CAPÍTULO 2.1.17.

INFECCIONES POR TRYPANOSOMA EVANSI (INCLUYENDO SURRA)

RESUMEN Definición de la enfermedad: Trypanosoma evansi causa una enfermedad conocida como Tripanosomiasis1 (“surra”) que afecta a varias especies de animales domésticos de Asia, África, América Central y Sudamérica. La especie hospedadora principal varía según el área geográfica, pero en particular el búfalo, el ganado vacuno, los camellos y los caballos resultan ser los más afectados, aunque también hay otros animales, incluyendo los salvajes, que son susceptibles. Es una enfermedad transmitida por artrópodos. Diversas especies de dípteros hematófagos, como especies de Tabanus y de Musca, están implicadas como vectores en la transmisión mecánica de un hospedador a otro. En Brasil se han relacionado a los murciélagos1 vampiro con la transmisión. Descripción de la enfermedad: La enfermedad se manifiesta en los animales susceptibles con fiebre, vinculada directamente a la parasitemia, junto con una anemia progresiva, pérdida de la condición normal y decaimiento. Durante el curso de la enfermedad, se presentan episodios recurrentes de fiebre y parasitemia. A menudo se observan edemas, particularmente en las partes inferiores del cuerpo, placas de urticaria y hemorragias petequiales de las serosas. Se han descrito abortos en los búfalos y los camellos. Existen indicios de que la enfermedad provoca inmunodeficiencias. Identificación del agente: Los síntomas clínicos generales de la infección por T. evansi no son suficientemente patognomónicos para el diagnóstico. Se requieren métodos de laboratorio para detectar al agente patógeno. El examen de la sangre del hospedador resulta problemático porque los tripanosomas sólo se detectan cuando existe una parasitemia alta. Bajo estas condiciones, el examen de extensiones de sangre fresca, los frotis de sangre teñida o el material de los nódulos linfáticos deben revelar la presencia de tripanosomas. En los casos más crónicos, como en la fase de portador, se requiere el examen de frotis sanguíneos muy densos, así como métodos de concentración de los parásitos y la inoculación en animales de laboratorio. Pruebas serológicas: La infección provoca respuestas de anticuerpos específicos y se han introducido diversas pruebas de detección de anticuerpos para su utilización en el laboratorio y en el campo. Algunas se han validado en parte, pero aún están pendientes de evaluación y normalización a gran escala. Entre las que se utilizan normalmente en el laboratorio están las de enzimoinmunoensayo, aglutinación en placa (CATT) con T. evansi y aglutinación en látex. Para la aplicación en el campo, se pueden utilizar tanto las pruebas de aglutinación en placa como las de aglutinación en látex, aunque no está aún disponible el formato de prueba individual (prueba de tipo lapicero). Los ensayos para detectar anticuerpos circulantes tienen un elevado índice de validez. Las estimaciones de los valores predictivos de las distintas pruebas serológicas indican que los enzimoinmunoensayos (ELISA) para detectar anticuerpos IgG son probablemente los más indicados para clasificar correctamente los animales no infectados, y son los apropiados para clasificar de un modo correcto a los animales verdaderamente infectados. Por tanto, una prueba ELISA para determinar IgG sería adecuada para comprobar, antes de un desplazamiento o durante una cuarentena, si los animales están libres de infección. En situaciones en las que la enfermedad se manifiesta abiertamente, se pueden utilizar las pruebas CATT para establecer un tratamiento individualizado de los animales contra los tripanosomas. Para declarar un estado de ausencia de enfermedad, se recomiendan pruebas seriadas, esto es, una prueba ELISA seguida de una comprobación por CATT de muestras sospechosas. No obstante, debe destacarse que hay 1

Nomenclatura de las enfermedades parasitarias: ver la nota del capítulo 2.4.18 Tripanosomosis (transmitida por tse-tsé).

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una semejanza antigénica considerable entre las diferentes especies de tripanosomas patógenos, por lo que, en zonas en las que ocurre la tripanosomiasis transmitida por la mosca tse-tsé, pueden producirse reacciones cruzadas en cualquier prueba serológica que se utilice. Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: No existen vacunas para la enfermedad.

