INFORME DE  PRÁCTICAS  Biotecnología       

Mónica Benito Muñoz      Informe de prácticas

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Mónica Benito Muñoz

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ÍNDICE

Introducción

............................................................................................................... 1

El entorno de trabajo .................................................................................................. 1 Distribución del laboratorio

Técnicas

........................................................................................................... 2-5

Electroforesis Purificación del DNA ( GENECLEAN®) Extracción de DNA plasmídico PCR Purificación de plásmidos ( high puritys) Western-blot Extracción de DNA de sangre Otras tareas

Evaluación personal ............................................................................................ 6 y 7

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INTRODUCCIÓN La realización de las prácticas, durante el periodo de un mes, en el laboratorio de Medicina Molecular de la facultad de medicina y en el centro de Investigación del Cáncer me han servido para ampliar y afianzar los conocimientos adquiridos en el curso académico y poder coger cierta destreza en el manejo de las técnicas habituales usadas en el laboratorio. Además, el hecho de trabajar en un equipo en el que cada cual tiene su propia línea de investigación, me ha permitido recibir mucha variedad de ideas. Otro concepto importante adquirido es que la motivación es un factor esencial si te quieres dedicar a la investigación, y aunque el trabajo sea largo y laborioso al final obtienes la merecida recompensa.

EL ENTORNO DE TRABAJO El centro de Investigación del Cáncer (CIC) está formado por distintas unidades: bioinformática; marketing y comunicación; investigación básica, aplicada y clínica; unidad administrativa y unidad técnica y de servicios; que permiten una amplia disposición de tecnología al alcance de los investigadores. Este centro está patrocinado por diversas entidades como la universidad de Salamanca, el CSIC (Consejo Superior de Investigaciones Científicas ), consejería de Sanidad y Educación de la Junta de Castilla y León... El objetivo del centro es realizar una investigación puntera en cáncer a nivel básico, aplicado y clínico, que se ve reflejado en las numerosas publicaciones en revistas de reconocido prestigio. Algunos de los laboratorios del centro, están unidos con departamentos de la facultad de medicina; como es el caso de la unidad de medicina molecular a cargo del Dr Rogelio González Sarmiento, en la que realicé la estancia de prácticas. DISTRIBUCIÓN DEL LABORATORIO La tecnología disponible en el laboratorio está accesible para cualquier trabajador, siendo él mismo responsable de su buen uso ( precaución con el material, limpieza...). El departamento cuenta con una serie de salas especiales como la sala fría (para el mantenimiento de placas), la de cámara oscura (para el revelado en el western-blot), otra tiene una serie de congeladores a distintas temperaturas donde hay stocks de bacterias, tejidos tumorales... Entre el material disponible existen una serie de centrífugas ( para eppendorf, falcon, tubos de ensayo); termocicladores ( para las PCR); cubetas, soluciones y electrodos para la electroforesis, además de la máquina de luz UV para la visualización de los geles, las cámaras de flujo laminar para la realización de muchas técnicas entre ellas PCR, réplicas de placas...(de este modo evitamos la contaminación en la medida de lo posible); el manifold para purificar plásmidos (high puritys), cámaras a distintas temperaturas, con y sin agitación, vortex , el nanodrop( en el CIC) para conocer la concentración de DNA (útil antes de secuenciar, porque si no es probable que no sea fiable la lectura de la secuencia a determinar)....Además de todos los reactivos necesarios para las reacciones, pipetas, material de vidrio y plástico...

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TÉCNICAS Mi trabajo en el laboratorio ha consistido en la familiarización con las técnicas más habituales usadas (que comentaré a continuación), además he aprendido el manejo de algunos programas informáticos que permiten localizar promotores, sitios de restricción, transcribir y traducir secuencias de DNA, ver conformaciones de las proteínas...;en conclusión, estos programas nos facilitan el trabajo enormemente; ya que por ejemplo permiten elegir los cebadores específicos más apropiados según los promotores estudiados. Otra labor realizada, previa a algunas técnicas, ha sido el estudio de los vectores de clonación y expresión, para buscar los sitios únicos donde cortan las enzimas de restricción y poder ligar el inserto de interés ( que deberá estar en fase con el vector, tener las secuencias específicas para que se exprese...).

