INFLUENCIA DEL SUBCULTIVO DE LA LEVADURA SACCHAROMYCES CEREVISIAE EN EL DESARROLLO DE UNA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

JORGE LUIS BEITIA SAMUDIO

Proyecto de grado para optar al título de Ingeniero de Producción Agroindustrial

Director BERNADETTE KLOTZ Bióloga

UNIVERSIDAD DE LA SABANA FACULTAD DE INGENIERIA PROGRAMA DE PRODUCCION AGROINDUSTRIAL BOGOTA, D.C. 2001

Nota de aceptación ____________________________ ____________________________ ____________________________

____________________________ Presidente del jurado

____________________________ Jurado

____________________________ Jurado

Bogotá, 26 de abril 2001

A mis padres, a mis hermanos

AGRADECIMIENTOS El autor expresa su agradecimiento a: Bernadette Klotz, bióloga y directora de esta investigación, por sus valiosas orientaciones.

CONTENIDO

Pág

RESUMEN ----------------------------------------------------------------------------- XIII JUSTIFICACIÓN--------------------------------------------------------------------- XIV 1. OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------- 16 1.1 GENERAL -------------------------------------------------------------------------- 16 1.2 ESPECÍFICOS--------------------------------------------------------------------- 16 2. FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA ----------------------------------------------- 17 2.1 METABOLISMO ------------------------------------------------------------------ 17 2.1.1 Metabolismo catabólico (generación de adenosina trisfosfato ATP). ------------------------------------------------------------------------------- 18 2.1.2 Glucólisis----------------------------------------------------------------------------------------- 18 2.1.3 Fermentación ----------------------------------------------------------------------------------- 24 2.2 CULTIVO DE MICROORGANISMOS ---------------------------------------------- 25 2.2.1 Cultivo discontinuo ---------------------------------------------------------------------------- 25 2.2.2 Subcultivos -------------------------------------------------------------------------------------- 27 2.2.3 Preparación del medio de cultivo---------------------------------------------------------- 27 2.2.3.1 Requerimientos nutricionales ------------------------------------------------------------ 27 2.2.3.2 Factores de crecimiento------------------------------------------------------------------- 29 2.3 LEVADURAS ----------------------------------------------------------------------------------- 31 2.3.1 Morfología --------------------------------------------------------------------------------------- 31 2.3.2 Fisiología----------------------------------------------------------------------------------------- 31

V

Contenido

VI

2.3.3 Reproducción ----------------------------------------------------------------------------------- 32 2.3.4 Características de los cultivos-------------------------------------------------------------- 32 2.3.5 Saccharomyces -------------------------------------------------------------------------------- 32 2.3.5.1 Requerimientos nutricionales ------------------------------------------------------------ 33 2.3.5.2 Factores de crecimiento------------------------------------------------------------------- 33 2.3.5.3 Variables que influyen en el crecimiento de Saccharomyces --------------------------------------------------------------------------- 33 3. MATERIALES Y MÉTODOS ------------------------------------------------------------- 35 3.1 PROCEDIMIENTO -------------------------------------------------------------------------- 35 3.2 DISEÑO EXPERIMENTAL -------------------------------------------------------------- 36 3.2.1 Preparación de los medios de cultivo ---------------------------------------------------- 38 3.2.2 Esterilización de los erlenmeyer y adecuación de los medios de cultivo ---------------------------------------------------------------------------------------- 38 3.2.3 Activación de la levadura -------------------------------------------------------------------- 38 3.2.4 Inoculación de la levadura ------------------------------------------------------------------ 39 3.2.5 Establecimiento de los tres paralelos ---------------------------------------------------- 39 3.3 MATERIALES Y MÉTODOS------------------------------------------------------------ 39 3.3.1 Método Kjeldahl para la determinación de nitrógeno total-------------------------- 39 3.3.1.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 39 3.3.1.2 Reacciones que se presentan ----------------------------------------------------------- 39 3.3.1.3 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 40 3.3.1.4 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 40 3.3.1.5 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 40 3.3.2 Método para la determinación de azúcares -------------------------------------------- 42 3.3.2.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 42 3.3.2.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 42 3.3.2.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 43 3.3.2.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 43 3.3.3 Método para la determinación de microorganismos por cámara de recuento------------------------------------------------------------------------------------- 45 3.3.3.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 45 3.3.3.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 45

Contenido

VII

3.3.3.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 46 3.3.3.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 46 3.3.4 Método para la determinación del contenido alcohólico de etanol por oxidación química ----------------------------------------------------------------------- 46 3.3.4.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 46 3.3.4.2 Reacciones que se presentan ----------------------------------------------------------- 46 3.3.4.3 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 47 3.3.4.4 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 47 3.3.4.5 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 47 3.3.5 Método para la determinación de proteínas-------------------------------------------- 48 3.3.5.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 48 3.3.5.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 48 3.3.5.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 49 3.3.5.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 49 4. PRESENTACIÓN DE RESULTADOS ---------------------------------------- 50 4.1 CURVAS DE CALIBRACIÓN-------------------------------------------------- 50 4.1.1 Curva de calibración para el método de determinación de azúcares ------------------------------------------------------------------------ 50 4.1.2 Curva de calibración método Kjeldahl --------------------------------------------------- 51 4.1.3 Curva de calibración método para la determinación del contenido alcohólico de etanol por oxidación química -------------------------------------------- 55 4.1.4 Curva de calibración método para la determinación de proteínas ---------------------------------------------------------------------------------------- 57 4.2 PRUEBAS PRELIMINARES ------------------------------------------------------------ 59 4.3 SUBCULTIVOS ------------------------------------------------------------------------------- 60 4.3.1 Resultados cultivo 1 -------------------------------------------------------------------------- 61 4.3.2 Resultados cultivo 2 -------------------------------------------------------------------------- 63 4.3.3 Resultados cultivo 3 -------------------------------------------------------------------------- 65 4.3.4 Resultados cultivo 4 -------------------------------------------------------------------------- 67 4.3.5 Resultados cultivo 5 -------------------------------------------------------------------------- 69 4.3.6 Resultados nitrógeno por célula y proteína por célula cultivos------------------------------------------------------------------------------------------- 71

Contenido

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4.3.7 Balance general de la glucosa fermentada--------------------------------------------- 73 5. DISCUSIÓN Y ANÁLISIS DE RESULTADOS ----------------------------------- 77 5.1 CURVA DE CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS ----------------- 77 5.1.1 Curva de crecimiento por conteo de microorganismos------------------------------ 77 5.1.2 Tasa de crecimiento cultivos --------------------------------------------------------------- 79 5.1.3 Contenido de nitrógeno total---------------------------------------------------------------- 79 5.1.4 Contenido de proteínas ---------------------------------------------------------------------- 83 5.2 SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES ---------------------------------------------------- 86 5.3 BALANCE GENERAL DE LA GLUCOSA FERMENTADA --------------- 88 5.4 ANÁLISIS GENERAL DE LOS PARÁMETROS

DETERMINADOS---------------------------------------------------------------- 89 5.5 ESTANDARIZACIÓN Y ADECUACIÓN DE NORMAS -------------------- 89 5.6 APLICACIÓN INDUTRIAL --------------------------------------------------------------- 90 CONCLUSIONES-------------------------------------------------------------------------------------- 92 RECOMENDACIONES------------------------------------------------------------------------------- 93 ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------- 94 GLOSARIO -------------------------------------------------------------------------------------------- 112 BIBLIOGRAFÍA --------------------------------------------------------------------------------------- 113

LISTA DE TABLAS Pág Tabla 2.1 Fuentes de carbono y nitrógeno utilizados en medios de cultivos ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 28 Tabla 2.2 Requerimientos nutricionales de los microorganismos y formas comunes de satisfacerlos en los cultivos -------------------------------------------------------- 29 Tabla 2.3 Factores de crecimiento y su efecto sobre la levadura------------------------ 30 Tabla 3.1 Normas y métodos utilizados--------------------------------------------------------- 35 Tabla 3.2 Medio de cultivo para levaduras ----------------------------------------------------- 38 Tabla 4.1 Datos de calibración método Kjeldahl destilación------------------------------- 52 Tabla 4.2 Datos de calibración método kjeldahl ---------------------------------------------- 54 Tabla 4.3 Volumen tomado de etanol 99.5 % para la curva de calibración ----------- 55 Tabla 4.4 Datos curva de calibración contenido alcohólico-------------------------------- 56 Tabla 4.5 Cantidades utilizadas para la estandarización del método de proteínas --------------------------------------------------------------------------------------------- 57 Tabla 4.6 Datos curva de calibración método del ácido bicinchonínico (proteínas) ----------------------------------------------------------------------------------------------- 58 Tabla 4.7 Resultados para el cultivo 1 ---------------------------------------------------------- 61 Tabla 4.8 Resultados para el cultivo 2 ---------------------------------------------------------- 63 Tabla 4.9 Resultados para el cultivo 3 ---------------------------------------------------------- 65 Tabla 4.10 Resultados para el cultivo 4--------------------------------------------------------- 67 Tabla 4.11 Resultados para el cultivo 5--------------------------------------------------------- 69 Tabla 4.12 Relación nitrógeno/cel- proteína/cel cultivo 1---------------------------------- 71 Tabla 4.13 Relación nitrógeno/cel- proteína/cel cultivo 2---------------------------------- 71 Tabla 4.14 Relación nitrógeno/cel- proteína/cel cultivo 3---------------------------------- 72 Tabla 4.15 Relación nitrógeno/cel- proteína/cel cultivo 4---------------------------------- 72 Tabla 4.16 Relación nitrógeno/cel- proteína/cel cultivo 5---------------------------------- 73 Tabla 4.17 Balance de la glucosa fermentada cultivos ------------------------------------- 75

IX

Lista de tablas

Tabla 5.1 Conteo inicial-final de levaduras cultivos------------------------------------------ 78 Tabla 5.2 Conteo máximo de microorganismos cultivos ----------------------------------- 78 Tabla 5.3 Tasa de crecimiento cultivos --------------------------------------------------------- 79 Tabla 5.4 Contenido de nitrógeno rango inicial y final cultivos --------------------------- 81 Tabla 5.5 Conteo de microorganismos y contenido de nitrógeno cultivo 1------------ 82 Tabla 5.6 Contenido máximo de nitrógeno cultivos ------------------------------------------ 82 Tabla 5.7 Porcentaje de asimilación de nitrógeno del medio por cultivo --------------- 82 Tabla 5.8 Asimilación de nitrógeno del medio y el incremento de nitrógeno en la biomasa ------------------------------------------------------------------------------------------- 83 Tabla 5.9 Conteo de microorganismos y contenido de proteínas cultivo 1 ----------- 85 Tabla 5.10 Sólidos solubles totales inicial y final cultivos ---------------------------------- 86 Tabla 5.11 Porcentaje de azúcar consumida -------------------------------------------------- 88

X

LISTA DE FIGURAS Pág Figura 2.1 Glucólisis---------------------------------------------------------------------------------- 21 Figura 2.2 Comparación respiración-fermentación ------------------------------------------ 22 Figura 2.3 Ciclo de krebs---------------------------------------------------------------------------- 23 Figura 2.4 Resumen ciclo de krebs -------------------------------------------------------------- 23 Figura 2.5 Curva de crecimiento de microorganismos -------------------------------------- 26 Figura 3.1 Inoculación sucesiva subcultivos --------------------------------------------------- 36

XI

LISTA DE ANEXOS Pág Anexo A Conteo de microorganismos cultivos ------------------------------------------------- 94 Anexo B Contenido de nitrógeno total cultivos------------------------------------------------- 97 Anexo C Contenido final de nitrógeno en el medio de cultivo---------------------------- 100 Anexo D Contenido de proteína total cultivos ------------------------------------------------ 101 Anexo E Sólidos solubles totales --------------------------------------------------------------- 104 Anexo F Contenido alcohólico cultivos ------------------------------------------------------- 107 Anexo G Calibración método determinación azúcares ------------------------------------ 108 Anexo H Contenido de azúcar residual cultivos --------------------------------------------- 109 Anexo I Manejo estadístico------------------------------------------------------------------------ 111

XII

RESUMEN

Se analizó el comportamiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae sometida a subcultivos en medio semisintético, para establecer la influencia de estos sobre esta cepa. Se estableció un cultivo iniciador y cuatro subcultivos, todos sometidos a condiciones estables de temperatura (25 oC). Los subcultivos se establecieron inoculando de forma sucesiva, levadura en fase estacionaria temprana, del pase anterior. Para determinar el comportamiento de las fermentaciones y las curvas de crecimiento, con el fin de establecer la influencia de los subcultivos, se determinaron los siguientes parámetros: conteo de microorganismos, nitrógeno total, contenido de proteína, sólidos solubles totales, contenido de azúcares residuales y alcohol final. Al analizar estos parámetros, podemos concluir, que la levadura Saccharomyces cerevisiae, no presenta degeneración al someterse a subcultivos.

Abstract:

The behavior of the yeast Saccharomyces cerevisiae submited to subculturing was analyzed. For the fermentation process a semi-sinthetic medium was used at an incubation temperature of 25°C. The subcultures were established by the inoculation of yeast in early stationary phase of the previous culture in succesive form. To establish the influence of the subculturing in the fermentation behavior of Saccharomyces cerevisiae following parameters were determined: total count of microorganisms, total nitrogen concentration, total protein concentration, total soluble solids concentration, total residual sugar and final alcohol concentration. After four subcultures or five succesive fermentation no degeneration of the strain was observed.

XIII

JUSTIFICACION

La Facultad de Ingeniería ha iniciado, hace poco tiempo, una línea de investigación en fermentaciones. Por tal motivo es necesario estandarizar metodologías de laboratorio que son de rutina para la caracterización de este tipo de procesos. Estas metodologías, internacionalmente aceptadas, deben ser adaptadas a la infraestructura de los laboratorios con los que cuenta la Facultad. Con esta finalidad se han realizado tres proyectos de grado. En microbiología industrial se requiere en la parte de estandarización de procesos fermentativos, la determinación de parámetros que permitan valorar dichos procesos. Los parámetros más importantes a determinar son: contenido de nitrógeno total y los contenidos de proteína en la biomasa y en el medio de cultivo. Los factores utilizados para determinar el contenido de proteína a partir de nitrógeno total, aplicados en la caracterización de alimentos, no son adecuados para este tipo de procesos. Para tal efecto se estandarizó el método espectrofotométrico conocido como el método del ácido bicinchonínico para la determinación de proteína total. Desde el punto de vista de la producción industrial, es necesario conocer la influencia que pueda ejercer el subcultivo de un microorganismo en el rendimiento del proceso, como ocurre en la industria cervecera, en la cual la levadura utilizada en el proceso fermentativo va perdiendo cualidades a medida que es reutilizada en fermentaciones posteriores. En este trabajo se analizó el comportamiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae sometida a subcultivos en medio semisintético, con el fin de establecer la influencia que pueda tener el subcultivo sobre esta levadura. Para ello se estableció un cultivo iniciador y cuatro subcultivos, todos sometidos a condiciones estables de temperatura (25 oC). Los subcultivos se establecieron inoculando de forma sucesiva, levadura en fase estacionaria temprana, del pase anterior. La levadura Saccharomyces cerevisiae es un organismo aerobio, que en ausencia de oxígeno tiene la capacidad de fermentar. Los cultivos aerobios poseen como rasgo característico una mayor producción de biomasa que los anaerobios, sin embargo estos últimos, los anaerobios, dan como resultado una mayor producción de alcohol. Es conocido que el mantenimiento por periodos largos de anaerobiosis llevan consigo la inhibición de la levadura, además, los subcultivos tienden a influir en el comportamiento de la cepa, ya que al aumentar el número de pases entre el cultivo madre y la fermentación final, mayor será el riesgo de contaminación y degeneración de la cepa.

XIV

Justificación

XV

Para determinar el comportamiento de las fermentaciones y las curvas de crecimiento, con el fin de establecer la influencia de los subcultivos sobre esta cepa, se determinaron los siguientes parámetros: conteo de microorganismos, contenido de nitrógeno total, contenido de proteína, sólidos solubles totales, contenido de azúcares residuales y alcohol final. La influencia de los subcultivos fue establecida mediante la comparación de las curvas de crecimiento, el consumo de azúcares y la producción de alcohol.

CAPITULO 1

OBJETIVOS 1.1 GENERAL ❏

Determinar el comportamiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae durante el desarrollo de una fermentación alcohólica en forma de subcultivo cerrado tomando como inóculo levadura en fase estacionaria.

1.2 ESPECIFICOS ❏

Estandarizar el método espectrofotométrico internacionalmente aceptado para la determinación del contenido de proteína, durante una fermentación alcohólica con levaduras.

❏

Determinar la curva de crecimiento para la levadura Saccharomyces cerevisiae en una fermantación alcohólica en cada uno de los subcultivos mediante los siguientes parámetros: nitrógeno total, contenido de proteína y número de microorganismos.

❏

Determinar el consumo de azúcares y la producción de alcohol mediante los siguientes parámetros: grados brix, alcohol y azúcares residuales.

❏

Determinar la influencia de los subcultivos mediante la comparación de las curvas de crecimiento, consumo de azúcar y producción de alcohol.

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CAPITULO 2

FUNDAMENTACION TEORICA

Este capítulo cubre los aspectos más importantes relacionados con la revisión bibliográfica, que fue utilizada como base, para el estudio, preparación y realización de este proyecto. Incluye aquellos temas requeridos para el establecimiento del diseño experimental e interpretación de los resultados.

2.1 METABOLISMO La principal característica que tienen los organismos vivos es su capacidad para organizar moléculas y reacciones químicas en estructuras específicas y en secuencias sistemáticas. Como resultado de esto el organismo vivo tiene la capacidad de hacer réplicas de sí mismo. El metabolismo es el estudio de las reacciones químicas que se llevan a cabo dentro de las células. Los elementos químicos, bases celulares, provienen del exterior de las células, del medio ambiente, pero estos elementos químicos son transformados por la célula en los constituyentes que la componen. Estas sustancias químicas del ambiente reciben el nombre de nutrientes, los cuales son introducidos a la célula y transformados en parte de ésta. El metabolismo comprende dos clases básicas de transformaciones químicas: los procesos de construcción o biosintéticos llamados anabolismo y los procesos de degradación, llamados catabolismo, que dan como resultado una liberación de energía. Durante el metabolismo, las células toman los nutrientes, los convierten en sus componentes celulares y excretan al medio los productos de desecho. La biosíntesis es un proceso que requiere de energía, por lo que cada célula debe disponer de algún medio para obtenerla. Los organismos se dividen en dos grupos de acuerdo a la fuente de energía, los organismos que utilizan la luz como fuente de energía se llaman fotótrofos, los que emplean compuestos químicos como fuente de energía, quimiótrofos. Son quimiolitotrofos los que utilizan sustancias inorgánicas y quimioorganotrofos los que utilizan compuestos orgánicos como fuente de energía.

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Fundamentación Teórica

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Es importante conocer el metabolismo celular para comprender el desarrollo microbiano en sus diferentes aplicaciones. 2.1.1 Metabolismo catabólico (generación de adenosina trifosfato ATP) Todos los organismos, para crecer y mantenerse, tienen que tener la capacidad de generar moléculas de alta energía, dentro de las cuales, la más importante es el nucleótido de alta energía adenosín trifosfato (ATP), la generación de energía se requiere para acoplarla a procesos anabólicos (biosintéticos), como el transporte de nutrientes y desechos, y el movimiento entre otros. A pesar de le existencia de variaciones, las rutas que tienen que ver con la producción de ATP son, en esencia, similares en todos los organismos. Existen tres formas para la generación del ATP: la fotofosforilación, la fosforilación oxidativa y la fosforilación a nivel de sustrato. Los organismos capaces de utilizar la luz como fuente de energía comprenden un grupo grande y heterogéneo. Estos organismos son capaces de generar ATP por medio de la luz, en el proceso de fotofosforilación. En este proceso la síntesis del ATP durante el flujo fotosintético de los electrones ocurre como resultado de la formación de un gradiente de protones y la reacción redox dirigida por la luz tiene lugar a través de la membrana fotosintética. En la fosforilación oxidativa el ATP se produce por eventos en los que participa una cadena transportadora de electrones, no conectados directamente al metabolismo de sustratos específicos, en esta síntesis se presenta la creación de una fuerza motriz protónica. El ATP se produce en las fermentaciones por un proceso de fosforilación a nivel de sustrato, en el cual se sintetiza enlaces fosfatos de alta energía (ATP), por medio de la reacción de fosfato inorgánico con un sustrato orgánico usualmente activado. 2.1.2 Glucolisis El crecimiento de un microorganismo está determinado, entre otros factores, por la cantidad de energía que pueda obtener de la degradación de los nutrientes. Bajo estos supuestos la fermentación es un proceso menos eficaz energéticamente que la respiración aerobia, ya que parte de la energía presente en la sustancia orgánica descompuesta está todavía presente en los compuestos finales, como en el etanol o el ácido láctico. La principal ruta para la degradación de la glucosa y la fructosa es la de EmbdenMeyerhof-Parnas (EMP o glucólisis). La glucólisis es la secuencia de reacciones que convierten una molécula de glucosa en dos moléculas de piruvato produciendo ATP. Cada reacción es regulada por una enzima específica, y en cada reacción hay una ganancia neta de dos moléculas de ATP. La glucólisis no requiere de oxígeno y puede realizarse en condiciones aerobias o anaerobias. Este proceso ejemplifica de que manera los procesos bioquímicos de una célula viva se desarrollan en pequeños pasos secuenciales. En la glucólisis se presenta una serie de nueve reacciones, cada una catalizada por una enzima específica.

