberadora de la GH Hora (s) h hCMV Citomegalovirus humano HGH Hormona del crecimiento humano h-HGH.... HGH obtenida de hipófisis hGH N Gen normal para HGH HPL Hormona lactogénica placentaria kDa. Kilodaltones kpb Kilopares de bases M Concentración molar met-HGH.. Forma metionil-HGH mg Miligramos min Minuto (s) mi Mililitros MTX Metotrexato ¡jq Microgramos lil Microlitros nM Nanomolar pb Pares de bases PGH GH porcina pfí Logaritmo negativo de la concentración de iones H"* pMT Promotor del gen metalotioneína Prl Prolactina RCP Reacción en cadena de la polimerasa RIA Radioinmunoensayo SDS Dodecil sulfato de sodio SBF Suero bovino fetal Sm Somatomedina SMC Sitio múltiple de clonación St.. Somatostatina SV40 Virus 40 del simio

LISTA DE FIGURAS Y TABLAS Figura

1:

Regulación de la secreción de HGH

Figura

2:

Secuencia

de

5

aminoácidos de HGH22kDa y

modelo tridimensional general para las GHs

8

Figura

3:

Complejo multigénico hGH-hPL

10

Figura

4:

Ciclo del dihidrofolato (FH2)

18

Figura Figura

5: 6:

Estructura del minigen HGH Estrategia general del trabajo experimental

21

Figura

Estrategia de clonación utilizada para el ensamblaje de los minigenes HGH 20 y 22kDa en el vector pNUT

31

Estrategias utilizadas para la cuantificación del número de copias génicas

40

Mapas de restricción y organización de los plásmidos: pNUTHGH2OkD, pNUTHGH22kD y pNUT(-)

46

Patrones electroforéticos de los plásmidos pNUThGH20kD, pNUThGH22kD y pNUT cortados con las enzimas de restricción PvuII, BamHl+Rsal y BamHl+EcoRl

47

Patrones electroforéticos de los plásmidos pNUThGH20kD, pNUThGH22kD y pNUT cortados con las enzimas de restricción PstI, Bqlll y Smal

48

Figura 12:

Resultados del ensayo CAT

50

Figura 13:

Ensayo de toxicidad con MTX en la línea celular CHODG44

51

Expresión de HGH en células CH0DG44 transí ectadas

52

Expresión de HGH en cultivos sometidos a dosis iniciales bajas de MTX seguida de dosis crecientes de la droga (Estrategia A)...

53

Figura Figura

7:

27

8: 9:

Figura 10:

Figura 11:

Figura 14: Figura 15:

Figura 16:

Figura 17:

Figura 18: Figura 19: Figura 20:

Figura 21:

Figura 22:

Figura 23:

Niveles de expresión de HGH en cultivos sometidos a dosis crecientes de MTX, iniciando con dosis altas de la droga (Estrategia B)

54

Comparación de la expresión de HGH en cultivos sometidos a ambas estrategias de amplificación

55

Expresión de HGH 20 y 22kDa determinada por "Western blot"

56

Análisis de productos amplificados a partir de los híbridos ARN-ADNc

59

Cuantificación del número de copias en la línea celular productora de HGH20kDa, resistente a 50 nM de MTX

62

Cuantificación del número de copias en la línea celular productora de HGH22kDa, resistente a 50 nM de MTX

63

Cuantificación del número de copias en la línea celular productora de HGH20kDa/ resistente a 10 juM de MTX

64

Cuantificación del número de copias en la línea celular productora de HGH20kDa, resistente a 50 nM de MTX, utilizando la estrategia 1

65

4

Tabla

1:

Efectos principales de HGH

Tabla

2:

Isoformas de las hormonas de crecimiento..

11

Tabla

3:

Resultados de la purificación de los plásmidos en gradiente de cloruro de cesio

49

Tabla

4:

Parámetros para la reacción de amplificación ( RCP )

58

RESUMEN La hormona del crecimiento (20kDa) es una HGH

humano (HGH) de 20

variante o isoforma (producto

de 22kDa

que

se encuentra

de han

HGH.