ELECTROFORESIS

Es una técnica usada para la separación de moléculas en base a su tamaño y carga eléctrica, las muestras se colocan en los pocillos de un gel que puede ser de agarosa, agar-agar o acrilamida, y luego se someten a una corriente eléctrica que separará las moléculas, en el caso del DNA como la carga que presenta es negativa migrará hacia el polo positivo (por eso debemos tener cuidado al colocar los electrodos porque las muestras se pueden salir del gel ). El procedimiento consta de una serie de pasos; en nuestro caso los geles usados eran de agarosa que permite una resolución de fragmentos de DNA de 100 pb a 20-30 kb ( cuanto más baja es la concentración de agarosa se separan fragmentos de mayor tamaño). Para la preparación del gel a la concentración deseada (en función de las moléculas a separar) se pesa la agarosa y se disuelve en tampón TBE ( es necesario el microondas para que se disuelva), luego se le añaden unas gotas de un compuesto -Saiber -( antes se utilizaba el bromuro de etidio que es mutagénico) que nos va a permitir discriminar los fragmentos, se prepara el recipiente con los peines donde se va a añadir la solución del gel y se deja solidificar, después se quitan los peines y se cargan las muestras en los pocillos ( en mi caso DNA previamente digerido con enzimas de restricción) y además se carga también un marcador de peso molecular para determinar el tamaño de las muestras. Las muestras deben haberse puesto en los pocillos con un tampón de carga. El proceso de carga de las muestras se realiza en la cubeta con el tampón TBE. Finalmente se colocan los electrodos y se deja correr la electroforesis ( la rapidez en correr la electroforesis es función del voltaje aplicado). La visualización de los fragmentos se realiza con una lámpara de luz UV, además está acoplada a un equipo informático que permite fotografiar el gel, de esta manera es mucho más fácil el manejo con la copia fotográfica que con el propio gel. En algunas ocasiones se observa la zona inferior difuminada, eso es porque las muestras no eran sólo DNA y lo que se observa normalmente es RNA. La electroforesis es una técnica fundamental en el laboratorio y previa para muchas de las otras técnicas, en mi caso para detectar si los plásmidos contenían el inserto de interés.

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¾ Después de observar los fragmentos en el gel, si hay alguno que me interese puedo purificar el DNA, el kit usado en el laboratorio es GENECLEAN®. El proceso a seguir es el siguiente: -Cortar la zona del fragmento que nos interese bajo luz UV para poder visualizarlo y pasarlo a un tubo de polipropileno -Se añade una solución de NaI (los volúmenes añadidos van en función del peso de la banda cortada) y se pone al baño a 45º hasta que la agarosa se disuelva -Se añade EZ-GLASSMILK® , en función de los volúmenes anteriores, a la solución de agarosa y NaI y se incuba a temperatura ambiente, este paso va a hacer que las moléculas de DNA se unan a la matriz de sílice y se forme un pellet -Centrifugación a 14000g durante 5 segundos, después se añade NEW Wash y se resuspende con la pipeta -Centrifugación a 14000g durante 5 segundos y repetir el lavado -Quitar el sobrenadante y dejar secar el pellet -Se hace un último lavado con agua y se centrífuga a 14000g durante 30 segundos. Este Kit permite obtener el DNA con un grado de pureza elevado. El DNA obtenido puede ser usado en siguientes experimentos o almacenado.

¾ Otro método que he utilizado para extracción de DNA, en este caso plasmídico, a partir de cultivos de E.coli en medio LB se basa en la rotura de las células mediante lisis alcalina. El proceso consiste en una centrifugación a 12000g durante 30 segundos del cultivo de E.coli, luego se elimina el sobrenadante( sin tocar el pellet) y se resuspende con la solución de Resuspensión( que lleva Rnasa) por vortex, después se añade la solución de lisis que permitirá la salida del contenido celular, seguido se añade la solución de precipitación y neutralización que hace precipitar las proteínas y el DNA genómico, centrifugación en una microcentrífuga, pasar el sobrenadante( que contiene el DNA plasmídico) a un microtubo nuevo que contenga isopropanol, se centrífuga para precipitar el DNA plasmídico, se retira el sobrenadante y se deja secar. Finalmente se resuspende el DNA en TE o agua estéril. En algunas ocasiones hemos obtenido poca cantidad de DNA porque la lisis fue muy prolongada. ¾ En mi caso, el DNA lo usamos para realizar reacciones de PCR( reacción en cadena de la polimerasa), con lo cual obtendremos muchas copias del DNA plasmídico de interés( que tendrá el inserto) y con el que luego podremos transformar a bacterias. Para la realización de PCR se utiliza el kit Master Mix que permite amplificar en el rango de 0,2-2 kb, la técnica consiste en preparar una solución que contenga la Taq polimerasa, los dNTPs, buffer para la enzima, upstream primer, downstream primer, dH2O, MgCl2 (necesario para que la enzima funcione) y el DNA molde; algunos de estos compuestos vienen preparados en una solución (PCR Master Mix), aunque depende de la casa comercial. Después la mezcla es introducida en el termociclador y se produce la reacción en cadena (hay que programar el termociclador dependiendo de la

