INFORMACION PARA COORDINADORES DE SERVICIOS DE SALUD Y MEDICOS En los hallazgos de auditoria externa se encontró “Falta de concordancia entre los examenes registrados en el manual y la técnica utilizada en el laboratorio” Como plan de mejoramiento del Sistema de gestión de Calidad, se determino realizar la divulgación de los factores que diferencian las técnicas y que se registran en los manuales de tarifas como (CUPS) clasificación única de procedimientos en salud, para que desde la solicitud del análisis se especifique ya sea como código numérico o haciendo la descripción de la técnica y en la revisión de cuentas se manejen los homólogos. Para que la información sea más didáctica la enfocamos en la modalidad de preguntas. 1. Que técnicas se utilizan en los análisis bioquímicos? Como respuesta al avance tecnológico que cada día garantiza resultados mas confiables por permitir mayor objetividad en su medida, las técnicas van depurándose prevaleciendo aquellas que cumplan con características de precisión, exactitud, sensibilidad y especificidad, criterios que se deben utilizar en la adquisición de equipos y reactivos ofertados. Bajo estos parámetros las técnicas mas utilizadas en el laboratorio clínico son: Espectrofotometría, luminiscencia, fluorescencia, fosforescencia, turbidimetría y nefelometría. MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS: Son aquellos en los que existe intercambio de energía entre la radiación electromagnética y la materia. En estos métodos se miden espectros, debidos a transiciones entre distintos niveles energéticos. Técnicas basadas en la absorción de radiación: -niveles moleculares: UV-visible, microondas -niveles atómicos: absorción atómica, rayos x Técnicas basadas en la emisión de radiación: -niveles moleculares: luminiscencia, fluorescencia y fosforescencia. -niveles atómicos: espectrometría de emisión, fluorescencia de rayos x, fluorescencia atómica MÉTODOS NO ESPECTROSCÓPICOS: Son aquellos en los que no hay intercambio de energía sino cambios en la dirección o en las propiedades físicas de la radiación electromagnética Técnicas basadas en la dispersión de radiación: turbidimetría, nefelometría Técnicas basadas en la refracción de radiación: refractometría, interferometría Técnicas basadas en la difracción de radiación: rayos x o electrones Técnicas basadas en la rotación óptica: polarimetría, dicroísmo circular. 2. Que diferencia hay en técnicas químicas e inmunoquímicas? Mediante las técnicas químicas se analizan componentes de bajo peso molecular o de alta concentración en la muestra, los analitos presentes en sangre, orina y otros líquidos biológicos son analizados principalmente por técnicas espectrofotometrícas, que garanticen exactitud y precisión, bajo la estandarización de variables como temperatura, agitación, tiempo, volumen, estabilidad de reactivos y correcta calibración de equipos.

Gran parte del progreso alcanzado por la biología moderna se debe al perfeccionamiento de los métodos analíticos de medida. La introducción de los procedimientos basados en las reacciones inmunológicas ha representado un importante avance en el análisis de sustancias de interés en el laboratorio clínico. Dentro de los procedimientos inmunológicos, los más útiles y prácticos son aquellos que se basan en la especificidad de la unión Ag-Ac. La propiedad que tienen las Inmunoglobulinas de unirse a un Ag, la especificidad de esta unión y el hecho de que pueda ser visualizable por los fenómenos de precipitación, aglutinación, marcaje con fluoresceína, radioisótopos o enzimas, hacen que estos métodos se empleen ampliamente y que cada día sean mas confiables. Estas técnicas son utilizadas para medir moléculas de estructura compleja o de concentraciones muy bajas, siendo importante garantizar la especificidad y sensibilidad del analito que se analiza. Para asegurar el resultado exacto se hacen ligaciones con otros cofactores que aseguran mayor estabilidad en la reacción o la utilización de múltiples lugares de enlace, esto determina la generación del reactivo contando actualmente con reactivos hasta de quinta generación.