Fundamentación Teórica

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Paso 1. La glucólisis comienza con una reacción de preparación, en la cual se activa la glucosa. La glucosa recibe un grupo de fosfato de una molécula de ATP. El ATP es fuente de energía y de fosfatos necesarios para unir el fosfato a la molécula de glucosa. ( Una vez que se gasta el ATP, se convierte en ADP y se une a la reserva de ADP en la célula, hasta que se convierte de nuevo en ATP). Esta reacción la cataliza la hexocinasa. La glucosa fosforilada se llama glucosa 6-fosfato. La fosforilación de la glucosa le da mayor reactividad química. La carga eléctrica del grupo fosfato evita que la glucosa salga de la célula, ya que la membrana celular es impermeable a iones. Paso 2. La glucosa 6-fosfato vuelve a arreglar sus átomos de hidrógeno y oxígeno, otra reacción de preparación, catalizada por una isomerasa. En esta reacción, la glucosa 6-fosfato se convierte en su isómero fructosa 6-fosfato. Paso 3. Posteriormente otra molécula de ATP dona un fosfato a la molécula, formando fructosa-1,6 difosfato. Hasta aquí se han invertido dos moléculas de ATP sin que se haya producido uno solo. Los grupos fosfatos se unen a los carbono 1 y 6 mediante enlaces éster: la molécula está lista para dividirse. Paso 4. La fructosa 1,6 difosfato se divide, mediante una enzima aldolasa, en dos azucares de tres carbonos, el gliceraldehído3-fosfato (PGAL) y la dihidroxilacetonafosfato. Esta última puede convertirse enzimáticamente en su isómero, el gliceraldehido3-fosfato, para su posterior metabolismo en la glucólisis. Aunque la isomerasa interconvierte estos azucares, sólo el PGAL continúa en la secuencia glucolítica. Esto desvía el equilibrio en dirección del PGAL. Paso 5. El gliceraldehído 3-fosfato reacciona con un grupo SH (sufhidrilo) de la enzima gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, formando un grupo H-C-OH que puede deshidrogenarse con el NAD+ como aceptor. El producto de esta reacción es el fosfoglicerato, que permanece unido a la enzima. La reacción exergónica está acoplada a otra reacción que produce un enlace energético del fosfato con el carbono 1. En esta reacción el fosfoglicerato reacciona con un fosfato inorgánico del citoplasma para formar 1,3-difosfoglicerato, que es liberado por la enzima. En esta reacción de oxidorreducción, el PGAL se convierte en difosglicerato, y el grupo fosfato recién agregado está unido por un enlace energético. Paso 6. El fosfato energético reacciona con el ADP para formar ATP. Esta transferencia de un fosfato energético de un compuesto a la molécula de ATP se denomina fosforilación a nivel de sustrato. Paso 7. El 3-fosfoglicerato se rearregla en 2-fosfoglicerato mediante un cambio enzimático de la posición de su grupo. Esta es una reacción de preparación. Paso 8. Posteriormente, en una reacción poco usual, se genera un fosfato energético, por la eliminación de agua; es decir, en una reacción de deshidratación, en vez de generarse por la eliminación de un hidrógeno (deshidrogenación). El producto de esta reacción es el fosfoenolpiruvato o PEP. El enlace fosfato energético del PEP es el segundo de este tipo formado a nivel del sustrato en el metabolismo de la glucosa al piruvato.

Fundamentación Teórica

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Paso 9. Cada una de las dos moléculas de PEP pueden transferir su grupo fosfato al ADP para producir ATP y piruvato. En un esquema simplificado la glucólisis se divide en dos etapas principales, la primera corresponde a los primeros cuatro pasos descritos anteriormente. En esta fase se agrega fosfato a la molécula de glucosa; esta reacción se llama fosforilación. Luego la glucosa se divide formando dos moléculas de tres carbonos llamadas gliceraldehido-3fosfato (PGAL). Para esta transformación se requiere de energía, de manera que la célula invierte dos moléculas de ATP para iniciar la oxidación de la glucosa. En la segunda fase de la glucólisis (pasos 5 a 9), el PGAL se oxida, con la eliminación de dos átomos de hidrógeno: algunos otros átomos se vuelven a arreglar, de manera que el PGAL se transforma en una molécula de piruvato. Durante estas reacciones, se libera suficiente energía química de la molécula de azúcar, con lo cual se producen cuatro moléculas de ATP. Para iniciar la secuencia glucolítica es necesaria la energía de los enlaces de fosfato de dos moléculas de ATP. Posteriormente se producen dos moléculas de NADH a partir de dos de NAD +, y cuatro ATP a partir de cuatro ADP. Glucosa +2ATP+4ADP+2Pi+2NAD+

2 Ácido pirúvico+2ADP+4ATP+2NADH +2H+ +2H2O

Es así como una molécula de glucosa se ha convertido en dos moléculas de ácido pirúvico. La ganancia neta, la energía recuperada, es de dos moléculas de ATP y dos moléculas de NADH por molécula de glucosa. Las dos moléculas de ácido pirúvico contienen todavía una gran cantidad de la energía potencial que se encontraba almacenada en la molécula de glucosa original. En la primera fase de la glucólisis se consumen dos moléculas de ATP, y en la segunda fase se producen cuatro moléculas de ATP. Así, la glucólisis brinda un beneficio neto de energía de dos moléculas de ATP. Las células utilizan tres vías para obtener energía libre de los nutrientes, que son: la respiración aerobia, la respiración anaerobia y la fermentación. En la primera vía mencionada, a saber, la aerobia, los electrones que se eliminan de las moléculas de nutrientes durante la glucólisis y el ciclo del ácido cítrico se transfiere a una secuencia de aceptores de electrones. El aceptor final de electrones es el oxígeno molecular. Durante la respiración anaerobia, el oxígeno no se utiliza como aceptor de electrones; en lugar de ello, un compuesto inorgánico, como el nitrato o el sulfato sirve de aceptor final de electrones. Tanto la respiración anaerobia como la fermentación dependen de las reacciones de la glucólisis. En la fermentación, otra de las vías para obtener energía libre, el aceptor final de electrones del NADH es un compuesto orgánico. Las levaduras llevan a cabo la fermentación alcohólica ya que cuando son privadas de oxígeno, las levaduras separan el dióxido de carbono del piruvato y forman un

Fundamentación Teórica

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compuesto llamado acetaldehído. El hidrógeno del NADH + H se transfiere al acetaldehído para formar el alcohol etílico.

GLUCOLISIS

ACTIVACION

OXIDACION +Pi

+Pi

Figura 2.1 Pasos de la glucolisis FUENTE: www.lluengo.citológica.net/glucólisis.html, 12 noviembre 2000

Fundamentación Teórica

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GLUCOSA GLUCOLISIS

PIRUVATO RESPIRACIÓN

ACETIL CoA

FERMENTACIÓN

ACETALDAHÍDO

TCA

ATP

NADH

Cadena transportadora de eATP O2 Figura 2.2 Comparación respiración-fermentación FUENTE: Autor

ETANOL + CO2

Fundamentación Teórica

Figura 2.3 Ciclo de krebs (TCA) FUENTE: www.arrakis.es/∼lluengo/ciclokrebs.html, 12 noviembre 2000

Figura 2.4 Resumen ciclo de Krebs FUENTE: www.arrakis.es/∼lluengo/ciclokrebs.html, 12 noviembre 2000

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Fundamentación Teórica

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En el metabolismo respiratorio se observa que cualquier tipo de sustrato de crecimiento que contenga tres o más átomos de carbono puede oxidarse, directa o indirectamente, vía los intermediarios de la ruta glicolítica a acetil CoA que posteriormente se oxida completamente a dióxido de carbono vía el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA o ciclo de Krebs). Durante estas reacciones de transporte de electrones se libera energía, conservándose una porción de la misma mediante el proceso de fosforilación oxidativa. El resultado final de este proceso es la generación de ATP. En el metabolismo de los azúcares, los polisacáridos son componentes claves de las paredes celulares de muchos organismos y con frecuencia las células almacenan energía en forma de polisacáridos glucógeno o almidón. Los azúcares de los polisacáridos son principalmente azúcares de seis carbonos llamados hexosas. La hexosa más común en los polisacáridos es la glucosa, la cual, es también, una fuente excelente de energía para una gran parte de microorganismos. Además de las hexosas dos azúcares de cinco carbonos o pentosas son componentes clave de los ácidos nucleicos, ribosa en el RNA y desoxirribosa en el DNA. Los azúcares de seis carbonos necesarios para la biosíntesis se pueden obtener del medio ambiente o bien sintetizarse dentro de la célula a partir de materias primas diferentes de los azúcares. Cuando un microorganismo dispone de una hexosa como fuente de energía y de carbono, esta hexosa, sirve en general como precursor de las hexosas que se necesitan para la biosíntesis. Los azúcares con seis átomos de carbono son los donadores de electrones más importantes para muchos quimioorganotrofos.

2.1.3 Fermentación El metabolismo fermentativo comparte con la biocatálisis la característica de ser las formas más antiguas de biotecnología. La fermentación en su aspecto bioquímico es un proceso que genera energía en el que los compuestos orgánicos actúan como dadores de electrones y aceptores terminales de electrones. En su aspecto práctico la fermentación es un proceso destinado a la producción de un producto mediante el cultivo masivo de microorganismos. La fermentación de la glucosa por las levaduras es un medio para producir alcohol, el producto que se desea en las bebidas alcohólicas y la producción de ácido láctico es el paso inicial de productos de leche fermentada. En condiciones fermentativas solamente se efectúa una oxidación parcial de los átomos de carbono del compuesto orgánico, por tal motivo, solo una pequeña cantidad de la energía potencial disponible se libera. El potencial de la fermentación es tan variado como los mismos microorganismos, pero es necesario conocer estos microorganismos, controlar su metabolismo y crecimiento y manejarlos a gran escala. La siguiente reacción es un ejemplo de fermentación alcohólica, el catabolismo de la glucosa por levaduras: GLUCOSA

2ETANOL+2 BIOXIDO DE CARBONO

Fundamentación Teórica

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C6 H12O6

2C2H6O+2CO2

2.2 CULTIVO DE MICROORGANISMOS El crecimiento de un microorganismo está condicionado a la conjunción de diferentes factores (sustancias nutritivas, factores de crecimiento), y de condiciones fisicoquímicas como la temperatura, el pH y aireación. Un microorganismo sólo crecerá en un medio de cultivo si contiene todos los nutrientes necesarios en una forma disponible y si son adecuados el resto de los factores ambientales. En el crecimiento microbiano existe un factor muy importante conocido como factor limitativo, cuya ausencia o modificación trae como consecuencia la detención del crecimiento. Al colocar algunas células de microorganismos en un medio de cultivo conveniente, estas, se multiplicarán hasta el agotamiento de un factor limitativo, o hasta el momento en que un factor limitativo alcanza un valor crítico. 2.2.1 Cultivo discontinuo Es el método de cultivo más simple en el que el microorganismo crece a partir de una cantidad limitada de medio hasta que se agota un nutriente esencial o se acumulan subproductos tóxicos a niveles que inhiben el crecimiento. En este sistema el cultivo pasará por una serie de fases: fase de latencia, fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte. Fases del crecimiento microbiano: Fase de Latencia Cuando las células se transfieren de un medio a otro no existe inicialmente aumento en el número de células, aunque la masa celular puede cambiar, este es un período de adaptación al medio ambiente. Cuando un cultivo que crece en forma exponencial es inoculado en un mismo medio, bajo las mismas condiciones de crecimiento, no presentará fase de latencia y el crecimiento exponencial continuará a la misma velocidad. Fase Exponencial Las células se han adaptado a las condiciones de crecimiento. La tasa de crecimiento es constante y máxima, la mortalidad es nula. La mayor parte de los microorganismos unicelulares crecen exponencialmente, pero la velocidad de crecimiento exponencial varia mucho de un organismo a otro. El crecimiento de la masa celular se describe cuantitativamente en función de la duplicación del número de células por unidad de tiempo (levaduras y bacterias). Cuando existe substrato en exceso, la velocidad de crecimiento es independiente de la concentración del mismo. Fase Estacionaria En esta fase se detiene o disminuye el crecimiento, debido a la falta de sustrato y a la formación de substancias tóxicas. No se presenta incremento o decremento en la cantidad de células, pero muchas de las funciones celulares pueden continuar,

Fundamentación Teórica

26

incluyendo el metabolismo energético y algunos procesos biosintéticos. La población permanece estacionaria en un lapso más o menos largo, según condiciones experimentales y el microorganismo implicado. Fase de Muerte En esta fase las reservas de energía de las células se agotan. Cuando se representan en forma semilogarítmica los supervivientes frente al tiempo, puede ser obtenida una línea recta, lo que indica que las células mueren a una velocidad exponencial. La longitud de tiempo entre la fase estacionaria y la fase de muerte dependen del organismo y del proceso utilizado. Durante la fase de muerte, el conteo microscópico directo puede permanecer constante, pero la viabilidad disminuye lentamente. En algunos casos, la muerte puede ir acompañada por lisis celular, dando lugar a una disminución en el conteo microscópico directo junto con la disminución del conteo de viabilidad.

CURVA DE CRECIMIENTO DE UN CULTIVO BACTERIANO

Figura 2.5 Curva de crecimiento de microorganismos FUENTE: Biotecnología: Manual de Microbiología Industrial Crueger Wulf página 7

2.2.2 Subcultivos En la industria, suelen utilizarse subcultivos de microorganismos en el proceso de producción, tal es el caso de la industria cervecera, en la cual al finalizar la fermentación, parte de la levadura utilizada, es conservada para su posterior reutilización en fermentaciones posteriores, sometiéndola de esta forma a subcultivos.

Fundamentación Teórica

27

Es necesario conocer la influencia que pueda tener el subcultivo de la levadura, sobre los rendimientos en el proceso de producción, y de esta forma determinar el número de pases entre el cultivo madre y la fermentación siguiente, "ya que la levadura va perdiendo cualidades a medida que va siendo utilizada en distintas fermentaciones". (terra.es/personal/ale38es/Estilo/levaduras, 12 de noviembre 2000). Al incrementar el número de pases entre el cultivo madre y la fermentación final, se presenta el riesgo de contaminación y degeneración de cepas, ya que el subcultivo repetido del material matriz trae como resultado mutaciones o modificaciones en el microorganismo, que pueden llevar "a cambios en su comportamiento bioquímico" (Kunz, 1986, 48). 2.2.3 Preparación del medio de cultivo Generalmente se utilizan dos clases de medios de cultivo en microbiología: químicamente definidos (sintéticos) o indefinidos (complejos). Los medios químicamente definidos se preparan adicionando cantidades precisas de sustancias inorgánicas u orgánicas puras al agua destilada. De esta forma, se conoce la composición química exacta de este medio definido. En muchos casos conocer la composición exacta del medio de cultivo no es indispensable. En estos casos, en los cuales no es necesario conocer la composición química del medio, son suficientes los medios indefinidos que incluso pueden ser ventajosos. Los medios complejos emplean extractos de sustancias altamente nutritivas que son subproductos agroindustriales, aunque nutricionalmente indefinidas. Estos extractos, los cuales son medios complejos, se venden en forma de polvo que pueden ser pesados y adicionados a los medios de cultivo. Una desventaja importante de los medios complejos es la pérdida de control sobre las especificaciones precisas de los nutrientes. 2.2.3.1 Requerimientos nutricionales El medio de cultivo que se utilice no sólo debe cubrir las necesidades nutritivas del microorganismo sino también las exigencias del proceso industrial si este lo requiere. Todos los microorganismos requieren de agua, fuentes de carbono y nitrógeno, elementos minerales y, posiblemente, nutrientes específicos, como vitaminas y aminoácido. En la siguiente tabla se presentan algunos ejemplos de fuentes de carbono y nitrógeno que se utilizan frecuentemente en la preparación de medios.

Fundamentación Teórica

28

Tabla 2.1 Fuentes de Carbono y Nitrógeno utilizados en medios de cultivos.

FUENTES DE CARBONO

FUENTES DE NITRÓGENO

Almidón

Amoníaco

Glucosa

Sales amónicas

Malta

Nitratos

Melazas de remolacha

Macerado de maíz

Melazas de caña

Gránulos de cacahuates

Aceites vegetales

Harina de soja

Hidrocarburos

Sangre deshidratada Medios formulados Harina de soja Solubles de destilería Extracto de levadura

FUENTE: Biotecnología: Principios Biológicos página 103

La mayoría de los microorganismos comercialmente importantes son quimiorganotrofos heterótrofos, por tanto, la fuente de energía y carbono es una misma. El carbono y el nitrógeno se suministran habitualmente en forma de mezclas complejas de productos naturales económicos o son subproductos de otros procesos. Cualquier nutriente específico que se requiera, como vitaminas o aminoácidos, debe añadirse en forma pura pero puede que exista también en el mercado como extracto de origen animal o vegetal. Los fosfatos deben añadirse al medio como agentes tamponadores o reguladores de pH. En términos generales los requerimientos nutricionales de todos los organismos son los mismos, todos los organismos requieren de una fuente de energía, de macronutrientes y micronutrientes para su crecimiento y desarrollo. Algunos organismos requieren determinados nutrientes en forma específica. La proporción y el tipo de cada nutriente en un medio de cultivo puede variar notablemente para cultivar microorganismos diferentes. En la siguiente tabla se presentan los posibles requerimientos nutricionales para un medio de cultivo y las formas más comunes de satisfacerlos.

Fundamentación Teórica

29

Tabla 2.2 Requerimientos de nutrientes de los microorganismos y formas comunes de satisfacerlos en los cultivos.

NUTRIENTE

Carbono

FORMA QUIMICA SUMINISTRADA AL MEDIO DE CULTIVO

Orgánico medio definidos: Glucosa, acetato, piruvato malato, cientos de otros compuestos; medios complejos: extracto de levadura, extracto de carne de res, peptona y otros extractos. Inorgánico:CO2, HCO3-

Nitrógeno

Orgánico: Amino ácidos, bases nitrogenadas Inorgánico :NH4Cl, (NH4)2SO4, KNO3, N2

Fósforo

KH2PO4, NaHPO4

Azufre

Na2SO4, H2S

Potasio

KCL, K2HPO4

Magnesio

MgCl2, MgSO4

Sodio

NaCl

Hierro

FeCl3, Fe(NH4)(SO4)2, quelatos de hierro

Micronutrientes

CoCl2, ZnCl2, Na2MoO4, CuCl2, MnSO4,NiCl2, Na2SeO4,NaWO4,Na2VO4

FUENTE: Microbilogía Tomas D. Brock página 13

2.2.3.2 Factores de crecimiento Los microorganismos exigen pequeñas cantidades de otras sustancias, llamadas factores de crecimiento, que son, a la vez, factores de multiplicación y de actividad celular; su carencia perturba los mecanismos del metabolismo.

Fundamentación Teórica

30

Tabla 2.3 Tabla de factores de crecimiento y su efecto sobre la levadura FACTORES DE CRECIMIENTO

EFECTO SOBRE LAS LEVADURAS

Biotina

En su ausencia las levaduras reaccionan con una síntesis acrementada de tiamina, nicotinamida y riboflamina. Reduce la tasa de ácido succínico

Piridoxina

Estimulante En su ausencia se nota una formación menor de glicerol y de ácido succínico.