A. INTRODUCCIÓN Los síntomas clínicos de la surra, la enfermedad causada por Trypanosoma evansi, resultan indicativos, pero no son suficientemente patognomónicos, por lo que el diagnóstico de la enfermedad se debe confirmar mediante métodos de laboratorio. En los animales susceptibles, que incluyen el ganado bovino, los búfalos, los camellos y los dromedarios, los caballos, los cerdos, las ovejas y las cabras, la enfermedad se manifiesta con fiebre, asociada directamente a la parasitemia, junto con anemia progresiva, pérdida de la condición normal y lasitud. Durante el curso de la enfermedad, ocurren episodios recurrentes de fiebre y parasitemia. A menudo se observa edema, particularmente en las partes inferiores del cuerpo, placas de urticaria y hemorragias petequiales de las membranas serosas. Se han descrito abortos en los búfalos y los camellos (8, 17). Existen indicios de que la enfermedad provoca inmunodeficiencias (5, 21). Hay una variación considerable en la enfermedad en lo que respecta a la patogenicidad de las diferentes cepas y a la susceptibilidad de las diferentes especies de hospedadores. La enfermedad se puede manifestar en forma aguda o crónica y, en el último caso, puede persistir durante muchos meses. A menudo la enfermedad es mortal en los camellos, búfalos, ganado bovino, llamas y perros, pero en estas especies también se pueden presentar infecciones leves y subclínicas. Algunos animales salvajes, como los ciervos y los roedores capibaras, pueden resultar infectados. Los animales sometidos a estrés – malnutrición, preñez o trabajo – son más susceptibles a la infección. Trypanosoma evansi es biológicamente muy semejante a T. equiperdum, el agente causal de la durina, y se parece morfológicamente a las formas delgadas de los tripanosomas transmitidos por la mosca tse-tsé, T. brucei, T. gambiense y T. rhodesiense. La caracterización molecular de varias cepas de T. evansi aisladas de Asia, África y Sudamérica indica que tienen un único origen. La caracterización molecular de T. evansi y T. equinoperdum mediante técnicas de amplificación al azar de ADN polimórfico y el análisis con endonucleasas mostró que forman un grupo estrechamente relacionado y muy homogéneo. Una posibilidad es que T. equinoperdum no sea una especie per se y que el desarrollo clínico de la enfermedad esté relacionado fundamentalmente con la respuesta inmune del hospedador. Como todos los tripanosomas patógenos, T. evansi está recubierto por una densa capa proteica formada por una única proteína llamada la glicoproteína variable de superficie. Esta actúa como el inmunógeno principal e induce la formación de anticuerpos específicos. Los parásitos son capaces de evitar las consecuencias de estas reacciones inmunes cambiando la glicoproteína variable de superficie, fenómeno que se conoce como variación antigénica.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1. Identificación del agente Los métodos parasitológicos clásicos para el diagnóstico de la tripanosomosis, principalmente el examen de muestras de sangre o de nódulos linfáticos, no resultan ser muy sensibles, pero raramente lo son cuando se utilizan extractos de otros tejidos. En regiones donde ocurren otras especies de Trypanozoon además de T. evansi, no es posible una identificación microscópica específica. Las sondas de ADN específicas (19, 24) pueden facilitar la identificación de las especies de tripanosomas mediante hibridación no radioactiva del ADN. Se ha desarrollado una reacción en cadena la polimerasa (PCR) que es específica de especie basada en el antígeno específico de T. evansi (RoTat 1.2 VSG), pero no se ha validado en el campo (3).



Métodos directos

a)

Métodos normales de campo i)

Muestra de sangre Trypanosoma evansi es un parásito de la sangre y de los tejidos; a menudo, se encuentra en los vasos sanguíneos profundos en los casos de parasitemia baja. Por esta razón se recomienda que la sangre para diagnóstico se obtenga tanto de los vasos periféricos como de los profundos. Sin

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embargo, es preciso saber que, mediante el examen de la sangre periférica, se pueden identificar menos del 50% de los animales infectados. La sangre periférica se obtiene por punción de una pequeña vena de la oreja o de la cola. Las muestras más profundas se toman de una vena más grande con una jeringuilla. Primero se limpia con alcohol un área marginal de la oreja o de la punta de la cola y, cuando está seca, se pincha con un instrumento adecuado. Es importante esterilizar los instrumentos o utilizar los de un solo uso entre animales individuales, de modo que la infección no se transmita por sangre residual. ii)

