Unidad 3. Estudio de cultivos bacterianos puros y Unidad 4. Estudio microscópico y cultivo de hongos algas y protozoarios

Práctica 5. Técnicas de siembra y cultivo de bacterias y hongos Objetivos     

Aplicar las diferentes técnicas de siembra que se emplean para el estudio y asilamiento de bacterias y hongos levaduriformes y filamentosos. Relacionar la presentación del medio de cultivo con la técnica de siembra. Distinguir las condiciones de incubación para el cultivo de bacterias y hongos. Describir las características morfológicas macroscópicas y microscópicas de las bacterias y hongos (levaduriformes y filamentosos). Comprobar la pureza de los cultivos mediante tinciones simples y/o diferenciales.

Introducción La identificación de microorganismos se basa en la observación de las características microscópicas y de desarrollo que presentan en medios líquidos, semisólidos y sólidos. En los últimos la formación de colonias visibles con características particulares permite diferenciar a los microorganismos, así como detectar contaminantes en los cultivos puros.

Materiales  Cultivos puros de bacterias: Escherichia coli Serratia marcescens Micrococcus luteus Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Streptomyces griseus Streptomyces erythraeus  Cultivos puros de hongos: Saccharomyces cerevisiae Rhodototula sp Penicillum sp Aspergillus niger Rhizopous sp Alternaria sp Fusarium sp

 Material por equipo ME1515 – 2012/2 - Práctica 5 - Página 1

1 Microscopio 2 mecheros 2 gradillas 2 asas bacteriológicas 2 asas micológicas 1 vaso de precipitados de 250mL  Colorantes 1 juego de colorantes de Gram Lactofenol azul de algodón Azul de metileno para tinción simple  Medios de cultivo 8 cajas de Petri con Agar de uso general1 2 cajas con YPDM 4 cajas con Agar Sabouraud  Material que deben tener los alumnos: 4 tubos con caldo BHI* 2 tubos con medio semisólido* 4 tubos con agar BHI inclinado* Pipetas Pasteur estériles Portaobjetos 1Puede

ser Agar Soya Tripticase (TSA), Agar Infusión de Cerebro y Corazón (BHI), Agar Nutritivo (AN), Agar Casoy (AC), etc. * Material preparado la práctica anterior

2ª sesión Cultivo de bacterias, hongos y actinomicetos

Metodología  Siembra de bacterias (cada equipo debe sembrar 2 bacterias diferentes) 1. A partir de la muestra problema preparar un frote, teñir con Gram y observar en 100x y registrar sus observaciones. 2. Organizar el material de modo que cada alumno cuente con lo siguiente: 4 cajas con Agar de uso general1, 2 tubos con caldo* 2 tubos con agar inclinado* y un tubo con medio semisólido*. 3. Identificar las cajas de Petri y tubos de ensayo con plumón indeleble o con etiquetas con los siguientes datos: tener cuidado de que las anotaciones queden en la periferia de la base de la caja o cerca de la boca del tubo.

1515-09-# de equipo Nombre del microorganismo dd/mm/aa

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4. A partir de la muestra bacteriana inocular una asada en un tubo con 7mL de caldo BHI (tubo 1). 5. A partir del tubo 1 inocular el material que se muestra en el cuadro siguiendo el esquema de trabajo. 6. Sellar con las cajas dos tiras de masking tape, y colocar los tubos en un bote de metal o plástico. Incubar los dos tubos y las cajas invertidas a 37°C durante 24 horas en condiciones aeróbicas. 7. Transcurrido el tiempo de incubación, revisar y guardar en refrigeración a 4°C.  1 tubo con caldo mediante la transferencia una gota con pipeta Pasteur.

 1 tubo con agar semisólido mediante picadura (emplear el asa recta o en aguja)

 2 tubos con agar inclinado. Uno con estría recta y el segundo con estría ondulada.

 1 caja de Petri con hisopo mediante la técnica de extendido o siembra masiva. Esta técnica también puede hacerse con asa bacteriológica.

 1 caja de Petri con el asa trazar una estría simple en un cuarto de caja (cuadrante simple). Esta también puede aplicarse en el área total de la caja.

2 cajas de Petri con el asa trazar una serie de estrías con el fin de aplicar la técnica de cuadrante radial o estriado por agotamiento.