PRINCIPALES TECNICAS BASADAS EN LA UNION Ag-Ac 1. Técnicas de aglutinación. Cuando el antígenos se encuentra unido o formando parte de células, bacterias o partículas, la reacción Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado celular o bacteriano formado. 2. Técnicas de fluorescencia y citometría de flujo. Para la realización de estas técnicas el anticuerpo se marca con un fluoro cromo detectándose la formación del complejo Ag-Ac por la fluorescencia emitida. 3. Técnicas de radioinmunoensayo. En estas técnicas al anticuerpo se une a un isótopo Radiactivo siendo posible la cuantificación del complejo Ag-Ac a través de la radiactividad emitida. 4. Cromatografía de afinidad. La especificidad de la unión Ag-Ac puede utilizarse para obtener Anticuerpos y Anfígenos puros. 5. Inmunoprecipitación e inmunoblotting. Permite detectar la presencia y cantidad de antígenos y anticuerpos específicos que difunden en geles 6. Enzimoinmunoensayo. Estas técnicas son conocidas también como Enzimoinmunoanalisis (EIA). La identificación de los complejos Ag-Ac, se hace mediante el empleo de enzimas, bien unidas al antígeno o al anticuerpo. Esta técnica, también se conoce como test de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 7. Inmunonefelométricas o Inmunoturbidimétricas. Estas técnicas se basan en la detección de los complejos Ag-Ac, por la dispersión que dichos complejos producen sobre rayos de luz que se hacen pasar por el tubo con el complejo inmune correspondiente. Habitualmente se utilizan rayos láser y se establece una relación entre la cantidad de luz que llega y la cantidad de complejos formados. Este procedimiento es rápido y sensible y se está utilizando en la actualidad, sobre todo, para la cuantificación de proteínas en suero y en otros líquidos biológicos. Las graficas siguientes permiten visualizar mejor este tipo de reacciones.

Grafica 1. Corresponde a reacciones de aglutinación o precipitación. Es muy importante el equilibrio entre el Ag y el Ac, para que no se presenten fenómenos zonales, que son los responsables de fasos positivos o falsos negativos. Corresponden a técnicas cualitativas y muy sujetivas mientras no se cuente con un sistema de medida calibrado. Los resultados se reportan como positivos, negativos o en diluciones, en precipitación sobre geles se puede hacer curvas con controles, obteniendo resultados semicuantitativos. Pertenecen a este grupo entre otras: Látex, Inmunodifución radial (IDR), Inmunoelectroforesis, cromatografías de afinidad.

Grafica 2. Se representa una placa donde se ha realizado la técnica de inmunodifusión radial. Se siembran controles de diferentes se miden los halos correspondientes que determinan los puntos de una curva sobre la cual se ubican las muestras de los pacientes. Como es tan manual no cuenta con la exactitud y precisión que ofrecen las automatizadas.

Figura 3. El fundamento de todas las técnicas denominadas Emzimo Inmuno Análisis EIA. Si el sustrato se acopla a una reacción coloreada se denomina ELISA, si la reacción emite luz LIA, si emite fluorescencia FIA, si emite radiación RIA. Cada una de ellas presenta diferente sensibilidad y especificidad dependiendo de la automatización y generación del reactivo utilizado.

Figura 4. Las técnicas nefelométrica y turbidimétrica están basadas en la dispersión de la luz de las partículas formadas por el complejo inmune el cual se encuentra en

suspensión en el seno de una disolución. La diferencia entre estas dos técnicas está en la forma de medir la luz dispersa.

3. Que diferencia hay entre un examen realizado correctamente y un resultado confiable? El Bacteriologo sigue las indicaciones del desarrollo de una técnica, por tanto el análisis cumple con el procedimiento, se espera un resultado correcto, pero si no se compara con segundas opiniones no conoceremos su confiabilidad. La confiabilidad esta sujeta a la verificación de la exactitud y precisión del ensayo, mediante el uso de controles. Si la comparación se realiza con un grupo de otros laboratorios a través de una muestra ciega, se mide la exactitud de su reporte. Si cuenta con equipos susceptibles a prevenir la descalibracion y reactivos con manejo óptimo de condiciones ambientales puede asegurar la precisión utilizando muestras de concentración conocida. Las medidas de biomóleculas en el orden de micro, nano o fentogramos, requieren un estricto control de variables como volumen, lavados y agitación que se logran a través de la automatización. Factores que afectan la sensibilidad y especificidad de los inmunoanálisis: - La potencia del anticuerpo y la relación de los pKa. - La concentración molar del anticuerpo, del analito, del trazador y del conjugado. - La pureza de anfígenos o anticuerpos de los reactivos. - La temperatura a la que se realizan los ensayos (Temperatura ambiental, del baño o estufas de incubación en técnicas manuales). - El pH y la fuerza iónica del medio donde transcurre la inmunorreacción. - El tiempo en que transcurre la inmunorreacción y si la reacción llega o no, al equilibrio. Exceso o defecto del tiempo de reacción o incubación establecida por el fabricante de los reactivos.