Tiamina

En la mayor parte de las levaduras aumenta la velocidad de fermentación más que la de crecimiento.

Acido pantoténico

Su carencia modifica profundamente la formación de los productos secundarios durante la fermentación alcohólica

Mesoinositol

Su ausencia lleva a la formación de pequeñas cantidades de glicerol y de ácido succínico.

Nitcotinamida

Es un componente del NAD y del NADP, coenzimas que intervienen en los mecanismos de deshidrogenación.

Acido ρ-Aminobenzoico

Poco indispensable para las levaduras. En las bacterias Lácticas es el precursor del pteroilglutámico.

FUENTE: Autor basado en Ciencias y Técnicas del vino Jean Gayon página 312

Los factores de crecimiento son sustancias orgánicas que desempeñan el papel de metabolitos esenciales; son indispensables para los microorganismos. Son compuestos orgánicos que el organismo es incapaz de sintetizar a partir de los nutrientes y son fundamentales para la maquinaria metabólica de la célula. Son vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas, etc. Con relación al requerimiento de factores de crecimiento los organismos se pueden dividir en: − Protótrofos: microorganismos que sintetizan sus propios factores de crecimiento. − Auxótrofos: microorganismos que requieren una fuente exógena de factores de crecimiento debido a que son incapaces de sintetizarlos. Deben proveerse a aquellos que al no sintetizarlos, no pueden desarrollarse en su ausencia. Una de sus características es la de actuar en una concentración reducida.

Fundamentación Teórica

31

Ciertos aminoácidos, las purinas y las pirimidinas sirven de factores de crecimiento a numerosas bacterias que exigen cantidades relativamente importantes de dichas sustancias. Pero los factores de crecimiento propiamente dichos son las vitaminas, necesarias para los organismos superiores. Las vitaminas presentan una estructura idéntica o muy parecida a la de ciertas coenzimas, es decir, la parte activa de las enzimas. Para las levaduras estos factores pertenecen a la clase de vitaminas: biotina, piridoxina, tiamina, ácido pantotéico, mesoinositol, nicotinamida, ácido ρaminobenzoico. Para las bacterias lácticas hay que agregar también, riboflavina y el ácido pteroilglutámico.

2.3 LEVADURAS 2.3.1 Morfología La forma de las levaduras puede ser desde esférica a ovoide, alimonada, piriforme, cilíndrica, triangular, e incluso alargada, constituyendo un verdadero micelio o un falso micelio. También se diferencian en cuanto a su tamaño. Son partes observables de su estructura, la pared celular, el citoplasma, las vacuolas de agua, los glóbulos de grasa y los gránulos, los cuales pueden ser metacromáticos, de albúmina o de almidón. 2.3.2 Fisiología Las levaduras están desprovistas de clorofila y, por tanto, son incapaces de producir los compuestos orgánicos necesarios para su crecimiento a partir de sustancias minerales, como lo hacen los vegetales superiores, las algas y algunas bacterias. Son pues saprofitas y a veces parásitas. Para su crecimiento necesitan oxígeno, fuentes de carbono orgánicas y nitrógeno mineral u orgánico, diversos minerales y una temperatura y pH adecuados. El intervalo de temperaturas de crecimiento de la mayoría de las levaduras es, en general, parecido al de los mohos, con una temperatura óptima en torno a los 25 a 30°C y una temperatura máxima en torno a los 35 a 47°C. Algunas especies son capaces de crecer a temperaturas de 0°C o inferiores. Las levaduras utilizan numerosos sustratos carbonados, bien sea por vía oxidativa únicamente o, como pasa con la mayoría, por vía fermentativa, después de una fase inicial de crecimiento aeróbico. En este último caso, vía fermentativa o anaeróbica, se produce etanol y CO2. El pH óptimo para el crecimiento de las levaduras varía de 4,5 a 6,5 aunque muchas especies toleran grandes variaciones de pH. Una reacción ácida del medio próximo a un pH de 4 a 4,5 estimula el crecimiento de la mayoría de las levaduras, mientras que en medios básicos no crecen bien a no ser que se hayan adaptado a los mismos. Las levaduras crecen mejor en aerobiosis, aunque las especies de tipo fermentativo son capaces de crecer, aunque lentamente, en anaerobiosis.

Fundamentación Teórica

32

Los azúcares son la fuente energética más apropiada para las levaduras, aunque las oxidativas, por ejemplo las formadoras de película, oxidan los ácidos orgánicos y el alcohol. El dióxido de carbono que producen las levaduras que se utilizan en la panificación, completa la fermentación del pan, mientras que el alcohol producido por las levaduras fermentativas es el principal producto en la fabricación de vinos, cerveza, alcohol industrial y otros productos. 2.3.3 Reproducción La mayoría de las levaduras se reproducen asexualmente por gemación polar, mecanismo de reproducción mediante el cual una porción de protoplasma sobresale de la pared de la célula de la levadura y forma una protuberancia; esta protuberancia, o yema, aumenta de tamaño y finalmente se desprende como célula de levadura neoformada. Algunas levaduras tienen una reproducción sexual correspondiente a una fase de su ciclo biológico, constituida por una alternancia de fases haploide y diploide. Este fenómeno, es importante, pues hace posible aplicar a estas especies las técnicas de selección genética. Las esporas de origen sexual presentan morfologías diferentes (forma, aspecto, tamaño), pudiendo servir para la identificación de especies. 2.3.4 Características de los cultivos En los cultivos en placas de agar, es difícil diferenciar las colonias de levaduras de las colonias bacterianas; la observación microscópica de los microorganismos es la única forma segura que existe para poderlas diferenciar. La mayoría de las colonias jóvenes de levaduras son húmedas y algo mucosas, aunque es posible que tengan un aspecto harinoso; la mayoría de las colonias son blancuzcas, aunque algunas tienen un color crema o rosado. Las levaduras son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad metabólica es a la vez de ambos tipos. En la superficie de un líquido, las levaduras oxidativas pueden crecer en forma de película, de velo, o de espuma, y por ello se denominan levaduras formadoras de película. Las levaduras fermentativas suelen crecer en toda la masa del líquido y producen dióxido de carbono. 2.3.5 Saccharomyces Estas levaduras pertenecen al reino Fungi, se encuentran dentro del grupo de los ascomicetos, pertenecientes al género Saccharomyces. Las células de estas levaduras pueden ser redondeadas, ovaladas o alargadas y pueden producir un seudomicelio. Se reproducen por gemación multipolar o mediante la producción de ascosporas, las cuales se pueden formar tras la conjugación de dos células, o pueden derivar de células diploides cuando éstas representan la fase vegetativa. Las ascosporas, en número de una a cuatro por ascas, suelen ser redondeadas u ovaladas. La especie tipo S. cerevisiae, se emplea en muchas industrias alimentarias, utilizándose cepas específicas en la fermentación del pan, como levaduras de superficie en la fermentación de la

Fundamentación Teórica

33

cerveza, en la fermentación de los vinos y en la producción de alcohol, glicerol e invertasa. 2.3.5.1 Requerimientos nutricionales Carbono: Esta especie fermenta azúcares de 6 carbonos (hexosas), d-glucosa, dfructosa, d-manosa. La tasa de fermentación de la manosa es menor que la de la glucosa, y junto con otras especies, la fructosa se fermenta más lento que la glucosa. Nitrógeno: Las levaduras tienen un contenido de nitrógeno alrededor del 10% de su peso seco; de aquí que el nitrógeno sea un constituyente importante de cualquier medio de crecimiento. Muchas sales de amonio inorgánicas han sido encontradas para promover el crecimiento de las especies de Saccharomyces y las más eficientes son las siguientes: acetato de amonio, carbonato de amonio, bicarbonato de amonio, fosfato de amonio, lactato de amonio, sulfato de amonio y tartrato de amonio. El sulfato de amonio es el más usado como fuente de nitrógeno y suministra una fuente fácilmente asimilable de azufre. Las levaduras cerveceras y panaderas son incapaces de asimilar los nitratos, por lo tanto, estos no son generalmente apropiados como fuentes de nitrógeno en medios de cultivos para la Saccharomyces. Fósforo: Es esencial para el crecimiento de todas las levaduras, controlando la síntesis de lípidos y carbohidratos y manteniendo la integridad de la pared celular. Azufre: La Saccharomyces puede obtener el azufre que necesita, del sulfato, sulfito o tiosulfito inorgánicos, los cuales se reducen al aminoácido metionina dentro de la célula. A pesar de que la metionina es la fuente de azufre preferida, el sulfato de amonio es generalmente el escogido para la fermentación industrial. 2.3.5.2 Factores de crecimiento Los factores de crecimiento incluyen a las vitaminas, aminoácidos, ácidos nucleicos, ácidos grasos y esteroles. El inositol es un factor clave de crecimiento, y su ausencia, puede llevar a una división celular menos eficiente y a cambios morfológicos dentro de la pared celular. 2.3.5.3 Variables que influyen en el crecimiento de la Saccharomyces pH: La mayoría de las levaduras del género Saccharomyces crecen dentro del rango de pH 2.4-8.6. El pH intracelular de esta levadura es controlado dentro del rango 5,8-6,3 y ha sido mostrado como independiente de los valores de pH externo (3-7). El crecimiento de la levadura y las ratas de fermentación parecen no ser afectadas por los valores de pH, variando entre 3,5 y 6, esto se debe probablemente al control estricto sobre el pH intracelular. Efectos inhibitorios de la temperatura y el etanol: Muchas de estas levaduras crecen a cualquier temperatura entre 0° y 40°C, aunque la temperatura óptima para la

Fundamentación Teórica

34

máxima tasa de crecimiento depende del tipo, y generalmente se encuentra en un rango de 28° a 35°C. El crecimiento de esta levadura a temperaturas cerca de su límite de tolerancia (40°C), provoca la desestabilización de la membrana plasmática y una disminución en la viabilidad de la célula. La temperatura tiene un efecto muy fuerte en la tasa de mutación en cuanto a la deficiencia respiratoria de la S. cerevisiae, lo cual puede producir cantidades significativas de estas pequeñas células mutantes a 40°C, a pesar que muy pocas se detectan a temperaturas por debajo de los 35°C. En general, la temperatura óptima para la producción de etanol por parte de esta levadura es de 5° a 10°C más alta que la temperatura para el crecimiento. Sin embargo, el etanol producido durante la fermentación tiene un efecto inhibidor en el crecimiento de la levadura. La inhibición del crecimiento de la célula por grandes concentraciones de etanol, es superior a medida que aumenta la temperatura. Se considera que este efecto se debe al etanol producido dentro de la célula a una tasa elevada que puede ser transportado por medio de la membrana celular, esto lleva a la inhibición de las enzimas y es seguido por la muerte celular. En un estudio, la adición de etanol en cultivos de S. cervisiae y de S. uvarum que crecen exponencialmente a 23 oC produjo un 10% de disminución en la tasa de crecimiento a un 2% de etanol, un 50% de disminución en 6% de etanol y un 90% de disminución en 10% de etanol. (G.M. Hall, 1996, 255).

CAPITULO 3

MATERIALES Y METODOS

En este capítulo se describen las metodologías que fueron utilizadas para la realización de este trabajo. Las metodologías internacionalmente aceptadas, fueron adaptadas a las infraestructuras de los laboratorios con los que cuenta la Facultad de Ingeniería.

3.1

PROCEDIMIENTO

Para la implementación de las normas se realizaron los siguientes pasos: Tabla 3.1 Normas y métodos utilizados DETERMINACIÓN

NORMA/MÉTODOS

Nitrógeno

Norma AOAC 960.52

Etanol

Norma AOAC 969.12

Azúcares reductores

Manual de métodos analíticos para el control de calidad de bebidas alcohólicas (NTC) y norma AOAC 940.11

Proteína

Método espectrofotométrico (método del ácido bicinchonínico), Solución de ácido bicinchonínico para la determinación de proteína total,kit SIGMA C.O

Conteo de microorganismos

Método cámara de conteo Neubauer Improved

FUENTE: Autor

− Elaboración de curvas de calibración para las metodologías que lo requieran, utilizando muestras de concentración conocida, para los métodos empleados. − Cálculo del porcentaje de error de exactitud al comparar el valor teórico de las muestras de concentración conocida con el valor de las muestras experimentales. 35

3.2

DISEÑO EXPERIMENTAL

Para la realización de este trabajo, se desarrolló una fermentación alcohólica a 25oC utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae, sometida a un cultivo cerrado del cual se partió para establecer subcultivos. Para esto se estableció un cultivo iniciador y cuatro subcultivos sometidos a las mismas condiciones del cultivo iniciador (temperatura 25 oC ). Se inoculó de manera sucesiva los subcultivos, tomando como inóculo levadura en fase estacionaria temprana del medio inmediatamente anterior, con el propósito de medir los siguientes parámetros: Contenido de proteína, número de microorganismo, contenido de nitrógeno total, sólidos solubles totales, azúcares residuales y alcohol final.

2ml

CULTIVO 1

2ml

CULTIVO 2

2ml

CULTIVO 3

2ml

CULTIVO 4

CULTIVO 5

Figura 3.1 Inoculación sucesiva subcultivos. FUENTE: Autor

Como recipientes se utilizaron erlenmeyer de 500 ml esterilizados y debidamente cerrados. La levadura Saccharomyces cerevisiae utilizada para la inoculación del primer medio (cultivo iniciador), se activó previamente. Posteriormente durante la fase estacionaria de este primer cultivo, se tomó una muestra de 2 ml, con el fin de inocular el primer subcultivo al cual se le llamó cultivo 2 (a este proceso se le llamó pase). De esta misma forma cuando el cultivo 2 alcanzó su fase estacionaria, se tomo una muestra de 2 ml de este segundo medio para inocular el segundo subcultivo al cual se le llamó cultivo 3. Esta operación se realizó hasta el cultivo 5, siempre tomando como inóculo una muestra de 2 ml del cultivo en fase estacionaria inmediatamente anterior. Todo este proceso se realizó por triplicado. Ver figura 3.1. Se realizó un manejo estadístico simple, para el análisis de la información se reunieron unos valores que resumen o tipifican el conjunto de datos obtenidos, estos valores reciben el nombre de medidas de tendencia central o promedios. Para los métodos en los cuales se calculó el error de exactitud, nitrógeno y alcohol, se utilizó este error para determinar los rangos superior e inferior de cada dato obtenido; para los métodos de determinación de azúcares reductores, contenido de proteína, conteo de microorganismos y determinación de sólidos solubles, se calculó la desviación estándar, la cual fue utilizada para determinar los rangos de los datos obtenidos. 36

Materiales y métodos

37

DIAGRAMA DE FLUJO DISEÑO EXPERIMENTAL Preparación del medio de cultivo Esterilización de los erlenmeyer Introducción del medio en los erlenmeyer (llevar el medio a 25°C) Activación de la levadura Inoculación de la levadura en el primer medio (iniciador)

Determinación de los parámetros iniciales: Número de microorganismos, sólidos solubles totales, nitrógeno total y contenido de proteína Determinación de los parámetros en función del tiempo: Nitrógeno total, contenido de proteína, número de microorganismos y sólidos solubles totales

Determinación de los parámetros finales: Azúcar residual, alcohol, contenido de proteína, nitrógeno final, sólidos solubles totales, contenido de proteína del medio y nitrógeno del medio

Tomar un volumen del cultivo inicial en fase estacionaria e inocular en el segundo subcultivo (Primer pase) Determinación de los parámetros iniciales: Número de microorganismos, sólidos solubles totales, nitrógeno total y contenido de proteína

Determinación de los parámetros finales: Azúcar residual, alcohol, contenido de proteína, nitrógeno final y sólidos solubles totales Determinación de los parámetros finales: Azúcar residual, alcohol, contenido de proteína, nitrógeno final, sólidos solubles totales, contenido de proteína del medio y nitrógeno del medio Del segundo subcultivo tomar un volumen en fase estacionaria e inocular en el tercer subcultivo (segundo pase), y así sucesivamente hasta el quinto pase

Materiales y métodos

38

3.2.1 Preparación de los medios de cultivo El medio de cultivo utilizado para este estudio se presenta en la tabla 3.2 Tabla 3.2 Medio de cultivo para levaduras ELEMENTO

CANTIDAD Gramos para 7.5 litros

Extracto de levadura

60

Fosfato de amonio

1.875

Metabisulfito de sodio

0.375

Glucosa

710

Sacarosa

985.4

Äcido tartárico

9.18

Äcido citríco

5.811

Complejo vitamínico

0.82 ml

Biotina

0.0075

Cloruro de calcio

0.471

Sulfato de magnesio 7H2O

0.525

Cloruro de potasio

0.132

FUENTE: Determinación de la incidencia de diferentes sustratos en un proceso de fermentación utilizando Saccharomyces cerevisiae, (TM 12.99 012 Facultad de Ingeniería Universidad de La Sabana).

3.2.2 Esterilización de los erlenmeyer y adecuación de los medios de cultivo Para la esterilización de los 15 erlenmeyer se utilizó una estufa WTB-BINDER, para ello se procedió a cerrarlos con papel aluminio, con el fin de que permanecieran estériles hasta el tiempo en el que fueran utilizados. La esterilización se llevó a cabo a 200oC durante dos horas. Se procedió a la introducción del medio en los erlemeyer, este proceso se realizó dentro de una cámara de flujo laminar CAE ET (30"x36"x6"), para evitar la contaminación de los medios de cultivo. Luego se aumento la temperatura de los medios a 25oC, al colocarlos en una estufa Binder adecuada a esta temperatura. En la preparación del medio de cultivo fue agregado el metabisulfito de sodio con el fin de realizar una inhibición bacteriana química y esta forma, evitar el crecimiento de la flora bacteriana que podría contaminar el medio, formada principalmente por bacterias fermentativas tolerantes a medios ácidos. 3.2.3 Activación de la levadura La levadura Saccharomyces cerevisiae se activó previamente antes de ser inoculada en el primer cultivo (iniciador).

Materiales y métodos

39

Inicialmente se prepara una solución de agua azucarada al 5%. Se toma una cantidad determinada de agua azucarada, siguiendo la siguiente proporción, 75 ml de agua azucarada para 7.6 gramos de levadura seca. El volumen calculado de agua azucarada se lleva a 35 oC, posteriormente se toman 0.6 gramos de levadura activa seca y se introducen en la solución de agua azucarada a 35 oC y se mantiene durante 20 minutos. La levadura ha sido activada cuando se presenta la formación de espuma. Para calcular la cantidad indicada de levadura se tomó la siguiente proporción: 40 gramos de levadura activa seca para 100 litros de medio, teniendo presente que el cultivo 1 o iniciador cuenta con un volumen de 1.5 litros. 3.2.4 Inoculación de la levadura La inoculación de la levadura se realiza tomando en consideración los procedimientos para el manejo estéril de cultivos. Para ello todas las inoculaciones se realizan en la cámara de flujo laminar CAE ET, utilizando material previamente esterilizado (pipetas, erlemeyer) y utilizando el mechero para flamear todo el material que tuviera contacto con los medios 3.2.5 Establecimiento de los tres paralelos Para la determinación de los parámetros se tomaron muestras diarias de manera estéril y por triplicado. Las metodologías que se siguieron para la determinación de los parámetros se presentan en la sección 3.3.