Las dificultades para

limitado

su

fisiológico.

estudio

y

En nuestro

clonar, a partir de

variante

humanas

total

la purificación de esta variante el

esclarecimiento

de

hipófisis humanas, los ADNs

su

papel

se lograron

complementarios

(ARNms) correspondientes a HGHs de

Con la finalidad de mejorar la disponibilidad de

de 20kDa

propiedades

y

así

poder

biológicas,

de

y sangre

5 al 10% del

laboratorio recientemente

(ADNcs) a los ARNs mensajeros 20 y 22kDa.

del mismo gen)

en hipófisis

periférica constituyendo aproximadamente del

kilodaltones

estudiar

se decidió

diferencias

expresar dicho

sistema que permitiera su expresión estable

en

ADNc

la sus

en un

y la sobreproducción

de la hormona recombinante. En este trabajo logré la obtención de tres líneas celulares, dos

productoras

de

HGH20kDa

y

una

empleando el sistema CHO/DHFR/MTX de

hámster chino

dihidrofolato selección de

inhibidor

(DHFR).

de la

HGH22kDa,

para

sistema

induce la

la enzima la

incluya una

otra del gen para

utilizando

ovario

permite

un plásmido que

interés (gen hGH) y DHFR, se

el gen

Este

células portadoras de y posteriormente,

de

que utiliza células de

deficientes en

reductasa

copia del gen de (gen dhfr)

(CHO)

productora

la DHFR

metotrexato (MTX),

un

amplificación conjunta

de

dichos genes. Probando

variaciones

amplificación,

encontré

establecimiento

de

en las

cultivos

el

esquema

condiciones estables

con

de que

inducción de

la

favorecen

el

fenotipo

normal

productores de la forma recombinante de la variante hormonal.

y

Confirmé

la presencia de las isoformas de

20 y 22 kDa

por

"Western blot" y las células, actualmente resistentes a 100 nM de MTX, tienen

niveles de producción de 6

que rebasan sometidas genómico de

1 ¿/g/10 células/día, al

proceso de estas células

las hormonas recombinantes las cuáles continúan

amplificación. mostró

El

que el ADNc

análisis

siendo del ADN

de HGH20kDa está

amplificado en más de 100 copias e integrado al genoma celular.

INTRODUCCION

1. LA HORMONA DEL CRECIMIENTO HUMANO 1.1. Actividad biológica de HGH HGH

es

esencial para

el crecimiento

postnatal y

para el

metabolismo normal de carbohidratos, lípidos y proteínas (1). Las propiedades

inductoras

del

crecimiento

de

HGH se

determinan

mediante la prueba de ganancia de peso (valoración del incremento de

peso

en

animales

alargamiento de epífisis

la

hipofisectomizados)

tibia

(medición

de las tibias después de

del

y

la

prueba

crecimiento

de

de las

inyecciones diarias de HGH en

animales hipofisectomizados) (1,2) . Aunque

con

estas pruebas

fácilmente reconocidos, el la

obstáculos

en la exploración de los

discrepancia

observados in

no

de

vitro.

son

los

La

efectos de

sitio y el

efectos de es la

hormona

los

Uno vivo

con

administración de HGH

crecimiento

somático acelerado. Sin

de

los

los

mayores

mecanismos de acción de HGH

efectos ^

estimulación de

pueden ser

mecanismo celular de

claros.

una marcada

HGH

la condrogénesis

los

efectos

¿n vivo produce y un

subsecuente

embargo, cuando se adiciona

la hormona a explantes de cartílago y a preparaciones de músculo, los efectos son casi nulos (2). Esta

discrepancia de efectos y la identificación de algunas

proteínas

en

estimula el factores

dependientes de

crecimiento somático de

de crecimiento llamadas

como segundos factores

plasma,

mensajeros de GH

GH,

sugirieron

manera indirecta,

que HGH mediante

somatomedinas (Sm), que fungen (3).