Extensiones de sangre fresca Se coloca sobre un porta de vidrio limpio una pequeña gota de sangre y se deposita encima un cubre para extender la sangre como si fuera una monocapa de células. Esta se examina por microscopía de fondo claro (×200) para detectar cualquier tripanosoma móvil.

iii)

Tinción de frotis densos En el centro de un porta para microscopía se coloca una gota grande de sangre y se extiende con un palillo o con el borde de otro porta hasta cubrir un área aproximada de 1,0–1,25 cm de diámetro. Se deja secar durante al menos 1 hora protegiendo la preparación de los insectos. El frotis sin fijar se tiñe durante 25 minutos con Giemsa (una gota de Giemsa comercial + 1 ml de solución salina tamponada con fosfato [PBS, 2,4 g de Na2HPO4.2H2O, 0,54 g de NaH2PO4.2H2O, 0,34 g de NaCl], pH 7,2). Después de lavar, se examinan los frotis en un microscopio de fondo claro a un aumento elevado (×500–1.000). La ventaja de la técnica de frotis denso es que concentra la gota de sangre en un área pequeña y se necesita menos tiempo para detectar los parásitos. La desventaja es que se pueden dañar los parásitos durante el proceso, y el método no es, por tanto, adecuado para la identificación de especies en el caso de las infecciones mixtas.

iv)

Tinción de frotis finos Se coloca una gota de sangre a 20 mm de un extremo de un porta limpio para microscopía y se prepara una extensión fina del modo usual. La extensión se seca brevemente al aire, se fija durante 2 minutos con alcohol metílico y se deja secar. Luego los frotis se tiñen 25 minutos con Giemsa (una gota de Giemsa + 1 ml de PBS, pH 7,2). Esta preparación se escurre, se lava con agua del grifo y se seca. Los frotis no fijados se pueden teñir cubriéndolos 2 minutos con colorante de May–Grünwald, y se añaden luego un volumen igual de PBS, pH 7,2, dejando los portas durante otros 3 minutos. Esta preparación se escurre y se añade Giemsa diluido, que se mantiene durante 25 minutos. Esta se vierte de nuevo, se lava el porta con agua de grifo y se seca. Los portas se examinan a un aumento elevado (×400–1.000). Esta técnica permite estudios morfológicos detallados y la identificación de la especie de tripanosoma. También existen técnicas rápidas de tinción (Tinción de Field, Diff Quick).

v)

Biopsias de nódulos linfáticos Normalmente las muestras se obtienen de los nódulos linfáticos preescapulares o precrurales (subilíacos). Se selecciona mediante palpación un nódulo adecuado y se limpia la zona con alcohol. El nódulo se pincha con una aguja adecuada y el material del nódulo linfático se aspira con la jeringuilla. Este material se sitúa luego sobre un porta, se tapa con un cubre y se examina como en las preparaciones de sangre fresca. También se pueden guardar frotis densos o finos fijados para un examen posterior.

b)

Métodos de concentración En muchos hospedadores, T. evansi puede inducir infecciones clínicas leves o un estado subclínico de portador con baja parasitemia en donde resulta difícil poner de manifiesto los parásitos. En estas condiciones, pueden necesitarse métodos de concentración. i)

Centrifugación de hematocritos Se recoge sangre (70 µl) en al menos dos tubos capilares (75 × 1,5 mm) con heparina, que luego se cierran a la llama por el extremo seco y se centrifugan, con el extremo cerrado hacia abajo, a 3.000 g durante 10 minutos. Se pegan a un porta dos trozos de cristal (25 × 10 × 1,2 mm) y se coloca entre ellos el tubo capilar. Se puede colocar encima un cubre al nivel de la unión de la capa de leucocitos, donde los tripanosomas aparecerán concentrados. El espacio alrededor de esta parte del capilar se rellena con agua o con aceite de inmersión, y se examina el área de la capa de leucocitos al microscopio (100–200×). Mediante esta técnica se pueden detectar alrededor de 400 tripanosomas/ml. Una alternativa más simple consiste en examinar el tubo capilar centrifugado colocando una gota de aceite de inmersión sobre el tubo y asegurándose de que hay contacto entre la lente objetivo y el aceite de inmersión.