3.3

MATERIALES Y METODOS

3.3.1 Método Kjeldahl para la determinación de nitrógeno total 3.3.1.1 Fundamento del método En este método la muestra analizada se descompone con ácido sulfúrico concentrado en caliente, para convertir el nitrógeno en ion amonio. Cuando la descomposición se completa, la solución resultante se enfría, se diluye y se alcaliniza con hidróxido de sodio. El amonio liberado se separa por destilación y se recoge en una solución ácida, posteriormente se cuantifica por titulación. El ácido sulfúrico que se utiliza para descomponer la muestra, oxida al carbón e hidrógeno a dióxido de carbono y agua, siendo esta etapa la más crítica en este método. La transformación del nitrógeno depende del estado de combinación en la muestra analizada. 3.3.1.2 Reacciones que se presentan muestra + H2 SO4 + H2O (NH4)2 SO4 + 2 NaOH

(NH4)2 SO4 + CO2

Digestión

2NH3 + Na2 SO4 + 2H2O Destilación

Materiales y métodos

40

2 NH3 + 2H3BO3

2H2BO3- + 2NH4+ Destilado

2H2 BO3- + 2HCL

2H3 BO3 + 2Cl- Titulación

3.3.1.3 Materiales − Sistema de digestión de KJELDAHL − Sistema de destilación simple − Centrífuga HERMLE Z320 − Balón de kjeldahl de 100 ml − Vaso de precipitado de 1000 ml (plásticos) − Probeta de 25 ml ( + 0.5 ml) − Bureta de 10 ml ( + 0.05 ml) − Pipetas de 5 y 10 ml (+ 0.045 - 0.05 ml) respectivamente − Perlas de vidrio − Erlenmeyer de 50 ml − Tubos de ensayo − Tubos para centrífuga − Hielo 3.3.1.4 Reactivos − Acido sulfúrico concentrado r.a − Pastillas catalizadoras de Kjeldahl sin selenio − Indicador Taschiro: Se disuelve 0.1 gramos de azul de metileno en 100 ml de etanol y aparte 0.2 gramos de rojo de metilo en 100 ml de etanol. Se mezclan volúmenes iguales de las dos soluciones − Indicador rojo de metilo − Acido bórico al 4% − Solución de hidróxido de sodio al 60% − Acido clorhídrico 0.1 N − Agua destilada

Materiales y métodos

41

3.3.1.5 Procedimiento Digestión − Tomar una muestra homogenizada de 10 ml del fermento y colocarla en un tubo de ensayo para centrifugarla a 4100 rpm durante 20 minutos. − Una vez centrifugado eliminar el líquido sobrenadante con ayuda de una pipeta de 5 ml. − Llenar el tubo de ensayo con agua destilada y agitar vigorosamente para que el sedimento se separe de la parte inferior del tubo. − Verter esta solución en un balón de Kjeldahl de 100 ml y enjuagar dos veces más el tubo de ensayo con agua destilada, vertiendo el agua de enjuague en el balón de 100 ml. − Adicionar 5 ml de ácido sulfúrico concentrado por las paredes del matraz y un cuarto de catalizador de Kjeldahl sin selenio. − Colocar el balón en un sistema de digestión con extracción de gases e iniciar el calentamiento. La digestión finaliza cuando la muestra en estado líquido adquiere una coloración verde cristalina. − Retirar el balón del sistema de extracción de gases y dejar enfriar. Destilación: − Añadir al balón de Kjeldahl 15 perlas de vidrio y 10 ml de agua destilada, con el fin de enjuagar el balón. − Pasar el contenido del balón de Kjeldahl a un balón de 250 ml, el cual forma parte del sistema de destilación simple. − Enjuagar nuevamente el balón de Kjeldahl con 10 ml de agua destilada y pasar este enjuague al balón de 250 ml. Repetir la operación anterior con cinco ml de agua destilada. − Introducir el balón de 250 ml en un baño con hielo durante diez minutos aproximadamente. Esto evitará que reaccione. − En un erlenmeyer de 50 ml añadir 25 ml de ácido bórico al 4%, una gota de Taschiro, y una gota de rojo de metilo. Este erlenmeyer se coloca en el tubo colector del sistema de destilación simple, cuidando que quede completamente sumergido en la solución, para evitar escapes de ion amonio en el momento de la destilación. − Pasados 10 minutos de enfriamiento y con el sistema de destilación armado, explicado anteriormente, se procede a añadir al balón de destilación, lentamente, 25 ml de hidróxido de sodio al 60%, teniendo presente de introducirlo por las paredes para que no produzca reacción y exista pérdida de ion amonio. Es recomendable enfriar previamente el hidróxido de sodio. Tapar el balón con el tapón de caucho y cerciorase de la inexistencia de escapes.

Materiales y métodos

42

− La destilación termina cuando la solución del matraz de 50 ml vire su color azulado a verde. − Se procede a valorar la solución del matraz recolector de 50 ml con ácido clorhídrico 0.1 N, con un viraje de color verde a azulado. 3.3.2 METODO PARA LA DETERMINACION DE AZUCARES 3.3.2.1 Fundamento del método Los azúcares totales están constituidos por la suma de los azúcares reductores directos, más los procedentes de la hidrólisis de la sacarosa. Esta determinación comprende los siguientes pasos: Neutralización del fermento Clarificación Hidrólisis Determinación de azúcares reductores totales Método colorimétrico: Este método esta basado en la determinación diferencial de la cantidad de cobre no reducido que queda en la solución después de tres minutos de ebullición de una alícuota de la muestra preparada a partir del fermento y un volumen determinado de la solución cuproalcalina. 3.3.2.2 Materiales − Balón aforado de 100 ml (+ 0.1 ml) − Balón aforado de 2000 ml (+ 0.6 ml) − Balón aforado de 1000 ml (+ 0.4 ml) − Balanza analítica METTLER TOLEDO (+ 0.1 mg) − Pipeta volumétrica de 10 ml (+ 0.03 ml) − Vaso de precipitado de 1000 ml − Vaso de precipitado plástico de 1000 ml − Vaso de precipitado de 250 ml − Erlenmeyer de 250 ml − Tubos para reflujo − Tubos para centrífugas. Gradilla − Centrifuga HERMLE Z320 − Embudo de buchner

Materiales y métodos

43

− Papel filtro diámetro de poro de 0.2 µm − Espátula de porcelana − Celdas para espectrofotómetro − Espectrofotómetro SPECTRONIC 20D Milton Roy Company − Mechero − Baño maría 3.3.2.3 Reactivos Solución de azúcar invertido al 1% (1 litro) − Sacarosa pura = 9.5 g − Acido clorhídrico = 5 ml r.a. − Agua destilada = 1000 ml Solución A (1 litro) − Sulfato cúprico puro, 5H2O = 40 gramos − Ácido sulfúrico puro = 2 ml − Agua destilada = 1000 ml Solución B (1 litro) − Tartrato de sodio y potasio tetrahidratado = 200 gramos − Hidróxido de sodio puro = 150 gramos − Agua destilada = 1000 ml Neutralización y clarificación del fermento − Hidróxido de sodio 1N − Solución saturada de acetato neutro de plomo − Oxalato de potasio anhidro 3.3.2.4 Procedimiento Neutralización y clarificación del fermento − Tomar 100 ml del fermento y colocarlo en un vaso de precipitado. − Neutralizar exactamente con solución de NaOH 1N. Para soluciones coloreadas es conveniente utilizar un potenciómetro para controlar la neutralización. − Evaporar al baño maría hasta unos 25 ml. − Dejar enfriar y pasar a un matraz volumétrico de 100 ml.

Materiales y métodos

44

− Agregar por pequeñas porciones, solución de acetato neutro de plomo, hasta que no se observe la formación de más precipitado. − Diluir con agua hasta la marca del matraz, mezclar y dejar en reposo. − Filtrar la parte sobrenadante, utilizar papel y embudos secos (filtrar a vacío). − Agregar por pequeñas porciones, oxalato de potasio anhidro, agitando después de cada adición hasta que no se observe la formación de más precipitado. Volver a filtrar. El filtrado que se obtiene corresponde, volumen a volumen, con el fermento original. Determinación de azúcares − Colocar en un erlenmeyer de 250 ml, 20 ml de la solución preparada para el ensayo, 20 ml de la solución B y 20 ml de la solución A, siguiendo el orden anteriormente establecido. − Hervir la solución exactamente tres minutos bajo reflujo. − Enfriar la solución bajo chorro de agua. − Pasar el sobrenadante de la solución a los tubos para centrífuga y proceder a centrifugar a 4100 rpm durante 20 minutos. − Pasar el sobrenadante de los tubos para centrífuga, a las celdas para espectrofotómetro, teniendo la precaución de no pasar el sedimento a las celdas. − Medir la absorbancia y transmitancia de la solución a 630 nanómetros. − El valor obtenido de absobancia se relaciona con una gráfica de calibración preparada previamente. Calibración del espectrofotómetro − Verificar que el fototubo instalado en el espectrofotómetro corresponda en su rango a la longitud de onda de 630 nanómetros, se debe verificar la presencia del filtro. − Encender el espectrofotómetro por lo menos 30 minutos antes de hacer la primera medición, para lograr que se estabilice. Se ajusta la longitud de onda a 630 nanómetros (botón superior derecho). − Al momento de medir después de los 30 minutos, es necesario ajustar la transmitancia a cero con la cavidad para la celda vacía y cerrada. Para esto se rota el botón inferior izquierdo del espectrofotómetro. − Con una celda que contenga agua destilada, se ajusta el 100% de transmitancia, rotando el botón inferior derecho del espectrofotómetro. Es importante ajustar el cero y el 100% de transmitancia explicado anteriormente, cada vez que se realice la determinación de una muestra, con el fin de minimizar los errores de procedimiento.

Materiales y métodos

45

3.3.3 MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS POR CÁMARA DE RECUENTO Las cámaras de recuento se utilizan para determinar el número de partículas por unidad de volumen en un líquido. Las partículas en este caso levaduras se cuentan visualmente con ayuda de un microscopio. 3.3.3.1 Fundamento del método En un volumen determinado de suspensión, se determina microscópicamente el número de microorganismos vivos y muertos. Los microorganismos móviles deben ser inhibidos con una solución de formaldehído al 40%. Si la población de microorganismos es muy alta, es recomendables diluir la muestra para facilitar el conteo. Existen ciertas limitaciones con el conteo directo al microscopio: − No se distinguen las células vivas de las muertas. − La precisión es difícil de lograr. − Las células pequeñas son difíciles de ver y pueden ser omitidas en el conteo. Descripción y características La placa base de vidrio óptico especial tiene el tamaño de un portaobjetos. Las ranuras fresadas en la superficie de la placa base la dividen en dos zonas anchas exteriores y tres campos pequeños interiores. Los campos exteriores se utilizan para rotulación y no están esmerilados, mientras que los campos interiores se encuentran esmerilados y pulidos. En el campo central están grabadas dos cuadrículas de recuento, que están separadas entre sí por una ranura. El fondo de la cámara del campo central es usualmente 0.1 mm más bajo que ambos campos adyacentes. En el sistema de cámara de recuento Neubauer Improved, la profundidad de la cámara es de 0.1 mm. La cuadrícula de recuento muestra 9 cuadrados grandes, cada uno de 1 mm2. Los cuatro cuadrados grandes de las esquinas, están divididos en 16 cuadrados con aristas de 0.25 mm. El cuadrado grande central está dividido en 25 cuadrados medianos con aristas de 0.2 mm, estando cada cuadrado mediano subdividido en 16 cuadrados pequeños con aristas de 0.05 mm y una superficie de 0.0025 mm2. Los cuadrados medianos presentan en todos los lados líneas límites triples. La línea central es la frontera.

Materiales y métodos

46

3.3.3.2 Materiales − Microscopio de contraste de fases − Cámara de conteo Neubauer Improved − Tubos de ensayo − Pipeta de 10 ml (+0.075 ml) − Pipeta de 1 ml (+0.01 ml) − Goteros 3.3.3.3 Reactivos − Formol − Agua destilada 3.3.3.4 Procedimiento − Se toma 1ml del cultivo en forma aséptica y se diluye a 1x10-1 (9ml de agua destilada y 1 ml del medio fermentado). − Con la ayuda de un gotero, colocar una gota en cada celda de la cámara de conteo Neubauer Improved y cubrir con un cubreobjetos. − Colocar la cámara de conteo en el microscopio y enfocar con el lente de 40X. − Situarse en el cuadro grande central de los 9 cuadrados existentes. − Hacer el conteo de los cinco cuadrados que conforman el cuadrado grande central, preferiblemente en forma diagonal. Cada cuadrado tiene a su vez 16 cuadrados pequeños. − Realizar los cálculos correspondientes, según la siguiente fórmula: NMO = X / (VcxFd) NMO = Número de microorganismos por mililitro X = Promedio del número de microorganismos de los 10 cuadros Vc = Volumen de un cuadrado pequeños de la retícula de la cámara (4x10-6 ml) Fd= Factor de dilución utilizado

Materiales y métodos

47

3.3.4 MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO ALCOHÓLICO DE ETANOL POR OXIDACIÓN QUÍMICA 3.3.4.1 Fundamento del método Por la oxidación del etanol con dicromato potásico en presencia de ácido sulfúrico se obtiene ácido acético. El dicromato en exceso se determina reduciéndolo con una disolución valorada de sulfato ferroso amónico. 3.3.4.2 Reacciones que se presentan K2Cr2O7 + 3C2H5OH + 16H2SO4 Dicromato de Potasio

Etanol

ácido sulfúrico

K2Cr2O7 + 6Fe2+ + 14H+ Dicromato De potasio

4Cr3+ + 3CH3COOH + 11H2O

ión ferroso

ácido acético

2Cr3+ + 6Fe3+ + 7H2O

3.3.4.3 Materiales − Microdestilador − Mechero − Erlenmeyer de 250 ml − Pipeta de 1 ml (+ 0.01 ml) − Buretas de 25 ml (+ 0.1 ml) − Matraz aforado de 1000 ml (+ 0.4 ml) 3.3.4.4 Reactivos − Dicromato de potasio analítico − Ácido sulfúrico concentrado analítico − Sulfato ferroso amónico hexahidratado analítico − Sulfato ferroso heptahidratado analítico − Fenantrolina analítica − Agua destilada

Materiales y métodos

48

3.3.4.5 Procedimiento Preparación de soluciones − Solución de Dicromato de potasio Se añaden 325 ml de ácido sulfúrico concentrado a unos 400 ml de agua destilada. Se mezcla bien y se enfria a 80-90oC y se vierte en un matraz aforado de un litro. Se añaden 33.768 gramos exactamente pesados de dicromato potásico tipo primario y se diluye la solución con agua a 20oC hasta completar volumen. − Solución de sulfato ferroso amónico Se pesan 135. 5 gramos de sulfato ferroso amónico hexahidratado y se diluyen en 500 ml de agua destilada. Se añaden 30 ml de ácido sulfúrico concentrado y se diluye todo a un litro con agua destilada a 20oC en un matraz aforado de 1000 ml. − Indicador Se pesan 0.695 gramos de sulfato ferroso heptahidratado y se colocan en un matraz aforado de 1000 ml. Se agregan 50 ml de agua destilada. Se pesan 1.485 gramos de fenantrolina y se agregan al matraz, completar a volumen con agua destilada. Procedimiento para la microdestilación Se toma un mililitro de la muestra del fermento, se coloca en un matraz de 125 ml y se le adicionan 10 ml de agua destilada. Se efectúa la microdestilación, usando como colector un matraz de 250 ml conteniendo 25 ml de la solución de dicromato. Se destila y se deja ebullir durante 5 minutos a partir del momento que ocurre el cambio de color en la solución de dicromato. Se retira el matraz colector y se le adicionan dos gotas del indicador y se procede a la titulación con la solución de sulfato ferroso amónico. El punto final corresponde al cambio de color de verde-amarillo a verde azulado. Es importante realizar dos determinaciones en blanco ya que el factor de la solución de sulfato ferroso varía lentamente. Para ello se toman 25 ml de la solución de dicromato y se titulan con la solución de sulfato ferroso amónico hasta una coloración verde a la luz del día, se le añaden dos gotas del indicador y se prosigue la valoración hasta un cambio de color a verde azulado. Cálculo de resultados Se calcula el resultado de la siguiente forma: %Em = 25 - 25 x (A/B) %Em: Porcentaje de etanol en la muestra A: Volumen de la solución de sulfato ferroso amónico consumido en la valoración del exceso de dicromato ml. B: Volumen de la solución de sulfato ferroso amónico consumido en la valoración del blanco ml.

Materiales y métodos

49

3.3.5 MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS (MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCHONINICO) Kit Solución de ácido Bicinchonínico para la determinación de proteína total SIGMA C.O. 3.3.5.1 Fundamento del método Las proteínas reducen en medio alcalino el Cu (II) a Cu (I) de forma proporcional a su concentración. El ácido bicinchonínico es un reactivo cromogénico altamente específico para el Cu (I) formando un complejo púrpura con una absorbancia máxima a 562 nm. 3.3.5.2 Materiales − Pipeta graduada de 5 ml (+ 0.045 ml) − Pipeta graduada de 1 ml (+ 0.01 ml) − Balón aforado de 100 ml (+ 0.1 ml) − Espectrofotómetro SPECTRONIC 20D − Celdas para espectrofotómetro − Tubos de ensayo − Gradilla 3.3.5.3 Reactivos − BCA (ácido bicinchonínico) − Sulfato de cobre pentahidratado al 4% − Solución de proteína estándar (Albúmina de suero bovino 1mg/ml) 3.3.5.4 Procedimiento Cualquier cantidad de proteínas puede ser determinado mientras la absorbancia neta a 562 nm caiga dentro de la curva de calibración previamente establecida. − Preparar la cantidad requerida y suficiente, para la determinación por adición de una parte de la solución de sulfato de cobre al 4% a 50 partes de BCA. − Tomar un mililitro de la muestra del fermento, colocarla en un tubo de ensayo y centrifugarla a 4100 rpm durante 20 minutos. − Retirar el sobrenadante y suspender el sedimento en un mililitro de agua destilada. − Cuantitativamente adicionar la cantidad indicada de agua y la muestra de proteína desconocida (sedimento suspendido). Cantidades establecidas en la estandarización.

Materiales y métodos

50

− Adicionar 4 ml del reactivo solución BCA-Sulfato de cobre preparado anteriormente y haga vortex. − Incube los tubos a 37oC por 30 minutos. − Sacar los tubos y dejarlos reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos exactamente. Determinar la absorbancia en el espectrofotómetro pasando el contenido de los tubos a las celdas para su determinación y compare frente agua destilada. − Restar la absorbancia del blanco de la neta obtenida en los tubos con proteína. − Graficar la absorbancia neta frente a la concentración de proteína conocida, (proteína estándar: albúmina de suero bovino).

CAPITULO 4

PRESENTACION DE RESULTADOS

En este capítulo se presentan los resultados obtenidos en los ensayos realizados para la determinación de los parámetros estudiados. En primer lugar se presentarán los resultados obtenidos en la estandarización y adecuación de las normas, con las curvas de calibración para los métodos que los requieran y posteriormente los resultados obtenidos en la determinación de los parámetros para cada uno de los cultivos.

4.1 CURVAS DE CALIBRACIÓN 4.1.1 Curva de calibración para el método de determinación de azúcares Gráfica de calibración: Esta gráfica debe establecerse para cada operador. Procedimiento. Sección materiales y métodos 3.3.2.4 − Disolver la sacarosa pura y seca en 100 ml de agua destilada. − Agregar 5 ml de ácido clorhídrico. − Calentar al baño maría de modo que la temperatura de la solución se mantenga a 60oC por 15 minutos. − Pasar a un matraz aforado de 1000 ml y completar a la marca con agua destilada. 1 ml de la solución corresponde a 0.01 gramos de azúcar invertido. Cuando se tiene la solución patrón preparada se toman diluciones de 0%, 0.05%,0.1%, 0.15%, 0.20%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45% y 0.5%. La determinación de la curva de calibración, se realiza siguiendo el procedimiento descrito en el numeral 3.3.2.4 para el método colorimétrico. Cada determinación se realiza por triplicado para cada una de las concentraciones. El rango comprendido entre 0 y 0.5 %, presenta la mayor linealidad con un coeficiente de correlación de 0.998 y una función lineal Y = 1.685 - 2.811X. La curva de calibración para la determinación de azúcares se presenta en la gráfica 4.1 y sobre ella se determinaron las concentraciones de las muestras tomadas de los cultivos. 50

Presentación de resultados

51

GRÁFICA 4.1 CURVA DE CALIBRACIÓN AZÚCARES COEFICIENTE DE CORRELACIÓN 0.998 1.8 1.6

ABSORBANCIA

1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

% AZÚCAR FUENTE: Autor

4.1.2 Curva de calibración método Kjeldahl El método Kjeldahl consta de tres partes: digestión, destilación y la titulación. Cada una de estas partes puede dar origen a errores en la metodología. Con el fin de determinar los errores, se realizó una curva de calibración general (digestión + destilación) y una curva de calibración para la destilación de manera separada. Cada determinación se realizó por triplicado. ❏

Curva de calibración para la destilación.