Las Sm, también

de crecimiento insulino-agonistas I y

llamados

II (IGF I y II),

son altamente dependientes de los niveles circulantes de HGH.

Se

ha probado que las preparaciones de IGFs libres de HGH, insulina, testosterona

ó tiroxina y tienen el

mismo potencial de HGH para

promover

el

regulación

crecimiento de

la

somático

secreción de

y

IGF-I

el es

del

cartílago.

un proceso

La

complejo

influido por HGH, lactógeno placentario (HPL), prolactina (HPrl), hormonas esteroides (incluyendo andrógenos), hormonas tiroideas

glucocorticoides, estrógenos e insulina, así

como el

y

estado

nutricional (2,3). Recientemente,

gracias

recombinante (producida efectos

a

la disponibilidad

en bacterias), se ha

de HGH sobre el

de

su

forma

demostrado que los

metabolismo de lípidos, carbohidratos y

proteínas pueden dividirse

dos: efectos semejantes

a los de

la

insulina (insulino-agonistas) y efectos diabetogénicos (insulinoantagonistas)

que

se

correlacionan

respectivamente

efectos agudos y crónicos (Tabla 1).

TABLA 1.

EFECTOS PRINCIPALES DE HGH*

I. EFECTOS INDIRECTOS: - Estimula crecimiento corporal. II. EFECTOS DIRECTOS: A) Insulino-agonistas (efectos agudos) Incrementa la captación intracelular de aminoácidos. Induce hipoglicemia y aumento de la oxidación de ácidos grasos. Estimula adipogénesis. B) Insulino-antagonistas (efectos crónicos) Incrementa la resistencia a la insulina. Induce hiperglicemia (efecto diabetogénico). *Información recabada de las referencias 2 y 3.

con

los

Estos efectos parecen ser intrínsecos a la molécula de HGH y estar

mediados, en

forma

directa, por

receptores en

diversos

tejidos (4). 1.2. Síntesis y regulación fisiológica HGH es

sintetizada

adenohipófisis.

por

las

células

somatótrofas

de

la

Tiene una vida media de aproximadamente 25 min y

se secreta al torrente circulatorio a una tasa de aproximadamente 1

g/día

controlada

(2,5).

La

secreción

al

torrente

circulatorio

es

por dos factores hipotalámicos: La hormona liberadora

de GH (GHRH) que es el regulador positivo y la somatostatina (St) que

es el

regulador

negativo. Tanto

la

GHRH como

la

St son

modulados por el efecto de factores biológicos y ambientales como el estrés, el sueño, la hipoglicemia, algunos fármacos (L-dopa clorpromazina) vasopresina y

y

las

hormonas

la misma HGH)

(andrógenos,

que actúan

y

estrógenos,

en el sistema

nervioso

central y particularmente sobre el hipotálamo (2, 7). Recientemente se ha demostrado que la regulación positiva de GHRH se ejerce directamente a nivel del gen (hGHN), induciendo la liberación de factores activadores de la transcripción, que

la somatostatina

inhibiendo

regula negativamente

la movilización

de calcio

(al

la secreción

mientras de HGH

estabilizar reservas

intracelulares de este ion) requerido para mediar la unión de HGH a su receptor (7).

^Estimulo Ewterjru^] w

i

i

M

SOMRTOMED1HRS l

TEJIDOS PERIFERICOS

Figura 1. Regulación de la secreción de HGH. Se representa la interacción de algunos órganos, tejidos y hormonas que determinan la regulación positiva o negativa de HGH. GHRH: Hormona liberadora de HGH, IGF-I: Factor de crecimiento insulinoagonista, Sm: Somatomedina y St: Somatostatina.