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ii)

Técnica de la capa de leucocitos en campo oscuro o contraste de fases. Se recoge la sangre en tubos capilares con heparina y se centrifuga como se indica más arriba. El tubo se marca con un diamante de corte y se rompe 1 mm por debajo de la capa de leucocitos, de tal modo que la parte de arriba contiene la capa superior de eritrocitos (RBC), la capa de leucocitos y algo de plasma. El contenido de esta parte se saca parcialmente sobre un porta, se cubre con un cubreobjetos y se examina por microscopía de campo oscuro, por microscopía de contraste de fases o por microscopía ordinaria de campo claro. Como alternativa a la centrífuga de hematocrito que funciona con electricidad, se han utilizado con éxito microcentrífugas manuales para la detección de la tripanosomiasis en el ganado bovino y en los camellos (9, 14).

iii)

Técnicas hemolíticas Se puede utilizar dodecil sulfato sódico (SDS) como reactivo para provocar la hemólisis de RBC y facilitar así la detección de los tripanosomas móviles en las muestras de sangre parasitada. Como el SDS es tóxico, se debe evitar el contacto con la piel, su inhalación y su ingestión. La solución de SDS se puede guardar varios meses a temperatura ambiente. Tanto la solución de SDS como la muestra de sangre deben utilizarse a temperaturas superiores a 15°C. A temperaturas más bajas, los tripanosomas pueden destruirse.

Se pueden aplicar dos procedimientos generales2, la clarificación de frotis de sangre fresca y la centrifugación de hemólisis.



Método de clarificación de frotis de sangre fresca En este método se utiliza la lisis parcial de RBC para facilitar la detección de tripanosomas móviles. El método requiere una solución de SDS: 1% de SDS disuelto en Tris/glucosa/solución salina, pH 7,5, asas de inoculación (de 10 µl), portas y cubres (24 × 24 mm), y una gota de sangre fresca o heparinizada. Se disuelven 100 mg de SDS en 100 ml de tampón isotónico Tris/NaCl/glucosa, pH 7,5 (14 g de Trizma base, 3,8 g de NaCl, 10.8 g de glucosa; se disuelven los productos en 750 ml de H2O destilada, añadir 90–100 ml de HCl 1 N y se ajusta el pH a 7,5, luego se lleva a un volumen final de 1.000 ml con H2O destilada). Este tampón se puede guardar en viales pequeños durante varios meses a temperatura ambiente. La prueba no aporta una mayor sensibilidad que la técnica de las extensiones de sangre fresca. Además, el SDS puede causar problemas al enfocar el microscopio, y los movimientos de los tripanosomas se pueden limitar debido a la alta viscosidad del SDS. Se ponen aproximadamente 10 µl de sangre en un porta. Se añaden 10 µl de la solución de SDS utilizando un asa de inoculación y se mezclan ligeramente. Se aplica un cubre. Se visualiza inmediatamente toda la preparación a bajo aumento (×100 o ×200).



Técnica de la centrifugación de hemolisis Para este procedimiento se requiere una lisis casi completa de RBC. El material requerido incluye: solución de SDS (0,1% de SDS disuelto en Tris/glucosa/solución salina, pH 7,5), tubos cónicos de centrífuga, tubos de ensayo ordinarios, pipetas de plástico de punta larga y fina con perilla de goma incorporada, portas, cubres (24 × 24 mm o 24 × 32 mm), y sangre con heparina. Utilizando una pipeta o una jeringuilla, se transfieren nueve volúmenes de solución de SDS (máximo 6,3 ml) a un tubo de ensayo ordinario. Se aspira un volumen (máximo 0,7 ml) de sangre heparinizada con una pipeta con perilla de goma y se deposita justamente encima de la superficie de la solución de SDS; se mezcla rápida y minuciosamente. Se debe evitar la formación de espuma, que puede destruir los tripanosomas. Se debe esperar 10 minutos para permitir una hemolisis completa. Se pone la suspensión hemolizada en tubos cónicos de centrífuga y se centrifuga a aproximadamente 500 g durante 10 minutos. Se extrae tanto sobrenadante como se pueda mediante una pipeta limpia con perilla sin alterar el sedimento. Se extrae más sobrenadante utilizando de nuevo una pipeta de punta fina y con perilla, dejando en el fondo 10–20 µl de sobrenadante sin alterar. Luego se recoge con mucho cuidado el sedimento completo y se pone sobre un porta. Se aplica un cubre y se examina la preparación completa sin retraso a bajo aumento (×100 o ×200).