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Organigrama Cepa bacteriana

Siembra con asa

Tinción de Gram

Caldo BHI Siembra con pipeta Pasteur

Medio semisólido Siembra con aguja de siembra por picadura

Tubo 1 Caldo BHI

Agar BHI Siembra con asa, estría recta y estría ondulada

Agar BHI Siembra con asa, cuadrante simple

Agar BHI Siembra con hisopo, siembra masiva

Agar BHI Siembra con asa, cuadrante radial

 Siembra de actinomicetos o bacterias filamentosas (cada equipo debe sembrar 2 bacterias diferentes) 1. A partir de la muestra problema preparar un frote, teñir con Gram y observar a inmersión y registrar sus observaciones. 2. Con una pipeta Pasteur estéril colocar en un extremo de la placa de YPDM dos gotas del cultivo de Streptomyces griseus o de Streptomyces erythraeus. 3. Esterilizar el asa y estriar el cultivo sobre el medio con la técnica de cuadrante radial. 4. Identificar las cajas de Petri con plumón indeleble o con etiquetas con los siguientes datos: 1515-09-# de equipo Nombre del microorganismo dd/mm/aa

5. Sellar las cajas, invertirlas e incubar a 28°C durante 3 a 7 días. ME1515 – 2012/2 - Práctica 5 - Página 4

 Siembra de hongos levaduriformes (Cada equipo debe sembrar 2 levaduras diferentes) 1. Con el asa inocular una placa de Agar Sabouraud empleando la técnica de cuadrante radial con cada uno de los hongos levaduriformes. 2. Identificar las cajas de Petri con plumón indeleble o con etiquetas con los siguientes datos: 1515-09-# de equipo Nombre del microorganismo dd/mm/aa

3. Sellar las cajas, invertirlas e incubar a 28°C de 2 a 5 días.  Siembra de hongos filamentosos (Cada equipo debe sembrar 2 hongos filamentosos diferentes) 1. Identificar las cajas de Petri con plumón indeleble o con etiquetas con los siguientes datos: 1515-09-# de equipo Nombre del microorganismo dd/mm/aa

2. Esterilizar el asa micológica y dejar enfriar dentro de la zona aséptica. 3. Tomar una pequeña cantidad del cultivo del hongo seleccionado y sembrar en el centro de la placa de Agar Sabouraud, para ello presionar ligeramente el asa sobre la placa. 4. Sellar las cajas e invertirlas. 5. Incubar a 28°C de 5 a 7 días.

2ª sesión Resultados del desarrollo de bacterias, hongos y actinomicetos  Resultados de bacterias 1. Describir las características de desarrollo en los tubos (medio líquido, semisólido y sólido) y en las cajas de acuerdo con las guías de observación del manual de Microbiología General. 2. A partir del cultivo líquido y de dos colonias aisladas preparar 3 frotes y teñir con Gram. 3. Registrar sus resultados en el cuadro 1.  Bacterias filamentosas 1. Revisar las características coloniales. 2. Preparar un frote y teñir con Gram. 3. Comparar la morfología colonial y microscópica de las bacterias estudiadas en la sesión anterior y la actual. 4. Registrar los resultados en el cuadro 2.

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 Hongos levaduriformes 1. Revisar las características coloniales. 2. Realizar un frote y una tinción simple de cada una de las levaduras en estudio. 3. Comparar la morfología colonial y microscópica con las características de las bacterias. 4. Registrar los resultados en el cuadro 3. La descripción de las colonias debe hacerse de acuerdo con las características indicadas en el Manual de Microbiología General.  Hongos filamentosos 1. Revisar las características coloniales. 2. Mediante la técnica de impronta con diurex, hacer una preparación en fresco y teñir, observar al microscopio con los objetivos 10x y 40x. 3. Registrar los resultados en el cuadro 4, para ello describir las características de los hongos con ayuda de los esquemas del Manual de Microbiología General.

Disposición de desechos

1. Verter los desechos de colorantes en los contenedores dispuestos en los laboratorios 2. Después de observar las preparaciones, sumergir los portaobjetos en una solución sanitizante durante 10 minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y colocarlos en un frasco con alcohol al 95 %. 3. En el caso de ruptura de las preparaciones, envolver los fragmentos con papel, esterilizar el paquete en autoclave y después desecharlos en el contenedor de vidrio roto. 4. Los cultivos muestra deben ser esterilizados en autoclave, antes de ser desechados. 5. Después de observar las características de desarrollo, esterilizar los cultivos en autoclave. 6. Vaciar el agar sobre un papel y envolverlo. 7. Colocar el paquete en una bolsa de plástico y depositarla en el contenedor correspondiente. 8. Sellar las cajas de plástico con cultivos y depositarlas en el contendor rojo del laboratorio A.