- Conservación de la cadena de frío de los reactivos estipulada por el fabricante y la estabilidad de los reactivos durante el tiempo que el fabricante estima, previo al vencimiento. - Adicionar un paso de lavado en una etapa intermedia fuera del protocolo del fabricante. - La deshidratación de los geles con los ensayos de difusión como en las técnicas de inmunodifusión radial IDR. - Ensayos inmunoanalíticos basados en un punto de corte o cut-off. - Precisión de dispensado de reactivos o muestras en los equipos automáticos o la precisión de las micro pipetas automáticas en técnicas manuales. - Calidad del agua de dilución de reactivos en equipos automáticos. - Deterioro del agua de dilución de reactivos en equipos automáticos. - Contaminación bacteriana o fúngica en el conjunto de tubos y mangueras de los equipos automáticos. - Contaminación bacteriana o fúngica de los reactivos o controles de calidad. - Almacenamiento de los reactivos o muestras. - Estado de funcionamiento (temperatura y su estabilidad) de las heladeras, freezers o congeladoras, lugar y posición de almacenamiento de los reactivos y muestras dentro de las mismas. (Especial atención en la posición y el tiempo de almacenamiento de las placas de IDR). - Estructura y estabilidad de la molécula que se va a determinar. Proteína globular, anticuerpo, hormona asteroidea o tiroidea. - Sistema de separación (eficiencia de la separación de la fracción libre de la unida en el caso de los sistemas inmunoanalíticos heterogéneos), ej., aspirado o volcado, centrifugación, lavado, separación magnética, etcétera. - Tipo de señal que se va a medir (radiactividad, fluorescencia, color, turbidez, banda de precipitación, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, etcétera). - Estado de la lámpara de los microscopios de fluorescencia, lámpara y filtros del espectrofotómetro, cristal de centelleo y foto multiplicador (PMT), en el caso del contador de pozo (Gamma Counter) para la medición de radioisótopos y el PMT de los instrumentos de quimioluminiscencia y electroquimioluminiscencia.

- Pérdida de eficiencia de la capacidad de separación a causa de la platina magnética en los ensayos de separación magnética. - Iluminación ambiental en el lugar de trabajo con técnicas de EIA, ELISA e IF. - Entrenamiento y experiencia del operario. 4. Como se evidencia que el Laboratorio entrega resultados confiables? Las consecuencias de un resultado equivocado repercuten no solo en el tratamiento del paciente sino también en los costos de malos procedimientos que asumen los proveedor de salud, actualmente se encuentra personal capacitado en los procesos de verificación de la calidad y la competencia técnica en los laboratorios clínicos, que pueden realizar auditorias. Mediante la existencia de certificados de entidades como el Organismo Nacional de Acreditación de Colombia (ONAC), que cuentan con auditores expertos que garantizan el cumplimiento de la normatividad relacionada con requisitos específicos para laboratorio clínico como la ISO 15189. La acreditación de pruebas mediante esta norma, conlleva a evidenciar indicadores internacionales de índice de confiabilidad de cada una de las pruebas que se acreditan. 5. Que información ofrece la descripción del código CUPS referente a los examenes de Laboratorio? El nombre del examen que se requiere, pero principalmente la técnica con la cual quiere que se le realice la prueba, ejemplos 902207