Técnica de mini-intercambio aniónico y centrifugación Cuando se pasa una muestra de sangre humana o animal que esté infectada por tripanosomas a través de una columna apropiada de intercambio aniónico, como las células sanguíneas del hospedador están cargadas más negativamente que los tripanosomas, se adsorben al intercambiador aniónico, mientras que los tripanosomas resultan eluidos, manteniendo su viabilidad y su infectividad

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Se pueden obtener todas las instrucciones y materiales necesarios del Instituto de Medicina Tropical, Laboratorio de Serología, Nationalestraat 155, B-2000 Antwerp, Bélgica.

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(15). Se ha desarrollado un método de campo simplificado para la detección de parasitemias bajas (26). La sensibilidad de esta técnica puede aumentarse aproximadamente diez veces cuando se utilizan preparaciones de leucocitos en vez de sangre completa (25).



Preparación de solución salina de glucosa tamponada a pH 8 Na2HPO4 (anhidra) (13,48 g); NaH2PO4.2H2O (0,78 g); NaCl (4,25 g); agua destilada (1 litro). Las soluciones de diferente fuerza iónica se hacen diluyendo el stock de PBS, pH 8, y añadiendo glucosa para mantener una concentración adecuada. Para la sangre de ratón, de rumiantes salvajes y domésticos, y de perro, se añaden 4 partes de PBS a seis partes de agua destilada y se ajusta la concentración final de glucosa a 1%. Para la sangre de cerdos o conejos, se añaden tres partes de PBS a siete partes de agua destilada y se ajusta la concentración final de glucosa a 1,5%. La solución de PBS/glucosa (PSG) debe estar estéril.



Equilibrado de la matriz de DEAE-celulosa Se suspenden 500 g de DEAE-celulosa (dietilamino-etilcelulosa) en 2 litros de agua destilada. Se ajusta el pH a 8 con ácido fosfórico. Se deja sedimentar durante 30 minutos. Se elimina el sobrenadante que contiene gránulos finos. Se repite el proceso tres veces. Se guarda la suspensión equilibrada y concentrada (con aspecto de gel blando) a 4°C o en pequeñas alícuotas a –20°C.



Montaje de la matriz de DEAE-celulosa equilibrada Se dispone una jeringuilla de 2 ml sin su émbolo y provista de aguja (20 G × 1,5 pulgadas) sobre una gradilla. En el fondo de la jeringuilla se coloca un disco de papel de filtro Whatman No. 41 y se humedece con unas cuantas gotas de PSG. Se vierten en la jeringuilla 2–2,5 ml del gel de celulosa equilibrada y se compacta mediante elución con el tampón. La altura del sedimento debe ser de aproximadamente 3 cm. Se lava y se equilibra la columna con 2 ml de PSG sin alterar la superficie.



Adsorción de la sangre y elución de los tripanosomas Se colocan con cuidado 100–300 µl de sangre heparinizada sobre la superficie de la columna de celulosa. Se añaden diez gotas de PSG y se desechan las primeras diez gotas eluídas. Se va añadiendo 1,5 ml de PSG y se comienza a recoger el eluato en una pipeta Pasteur de punta fina con su extremo cerrado. Se pone la pipeta llena, protegiendo su extremo con la punta de una pipeta cónica de plástico, dentro de un tubo y se centrifuga a 525 g (o hasta 1.000 g) durante 10 minutos. Se examina la parte inferior de la pipeta al microscopio (×100 o ×200) utilizando un dispositivo especial de montaje. Alternativamente, el eluato se puede recoger en tubos de plástico de 50 ml, con fondo cónico, centrifugar a 1.000 g y examinar el sedimento por microscopía de fondo oscuro. Durante el proceso, la columna de celulosa debe permanecer constantemente húmeda.

c)