1.3. Estructura y aspectos bioquímicos La isoforma de por

una sola

extremos

amino

HGH mejor conocida

cadena polipeptídica de y

carboxi-terminales

es una proteína

formada

191 aminoácidos,

con los

libres

y

dos

enlaces

disulfuro internos que la constriñen y dan origen a dos asas, una mayor y otra menor

(Figura 2,A).

Esta proteína es una globulina

con un peso

molecular aproximado de 22kDa. Se sintetiza como una

pre-hormona

de

217

aminoácidos

con

un péptido

señal

de

26

residuos hidrofóbicos en el extremo amino terminal de la proteína madura (5).

Recientemente Abdel-Meguid y cois. llo y mejoramiento al

análisis

de los métodos de purificación de proteínas y

cristalográfico

determinaron la

(6), gracias al desarro-

estructura

crecimiento porcino

(PGH).

por

difracción

tridimensional La

alta

de

de la

similitud

rayos hormona

en

X, del

secuencia

aminoacídica que presentan las HGs de diferentes especies sugiere que

la estructura

encontrada puede

propornerse como

un modelo

tridimensional general para todas las GHs (Figura 2, B). 1.4. Aspectos moleculares El

gen

multigénico

hGH N hGH-hPL

se

encuentra localizado

constituyendo en

las

bandas

el

complejo

q22-q24

del

cromosoma 17.

Este complejo multigénico

contiene dos genes para

HGH

para

la

y

tres

HPL,

todos

con

misma

orientación

transcripcional y separados uno de otro por regiones intergénicas de 6 a 13 kilopares de bases (kpb). La disposición de estos genes en el genoma humano es la siguiente: 5 ' *-hGH N (normal) -hPL^hPL^-hGH^ (variante) -hPL 3 *-3 1 (Figura 3A). La alta similitud entre los genes hGH y hPL, tanto en la secuencia (aproximadamente del 95%) como en la función de sus productos, sugiere que éstos se generaron por duplicación y divergencia a partir de un gen ancestral común (8, 9). Los miembros de esta familia multigénica hGH-hPL se expresan en diferentes tejidos y bajo distintos mecanismos de control. El gen hGH N es el único que se expresa en que el resto lo hace en placenta (10).

la hipófisis, mientras

N

Figura 2. Secuencia de aminoácidos de HGH22kDa y modelo tridimensional general para las GHs. En (A) se muestran los 191 aminoácidos que constituyen a la proteína madura de HGH de 22kDa y la posición de sus enlaces disulfuro internos. El modelo tridimensional representado en (B) está basado en la estructura de PGH. Los cilindros representan la estructura a-hélice y la numeración de los resisuos aminoacídicos está hecha con base a la secuencia de HGH mostrada en (A).

Los cinco genes

son muy similares en organización, cada uno

presenta cinco exones interrumpidos cuatro

intrones

pequeños.

en las mismas posiciones por

Estos

genes

incluyen

regiones

simétricas invertidas, repetidas y palindrómicas que posiblemente unen

proteínas

importantes en

la

regulación

de la

expresión

génica (10). Numerosos estudios como

en

la

circulación

determinado por estructura,

han revelado

que tanto en

periférica,

el

efecto

la hipófisis de

HGH

está

una colección de polipéptidos similares pero con

motilidad

variable (11, 12).

electroforética

y

actividad

biológica

Propiamente, algunas de éstas corresponden

a

isoformas (productos de un mismo gen, generados por vias alternas de la maduración

del ARNm),

mientras que

agregados, formas inmaduras, etc.

otras corresponden

a

LOCUS

hGH-hPL Cromosoma # 17

/

Hipófisis

B)

P

II

_

III

l a c e n t a

_

1

60kb

IM

5'

Procesamiento del SNA

C)

525?

—AAA

51515?

-AAA

SHAn de HGH 22kD

• AAA

RNA Precursor

RHA Precursor _7m

7m

G

-AAA

RHAn de HGH 201 95X s í m i i a r al d e hGH.