HEMOGRAMA I [HEMOGLOBINA, HEMATOCRITO Y LEUCOGRAMA] METODO MANUAL +

902208

HEMOGRAMA II [HEMOGLOBINA, HEMATOCRITO, RECUENTO DE ERITROCITOS, ÍNDICES ERITROCITARIOS, LEUCOGRAMA, RECUENTO DE PLAQUETAS E INDICES PLAQUETARIOS] METODO MANUAL Y SEMIAUTOMATICO +

902209

HEMOGRAMA III [HEMOGLOBINA, HEMATOCRITO, RECUENTO DE ERITROCITOS, ÍNDICES ERITROCITARIOS, LEUCOGRAMA, RECUENTO DE PLAQUETAS, INDICES PLAQUETARIOS Y MORFOLOGÍA ELECTRONICA] METODO AUTOMATICO +

902210

HEMOGRAMA IV [HEMOGLOBINA, HEMATOCRITO, RECUENTO DE ERITROCITOS, ÍNDICES ERITROCITARIOS, LEUCOGRAMA, RECUENTO DE PLAQUETAS, INDICES PLAQUETARIOS Y MORFOLOGÍA ELECTRONICA E HISTOGRAMA] METODO AUTOMATICO+

En estudios de comparación de técnicas se ha encontrado una variación entre el método manual y el automatizado en el contaje de células: ARAMETRO

%CV MANUAL

Recuento de Leucocitos

11.8 – 25.2

Recuento de Plaquetas

22.0 – 60.0

%CV AUTOMATIZADO

< 2.0 < 4.0

En el método manual no se cuenta con controles de calidad “Confiables” para verificar los resultados. En equipos automatizados se puede verificar el resultado mediante controles confiables que permiten “acreditar la prueba “

901001

ANTIBIOGRAMA (DISCO)

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ANTIBIOGRAMA (MIC) MÉTODO AUTOMÁTICO

901003

ANTIBIOGRAMA (MIC) MÉTODO MANUAL

Los discos son muestras de antibióticos, la lectura del halo no es confiable, son almacenados por largo tiempo incidiendo en la sensibilidad de la concentración, no hay disponibilidad de un buen número de antibióticos ni ofrece diferentes concentraciones para el mismo antibiótico, no se pueden aplicar más de 8 sensidiscos en la placa. Puede presentar reacción cruzada por acercamiento de los halos de reacción. (MIC) Mínima Concentración Inhibitoria, se utilizan galerías de antibióticos de concentraciones garantizadas, específicos tanto a cada cultivo como al grupo de microorganismos de metabolismo similar, se presentan diferentes diluciones para el mismo antibiótico, con una buena variedad de opciones por familia de antibióticos que permiten ofrecer desde primera hasta última generación. Cada antibiótico corre separadamente y la reacción es de turbidez. 903026

MICROALBUMINURIA POR EIA +

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MICROALBUMINURIA POR NEFELOMETRÍA +

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MICROALBUMINURIA POR RIA +

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MICROALBUMINURIA POR TURBIDIMETRIA +

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PROTEÍNA C REACTIVA, CUANTITATIVO DE ALTA PRECISION

906914

PROTEÍNA C REACTIVA, PRUEBA SEMICUANTITATIVA

Las proteínas son moléculas complejas y varias de ellas de baja concentración, se requieren técnicas que permitan la formación de complejos inmunes, las que utilizan enzimas para revelar el sustrato pertenecen al grupo de las EIA. La técnica Nefelométrica o Turbidimétrica requiere conformar partículas de complejo inmune y son iguales. Cualquiera de las técnicas anteriores garantizan un resultado confiable por ser Cuantitativas. Técnicas como cromatografía de afinidad, látex, inmunoprecipitación, inmunodifusión radial IDR, son cualitativas y no garantizan medidas exactas. Si en la orden de solicitud solo se nombra el examen este se asimila al código menor o sea a la técnica menos confiable, si se agrega la palabra “Cuantitativo” se asimila a los códigos de EIA. Mas información CONTACTENOS.

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respecto:

www.laboratoriobolivar.com

GRACIAS Alix Bolivar Grimaldos Gerente Laboratorio Clínico de Especialidades Bolivar.

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