Inoculación en animales Se pueden utilizar animales de laboratorio para revelar infecciones subclínicas (no patentes) en animales domésticos. Trypanosoma evansi tiene un amplio rango de infectividad entre los pequeños roedores, de modo que se utilizan con frecuencia ratas y ratones. La inoculación en roedores no es sensible al 100% (18), pero se puede mejorar su eficacia utilizando material de la capa leucocitaria. Este procedimiento permitió detectar niveles tan bajos como 1,25 células de T. evansi/ por cada ml de sangre (25). En varios estudios de infecciones de los camellos por T. evansi, se han hecho comparaciones entre los análisis mediante frotis densos de sangre y las pruebas de inoculación en rata y en ratón; la inoculación en animales dio resultados más positivos, 15,2% y 17%, respectivamente, que el análisis de sólo frotis densos (7,27). Aunque la inoculación en ratón no es sensible al 100% (19), se puede mejorar la técnica utilizando como material la capa de leucocitos. Se ha utilizado un procedimiento modificado de inoculación en ratón que permite detectar un nivel tan bajo como 1,25 T. evansi/ml de sangre (30). La sangre tratada con heparina sódica se inocula intraperitonealmente en ratas (1–2 ml) o ratones (0,25– 0,5 ml). Se recomienda la inoculación de un mínimo de dos animales; los animales se sangran por la cola tres veces a la semana para detectar la parasitemia. El período de incubación, antes de la aparición de los parásitos y de su virulencia, depende de la cepa de los tripanosomas, su concentración en el inóculo, y la cepa de animal de laboratorio utilizada. La sensibilidad de este sistema de cultivo in vivo tal vez se pueda mejorar con la utilización de animales de laboratorio inmunosuprimidos. A tal fin, se utilizan compuestos como ciclofosfamida o acetato de cortisona, la irradiación con rayos X o la esplenectomía.

d)

Sondas de ADN recombinante Se han utilizado sondas específicas de ADN para detectar tripanosomas en sangre o en tejidos infectados pero no se aplican de forma rutinaria (28, 31). Aunque potencialmente los métodos moleculares tienen una elevada sensibilidad analítica, existen pocos estudios convincentes para evaluar la capacidad diagnóstica de estas pruebas en comparación con otras técnicas, como las serológicas.

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e)

Detección del ADN de los tripanosomas La detección de pequeñas cantidades de ADN de tripanosomas utilizando un procedimiento de PCR es un método factible para identificar animales con infecciones activas, y podrían tener la sensibilidad y especificidad requeridas (3, 20, 32). Los estudios experimentales realizados en búfalos (10) mostraron que la sensibilidad diagnóstica de una PCR fue de tan solo el 78%, que es similar a la de la inoculación en ratón.



Métodos indirectos

Estos métodos implican pruebas que demuestran los efectos del parásito sobre su hospedador en vez de detectar directamente el parásito mismo.

a)

Hematología La anemia suele ser un indicio fiable de infestacion por tripanosoma, aunque no es patognomónico. Sin embargo, hay animales con infestación subclínica suave que pueden tener parasitemia sin evidencia de anemia (4). La anemia se puede determinar midiendo el volumen de células empaquetadas y puede utilizarse en la vigilancia de rebaños o manadas en riesgo. Esta técnica es idéntica a la de centrifugación del hematocrito. Se examina el tubo capilar y los resultados se expresan como porcentaje del volumen de RBC empaquetados respecto al volumen total de sangre.

2.

Pruebas serológicas

Históricamente se han utilizado muchos métodos distintos para detectar los anticuerpos humorales específicos frente a los antígenos de los tripanosomas pero más recientemente ha habido una tendencia a centrarse en técnicas de fácil estandarización como el ELISA (6, 7, 12, 22, 23, 24, 27), las pruebas de aglutinación en placa o en tarjeta (CATT) (1, 20, 24) y las pruebas de aglutinación en látex (LAT) (11, 16). En Indonesia y Vietnam se ha llevado a cabo una extensa evaluación de los métodos ELISA y CATT con búfalos (6, 11, 29). Se puede simplificar la toma de muestras utilizando manchas de sangre en papel de filtro para su utilización posterior en los ELISA, mientras que en los ensayos de tipo CATT se puede sustituir la sangre completa por suero (11). Otras modificaciones innovadoras que se pueden desarrollar en un futuro son el uso de varillas con colorantes coloidales (13) que podrían permitir la realización de pruebas en condiciones de campo. Es muy importante que las pruebas serológicas se validen y estandaricen si se pretende que sean adecuadas para la identificación correcta de los animales infectados. Esto implica la elaboración de criterios estándar para interpretar las pruebas desarrolladas en cada especie animal así como en cada laboratorio que utilice el procedimiento.

a)