** HS p b e n e l DHAc

adicionales de HGHSSkO

Figura 5. Estructura del minigen HGH. Se representa la estructura del "minigen" que contiene el fragmento AatlI-Smal del ADNc que codifica para HGH20kDa y (**) la forma alternativa para el de HGH22kDa. Este minigen se reconstruyó utilizando para el extremo 5': un fragmento de 79 pb (*) correspondiente también a las regiones 5' del gen (fragmento BamHl- PstI) y del ADNc (fragmento PstI-AatlI) de hPL-3; para el extremo 3' se utilizó el fragmento Smal-EcoRl que comprende la región para la señal de poliadenilación (poli A) del gen hGHN. Los sitios BamHl y EcoRl son sitios únicos que flanquean de la región codificadora en ambos minigenes. Estos sitios los utilicé para llevar a cabo la construcción de los plásmidos recombinates pNUTHGH2 OkD y pNUTHGH22kD (ver más adelante en materiales y métodos).

OBJETIVOS E HIPOTESIS

OBJETIVOS Los objetivos fijados para llevar a cabo el presente trabajo fueron: 1.

Construir plásmidos

recombinantes

que

expresaran

en

cultivo celular, los minigenes HGH20kDa y 22kDa y que a la

vez

permitieran

la selección

de

clonas

que los

portaran. 2.

Introducir dichos plásmidos por transfección, a células en cultivo y seleccionar las

clonas productoras de las

isiformas de HGH. 3.

Derivar

líneas

sobreproductoras

de

las

isoformas

induciéndoles amplificación de los minigenes.

HIPOTESIS La hipótesis de trabajo fué la siguiente: "Si

se explotan las

introducir por de

HGH20kDa

exposición

ventajas del

modelo CHO/DHFR/MTX para

separado, en cultivo celular, y

HGH22kDa

y selección

e

inducir

con MTX,

los minigenes

su amplificación

se pueden

por

obtener líneas

celulares sobreproductoras de estas isoformas".

I

MATERIAL Y METODOS

1. ESTRATEGIA GENERAL DEL TRABAJO Para lograr dichos objetivos, dividí el trabajo experimental en tres fases

que se esquematizan en

la figura 6 y

describo a

continuación: I)

En

la primera fase

obtuve los plásmidos recombinantes

pNUTHGH20kD y pNUTHGH22kD que tienen la característica de poseer, además del minigen de interés, el ADNc de la enzima DHFR, el cual sirve como gen ellos.

de selección en células DHFR(-) transíectadas con

Caractericé estos

diagnósticas grandes

y

plásmidos con enzimas

confirmada

su

cantidades y en forma

identidad,

de

expresión

6, I).

utilicé,

plásmido pNUT(-), que carece de (38)

obtuve sus

A lo largo como testigo

de todos los negativo

al

secuencias codificantes para HGH

La segunda fase

del trabajo experimental

la introducción, por separado, de células CHO DHFR(-).

los plásmidos recombinantes en

a sin nucleótidos y

empleando dos estrategias para amplificar el minigenes

iniciar el otra

en

incorporados a

esquema de

aumentarlas en

las

amplificación con dosis muy

alta

posteriormente,

número de copias de

células.

forma paulatina (Figura

utilizar una

consistió en

Las células portadoras de los plásmidos las

seleccioné utilizando medio

Una

consistió en

dosis bajas

de MTX

6, Estrategia de MTX

para

I)

los cultivos así

hasta su

completa recuperación

determiné la expresión de HGH .

por RIA (39) y por

y

y la

iniciar la

inducción de la amplificación (Figura 6, Estrategia II).

(40)

en

. II)

los

ADNs

pura para realizar los siguientes

ensayos de transfección (Figura experimentos

de restricción

en los

Mantuve cuales

"Western Blot"

III) En finalidad

de

la

tercera y

corroborar

minigenes en el genoma cualitativos

última la

identidad

y cuantitativos del ARN y

reacción en

varios

cadena

de la

e

trabajo,

integración

con de

la los

del ADN obtenidos de las mediante la metodología de

polimerasa (RCP)

cultivos productores de HGH y

(41).