Para la realización de la curva de destilación se utilizaron diferentes pesos de sulfato de amonio. Las pruebas se efectuaron siguiendo el procedimiento descrito en el numeral 3.3.1.5, omitiendo el procedimiento correspondiente a la digestión. El error de exactitud promedio de los datos es del 5.9%. presentan en la tabla 4.1.

Los datos obtenidos se

La curva de calibración muestra los datos teóricos y experimentales, relacionando el peso de la solución de sulfato de amonio con el nitrógeno teórico y el nitrógeno valorado o experimental. La curva de calibración se muestra en la gráfica 4.2.

Presentación de resultados

52

Cálculos efectuados: − Nitrógeno recuperado − Nr = (Vac x Nac) / 71.43 Nr = Nitrógeno recuperado gramos Nac= Normalidad del HCl 0.1218 N Vac = Volumen de HCl gastado en la titulación ml Factor calculado a partir de la estequiometría de la reacción 71.43 − Porcentaje de recuperación de nitrógeno %Rn = Nr / (Vsa x Cnsa) x 100 % Rn = Porcentaje de recuperación de nitrógeno Nr = Nitrógeno recuperado gramos Vsa = Volumen de la solución de sulfato de amonio ml Cnsa = Concentración de nitrógeno en la solución de sulfato de amonio 0.0006363 g de nitrógeno/ml − % de error de exactitud %Ee = I(Nt - Nr)I / Nt x 100 %Ee = Porcentaje de error de exactitud Nt = Nitrógeno teórico en el volumen de la solución de sulfato de amonio (Vsa x Cnsa) gramos Nr = Nitrógeno recuperado gramos Tabla 4.1 Datos de calibración método Kjeldahl destilación ml sulfato de amonio

Gramos sulfato de amonio

ml gastados de HCl 0.1218 N

Gramos de nitrógeno presente en la muestra

Gramos de nitrógeno recuperado

%

%

Error de exactitud

de recuperado

4

0.012

1.40

0.00254

0.00239

5.9

94.1

8

0.024

2.80

0.00509

0.00478

6.1

93.9

12

0.036

4.27

0.00764

0.00728

4.7

95.3

13

0.039

4.50

0.00827

0.00768

7.1

90.5

16

0.048

5.40

0.01018

0.00921

9.5

93.1

18

0.054

6.25

0.01145

0.01066

6.9

98.7

20

0.060

6.60

0.01273

0.01257

1.2

92.8

5.9

94.1

Promedio FUENTE: Autor

Presentación de resultados

53

El error de exactitud obtenido para la destilación fue del 5.9%, con un porcentaje de recuperación del 94.1%. GRÁFICA 4.2 CURVA DE CALIBRACIÓN MÉTODO KJELDAHL DESTILACIÓN

NITRÓGENO gramos

0.014 0.012 0.01 0.008 0.006 0.004 0.002 0 0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

SULFATO DE AMONIO gramos Teórica

Experimental

FUENTE: Autor ❏

Curva de calibración general (digestión + destilación).

Para la construcción de la curva de calibración general se utilizaron diferentes pesos de urea pura y seca, como fuente de nitrógeno (patrón). Los ensayos se efectúan siguiendo el procedimiento descrito en el numeral 3.3.1.5, pesando las muestras de urea en papel de arroz. El error de exactitud total promedio de los datos obtenidos es del 6.5%, con un porcentaje promedio de recuperación de nitrógeno del 94%. Los datos se presentan en la tabla 4.2. En la gráfica 4.3 se establece la curva de calibración general para el método Kjeldahl, esta gráfica relaciona los pesos de urea con el nitrógeno teórico y el nitrógeno experimental o recuperado. Error total = error de digestión + error de destilación 6.5% 0.6% 5.9% El error de titulación se obtiene calculando el peso de nitrógeno contenido en una gota de HCl al realizar la titulación, de la siguiente forma: Volumen de 1 gota = 0.45 ml/10gotas= 0.045 ml/gota N = (0.045 ml de HCl x 0.12 18 N)/71.43 = 7.6x10-5 gramos de nitrógeno por gota Para calcular el error de exactitud de titulación, se tomaron los gramos de nitrógeno teórico calculados en la tabla 4.2 y se le sumaron y restaron los gramos de nitrógeno correspondientes a una gota de HCl, de esta manera se determinó el error por exceso o defecto. El error de titulación puede establecerse por una gota, ya que ésta marcaba el

Presentación de resultados

54

cambio definido del color por exceso o defecto. El porcentaje de error de exactitud se calculó utilizando la ecuación descrita en el numeral 4.1.2. Error de titulación 1.0%. El error de titulación forma parte del error de destilación calculado en 5.9%. Tabla 4.2 Datos calibración método Kjeldahl Gramos urea pesada

ml gastados de HCl 0.1218N

Gramos de nitrógeno teórico

Gramos de nitrógeno valorado

% error de exactitud

% de recuperación

0.0532

14.17

0.0248

0.0242

2.4

97.5

0.0427

10.80

0.0199

0.0184

7.5

92.5

0.0325

7.95

0.0151

0.0136

9.9

90.1

0.0216

5.60

0.0100

0.0096

4.0

96.0

0.0172

4.50

0.0080

0.0078

2.5

97.5

0.0106

2.40

0.0047

0.0041

12.8

87.2

0.0060

1.60

0.0028

0.0027

3.5

96.4

0.0024

0.60

0.0011

0.0010

9.1

90.9

0.0011

0.30

0.0005

0.0005

0.0

97.5

6.5

94.0

Promedio FUENTE: Autor

GRÁFICA 4.3 CURVA DE CALIBRACIÓN MÉTODO KJELDAHL

NITRÓGENO gramos

0 .0 3 0 0 .0 2 5 0 .0 2 0 0 .0 1 5 0 .0 1 0 0 .0 0 5 0 .0 0 0 0

0 .0 1

0 .0 2

0 .0 3

0 .0 4

U R E A g ra m o s C u rv a te ó ric a

FUENTE: Autor

C u rv a e x p e rim e n ta l

0 .0 5

0 .0 6

Presentación de resultados

55

Cálculos efectuados: − Nitrógeno recuperado Nr = (Vac x Nac) / 71.43 Nr = Nitrógeno recuperado gramos Vac = Volumen de HCl gastado en la titulación ml Nac = Normalidad del HCl 0.1218N Factor calculado a partir de la estequiometría de la reacción 71.43 − Porcentaje de recuperación de nitrógeno % Rn = Nr / (Wu x 0.4662) x 100 % Rn = Porcentaje de recuperación de nitrógeno Nr = Nitrógeno recuperado gramos Wu = Peso medido de urea Fracción de nitrógeno contenida en la urea 0.4662 4.1.3 Curva de calibración método para la determinación del contenido alcohólico de etanol por oxidación química Para construir la curva de calibración se prepararon soluciones de diferentes concentraciones de etanol, a partir de un patrón de etanol al 99.5% v/v. La siguiente tabla muestra los volúmenes tomados de etanol para las diferentes concentraciones. Para ello se tomaron las cantidades indicadas en la tabla y se llevaron a volumen utilizando balones aforados de 100 ml. Tabla 4.3 Volumen tomado de etanol 99.5% para la curva de calibración CONCENTRACIÓN REAL DE ETANOL (v/v)

VOLUMEN DE ETANOL 99.5% (v/v)

0

0.00

2

2.01

4

4.02

6

6.03

8

8.04

10

10.05

12

12.06

FUENTE: Autor

Presentación de resultados

56

Los ensayos se realizaron siguiendo el procedimiento descrito en el numeral 3.3.4.5. Los datos obtenidos se presentan en la tabla 4.4. El error de exactitud promedio de los datos es del 2.8%. La curva de calibración relaciona la concentración real de la solución de etanol con la concentración valorada de las soluciones preparadas a partir del patrón de etanol al 99.5% v/v. La curva de calibración se presenta en la gráfica 4.4. Tabla 4.4 Datos curva de calibración contenido alcohólico CONCENTRACIÓN REAL DE ETANOL %

CONCENTRACIÓN VALORADA DE ETANOL %

% ERROR DE EXACTITUD

0

0.0

0.0

2

1.9

5.0

4

3.8

5.0

6

5.9

1.7

8

7.9

1.2

10

9.8

2.0

12

11.8

1.7

Promedio

2.8

FUENTE: Autor

GRÁFICA 4.4 CURVA DE CALIBRACIÓN MÉTODO CONTENIDO ALCOHÓLICO DE ETANOL 14

%ETANOL v/v

12 10 8 6 4 2 0 0

2

4

6

8

10

%E T AN O L v/v S o lució n p atró n T eórica

FUENTE: Autor

E x perim ental

12

14

Presentación de resultados

57

Cálculos efectuados: − Porcentaje de etanol en la muestra %Em = 25 - 25 x (A/B) %Em = Porcentaje de etanol en la muestra v/v A = Volumen de la solución de sulfato ferroso amónico consumido en la valoración del exceso de dicromato ml B = Volumen de la solución de sulfato ferroso amónico consumido en la valoración del blanco ml − % Error de exactitud %Ee = I %Et - %Ev / Et I x 100 %Ee = Porcentaje de error de exactitud % v/v Et = Concentración real de la solución de etanol %v/v Ev = Concentración obtenida a partir de la valoración de la solución de etanol %v/v 4.1.4 Curva de calibración método para la determinación de proteínas (método del ácido bicinchonínico ). Para la realización de la curva de calibración se utilizó como solución patrón albúmina de suero bovino (BSA) 1mg/ml. Los ensayos se efectuaron siguiendo el procedimiento descrito en el numeral 3.3.5.4. Las cantidades establecidas para el reactivo utilizado en la determinación de proteína (ácido bicinchonínico (BCA) + sulfato de cobre), el patrón de proteína (albúmina de suero bovino BSA) y el agua destilada se presentan en la tabla 4.5. Tabla 4.5 Cantidades utilizadas para la estandarización del método de proteína TUBO

AGUA ml

PROTEÍNA ESTANDAR BSA ml

REACTIVO DE PROTEÍNA ml

1

0.25

0.00

4.0

2

0.20

0.05

4.0

3

0.15

0.10

4.0

4

0.10

0.15

4.0

5

0.05

0.20

4.0

6

0.00

0.25

4.0

FUENTE: Autor

La celda utilizada para medir la absorbancia en el espectrofotómetro tiene un volumen mínimo aproximado de medida de 4.25 ml, por esta razón se utilizan las cantidades de

Presentación de resultados

58

agua y reactivo de proteína establecidas en la tabla anterior. Todos los ensayos se realizaron por duplicado. En la tabla 4.6 se presentan los datos obtenidos para la curva de calibración del método del ácido bicinchonínico para la determinación de proteínas. Tabla 4.6 Datos curva de calibración método ácido bicinchoniníco CONCENTRACIÓN mg/ml

ABSORBANCIA

0.00

0.068

0.05

0.210

0.10

0.385

0.15

0.574

0.20

0.794

0.25

0.989

FUENTE: Autor

Los datos de absorbancia fueron restados del blanco 0.068. El coeficiente de correlación de los datos obtenidos es de 0.997. La función lineal de los datos se ajusta a la siguiente ecuación Y = 3.576 x 10 -2 + 3.741 X. La curva de calibración relaciona la aborbancia con la concentración de proteína, esta curva se presenta en la gráfica 4.5. GRÁFICA 4.5 CURVA DE CALIBRACIÓN MÉTODO ÁCIDO BICINCHONÍNICO 1.20

ABSORBANCIA

1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 0.00

0.05

0.10

0.15

PROTEÍNA mg FUENTE: Autor

0.20

0.25

0.30

Presentación de resultados

59

4.2 PRUEBAS PRELIMINARES Las pruebas preliminares se realizaron con el fin de determinar el tiempo que toma el cultivo para entrar a la fase estacionaria y así establecer la toma de muestra para inocular los subcultivos. Con estas pruebas también se determinó el tiempo para la toma de muestras necesarias para determinar las variables antes mencionadas. Para estas pruebas se utilizó un cultivo iniciador o madre, el cual guarda las mismas condiciones de fermentación (pH, composición del medio de cultivo y temperatura), que los medios preparados posteriormente para el estudio. Analizando la curva de crecimiento del cultivo iniciador se pudo establecer la toma de muestra para el inóculo aproximadamente en el sexto día de la fermentación (fase estacionaria temprana). Para inocular los medios se utilizó levadura en fase estacionaria temprana, ya que en este punto se tiene la certeza de utilizar una muestra de levadura viable, al utilizar una muestra en fase estacionaria más avanzada se puede correr el riesgo de tomar células muertas o que presenten algún tipo de degeneración, causada posiblemente por el agotamiento del sustrato entre otros factores. La toma de muestras para la determinación de las variables estudiadas se realizó diariamente, estableciéndose el tiempo de fermentación de 14 días aproximadamente. El crecimiento máximo alcanzado como límite superior fue de 3.9x108 cel/ml. GRÁFICA 4.6 CURVA DE CRECIMIENTO PRELIMINAR

CEL/ml

1.0E+09

1.0E+08 0

50

100

150

200

TIEMPO (Horas) FUENTE: Autor

250

300

350

Presentación de resultados

60

4.3 SUBCULTIVOS En esta sección se presentan los resultados obtenidos para el cultivo 1 (iniciador) y los cuatro subcultivos posteriores. Como se mencionó anteriormente los parámetros que fueron determinados se pueden clasificar de la siguiente manera de acuerdo a la fase del cultivo: Parámetros iniciales − Número de microorganismos − Nitrógeno total − Contenido de proteína − Sólidos solubles totales Parámetros en función del tiempo − Número de microorganismos − Nitrógeno total − Contenido de proteína − Sólidos solubles totales Parámetros finales − Nitrógeno final en la biomasa − Contenido de proteína en la biomasa − Sólidos solubles totales − Azúcar residual − Alcohol final − Nitrógeno final en el medio − Contenido de proteína del medio

Presentación de resultados

61

4.3.1 Resultados cultivo 1 Los resultados obtenidos para el cultivo 1 (iniciador ) se presentan en la tabla 4.7. Tabla 4.7 Resultados obtenidos para el cultivo 1 PARÁMETROS

INICIAL

FINAL

CONTEO DE M.O CEL/ml

4.5X107-3.7X107

3.2X108-3.0X108

NITRÓGENO TOTAL mg/ml

0.04-0.03

0.32-0.28

PROTEÍNA mg/ml

0.925-0.845

1.401-1.332

SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES °brix

19.8-19.8

6.5-6.4

AZÚCAR RESIDUAL mg/ml

226

0.000

ALCOHOL FINAL %ETANOL

0.0

12.1-11.5

FUENTE: Autor

Conteo de microorganismos máximo alcanzado =3.5x108-3.0x108 cel/ml Contenido de nitrógeno máximo alcanzado = 0.32-0.28 mg/ml Contenido de proteína máximo alcanzado = 1.767-1.709 mg/ml Tasa de crecimiento 6.3x106-5.6x106 levaduras/hora Para el cultivo 1 no se tiene muestra correspondiente al conteo de microorganismos para el segundo día de fermentación. Se estima que el conteo de microorganismos para el segundo día de fermentación es de 3.0x108 cel/ml. Se llegó a este valor analizando gráficamente la tendencia presentada por los otros cultivos en el conteo de microorganismos para el segundo día de fermentación, estos cultivos presentaron valores comprendidos entre 3.2x108-3.0x108 cel/ml.

Presentación de resultados

62

GRÁFICA 4.7 CONTEO DE MICROORGANISMOS-CONTENIDO DE NITRÓGENO EN FUNCIÓN DEL TIEMPO CULTIVO 1 1.0E+09

1.0E+08

CEL/ml

0.32

0.22 1.0E+07 0.12

1.0E+06

NITRÓGENO mg/ml

0.42

0.02 0

2

4

6

8

10

12

14

16

TIEMPO (Días) Conteo de M.O

Contenido de nitrógeno

FUENTE: Autor

GRÁFICA 4.8 CONTENIDO DE PROTEÍNA-SÓLIDOS SOLUBLES EN FUNCIÓN DEL TIEMPO CULTIVO 1 1.8

PROTEÍNA mg/ml

20.0

1.4 1.2

15.0

1 0.8

10.0

0.6 0.4

5.0

0.2 0

0.0 0

2

4

6

8

10

12

TIEMPO (Días) Contenido de proteína

Sólidos solubles

14

16

SÓLIDOS SOLUBLES °brix

25.0

1.6

Presentación de resultados

63

FUENTE: Autor

4.3.2 Resultados cultivo 2 Los resultados obtenidos para el cultivo 2 se presentan en la tabla 4.8. Tabla 4.8 Resultados obtenidos para el cultivo 2 PARÁMETROS

INICIAL

FINAL

CONTEO DE M.O CEL/ml

1.4x106-1.2x106

3.9x108-3.2x108

NITRÓGENO TOTAL mg/ml

0.023-0.021

0.26-0.23

PROTEÍNA mg/ml

0.699-0.619

1.722-1.270

SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES °brix

19.5-19.5

6.3-6.3

AZÚCAR RESIDUAL mg/ml

226

0.96-0.88

ALCOHOL FINAL %ETANOL

0.0

11.0-10.4

FUENTE: Autor

Conteo de microorganismos máxima alcanzado = 3.9x108-3.2x108 cel/ml Contenido de nitrógeno máximo alcanzado = 0.28-0.25 mg/ml Contenido de proteína máximo alcanzado = 1.722-1.278 mg/ml Tasa de crecimiento = 6.7x106-4.2x106 levaduras/hora

Presentación de resultados

64

GRÁFICA 4.9 CONTEO DE MICROORGANISMOS-CONTENIDO DE NITRÓGENO EN FUNCIÓN DEL TIEMPO CULTIVO 2 1.0E+09

1.0E+08

CEL/ml

0.32

0.22 1.0E+07

0.12

1.0E+06

NITRÓGENO mg/ml

0.42

0.02 0

2

4

6

8

10

12

14

16

TIEMPO (Días) Conteo de M.O

Contenido de nitrógeno

FUENTE: Autor

GRÁFICA 4.10 CONTENIDO DE PROTEÍNA-SÓLIDOS SOLUBLES EN FUNCIÓN DEL TIEMPO CULTIVO 2

PROTEÍNA mg/ml

1.6 20.0

1.4 1.2

15.0

1 0.8

10.0

0.6 0.4

5.0

0.2 0

0.0 0

2

4

6

8

10

12

TIEMPO (días) Contenido de proteína

Sólidos solubles

14

16

SÓLIDOS SOLUBLES °brix

25.0

1.8

Presentación de resultados

65

FUENTE: Autor

4.3.3 Resultados cultivo 3 Los resultados obtenidos para el cultivo 3 se presentan en la tabla 4.9. Tabla 4.9 Resultados obtenidos para el cultivo 3 PARÁMETROS

INICIAL

FINAL

CONTEO DE M.O CEL/ml

1.4x106-1.3x106

3.5X108-2.5X108

NITRÓGENO TOTAl mg/ml

0.023-0.021

0.26-0.23

PROTEÍNA mg/ml

0.623-0.601

1.722-1.423

SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES °brix

19.5-19.5

6.4-6.3

AZÚCAR RESIDUAL mg/ml

226

1.49-1.45

ALCOHOL FINAL %ETANOL

0.0

11.7-11.1

FUENTE: Autor

Conteo de microorganismos máximo alcanzado = 3.9x108-3.2x108 cel/ml Contenido de nitrógeno máximo alcanzado = 0.27-0.24 mg/ml Contenido de proteína máximo alcanzado = 1.818-1.599 mg/ml Tasa de crecimiento = 6.7x106-4.2x106 levaduras/hora

Presentación de resultados

66

GRÁFICA 4.11 CONTEO DE MICROORGANISMOS-CONTENIDO DE NITRÓGENO EN FUNCIÓN DEL TIEMPO CULTIVO 3 1.0E+09

1.0E+08

CEL/ml

0.32

0.22 1.0E+07 0.12

1.0E+06

NITRÓGENO mg/ml

0.42

0.02 0

2

4

6

8

10

12

14

16

TIEMPO (Días) Conteo de M.O

Contenido de nitrógeno

FUENTE: Autor

GRÁFICA 4.12 CONTENIDO DE PROTEÍNA-SÓLIDOS SOLUBLES EN FUNCIÓN DEL TIEMPO CULTIVO 3

PROTEÍNA mg/ml

1.6 20.0

1.4 1.2

15.0

1 0.8

10.0

0.6 0.4

5.0

0.2 0

0.0 0

2

4

6

8

10

TIEMPO (Días) Contenido de proteína

FUENTE: Autor

sólidos solubles

12

14

16

SÓLIDOS SOLUBLES °brix

25.0

1.8

Presentación de resultados

67

4.3.4 Resultados cultivo 4 Los resultados obtenidos para el cultivo 4 se presentan en la tabla 4.10. Tabla 4.10 Resultados obtenidos para el cultivo 4 PARÁMETROS