Registro de resultados  Cuadro 1. Características microscópicas y de crecimiento en medios líquidos, semisólidos y sólidos, inoculados mediante diferentes técnicas. Nombre científico de la bacteria: ______________________________________________________ Presentación del medio de cultivo y técnica de siembra Características microscópicas Caldo inoculado con asa

Características de desarrollo

Resultados

Forma Agrupación Gram Superficial (pelicular o anillado) Sedimento Turbiedad ME1515 – 2012/2 - Práctica 5 - Página 6

Picadura en medio semisólido

Características de crecimiento

Agar vertical inoculado con pipeta

Superficial En todo el medio En el fondo Formación de burbujas Forma del crecimiento: (filiforme, perlado o arborescente) Color Textura (acuosa, butirosa, cremosa, membranosa, viscosa) Consistencia (seca, húmeda) Desarrollo masivo o confluente Presencia de colonias aisladas Color Desarrollo a lo largo del estriado Presencia de colonias aisladas Características de las colonias: Forma (puntiforme, circular, ameboide, rizoide, fusiforme) Color (blanquecino, blanco opaco, amarillo etc) Borde (entero, ondulado, lobulado, crenado, filamentoso) Elevación (plana, elevada, convexa, rugosa, papilar, embonada) Textura (acuosa, butirosa, cremosa, membranosa, viscosa) Consistencia (seca, húmeda)

Agar inclinado

Placa por extensión o masivo

Placa cuadrante simple

Placa estría radial (cuadrante radial o agotamiento)

Movilidad (+ o -)

Presencia de colonias aisladas Características de las colonias: Forma (puntiforme, circular, ameboide, rizoide, fusiforme) Color (blanquecino, blanco opaco, amarillo etc) Borde (entero, ondulado, lobulado, crenado, filamentoso) Elevación (plana, elevada, convexa, rugosa, papilar, embonada) Textura (acuosa, butirosa, cremosa, membranosa, viscosa) Consistencia (seca, húmeda)

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 Cuadro 2. Características microscópicas y de crecimiento de bacterias filamentosas. Nombre científico de la bacteria: _________________________________________________________

Características coloniales

Características microscópicas

Forma Color Elevación Textura Aspecto (seco, húmedo) Forma Otras estructuras Gram

 Cuadro 3. Características de crecimiento y microscópicas de un hongo levaduriforme. Nombre científico: _______________________________________________________________________

Coloniales

Microscópicas

Color Aspecto superficial (liso, rugoso, cerebriforme) Consistencia (cremosa, seca) Forma Tamaño relativo con respecto a las bacterias Presencia y distribución de blastosporas

 Cuadro 4. Características de crecimiento y microscópicas de un hongo filamentoso Nombre científico: _______________________________________________________________________

Coloniales

Microscópicas

Desarrollo (escaso, medio, abundante) Color Aspecto del micelio superficial (algodonoso laxo, lanoso, aterciopelado) Color del micelio profundo Aspecto del micelio profundo (homogéneo, con anillos concéntricos, sectorial Color Tipo de hifas (cenocítica, septada) Tipo de cuerpo fructífero (esporangióforo, conidióforo) De las esporas: Morfología (esférica, oval, reniforme, fusiforme) Color Aspecto externo (lisas, punteadas, estriadas, verrugosas) ME1515 – 2012/2 - Práctica 5 - Página 8

Bibliografía complementaria     

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Cappuccino, James G. and Sherman Natalie. 2005. Microbiology: a laboratory manual. 7th edition. Pearson/Benjamin Cummings. USA. QR63 C36 2005. Leboffe Michael J. and Burton E. Pierce. 2006. Microbiology laboratory theory and application. 2nd edition, Morton Publishing Co. USA. QR63 L43 2006. Madigan, M. T. and J. M. Martinko. 2006. Brock Biology of microorganisms. 11th edition. Pearson Prentice Hall. USA. QR41.2 B753 2006 Prescott Lansing M., Harley John P. and Klein Donald A. 2005. Microbiology. 6th edition. McGraw-Hill. USA. QR41.2 P74 2005 Ramírez-Gama, R. M., B. Luna Millán, O. Velásquez Madrazo, L. Vierna García, A. Mejía Chávez, G. Tsuzuki Reyes, L. Hernández Gómez, I. Müggenburg, A. Camacho Cruz y M del C. Urzúa Hernández. 2006. Manual de Prácticas de Microbiología General. 5ª edición. Facultad de Química, UNAM. México. Schaechter Moselio, Ingraham John L. and Neidhardt Frederick C. 2006. Microbe. American Society for Microbiology. USA. QR41.2 S288 Tortora Gerard J., Funke Berdell R. and Case Christine L. 2007. Microbiology : an introduction. 9th edition. Benjamin Cummings. USA. QR41.2 T67 2007

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