Analicé

después de que confirmé la

integración de los ADNcs en el genoma de número aproximado de

del

de las células CHO, llevé a cabo análisis

células que expresaban HGH20 ó 22kDa, la

fase

las células, calculé el

copias del material genético amplificado.

La ejecución experimental

de estas tres

fases requirió

los materiales y métodos descritos a continuación.

de

Figura 6 .

ESTRATEGIA GENERAL DEL TRABAJO

A

«3f § *© -

Z

ì

i

CONSTRUCCION DE L O S PLASMICOS R E C O M B I N A N T E S

EXPERIMENTAL

CARACTERIZACION COH ENZIMAS DE RESTRICCION

PURIFICACION V PROPAGACION

n)

1 © C E L U L A S CHO DHFR

O ©

0

O

o

o

@

PLASMIDOS RECOMBINANTES

I TRANSFECCIOH

SELECCION ( M e d i o oc) AMPLIFICACION < ESTRATEGIA I 5

MTX

5

nM

MTX

10 •

nM

MTX

SS n M

MTX

SO nM

AMPLIFICACION < ESTRATEGIA n > +

MTX 1 0 , 0 0 0

i

MTX 1 0 , 0 0 0

DETECCION

ANALISIS

DI)

DE HGH

DE LA

MINIGENES

POR

RIA

EXPRESION

DE

0

"WESTERN

E INTEGRACION

20 V 2 2 k D

MEDIANTE

LA

RRN

nM

nM

BL0T"

DE RCP

LOS

I

POOOOOCOOOOOOOC ADN GENOMICO

TRANSCRIPTASA INVERSA

fiDNc

r H

20k

22k

C

EXPRESION H = ADN G E N O M I C O

HUMANO

H SOk 8 2 k

C

INTEGRACION C = RON GENOMICO DE

S:1

H:2

^

%

i 3:3 i

N U M E R O DE CELULAS

NO

2:H f

i:S f

COPIAS

TRflHSFECTADflS

2. ORIGEN DEL MATERIAL Y DE LOS REACTIVOS El material requerido

para el cultivo de

células (pipetas,

botellas, tubos, cajas, filtros, unidades de filtración, etc.) lo obtuve de Falcon (Lincoln Park, NJ, EUA), EUA),

In^ vitro

Promega (Madison, WI, EUA), Corning

(Ventura CA,

(New York, NY, EUA) y

Costar (Cambridge, MA, EUA). Los reactivos necesarios para la preparación de soluciones y medios

de

cultivos,

[precursores

de

así

como

nucleótidos,

los

suplementos

aminoácidos,

(SBF),

etc.] los

adquirí de Sigma

EUA) y

Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, EUA) .

para

éstos

suero bovino

fetal

Chemical Co.

(Missouri, MI,

El MTX lo

compré de

Sigma. Las

enzimas

comerciales, England

como

Biolabs

(Indianapolis, utilicé

de

de

restricción

Bethesda (NEB;

las

Research

Beverly, MA,

IN, EUA) y Pharmacia

acuerdo a

obtuve de

varias

Laboratories EUA),

casas

(BRL),

New

Boehringer Mannheim

(Piscataway, NJ, EUA) y las

las recomendaciones

del fabricante.

estuche enzimàtico para la síntesis de los ADNcs

El

y la enzima ADN

polimerasa Taq (Taq poi), los obtuve de BRL. Los reactivos empleados amortiguadores, así como

en la

elaboración de soluciones

los utilizados para la

y

preparación, el

desarrollo y la tinción de los geles, provenían también de varias casas comerciales como Sigma, Merck (Darmstodt Germany), (Milwaukee, WI, EUA), IBI (Lakewood, NJ, EUA), BRL

Aldrich

y Casa Rocas,

S.A. (Monterrey, N.L. México). Los

oligonucleótídos

amplificación por RCP

que

utilicé

en

las

fueron diseñados en nuestro

reacciones

de

laboratorio y

adquiridos de Synthetic Genetics, Inc. (San Diego, CA, EUA).