INICIAL

FINAL

CONTEO DE M.O CEL/ml

1.5x106-1.3x106

3.6X108-3.2X108

NITRÓGENO TOTAL mg/ml

0.04-0.03

0.27-0.24

PROTEÍNA mg/ml

0.807-0.714

1.484-1.281

SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES °brix

19.5-19.5

7.9-6.7

AZÚCAR RESIDUAL mg/ml

226

4.710-4.710

ALCOHOL FINAL %ETANOL

0.0

9.8-9.2

FUENTE: Autor

Conteo de microorganismos máximo alcanzado = 3.8x108-2.9x108 cel/ml Contenido de nitrógeno máximo alcanzado = 0.28-0.24 mg/ml Contenido de proteína máximo alcanzado = 1.856-1.09 mg/ml Tasa de crecimiento = 7.0x106-4.3x106 levaduras/hora

Presentación de resultados

68

GRÁFICA 4.13 CONTEO DE MICROORGANISMOS-CONTENIDO DE NITRÓGENO EN FUNCIÓN DEL TIEMPO CULTIVO 4

0.42 1.0E+08

CEL/ml

0.32

0.22 1.0E+07 0.12

1.0E+06

NITRÓGENO mg/ml

1.0E+09

0.02 0

2

4

6

8

10

12

14

16

TIEMPO (Dïas) Conteo de M.O

Contenido de nitrógeno

FUENTE: Autor

GRÁFICA 4.14 CONTENIDO DE PROTEÍNA-SÓLIDOS SOLUBLES EN FUNCIÓN DEL TIEMPO CULTIVO 4

20.0

1.4 1.2

15.0

1 0.8

10.0

0.6 0.4

5.0

0.2 0

0.0 0

2

4

6

8

10

12

14

T IE M P O (D ía s ) C on tenido d e proteína

FUENTE: Autor

S ólido s solu bles

16

°brix

PROTEÍNA mg/ml

1.6

SÓLIDOS SOLUBLES

25.0

1.8

Presentación de resultados

69

4.3.5 Resultados cultivo 5 Tabla 4.11 Resultados obtenidos para el cultivo 5 PARÁMETROS

INICIAL

FINAL

CONTEO DE M.O CEL/ml

1.5x106-1.3x106

4.3x108-3.4x108

NITRÓGENO TOTAL mg/ml

0.07-0.06

0.31-0.27

PROTEÍNA mg/ml

0.496-0.451

1.567-1.487

SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES °brix

19.5-19.5

6.0-6.0

AZÚCAR RESIDUAL mg/ml

226

0.000

ALCOHOL FINAL mg/ml

0.0

11.9-11.3

FUENTE: Autor

Conteo de microorganismo máximo alcanzado = 4.4x108-3.5x108 cel/ml Contenido de nitrógeno máximo alcanzado = 0.33-0.29 mg/ml Contenido de proteína máximo alcanzado = 1.706-1.626 mg/ml Tasa de crecimiento = 7.0x106-5.0x106 levaduras/hora

Presentación de resultados

70

GRÁFICA 4.15 CONTEO DE MICROORGANISMOS-CONTENIDO DE NITRÓGENO EN FUNCIÓN DEL TIEMPO CULTIVO 5

0.42 1.0E+08

CEL/ml

0.32

0.22 1.0E+07 0.12

1.0E+06

NITRÓGENO mg/ml

1.0E+09

0.02 0

2

4

6

8

10

12

14

16

TIEMPO (Días) Conteo de M.O

Contenido de nitrógeno

FUENTE: Autor

GRÁFICA 4.16 CONTENIDO DE PROTEÍNA-SÓLIDOS SOLUBLES EN FUNCIÓN DEL TIEMPO CULTIVO 5

PROTEÍNA mg/ml

1.6 20.0

1.4 1.2

15.0

1.0 0.8

10.0

0.6 0.4

5.0

0.2 0.0

0.0 0

2

4

6

8

10

TIEMPO (Días) Contenido de proteína

Sólidos solubles

12

14

16

SÓLIDOS SOLUBLES °brix

25.0

1.8

Presentación de resultados

71

FUENTE: Auto

4.3.6 Resultados nitrógeno por célula - proteína por célula cultivos En las siguientes tablas se muestran los resultados obtenidos para los cultivos, al calcular los porcentajes de nitrógeno/célula y proteína/célula. Tabla 4.12 Relación nitrógeno/célula y proteína/célula cultivo 1 DÍA

NITRÓGENO/CEL %

0

8.3-6.8

1

6.0-5.1

PROTEÍNA/CEL %

4 5

10.2-7.9

56.1-43.2

6

8.8-7.6

49.9-42.8

8

9.9-9.2

54.7-51.3

11

10.9-9.6

55.2-48.3

14

10.2-9.6

46.5-43.6

PROMEDIO

9.2-8.0

52.5-45.8

FUENTE: Autor Muestras perdidas

Tabla 4.13 Relación nitrógeno/célula y proteína/célula cultivo 2

DÍA

NITRÓGENO/CEL %

PROTEÍNA/CEL %

2

8.2-6.3

55.1-42.4

5

9.4-6.4

65.2-44.6

7

7.4-6.8

50.9-46.7

8

7.8-7.4

49.4-46.7

9

8.6-7.9

12

7.8-6.7

51.2-43.9

14

8.0-6.5

47.8-39.2

PROMEDIO

8.2-6.9

53.3-43.9

FUENTE: Autor

Presentación de resultados

72

Tabla 4.14 Relación nitrógeno/célula y proteína/célula cultivo 3 DÍA

NITRÓGENO/CEL %

PROTEÍNA/CEL %

2

7.8-6.9

54.5-47.2

5

7.3-6.9

49.7-47.6

7

8.0-6.5

53.6-44.7

9

8.0-7.1

49.1-45.9

12

7.1-6.5

51.9-48.4

15

9.8-6.8

63.9-45.2

PROMEDIO

8.3-6.7

53.8-46.5

FUENTE: Autor

Tabla 4.15 Relación nitrógeno/célula y proteína/célula cultivo 4 DÍA

NITRÓGENO/CEL %

PROTEÍNA/CEL %

2

9.8-7.6

54.1-43.2

5

9.1-7.0

49.6-38.8

8

7.8-7.2

44.5-40.7

9

8.6-7.8

45.4-40.6

13

8.6-7.2

45.7-38.1

14

11.0-8.8

56.5-46.2

PROMEDIO

9.1-7.6

49.3-41.3

FUENTE: Autor

Presentación de resultados

73

Tabla 4.16 Relación nitrógeno/célula y proteína/célula cultivo 5 DÍA

NITRÓGENO/CEL %

PROTEÍNA/CEL %

2

8.5-7.6

52.5-46.6

5

10.0-8.3

50.0-41.2

6

9.6-8.3

49.0-42.3

7

8.7-7.8

46.1-41.1

12

8.7-7.0

48.4-38.2

13

9.6-8.5

50.6-45.0

14

9.0-7.1

45.8-36.6

PROMEDIO

9.2-7.8

48.9-41.6

FUENTE: Autor

4.3.7 Balance general de la glucosa fermentada Cálculos efectuados: Para 1 ml de fermento Azúcar consumida en la fermentación: − Gramos de alcohol producidos. Porcentaje de alcohol (v/v)

Mililitros de alcohol

Porcentaje de alcohol (v/v) / 100 ml de fermento = ml de alcohol / ml de fermento (ml de alcohol x densidad del alcohol) = Gramos de alcohol Densidad del alcohol a 20 oC = 0.8 g/ml Ejemplo: Alcohol 12.1% (v/v)

12.1 /100 = 0.121 ml de alcohol en 1 ml fermento.

0.121 ml de alcohol x (0.8 g/ml) = 0.096 gramos de alcohol − Gramos de glucosa consumida en la fermentación: GG = GA x 1.956 GG = Glucosa consumida en la fermentación en gramos GA = Alcohol producido en gramos

Presentación de resultados

74

Factor de relación estequiométrica glucosa : etanol = 1.956 Azúcar transformada en biomasa: − Peso de una levadura = CI / MO CI = cantidad inoculada en gramos (0.0004 g/ml) (levadura seca) MO = Conteo de microorganismos el día cero (4.08x107 cel/ml) − Gramos de carbono por levadura CL = Peso de 1 levadura x 0.45 CL = Gramos de carbono por levadura 0.45 = contenido de carbono por levadura (g/g) − Contenido de carbono en la glucosa (46.67%) AB = ( CMO x CL ) / 0.4667 AB = Azúcar transformada en biomasa CMO = conteo de microorganismos Cel/ml CL = Gramos de carbono por levadura El azúcar transformado en biomasa se calcula al final y al inicio de la fermentación, obteniéndose por diferencia de los valores final e inicial. AB total = AB final - AB inicial Azúcar no fermentada: El azúcar no fermentado se determinó por medio del azúcar residual obtenido al final de cada fermentación (método para la determinación de azúcares residuales finales). Azúcar consumida en la respiración: Se determinó por medio de la siguiente expresión: Azúcar total adicionada al medio = Azúcar consumida en respiración y productos secundarios + azúcar consumida en la fermentación + azúcar no fermentada + azúcar transformada en biomasa.

Presentación de resultados

75

Tabla 4.17 Balance de la glucosa fermentada cultivos (g/ml)

CULTIVO 1

CULTIVO 2

CULTIVO 3

CULTIVO 4

CULTIVO 5

0.226

0.226

0.226

0.226

0.226

0.097-0.092

0.088-0.083

0.094-0.089

0.078-0.074

0.095-0.090

Azúcar 0.190-0.180 fermentada g

0.172-0.163

0.183-0.174

0.153-0.144

0.186-0.177

0.00360.0030

0.00330.0030

0.00350.0029

0.00400.0032

0.049-0.059

0.038-0.048

0.065-0.074

0.036-0.046

0.000960.00088

0.001490.00145

0.004710.00471

0.00

Azúcar adicionada al medio g

Alcohol producido g

Azúcar transformada en biomasa g

0.00260.0025

Azúcar consumida 0.033-0.043 en respiración y productos secundarios g

Azúcar no consumida g FUENTE: Autor

0.00

Presentación de resultados

76

GRÁFICA 4.17 CONTENIDO ALCOHÓLICO EXPRESADO COMO % DE ETANOL CULTIVOS 14.0 12.1

% ETANOL (v/v)

12.0

11.5

11.9

11.7 11.0

11.1

10.4

9.8

10.0

11.3

9.2

8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 1

2

3

4

5

CULTIVOS Rango superior

Rango inferior

FUENTE: Autor

En la gráfica 4.17 se presenta los niveles de alcohol obtenidos en los cinco cultivos. Los datos obtenidos se presentan en rangos, superior e inferior, con el propósito de mostrar diferencias en el contenido alcohólico alcanzado en los cultivos.

CAPÍTULO 5

DISCUSIÓN Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

En este capítulo se presenta la discusión de los resultados obtenidos para cada uno de los parámetros estudiados, con el propósito de facilitar el análisis y la discusión de los resultados, estos serán acompañados con resúmenes gráficos y tabulados.

5.1 CURVA DE CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS En esta sección se analizarán las curvas de crecimiento determinadas para el cultivo 1 o iniciador y los cuatro subcultivos posteriores. 5.1.1 Curva de crecimiento por conteo de microorganismos. Al analizar las curvas de crecimiento para cada uno de los cultivos, podemos observar que el conteo total de microorganismos se encuentra dentro del siguiente rango (4.3x108-2.5x108) células por mililitro, tomado como el conteo máximo y mínimo alcanzado. Todos los cultivos presentaron el mismo conteo máximo de crecimiento de La tabla 5.1 microorganismos entre los siguientes rangos 4.4x108-2.9x108 cel/ml. muestra los rangos del conteo de microorganismos inicial y final para los cultivos. El inóculo utilizado para el cultivo 1 proviene de un cultivo starter. Este cultivo starter se activó utilizando como sustrato energético la sacarosa (descrito en la sección 3.2.3), que fue el mismo sustrato energético utilizado para el cultivo 1 y los demás subcultivos (cultivos 2, 3, 4 y 5). Por esta razón la levadura inoculada en el cultivo 1 presenta de manera inmediata la fase de crecimiento exponencial con un conteo de microorganismos inicial superior al registrado por los otros cultivos. El inóculo utilizado para los otros cultivos 2, 3, 4 y 5, proviene de un cultivo en crecimiento, en su fase estacionaria temprana y tomado de un "pase anterior". Los cultivos 2, 3, 4 y 5 iniciaron aproximadamente con el mismo conteo de levaduras 1.5x106-1.2x106 cel/ml. Todos los cultivos presentaron una misma tasa de crecimiento registrada dentro de los siguientes rangos 7.0 x106-4.2 x106 levaduras/hora.

77

Discusión y análisis de resultados

78

Tabla 5.1 Conteo inicial-final de levaduras cultivos CULTIVO

RANGO INICIAL cel/ml

RANGO FINAL cel/ml

1

4.5x107-3.7x107

3.2X108-3.0x108

2

1.4X106-1.2X106

3.9X108-3.2x108

3

1.4X106-1.3X106

3.6X108-2.5x108

4

1.5X106-1.3X106

3.6X108-3.2x108

5

1.5X106-1.3X106

4.3X108-3.4x108

FUENTE: Autor

Tabla 5.2 Conteo máximo de microorganismos cultivos CULTIVO

RANGO SUPERIOR cel/ml

RANGO INFERIOR cel/ml

1

3.5X108

3.0X108

2

3.9X108

3.2X108

3

3.8X108

3.2X108

4

3.8X108

2.9X108

5

4.4X108

3.5X108

FUENTE: Autor

GRÁFICA 5.1 RANGOS DE CRECIMIENTO CULTIVOS

1 .0 E + 0 9

CEL/ml

1 .0 E + 0 8

1 .0 E + 0 7

1 .0 E + 0 6 0

2

4

6

8

10

12

14

16

T IE M P O D ía s C o n te o 1

FUENTE: Autor

C o n te o 2

C o n te o 3

C o n te o 4

C o n te o 5

Discusión y análisis de resultados

79

5.1.2 Tasa de crecimiento cultivos Se calculó la tasa de crecimiento para cada uno de los cultivos, durante la fase exponencial de crecimiento entre el día cero y el segundo día de fermentación. Para calcular la tasa de crecimiento se empleo la siguiente expresión: Tasa de crecimiento método discontinuo ( Xt2-Xt1 ) / t2-t1 Xt2 = Densidad celular en el tiempo 2 (final fase exponencial) Xt1 = Densidad celular en el tiempo 1 (inicio de la fermentación día 0) La tabla 5.3 presenta los resultados obtenidos para cada uno de los cultivos Tabla 5.3 Tasa de crecimiento cultivos CULTIVO

RANGO SUPERIOR TASA

RANGO INFERIOR TASA

Levaduras/hora

Levaduras/hora

1

6.3X106

5.6X106

2

6.7X106

4.2X106

3

6.7X106

4.2X106

4

7.0X106

4.3X106

5

7.0X106

5.1X106

FUENTE: Autor

Todos los cultivos llegaron a un nivel de crecimiento en el cual el conteo de microorganismos totales permaneció aproximadamente constante entre el cuartoquinto día y se mantuvo hasta el final de la fermentación. En las gráficas del capítulo 4 se presentan las curvas de crecimiento obtenidas para cada uno de los cultivos. 5.1.3 Contenido de nitrógeno total En la gráfica 5.2 se presenta el comportamiento del contenido de nitrógeno total para los cinco cultivos, con el fin de comparar los niveles de nitrógeno obtenidos, se grafican los rangos superior e inferior de cada cultivo en función del tiempo. Las curvas de crecimiento para los cultivos basadas en el contenido de nitrógeno total, presentan las mismas tendencias, ya que luego de una fase en la cual se registra un aumento en el contenido de nitrógeno, se llega a un período en el cual el contenido de nitrógeno permanece aproximadamente constante y se mantiene estacionario, esto ocurre para todos los cultivos, a partir del cuarto-quinto día de fermentación. Los cultivos 2 y 3 presentan la tendencia a registrar un contenido de nitrógeno final ligeramente menor al reportado por los cultivos 1 y 5, esto pudo haber sido ocasionado por una lisis celular al final de la fermentación. El contenido de nitrógeno final para los cultivos se encuentra dentro del rango 0.32-0.23 mg/ml.

Discusión y análisis de resultados

80

Los cultivos 1, 2, 3, 4 y 5 presentaron un contenido de nitrógeno por célula comprendido entre los siguientes rangos (9.2-6.7)%, estos valores se encuentran dentro de los rangos reportados por la bibliografía (12.0-4.8)%. (Gayon,178,1989). Podemos comparar este rango de nitrógeno por célula obtenido, con el valor obtenido por otros proyectos de investigación que trabajaron bajo las mismas condiciones, los cuales registraron un contenido de nitrógeno por célula de 7.0%. (Determinación de la incidencia de diferentes sustratos en un proceso de fermentación utilizando Saccharomyces cerevisiae (TM 12.99 012 Facultad de Ingeniería Universidad de La Sabana). GRÁFICA 5.2 RANGOS DEL CONTENIDO DE NITRÓGENO CULTIVOS

0.35

NITRÓGENO mg/ml

0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0

2

4

6

8

10

12

14

TIEMPO Días

Contenido 1

FUENTE: Autor

Contenido 2

Contenido 3

Contenido 4

Contenido 5

16

Discusión y análisis de resultados

81

Tabla 5.4 Contenido de nitrógeno rango inicial y final cultivos CULTIVO

RANGO INICIAL mg/ml

RANGO FINAL mg/ml

1

0.04-0.03

0.32-0.28

2

0.02-0.02

0.26-0.23

3

0.02-0.02

0.26-0.23

4

0.04-0.03

0.28-0.24

5

0.07-0.06

0.31-0.27

FUENTE. Autor

El cultivo 1 muestra una tendencia diferente a la presentada por los otros cultivos, entre el primer día y el quinto día de fermentación, debido a la pérdida de muestras para estos días. La tendencia registrada por este cultivo no demostraría el comportamiento real del contenido de nitrógeno en el tiempo. En la gráfica 5.3 se presenta la tendencia de la curva de nitrógeno en función del tiempo al estimar el valor del contenido de nitrógeno para estos días, tomando como referencia el conteo de microorganismos y el porcentaje de nitrógeno por célula reportado en la tabla 4.12 sección 4.3.6. GRÁFICA 5.3 RANGOS DEL CONTENIDO DE NITRÓGENO CULTIVO 1

0.35

NITRÓGENO mg/ml

0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0

2

4

6

8

10

12

TIEMPO (Días) cultivo 1 FUENTE: Autor

cultivo 1 estimado

14

16

Discusión y análisis de resultados

82

Tabla 5.5 Conteo de microorganismos y contenido de nitrógeno cultivo 1

DÍA

CONTEO DE M.O cel/ml

CONTENIDO DE PROTEÍNA mg/ml

2

3.2X108- 2.8X108

0.27-0.24

4

3.3X108 -2.8 X108

0.28-0.24

FUENTE: Autor

Tabla 5.6 Contenido máximo de nitrógeno cultivos CULTIVO

RANGO SUPERIOR mg/ml

RANGO INFERIOR mg/ml

1

0.32

0.28

2

0.28

0.25

3

0.27

0.24

4

0.28

0.24

5

0.33

0.29

FUENTE: Autor ❏

Asimilación del nitrógeno del medio por los cultivos

Se calcula la asimilación de nitrógeno del medio para cada cultivo, la tabla 5.4 presenta los resultados. Tabla 5.7 Porcentaje de asimilación del nitrógeno del medio por cultivo CULTIVOS

RANGO SUPERIOR %

RANGO INFERIOR %

1

39.1

30.6

2

37.2

28.3

3

35.2

26.9

4

40.9

32.8

5

42.9

34.9

FUENTE: Autor

Para calcular el porcentaje de asimilación de nitrógeno se utilizó la siguiente expresión: Contenido de nitrógeno en el medio inicial = Gramos de extracto de levadura x % de nitrógeno en el extracto de levadura + Gramos de fosfato de amonio x 0.2121

Discusión y análisis de resultados

83

La fuente de nitrógeno en el medio preparado, proviene principalmente del extracto de levadura y del fosfato de amonio. El extracto de levadura contiene aproximadamente el 9.8 % de nitrógeno. El fosfato de amonio contiene 0.2121 gramos de nitrógeno por gramo de fosfato de amonio. Relacionando el contenido inicial de nitrógeno en el medio, con el contenido de nitrógeno determinado en el medio al final de la fermentación, se obtiene el porcentaje de asimilación de nitrógeno en cada uno de los cultivos. La asimilación de nitrógeno del medio por los cultivos se refleja en un aumento de nitrógeno en la biomasa. Para realizar esta comparación se calculó el incremento en el contenido de nitrógeno de la biomasa utilizando el porcentaje de nitrógeno por célula promedio para cada cultivo calculado en la sección 4.3.6. ❏

Incremento de nitrógeno en la biomasa

mg de nitrógeno = incremento cel/ml x peso de una célula mg/cel x %nitrógeno/cel El incremento se refiere al conteo final de microorganismos menos el conteo inicial en cel/ml. ❏

Asimilación de nitrógeno del medio durante la fermentación

mg de nitrógeno = mg de nitrógeno medio inicial - mg nitrógeno medio al final (inicio y final de la fermentación) La siguiente tabla muestra los resultados obtenidos al realizar el cálculo correspondiente al incremento de nitrógeno en la biomasa y la asimilación de nitrógeno del medio por los cultivos. Tabla 5.8 Asimilación de nitrógeno del medio y el incremento de nitrógeno en la biomasa. CULTIVOS

ASIMILACIÓN DE NITRÓGENO DEL MEDIO Rangos mg/ml

INCREMENTO DE NITRÓGENO EN LA BIOMASA Rangos mg/ml

1

0.33-0.26

0.29-0.24

2

0.31-0.24

0.31-0.22

3

0.29-0.22

0.29-0.16

4

0.34-0.27

0.32-0.24

5

0.36-0.29

0.39-0.29

FUENTE: Autor

5.1.4 Contenido de proteína La gráfica 5.4 presenta el comportamiento del contenido de proteína en función del tiempo. Con el fin de establecer igualdad entre los cultivos, se presentan los rangos superior e inferior en el contenido de proteína.