Enzimoinmunoensayo El principio de esta técnica se basa en que los anticuerpos específicos contra los tripanosomas se pueden detectar mediante anti-inmunoglobulinas ligadas a un enzima utilizando como fase sólida placas de poliestireno recubiertas de antígeno soluble. El enzima puede ser la peroxidasa, la fosfatasa alcalina o cualquier otro enzima apropiado. El enzima conjugado se une al complejo antígeno/anticuerpo y luego reacciona con un substrato adecuado para producir un cambio de color característico del substrato mismo o de un indicador añadido (el cromógeno). El antígeno de recubrimiento de las placas deriva de la sangre de una rata con elevada parasitemia. Los tripanosomas se separan por medio de una columna de DEAE-celulosa y se lavan tres veces por centrifugación con PSG frío, pH 8 (PBS con glucosa al 1%). El sedimento final se resuspende en PSG frío a una concentración del 3–5%, y se somete brevemente a ultrasonidos en hielo durante 30–120 segundos hasta lograr la desintegración completa de los organismos. Esta preparación se centrifuga a 4°C y 40.000 g durante 60 minutos. El sobrenadante se diluye con agua hasta obtener una concentración de proteína de 1 mg/ml. El producto así obtenido se puede guardar en pequeñas alícuotas a –70°C durante varios meses. También se puede liofilizar y mantener a –20°C. Se han aplicado diversos tratamientos a las preparaciones de antígeno para mejorar la precisión de la detección de los anticuerpos (32).

6



Procedimiento de la prueba

i)

El antígeno congelado o liofilizado se diluye o reconstituye con tampón carbonato/bicarbonato 0,01 M, pH 9,6, recién preparado. El reactivo (100 µl) se añade a cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos, y las placas se incuban durante toda la noche a 4°C o durante 1 hora a 37°C.

ii)

Se elimina el exceso de antígeno, se lavan las placas con 0,01 M de PBS que contenga 0,05% de Tween 20 (PBST), y se añaden diluciones de suero en PBST (100 µl). Las diluciones normales de ensayo deben determinarse empíricamente y suelen estar entre 1/100 y 1/1.000.

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iii)

Se incuban las placas a 37°C durante 30 minutos. Se elimina el contenido y se lavan tres veces con PBST.

iv)

Se añade la anti-globulina específica de especie conjugada con peroxidasa (100 µl) convenientemente diluida en PBST (normalmente entre 1/1.000 y 1/50.000).

v)

Se reincuban las placas a 37°C durante 30 minutos, se elimina el contenido y se lavan tres veces con PBST.

vi)

En conjugados con peroxidasa se pueden utilizar varias soluciones de substrato/cromógeno, que constan de peróxido de hidrógeno con un cromógeno, como tetrametilbenzideno (TMB), 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6- ácido sulfónico) (ABTS) y orto-difeniléndiamina (OPD). Una solución adecuada de substrato/cromógeno para conjugados con peroxidasa es el peróxido de hidrógeno al 30% (0,167 ml y 35 mg) en tampón citrato (100 ml), pH 6,0. El tampón citrato se prepara así: Solución A (36,85 ml): (0,1 mM de ácido cítrico [21,01 g/litro]); Solución B: (65,15 ml): (0,2 M de Na2HPO4 [35,59 g/litro]; y agua destilada (100 ml). Se disuelven 10 mg de TMB en 1 ml de dimetil sulfóxido y se añaden a 99 ml del tampón citrato. Varias de estas combinaciones están disponibles comercialmente y listas para su uso, y pueden permanecer estables a 4°C hasta 1 año.

vii)

Se añade el substrato cromógeno (100 µl) y se incuban las placas a temperatura ambiente durante 15–20 minutos.