3. ORIGEN DEL MATERIAL BIOLOGICO El plásmido pNUT (42) fué obsequiado a nuestro laboratorio por el Dr. Richard Palmiter de la Universidad de Washington en Seattle, E.U.A. Los plásmidos (pAVE2HGH20kD, pAVE 2 HGH2 2 kD, pNUT(-) y pCMVcat) y las bacterias (Escherichia coli de la cepa RR1) provinieron de la colección existente en nuestra Unidad de Laboratorios de Ingeniería y Expresión Genéticas (ULIEG), en cuyo laboratorio del Genoma realicé el presente trabajo. La

línea

celular CHO/DG44

(36)

la donó

el

Dr. Lawrence

Chasin de la Universidad de Columbia (New York, NY, EUA). Los

marcadores

de peso

molecular:

Lambda+HindIII+EcoRI y

pUC+Alu los preparó en el laboratorio Eddy Luz Cab Barrera. Para la cuantificación comercial

de Diagnostic

de HGH por

RIA, utilicé un

Products Co. (Los

estuche

Angeles, CA,

EUA) y

para ello recibí el invaluable apoyo del personal del Servicio de Endocrinología

de nuestro

Hospital

Universitario "Dr.

José E.

González". La

proteína HGH

anticuerpos (primero y inmunodetección Dra. de

purificada

de

hipófisis

segundo anticuerpos)

(h-HGH)

y

que emplee para

los la

por "Western blot" son generosos donativos de la

Angélica Salas, del Instituto de Investigaciones Biomédicas la UNAM.

El

anticuerpo de

cabra anti-Ig

total

conjugado con fosfatasa alcalina lo obtuve de Sigma.

de conejo

4. M E T O D O S 4.1. PRIMERA FASE: Clonación de los ADNcs de HGH de 20 y 22kDa en el plásmldo pNUT. Mediante técnicas estándares de Biología Molecular (43), llevé a cabo la construcción de los plásmidos pNUTHGH20kD y pNUTHGH22kD/ siguiendo la estrategia de clonación descrita en la figura 7, a partir de los plásmidos pAVE2HGH20kD, pAVE2HGH22kD y pNUT. De los dos primeros plásmidos, recuperé los minigenes HGH20kDa y HGH22kDa (1298 y 1343 pb respectivamente) mediante digestión con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI, los purifiqué por la técnica de electroelución (44) y finalmente los transferí por subclonación al vector de expresión seleccionado. Como vector de expresión elegí al plásmido pNUT (Figura 7), que originalmente portaba el gen hGH N bajo el control del promotor del gen de la metalotioneína (pMT-I). pNUT también contiene el ADNc de la enzima DHFR bajo el control del promotorpotenciador (enhancer) del virus 40 del Simio (SV40). Aprovechando que en pNUT el gen hGH está flanqueado por los sitios BamHI y EcoRI, utilicé estas enzimas de restricción para remover el gen y obtener el vector (abierto BamHI - EcoRI), en el que inserté el minigen HGH20kDa ó el de HGH22kDa, mediante reacciones de ligación para así construir los plásmidos pNUTHGH20kD y pNUTHGH22kD.

pNUT(-)

había

sido

laboratorio, eliminando

previamente

la región

preparado

codificadora de

en

nuestro

hGH en

pNUT

mediante digestión con Smal y volviendo a cerrar el vector en una reacción de ligación (38).

Bam Smal

SUMO

. T pMT-I

H1|T| Msp I , 335 \ " a i D.339

31

\ / pwu n,H63

40S9. B»"