Discusión y análisis de resultados

84

El comportamiento del contenido de proteína a través del tiempo sigue la misma tendencia de la curva de crecimiento por conteo de microorganismos y la curva de crecimiento por determinación de nitrógeno total. Los cultivos alcanzan una fase estacionaria en la cual se presenta un contenido de proteína constante (cuarto-quinto día aproximadamente). El contenido de proteína para los cultivos es igual, por lo cual se puede establecer que todos los cultivos alcanzaron aproximadamente el mismo nivel de proteína. Contenido máximo y mínimo alcanzado (1.856-1.09) mg/ml. Los cultivos 1, 2, 3, 4 y 5 presentaron contenidos de proteínas por célula comprendido entre los siguientes rangos (52.3-42.1)%. Estos valores se encuentran dentro de los rangos reportados por la bibliografía (30-75)%. (Gayon, 178, 1989). Se han determinado diferentes factores para calcular el porcentaje de proteína a partir del porcentaje de nitrógeno total, estos factores son adecuados para diferentes materiales, para carnes 6.25, para productos lácteos 6.38 y para cereales 5.70. El producto del porcentaje de nitrógeno por estos factores da como resultado el porcentaje de proteína en una muestra. Para el material que se estudia (levaduras), no se tiene un factor reportado por la bibliografía, que permita determinar el porcentaje de proteína a partir del porcentaje de nitrógeno total. Al relacionar los porcentajes obtenidos de nitrógeno por célula y proteína por célula, podemos establecer un factor que nos permita calcular el contenido de proteína en la levadura a partir del nitrógeno total en este tipo de cultivo. %proteína = 5.89 x %nitrógeno GRÁFICA 5.4 RANGOS DEL CONTENIDO DE PROTEÍNAS CULTIVOS 1.8

PROTEÍNA mg/ml

1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

2

4

6

8

10

12

14

TIEMPO Días

Contenido 1

FUENTE: Autor

Contenido 2

Contenido 3

Contenido 4

Contenido 5

16

Discusión y análisis de resultados

85

El cultivo 1 muestra una tendencia diferente a la presentada por los otros cultivos entre el día cero y el quinto día de fermentación, esto se debe a falta de datos para estos días por la pérdida de muestras. La tendencia presentada por el cultivo 1, no demostraría el comportamiento real del contenido de proteína en el tiempo, tendencia que se observa en los otros cultivos. En la gráfica 5.4 se muestra la tendencia de la curva para el cultivo 1 al estimar el valor para el contenido de proteína en estos puntos tomando como referencia el conteo de microorganismos correspondientes a estos días y el contenido de proteína/célula. Para calcular el contenido de proteína se utilizó el porcentaje de proteína/célula para el cultivo 1 calculado en la tabla 4.12, tomando como promedio 49.1%. Tabla 5.9 Conteo de microorganismos y contenido de proteína cultivo 1 DÍA

CONTEO DE M.O cel/ml

CONTENIDO DE PROTEÍNA mg/ml

2

3.2x108-2.8x108

1.540-1.348

4

3.3x108-2.8x108

1.589-1.348

FUENTE: Autor

GRÁFICA 5.5 RANGOS DEL CONTENIDO DE PROTEÍNAS CULTIVO 1 1.8

PROTEÍNA mg/ml

1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

2

4

6

8

10

12

TIEMPO (Días) Cultivo 1 FUENTE : Autor

Cultivo 1 estimado

14

16

Discusión y análisis de resultados

86

5.2 SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES Los sólidos solubles disminuyen a medida que el número de microorganismos aumenta en el medio ya que estos son en parte su fuente de alimento. Todos los cultivos presentaron esta tendencia. Entre el día cero y el cuarto-quinto día de fermentación se presenta el mayor consumo de sólidos solubles. Al calcular el consumo de sólidos solubles para los cultivos 1, 2, 3, 4 y 5, entre el día cero y el día quinto, podemos observar que para el cultivo 1 se presenta una disminución del 63.1% de los sólidos solubles iniciales (19.8 °brix). Para los otros cultivos se presentan los siguientes resultados 57.9%, 59%, 56.9% y 67.7% respectivamente. A partir del cuarto día se presenta un metabolismo más lento que predomina hasta el final de la fermentación (día 14). Estos cálculos se efectuaron tomado como referencia el contenido inicial de sólidos solubles (°brix), para cada uno de los cultivos. Ejemplo: Para el cultivo 1 el contenido de sólidos solubles iniciales fue de 19.8 °brix Tomando como referencia este contenido inicial se calcula el porcentaje de disminución para el quinto día de fermentación (7.3 °brix). Porcentaje de disminución sólidos solubles = 100 - (7.3 / 19.8) x100 La tabla 5.10 Sólidos solubles totales inicial y final cultivos o

o

CULTIVO

RANGO INICIAL Brix

RANGO FINAL Brix

1

19.8

6.5-6.4

2

19.5

6.3-6.3

3

19.5

6.4-6.3

4

19.5

7.9-6.7

5

19.5

6.0-6.0

FUENTE: Autor

Discusión y análisis de resultados

87

GRÁFICA 5.6 COMPORTAMIENTO DE LOS SÓLIDOS SOLUBLES EN FUNCIÓN DEL TIEMPO

SÓLIDOS SOLUBLES °brix

25.0

20.0

15.0

10.0

5.0

0.0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

TIEMPO Días

Contenido 1

Contenido 2

Contenido 3

Contenido 4

Contenido 5

FUENTE: Autor

Como podemos observar en la gráfica 5.4 el cultivo 4 no llegó a los sólidos solubles finales alcanzados por los otros cultivos (6.3-6) obrix, este hecho pudo ser ocasionado por una diminución en la temperatura de fermentación debido, probablemente, a la inestabilidad en el suministro de energía, lo que provocaría un aumento en la concentración de oxígeno en el medio, al disminuir la temperatura disminuye el metabolismo, por tal motivo el cultivo 4 pudo haber alcanzado los sólidos solubles finales de los otros cultivos, al extender su tiempo de fermentación, cultivo 4 (7.9-6.7) o brix. El cultivo 5 presentó lo sólidos solubles más bajos (6.0 °brix), un 24% menor al registrado por el cultivo 4. Al comparar el comportamiento de los sólidos solubles de estas fermentaciones, con el comportamiento registrado en otras investigaciones efectuadas bajo las mismas condiciones, podemos observar que el contenido de sólidos solubles disminuye de 19.619.3 °brix a 6.2-5.9 °brix al finalizar la fermentación (Determinación de la incidencia de diferentes sustratos en un proceso de fermentación utilizando Saccharomyces cerevisiae. (TM 12.99 012 Facultad de Ingeniería Universidad de La Sabana).

Discusión y análisis de resultados

88

Para este proyecto los sólidos solubles disminuyeron de 19.8 °brix a 7.9-6.0 °brix al terminar la fermentación (14días).

5.3 BALANCE GENERAL DE LA GLUCOSA FERMENTADA Al calcular el porcentaje de la glucosa fermentada se presentan diferencias entre los cultivos 2 y 4, al compararlos con los cultivos 1, 3 y 5, los porcentajes obtenidos para estos últimos cultivos son iguales, por lo que se puede establecer que no existen diferencias en el porcentaje de glucosa fermentada. Esta diferencia presentada por el cultivo 2, podría ser el resultado de la variabilidad que presentan los sistemas biológicos. Tabla 5.11 Porcentaje de azúcar consumida AZÚCAR FERMENTADA %

CULTIVOS

AZÚCAR TRANSFORMADA EN BIOMASA %

RESPIRACIÓN Y PRODUCTOS SECUNDARIOS

RANGO RANGO RANGO RANGO RANGO RANGO SUPERIOR INFERIOR SUPERIOR INFERIOR SUPERIOR INFERIOR

CULTIVO 1

84.1

79.6

1.1

1.1

19.2

14.8

CULTIVO 2

76.1

72.1

1.6

1.3

26.5

22.3

CULTIVO 3

81.0

77.0

1.5

1.3

21.7

17.6

CULTIVO 4

67.7

63.7

1.5

1.3

35.0

30.7

CULTIVO 5

82.3

78.3

1.8

1.4

20.3

16.0

FUENTE: Autor

Al analizar el balance de la glucosa fermentada, si los cultivos 2, 3 y 4 hubiesen consumido la totalidad del azúcar, como ocurrió en los cultivos 1 y 5, en los cuales no se registraron azúcares residuales, estos cultivos (2, 3 y 4) pudiesen haber alcanzado los siguientes contenidos de alcohol final: cultivo 2 (11.03-10.45), cultivo 3 (11.7711.19) y cultivo 4 (9.98-9.39), expresados como porcentaje de etanol. Tomando como referencia el rango superior del cultivo 1, 84.1% de azúcar fermentado, se comparan los porcentajes obtenidos para los cultivos 2 y 4. El porcentaje de glucosa fermentada para el cultivo 2 fue menor en un 9.5% al compararlo con el porcentaje registrado por el cultivo 1 (84.1%), de esta forma el cultivo 4 presentó un porcentaje de glucosa fermentada 19.5% menor en comparación con el cultivo 1. La tabla 4.17 correspondiente al balance de la glucosa fermentada, sirve como referencia para calcular los porcentajes de azúcar fermentada, azúcar transformada en biomasa y azúcar consumida en respiración y productos secundarios.

Discusión y análisis de resultados

89

Por ejemplo para el cultivo 1, al calcular el porcentaje de azúcar fermentada se utiliza la siguiente expresión: % de azúcar fermentada = (g azúcar fermentada / g totales de azúcar medio ) x 100 Azúcar adicionada al medio 0.226 g/ml.

5.4 ANÁLISIS GENERAL DE LOS PARÁMETROS DETERMINADOS Las curvas de crecimiento basadas en el conteo de microorganismos totales, contenido de nitrógeno total y contenido de proteína, presentan las mismas tendencias aproximadamente en los mismos tiempos. En todas las curvas se llegó a una fase estable (4-5 día), en la cual el valor de estos parámetros permaneció aproximadamente constante hasta el final de la fermentación (14 días). Con relación a la producción de etanol, los cultivos 1, 3 y 5 presentaron los mismos valores, lo que indica que alcanzaron aproximadamente la misma concentración final de alcohol, (12.1-11.1)% de etanol. El cultivo 4 presentó la menor concentración final de alcohol (9.8-9.2)%; esto pudo ser ocasionado por una disminución en la temperatura de fermentación, lo que incrementa la presencia de oxígeno aumentando la respiración, alterando el metabolismo y disminuyendo la producción de alcohol. El cultivo 4 alcanzó los mismos niveles en el conteo de microorganismos totales alcanzados por los otros cultivos, lo que indica que este cambio de temperatura se presentó después de iniciar su fase estacionaria, cuarto-quinto día de fermentación . Al aumentar el contenido de microorganismos, disminuye el contenido de sólidos solubles. Durante la fase en la cual se observa el mayor incremento en el conteo de microorganismos se presenta el mayor consumo de sólidos solubles ya que la levadura necesita mayor energía para su desarrollo, esta fase se observa entre el día cero y el cuarto-quinto día de fermentación.

5.5 ESTANDARIZACIÓN Y ADECUACIÓN DE NORMAS Con este proyecto se estandarizaron metodologías de laboratorio que son de rutina para la determinación de parámetros en este tipo de procesos. Las comparaciones se realizaron tomando como referencia los proyectos de investigación en fermentación realizados anteriormente: Manejo y funcionamiento del biorreactor BIO FLO 3000 BENCH-FERMENTOR en tres fermentaciones alcohólicas a 25 °C (TM 12.99 021 Facultad de Ingeniería Universidad de La Sabana), Manejo y funcionamiento del biorreactor BIO FLO 3000 BENCH-FERMENTOR en tres fermentaciones alcohólicas a 30 °C (TM 12.99 022 Facultad de Ingeniería Universidad de La Sabana) y Determinación de la incidencia de diferentes sustratos en un proceso de fermentación utilizando Saccharomyces cerevisiae (TM 12.99 012 Facultad de Ingeniería Universidad de La Sabana).

Discusión y análisis de resultados

90

Los errores de exactitud para el método Kjeldahl (determinación de nitrógeno total), reportados por los otros trabajos de investigación anteriores (tres), fueron los siguientes: Errores de exactitud general método Kjeldahl (7.7%, 7.4% y 6.3%). Para comparar estos errores, con el error calculado para el método Kjeldahl utilizado en esta investigación (6.5%), se tomó como referencia el mayor error reportado por los otros trabajos (7.7%). De esta forma se tiene una disminución del 15.6% al compararlo con el mayor error de exactitud reportado. En el método colorimétrico para la determinación de azúcares, los otros proyectos de investigación anteriores reportaron linealidad para concentraciones de sacarosa menores 0.6% (p/v); el coeficiente de correlación de la curva absorbancia contra la concentración de sacarosa fue de 0.999, 0.998 y 0.997. Al construir la curva de calibración del método colorimétrico para la determinación de azúcares se obtuvo un coeficiente correlación lineal de 0.998, presentándose linealidad para concentraciones de sacarosa menores a 0.5 %. 5.6 APLICACIÓN INDUSTRIAL En la industria cervecera, al finalizar la fermentación, la levadura es reutilizada para fermentar nuevos mostos, (www.cervesur.com.pe/almacén.htm, 4 julio 2000). La extracción de la levadura se realiza al final de cada fermentación, por lo cual se toman cepas de levadura en la fase estacionaria avanzada de crecimiento, con la consecuencia de diminuir la viabilidad de la cepa o la obtención de cepas degeneradas. La viabilidad es una medida de la habilidad de la cepa de levadura para fermentar. La degeneración de la levadura se refiere al deterioro gradual de su desempeño como cepa cervecera, afectando el curso de la fermentación. Entre los efectos ocasionados por la degeneración de cepas, podemos mencionar, entre otros, las fermentaciones tardías, la finalización prematura de la fermentación y la prolongación gradual del tiempo de fermentación. (www.beer-brewing.com, 7 marzo 2001). Al extraer las levaduras durante su fase estacionaria temprana, se podría asegurar una mayor homogeneidad del inóculo, sin la presencia de posibles cambios en la cepa que puedan afectar su capacidad de fermentación. Al analizar los parámetros estudiados, podemos observar que no se presenta degeneración al reutilizar la levadura en los cuatro subcultivos y el nivel de producción de alcohol se mantiene entre el primer cultivo y el quinto cultivo. Tomando en consideración lo expuesto anteriormente, la industria cervecera podría utilizar los subcultivos como método para mantener las características de un cultivo de levaduras. De esta forma solo se necesitaría adquirir una cepa de levadura, la cual a través del subcultivo (por lo menos cuatro), se tendría disponible un inóculo para cada fermentación industrial, utilizando la cepa original. Al utilizar este método se bajarían los costos generados por la compra de nuevas cepas de levadura, ya que se puede utilizar en cuatro fermentaciones sin afectar su capacidad de producción de alcohol. En la industria cervecera la levadura es utilizada en tres o cuatro fermentaciones, posteriormente va perdiendo cualidades y es retirada del proceso de producción industrial (www.terra.es/personal/ale38es/estilo/levaduras.htm, 12 noviembre 2000).

Discusión y análisis de resultados

91

Utilizando como referencia la cepa de levadura cervecera "Nottingham Ale" una Saccharomyces cerevisiae (www.homebrewery-mn.com/catalog/yeast.htm, 7 marzo 2001), que tiene un valor aproximado en el mercado de 0.15 centavos de dólar (us $) por gramo, se pude calcular de manera aproximada la disminución en los costos de producción al utilizar el subcultivo como método para mantener la pureza y las caraterísticas de una cepa. Según la ficha técnica de esta levadura (www.begerow.de, 7 marzo 2001), se utilizan 50 gramos de levadura por cada hectolitro de mosto, a nivel industrial se manejan fermentadores con una capacidad entre 1000-2000 hectolitros. Para una fermentación industrial de 1000 hectolitros se necesitarían 50 kilogramos de levadura, lo que llevaría un costo de 7500 dólares, es decir, se tendría un ahorro en los costos de producción de 7500 dólares por cada reutilización de la cepa a través del subcultivo. Los cerveceros utilizan la levadura por lo menos en tres fermentaciones (dos subcultivos), durante la fermentación industrial, (www.beer-brewing.com, 7 marzo 2001). Con el estudio realizado en este proyecto, se observa, que al utilizar la levadura en cinco fermentaciones (cuatro subcultivos), no se afecta su capacidad de producción de alcohol, es decir, se podría aumentar su utilización en cinco fermentaciones. En el proceso de elaboración industrial, los cerveceros retiran las levaduras después de un número sucesivo de fermentaciones, ya que estas podrían mezclarse con otras, contaminadas con levaduras salvajes y bacterias o provocar la mutación de las cepas deseables afectando de esta forma la tasa de fermentación entre otros factores. El uso continuo de la levadura y las altas tasas de repique (pase), incrementan la edad promedio de la levadura, reduciendo de esta forma su vigor. (www.beer-brewing.com, 7 marzo 2001).

CONCLUSIONES

2

Mediante la comparación de los parámetros: Conteo de microorganismos, nitrógeno total, contenido de proteína y alcohol final, se pudo establecer que la levadura Saccharomyces cerevisiae sometida a cuatro subcultivos durante una fermentación alcohólica, no presenta degeneración, es decir, un deterioro gradual en su desempeño fermentativo.

❏

Al analizar las curvas de crecimiento basadas en el conteo de microorganismos, contenido de nitrógeno total y contenido de proteína, para los cinco cultivos, se presenta la misma tendencia para todos los cultivos, en la cual aparece una fase de mayor crecimiento entre el día cero y el cuarto-quinto día de fermentación. Esta tendencia se refleja en un mayor consumo de sólidos solubles totales, el cual se presenta en el mismo tiempo. El crecimiento máximo alcanzado por los cultivos fue de 4.4x108-3.5x108 cel/ml.