viii) La reacción se detiene añadiendo 1M de ácido sulfúrico (50 µl). La absorbancia de la mezcla de cada pocillo se lee a 450 nm para el cromógeno TMB. Otros cromógenos pueden requerir lecturas a otras longitudes de onda. Todos los ensayos deben incluir sueros de control positivo de actividad alta y media conocida, un suero de control negativo y un control del tampón. Existe una amplia variedad de procedimientos de ensayo. Para las especies animales muy relacionadas, con frecuencia se pueden utilizar reactivos que dan reacción cruzada (por ejemplo, la inmunoglobulina antibovina en el caso de los búfalos) y se recomienda la utilización de conjugados anti-IgG monoespecíficos. Hay varios métodos que se pueden utilizar para determinar un punto de corte para la diferenciación entre resultados positivos y negativos. El método más simple es basar el corte en la inspección visual de los resultados del ensayo con las poblaciones negativas y positivas conocidas. A menudo estos resultados muestran cierto solapamiento. El operador puede elegir el punto más adecuado para modificar los resultados de falsos positivos o falsos negativos en función de la aplicación del ensayo. Una alternativa es establecer el corte en el valor medio + 2 desviaciones estándar (SD) o +3 SD en una muestra grande de animales negativos. Finalmente, si no se dispone de muestras positivas/negativas se puede establecer el corte basándose en el análisis de los datos en animales en situación endémica. Si se separan los animales infectados y los no infectados según una distribución bimodal, entonces se puede seleccionar un valor adecuado. Es probable que los métodos ELISA identifiquen correctamente los animales no infectados. Los resultados equívocos se pueden volver a ensayar mediante CATT. El Instituto de Medicina Tropical en Antwerp desarrolló un ELISA utilizando el VSG clon RoTat 1.2 de T. evansi. Se demostró (30) que este antígeno es el predominante en T. evansi y está ausente en T. brucei. Este ELISA/RoTat 1.2 se utilizó con éxito en Vietnam (11, 29). Se dispone en el ITM de Antwerp de protocolos para su uso en los equinos, camélidos y búfalos.

b)

Pruebas de aglutinación en placa Se sabe que varias cepas de tripanosomas de diferentes áreas comparten algunos tipos predominantes de antígenos variables (VATs). Este hecho se utilizó como base para una prueba diagnóstica de T. evansi – la prueba de aglutinación en placa CATT/T. evansi – desarrollada en el Laboratorio de Serología del Instituto de Medicina Tropical de Antwerp3 En esta prueba se utilizan tripanosomas fijados y teñidos de un VAT definido conocido como RoTat 1.2. En la reacción de aglutinación intervienen antígenos de superficie, tanto variables como constantes. El CATT está disponible en forma de equipo (kit) en el ITM, Antwerp. Consta de antígeno liofilizado, PBS, pH 7,4, tarjetas recubiertas de plástico, espátulas, sueros positivos y negativos de control y un rotor. El antígeno liofilizado puede guardarse a 2–8°C hasta 1 año. El antígeno reconstituido se puede mantener a 2–8°C durante 2 días, pero es preferible su utilización en 8 horas. Para el análisis se diluyen los sueros de prueba a 1/4 o 1/8 en PBS sobre los círculos de las tarjetas plastificadas. Se añaden 45 µl de la suspensión preparada del antígeno en los círculos de las tarjetas plastificadas. Se añaden 25 µl de cada suero de prueba. Se mezcla y se extienden los reactivos con una espátula, dejando que la tarjeta gire durante 5 minutos en el rotor suministrado con el equipo. Se compara el modelo de aglutinación con las ilustraciones de diferentes reacciones suministradas con el equipo. La aparición de depósitos azules granulares revela una reacción positiva que es visible a simple vista.

3

En el Laboratory of Parasite Diagnostic, Institute of Tropical Medicine, Nationalestraat 155, B-2000 Antwerp, Belgium, hay disponibles kits CATT/T. evansi ([email protected] ; [email protected])

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Capítulo 2.1.17. — Infecciones por Trypanosoma evansi (incluyendo surra)

c)

Pruebas de aglutinación en látex Existe un equipo comercializado por el ITM de Antwerp. Consta de una suspensión liofilizada de látex recubierto con antígenos variables de T. evansi RoTat 1.2, PBS, controles positivos y negativos, tarjetas de ensayo, espátulas de plástico y un rotor. Se reconstituyen las partículas de látex recubiertas de antígeno utilizando agua destilada desionizada. Se mezcla suavemente y se añaden 20 µl de la suspensión de látex sobre cada punto negro de la tarjeta de ensayo. Se diluyen los sueros de prueba con PBS (1/2 o 1/4) y se añaden 20 µl a la suspensión de látex. Se incluyen los controles apropiados. Se mezclan cuidadosamente los reactivos con una espátula de plástico. Se giran las tarjetas de prueba a 70 rotaciones/minuto durante 5 minutos y se observan bajo una buena fuente luminosa después de la incubación. Los sueros positivos producen la aglutinación de las partículas de látex.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO No existen vacunas para esta enfermedad.

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* * *

NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para las infecciones por Trypanosoma evansi (incluyendo surra) (véase el cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consúltese la lista más actualizada en la página web de la OIE: www.oie.int).

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