❏

La producción de alcohol no se ve afectada por la influencia del subcultivo, ya que el nivel de alcohol producido se mantiene entre el cultivo 1 y el cultivo 5. El nivel de alcohol alcanzado por los cultivos fue de 12.1-11.0 % expresado como porcentaje de etanol.

❏

Al relacionar los porcentajes obtenidos de nitrógeno por célula y proteína por célula, se estableció un factor que permite calcular el contenido de proteína en la levadura Saccaromyces cerevisiae, a partir del contenido de nitrógeno total, para este tipo de cultivo. %proteína = 5.89 x %nitrógeno

❏

En la industria cervecera, durante el proceso de fermentación, la extracción de la levadura durante su fase estacionaria temprana, podría asegurar la homogeneidad del inóculo, reduciendo la posibilidad de retirar, cepas que presenten cambios que puedan afectar la pureza y las características deseables en un cultivo de levaduras.

2

Se estandarizó el método espectrofotométrico para la determinación de proteína (método del ácido bicinchonínico), adaptándolo a la infraestructura de los laboratorios con los que cuenta la Facultad de Ingeniería de la Universidad de La Sabana. Se estableció la curva de calibración para este método, con un coeficiente de correlación de 0.997, regida por la función: Y = 0.0357 + 3.741 X

92

RECOMENDACIONES

2

Realizar el estudio sobre la influencia del incremento de los subcultivos en la levadura Saccharomyces cerevisiae a partir de la quinta fermentación (cuarto subcultivo), siguiendo con las mismas condiciones establecidas para esta investigación.

2

Investigar la influencia del subcultivo en la levadura Saccharomyces cerevisiae durante una fermentación alcohólica, utilizando un medio de fermentación industrial (industria cervecera).

2

Realizar el estudio sobre la influencia del subcultivo en cepas de levaduras cerveceras.

2

Determinar la influencia del escalamiento sobre este estudio.

2

Realizar un estudio en forma paralela sobre la influencia del subcultivo en la levadura Saccharomyces cerevisiae, tomando como inóculo levadura en fase estacionaria temprana y fase estacionaria tardía.

93

ANEXO A

CONTEO DE MICROORGANISMOS CULTIVOS

Las siguientes tablas presentan los rangos para el conteo de microorganismos en los cinco cultivos. Para el conteo de microorganismos se utilizó el método para la cámara de recuento Neubauer Improved, descrito en la sección 3.3.3. Tabla A1 Rangos conteo de microorganismos cultivo 1 DÍA

RANGO SUPERIOR cel/ml

RANGO INFERIOR cel/ml

0

4.5x10

7

3.7x107

1

1.9X108

1.7X108

4

3.3X108

2.8X108

5

3.5X108

2.7X108

6

3.5X108

3.0X108

7

3.4X108

3.2X108

8

3.2X108

3.0X108

11

3.3X108

2.8X108

12

3.3X108

2.9X108

13

3.2X108

2.9X108

14

3.2X108

3.0X108

FUENTE: Autor

94

Anexos

95

Tabla A2 Rangos conteo de microorganismos cultivo 2 DÍA

RANGO SUPERIOR cel/ml

RANGO INFERIOR cel/ml

0

1.4X106

1.2X106

1

1.6X108

1.0X108

2

3.9X108

3.0X108

5

3.8X108

2.6X108

6

3.6X108

3.1X108

7

3.6X108

3.3X108

8

3.6X108

3.4X108

9

3.5X108

3.2X108

12

3.5X108

3.0X108

13

3.8X108

3.3X108

14

3.9X108

3.2X108

FUENTE: Autor

Tabla A 3 Rangos conteo de microorganismos cultivo 3 DÍA

RANGO SUPERIOR cel/ml

RANGO INFERIOR cel/ml

0

1.4X10

6

1.3X106

1

1.6X108

1.0X108

2

3.4X108

3.0X108

5

3.8X108

3.4X108

6

3.7X108

3.5X108

7

3.9X108

3.2X108

8

3.8X108

3.3X108

9

3.6X108

3.2X108

12

3.6X108

3.3X108

13

3.7X108

3.5X108

14

3.6X108

3.3X108

15

3.5X108

2.5X108

FUENTE: Autor

Anexos

96

Tabla A4 Rangos conteo de microorganismos cultivo 4 DÍA

RANGO SUPERIOR cel/ml

RANGO INFERIOR cel/ml

0

1.5X106

1.3X106

1

1.7X108

1.0X108

2

3.1X108

2.5X108

5

3.8X108

2.9X108

6

3.7X108

3.2X108

7

3.6X108

3.4X108

8

3.7X108

3.4X108

9

3.4X108

3.1X108

12

3.6X108

3.1X108

13

3.7X108

3.1X108

14

3.6X108

3.2X108

FUENTE: Autor

Tabla A5 Rangos conteo de microorganismos cultivo 5 DÍA

RANGO SUPERIOR cel/ml

RANGO INFERIOR cel/ml

0

1.5X10

6

1.3X106

1

1.7X108

1.2X108

2

3.4X108

3.0X108

5

3.8X108

3.2X108

6

3.7X108

3.2X108

7

3.9X108

3.5X108

8

4.0X108

3.6X108

9

4.1X108

3.6X108

12

4.4X108

3.5X108

13

3.6X108

3.2X108

14

4.3X108

3.4X108

FUENTE: Autor

Anexos

97

ANEXO B

CONTENIDO DE NITRÓGENO TOTAL CULTIVO

Los rangos en el contenido de nitrógeno fueron utilizados para la construcción de las curvas del contenido de nitrógeno en función del tiempo. Las siguientes tablas muestran los rangos para el contenido de nitrógeno total en los cinco cultivos. El método utilizado para esta determinación fue el método Kjeldahl (determinación de nitrógeno total), descrito en la sección 3.3.1. Tabla B1 Rangos contenido de nitrógeno total cultivo 1 DÍA

RANGO SUPERIOR mg/ml

RANGO INFERIOR mg/ml

0

0.04

0.03

1

0.15

0.13

5

0.28

0.25

6

0.28

0.25

8

0.30

0.27

11

0.32

0.28

14

0.32

0.28

FUENTE: Autor

Tabla B2 Rangos contenido de nitrógeno total cultivo 2 DÍA

RANGO SUPERIOR mg/ml

RANGO INFERIOR mg/ml

2

0.25

0.22

5

0.25

0.22

7

0.25

0.22

8

0.28

0.24

Anexos

98

9

0.28

0.25

12

0.25

0.22

14

0.26

0.23

FUENTE: Autor

Tabla B3 Rangos contenido nitrógeno total cultivo 3 DÍA

RANGO SUPERIOR mg/ml

RANGO INFERIOR mg/ml

1

0.12

0.10

2

0.25

0.22

5

0.27

0.24

7

0.27

0.24

9

0.26

0.23

12

0.25

0.22

15

0.26

0.23

FUENTE: Autor

Tabla B4 Rangos contenido nitrógeno total cultivo 4 DÍA

RANGO SUPERIOR mg/ml

RANGO INFERIOR mg/ml

2

0.25

0.22

5

0.28

0.24

8

0.28

0.24

9

0.28

0.24

13

0.28

0.24

14

0.28

0.24

FUENTE: Autor

Tabla B5 Rangos contenido de nitrógeno total cultivo 5 DÍA

RANGO SUPERIOR mg/ml

RANGO INFERIOR mg/ml

2

0.27

0.24

5

0.33

0.29

6

0.31

0.28

Anexos

99

7

0.32

0.28

12

0.31

0.28

13

0.31

0.27

14

0.31

0.27

FUENTE: Autor

Anexos

100

ANEXO C

CONTENIDO FINAL DE NITRÓGENO EN EL MEDIO DE CULTIVO

Al finalizar cada fermentación se determinó el contenido de nitrógeno en el medio de cultivo, con el fin de registrar la asimilación de nitrógeno por los microorganismos. Tabla C1 Contenido final de nitrógeno en el medio de cultivo. CULTIVO

RANGO SUPERIOR mg/ml

RANGO INFERIOR mg/ml

1

0.581

0.510

2

0.600

0.526

3

0.612

0.542

4

0.563

0.494

5

0.545

0.478

FUENTE: Autor

Anexos

101

ANEXO D

CONTENIDO DE PROTEÍNA TOTAL CULTIVOS

Los rangos en el contenido de proteína fueron utilizados para la construcción de las curvas del contenido de proteína en función del tiempo. Para calcular determinar el contenido de proteína fue estandarizado el método del ácido bicinchonínico para la determinación del contenido proteína total Sigma C.O., descrito en la sección 3.3.5. Tabla D1 Rangos contenido proteína total cultivo 1 DÍA

RANGO SUPERIOR mg/ml

RANGO INFERIOR mg/ml

5

1.615

1.353

6

1.623

1.313

8

1.655

1.564

1

1.693

1.340

14

1.401

1.332

1 4

FUENTE: Autor Muestras perdidas

Tabla D2 Rangos contenido de proteína total cultivo 2 DÍA

RANGO SUPERIOR mg/ml

RANGO INFERIOR mg/ml

2

1.650

1.591

5

1.709

1.618

7

1.714

1.580

8

1.669

1.626

12

1.669

1.342

14

1.722

1.278

FUENTE: Autor

Anexos

102

Tabla D4 Rangos contenido de proteína total cultivo 3 DÍA

RANGO SUPERIOR mg/ml

RANGO INFERIOR mg/ml

1

0.715

0.616

2

1.650

1.527

5

1.818

1.599

7

1.743

1.631

9

1.642

1.562

12

1.714

1.682

14

1.722

1.423

FUENTE: Autor

Tabla D4 Rangos contenido de proteína total cultivo 4 DÍA

RANGO SUPERIOR mg/ml

RANGO INFERIOR mg/ml

2

1.391

1.209

5

1.706

1.155

8

1.856

1.09

9

1.396

1.353

13

1.484

1.280

14

1.484

1.281

FUENTE: Autor

Tabla D5 Rangos contenido de proteína total cultivo 5 DÍA

RANGO SUPERIOR mg/ml

RANGO INFERIOR mg/ml

2

1.570

1.516

5

1.631

1.556

6

1.631

1.556

7

1.634

1.505

12

1.706

1.626

13

1.644

1.548

14

1.567

1.487

FUENTE: Autor

Anexos

103

ANEXO E

SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES

Las siguientes tablas presentan el contenido de sólidos solubles totales para los cinco cultivos. La medición de los sólidos solubles se realizó con la ayuda de un refractómetro RL3 Laboratory Refractometer. Tabla E1 Contenido de sólidos solubles totales cultivo 1 DÍA

RANGO SUPERIOR °brix

RANGO INFERIOR °brix

0

19.8

19.8

1

18.0

18.0

4

8.9

7.1

5

8.1

6.6

6

7.4

6.6

7

6.5

6.5

8

6.5

6.4

11

6.5

6.4

12

6.5

6.4

13

6.5

6.4

14

6.5

6.4

FUENTE: Autor

Tabla E2 Contenido de sólidos solubles totales cultivo 2 DÍA

RANGO SUPERIOR °brix

RANGO INFERIOR °brix

0

19.5

19.5

1

18.0

18.0

2

15.0

15.0

5

8.2

8.2

Anexos

104

6

7.0

7.0

7

7.0

7.0

8

7.0

7.0

9

7.0

7.0

12

6.5

6.5

13

6.5

6.5

14

6.3

6.3

FUENTE: Autor

Tabla E3 Contenido de sólidos solubles totales cultivo 3 DÍA

RANGO SUPERIOR °brix

RANGO INFERIOR °brix

0

19.5

19.5

1

18.5

17.9

2

14.5

14.5

5

8.3

7.7

6

7.1

6.7

7

7.1

6.7

8

6.5

6.5

9

6.5

6.5

12

6.5

6.5

13

6.5

6.5

14

6.5

6.5

15

6.4

6.3

FUENTE: Autor

Tabla E4 Contenido de sólidos solubles totales cultivo 4 DÍA

RANGO SUPERIOR °brix

RANGO INFERIOR °brix

0

19.5

19.5

1

18.5

17.9

2

14.9

14.1

5

8.8

8.0

Anexos

105

6

8.2

6.7

7

8.2

6.7

8

8.2

6.7

9

8.2

6.7

12

7.9

6.8

13

7.9

6.8

14

7.9

6.8

FUENTE: Autor

Tabla E5 Contenido de sólidos solubles cultivo 5 DÍA

RANGO SUPERIOR °brix

RANGO INFERIOR °brix

0

19.5

19.5

1

18.0

18.0

2

15.0

15.0

5

8.0

8.0

6

6.5

6.5

7

6.0

6.0

8

6.0

6.0

9

6.0

6.0

12

6.0

6.0

13

6.0

6.0

14

6.0

6.0

FUENTE: Autor

Anexos

106

ANEXO F

CONTENIDO ALCOHÓLICO CULTIVOS

Se determinó el contenido de alcohol final alcanzado por los cultivos al finalizar la fermentación (14 días). La siguiente tabla muestra el contenido de alcohol final registrado por los cultivos. Tabla F1 Contenido de alcohol final cultivos CULTIVO

RANGO SUPERIOR % etanol

RANGO INFERIOR % etanol

1

12.1

11.5

2

11.0

10.4

3

11.7

11.1

4

9.8

9.2

5

11.9

11.3

FUENTE: Autor

Anexos

107

ANEXO G

CALIBRACIÓN METODO DETERMINACIÓN DE AZÚCARES

La siguiente tabla muestra los datos obtenidos para la construcción de la curva de calibración para el método de determinación de azúcares. Tabla G1 Curva de calibración para el método de determinación de azúcares

FUENTE: Autor

AZÚCAR %

ABSORBANCIA PROMEDIO

0

1.667

0.05

1.573

0.10

1.347

0.15

1.300

0.20

1.153

0.25

0.972

0.30

0.833

0.35

0.721

0.40

0.540

0.45

0.431

0.50

0.268

Anexos

108

ANEXO H

CONTENIDO DE AZÚCAR RESIDUAL CULTIVOS

Al finalizar la fermentación (14 días), se determinó el contenido de azúcares residuales para cada uno de los cultivos. En la siguiente tabla se presentan los contenidos de azúcar residual para los cinco cultivos. Estos valores fueron empleados para calcular el balance del general de la glucosa fermentada. Tabla H1 Azúcar residual cultivos CULTIVO

RANGO SUPERIOR mg/ml

RANGO INFERIOR mg/ml

1

0.00

0.00

2

0.96

0.88

3

1.49

1.45

4

4.71

4.71

5

0.00

0.00

FUENTE: Autor

Anexos

109

CONTENIDO DE AZÚCAR mg/ml

GRÁFICA H1 RANGOS CONTENIDO DE AZÚCAR RESIDUAL CULTIVOS 5

4.71 4.71

4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.49 1.45

1.5 0.96 0.88

1 0.5 0

0

0

1

0

2

3

4

CULTIVOS Rango superior FUENTE: Autor

Rango inferior

0

5

Anexos

110

ANEXO I

MANEJO ESTADÍSTICO

Para el análisis de la información, se utilizó un manejo estadístico simple. Se calculó el error de exactitud para los siguientes métodos: determinación del contenido de nitrógeno total y determinación del contenido alcohólico. Se calcularon los rangos para estas determinaciones, relacionando el valor promedio con el porcentaje de error de exactitud. Promedio = (Σ Xi )/ n Error de exactitud = (Vt - Vexp) / Vt x100 Vt : Valor teórico Vexp : Valor experimental Para los métodos de determinación de azúcares, contenido de proteína total y sólidos solubles totales, se calculó la desviación estándar y la ecuación de la recta por regresión lineal (método de los mínimos cuadrados). Desviación estándar = √ ( n Σ

i

2

-(Σ

2 i) )

/ (n x (n-1)

Para calcular el rango se sumo y se resto la desviación estándar al promedio.

GLOSARIO ❏

ATP: Trisfosfato de adenosina. El principal portador de energía dentro de la célula.

❏

Biomasa: Peso total de todos los microorganismos que se encuentran en un medio determinado.

❏

Biosíntesis: Producción de los constituyentes celulares necesarios, a partir de otras moléculas (normalmente más sencillas).

❏

Cepa: Población de células, descendientes todas de una sola célula.

❏

Cultivo: Cepa o clase particular de un microorganismo que crece en un medio de laboratorio.

❏

Inóculo: Material utilizado para iniciar un cultivo microbiano.

❏

Lisis: Ruptura de la célula, que da como resultado la pérdida de contenido celular.

❏

Metabolismo: Todas las reacciones bioquímicas en una célula, tanto catabólicas como anabólicas.

❏

Mutación: Cambio súbito, hereditario en el fenotipo de un organismo.

❏

NAD: Nicotinamida-adenín dinucleótido, coenzima acarreadora de átomos de hidrógeno.

❏

Nutriente: Sustancia tomada de su ambiente por una célula y utilizada en reacciones catabólicas o anabólicas.

❏

Pase: Proceso por el cual se toma una muestra de un cultivo y se inocula en otro cultivo, (repique).

111

BIBLIOGRAFÍA

❏

BROCK, Tomas D. y MADIGAN , Michael T. Microbiología. México : Prentice Hall, 1993. 956 p.

❏

CRUEGER, Wulf y CRUEGER, Anneliese. Biotecnología : Manual de microbiología industrial. España : Acribia, 1993. 790 p.

❏

CURTIS, Helena y BARNES, Sue. Biología. Argentina : Panamericana, 1993. 1199 p.

❏

FRAZIER, W.C y WESTHOFF, D.C. Acribia, 1993. 681 p.

❏

GAYON, Jean R. y PEYNAUD, Emile. Ciencia y técnicas del vino. Argentina : Hemisferio sur, 1989. 573 p.

❏

HALL, G.M. Methods of testing Protein Functionality. Great Britain : Chapman & Hall, 1996. 256 p.

❏

INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TÉCNICAS Y CERTIFICACIÓN. Manual de métodos analíticos para el control de calidad de bebidas alcohólicas. Bogotá : ICONTEC, 1994.

❏

KUNZ, Benno. Cultivo de microorganismos para la producción de alimentos. España : Acribia, 1996. 125 p.

❏

OFFICIAL METHODS OF ANALYSIS OF THE ASSOCIACION OF OFFICIAL ANALITICAL CHEMISTS. 15 ed. USA : Edited by Kenenth Helrich, 1990. 1298 p.

❏

SKOOG, Douglas. Química analítica. 6 ed. México : McGraw- Hill, 1994.

❏

TUITE, Michael. Saccharomyces. New YorK : Plenum Press, 1991.

❏

TREVAN, M.D. Biotecnología : Los principios biológicos. España : Acribia, 1990.

❏

VILLE, Claudia A. Biología. México : McGraw -Hill, 1992. 1404 p.

❏

WALPOLE, Ronald y MYERS, Raymond. MacGraw -Hill, 1992. 790 p.

❏

BONILLA, Henry y MARTINEZ, Vladimir. Manejo y funcionamiento del BIO FLO 3000 "BENCH-FERMENTOR" en tres fermentaciones alcohólicas a 30°C. Bogotá, 1999. Proyecto de grado (Ingeniero de Producción Agroindustrial).

Microbiología de los alimentos.

Probabilidad y estadística.

España :

México :

113

114

Universidad de La Sabana. Facultad de Ingeniería. Ingeniería de Producción Agoindustrial. ❏

MERCHAN, Carlos y CASTILLO, Angela. Manejo y funcionamiento del BIO FLO 3000 "BENCH-FERMENTOR" en tres fermentaciones alcohólicas a 25 °C. Bogotá, 1999. Proyecto de grado (Ingeniero de Producción Agroindustrial). Universidad de La Sabana. Facultad de Ingeniería. Ingeniería de Producción Agoindustrial.

❏

SIERRA, Rosa y ALBA, Daniel. Determinación de la incidencia de diferentes sustratos en un proceso de fermentación utilizando Saccharomyces cerevisiae. Bogotá, 1999. Proyecto de grado (Ingeniero de Producción Agroindustrial). Universidad de La Sabana. Facultad de Ingeniería. Ingeniería de Producción Agoindustrial.

❏

www.arrakis.es/∼lluengo/ciclokrebs.html.

❏

www.beer-brewing.com,

❏

www.begerow.de,

❏

www.lluengo.citológica.net/glucólisis.html.

❏

www.terra.es/personal/ale38es/Estilo/levaduras,

12 noviembre 2000.

7 marzo 2001.

7 marzo 2001. 12 noviembre 2000. 12 de noviembre 2000.