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muestra). La serie de reacciones que ocurren en el aparato son: desnaturalización a alta temperatura (que permite a las dos cadenas del DNA separarse), anillamiento de los primer a la cadena molde, extensión de la cadena gracias a la Taq polimerasa y los dNTP que participan en la formación de la nueva cadena y refrigeración; esta serie de ciclos se repite un numero determinado de veces y se obtienen muchas moléculas copia de la que pusimos como molde (el número de copias aumenta exponencialmente). La programación consiste en poner el tiempo y la temperatura a la que queremos que ocurra cada etapa. El número de ciclos no es ilimitado, ya que al final existen muchas moléculas de DNA y pocos cebadores, así que el proceso ya no es eficaz. Después de hacer la PCR, las muestras se corren en una electroforesis para comprobar que realmente se han amplificado; para ello es necesario realizar la PCR no sólo con la muestra sino también con un control negativo( al que no se ha añadido el DNA a amplificar); de esta forma nos aseguramos que no haya datos falsos por posibles contaminaciones (por RNA...).

¾ Otra técnica que he usado mucho es la purificación de plásmidos (protocolo midiprep, high puritys), para ello es necesario preparar un cultivo líquido con ampicilina en un matraz autoclavado y añadir el palillo con el que hemos picado la colonia, luego se deja el matraz en agitación. Al día siguiente se centrífuga, eliminas el sobrenadante y al precipitado que te queda le añades la solución de resuspensión y la de lisis (se puede apreciar en este paso que la solución se vuelve viscosa por la rotura celular), también se añade más tarde la solución de neutralización y se centrífuga, el resultado es que los restos celulares van a quedar adheridos al tubo y en el sobrenadante el DNA. Después llevamos el sobrenadante al manifold, aparato que se basa en una serie de columnas sobre las que se ejerce un vacío, en realidad cada columna está compuesta de dos tubos: uno en el que se va a limpiar la solución y otro en el que queda retenido el DNA, y se aplica el vacío, después de que ha pasado todo el líquido nos quedamos con el tubo que contiene el DNA, a este tubo añadimos unas soluciones de lavado. Después de que esté seco se pone la columna en un falcon al que añadimos agua libre de nucleasas y se centrífuga; al final obtenemos el plásmido purificado. Este plásmido ya está listo para la transformación a bacterias.

WESTERN-BLOT Sin duda, la técnica que más he aprendido a manejar es el western blot, debido a que el trabajo de investigación de la persona con la que estaba en el laboratorio se basaba en proteínas. Para la realización de un western es necesario preparar en primer lugar los geles de acrilamida y realizar una electroforesis. Los geles en realidad son dos, uno que se añade primero y queda en la parte inferior de los cristales (resolving: sirve para separar las proteínas por tamaño) y otro que se añade encima (stacking: sirve para poner todas las proteínas en la misma línea y que empiecen a correr a la par). El proceso a seguir es echar entre los cristales la solución de resolving hasta un límite y encima se añade isopropanol, se deja solidificar, después se quita el isopropanol y se echa la solución de stacking, se colocan los peines (sin formar burbujas)y se deja solidificar. Las muestras (con el tampón de carga) se colocan en el baño a 100º y después se les da un spin y se meten en hielo. La electroforesis tiene lugar en la cámara fría, debido a que

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las muestras son proteína y se pueden desnaturalizar con el calor desprendido por la corriente eléctrica. Se colocan los geles dentro de la cubeta, se añade el runnig buffer, se cargan las muestras y el marcador y se pone a correr. El siguiente paso es la transferencia de las proteínas del gel (ya separadas por la electroforesis) a una membrana, para ello es necesario desactivar la membrana con metanol y seguido se hacen unos lavados con agua destilada. Es muy importante marcar la membrana para saber luego la colocación de las proteínas. Para la transferencia es necesario colocar en el aparato el gel, la membrana y papeles whatman a modo de “sandwich” (previamente se incuban con un buffer de transferencia). Cuando acabe la transferencia se pone la membrana en una solución de bloqueo que lleva BSA, transcurrido el tiempo se pone en una bolsita: la membrana, la solución de bloqueo y el anticuerpo (Ac) primario; la bolsita se deja agitando un tiempo y antes de poner en contacto el Ac secundario con la membrana, se realizan una serie de lavados (para eliminar el Ac primario que no se haya pegado a la proteína), después del Ac secundario también se realizan unos lavados. El fundamento de la unión de los anticuerpos reside en que en las proteínas existen antígenos con los que interacciona el Ac primario específico, a éste se une un Ac secundario menos específico; y este Ac secundario se une a su vez a una enzima (peroxidasa) que va a permitir la detección de la proteína, ya que con determinados sustratos reacciona y el producto tiene alguna característica que permite la visualización. El último paso es el revelado de la membrana que consiste en colocar las membranas sobre una radiografía e incubar con el reactivo de revelar, después se colocan las películas encima de la membrana y todo ello en un cassete (cuando estemos trabajando con las películas es necesario estar a oscuras porque sino se velan).Transcurrido unos minutos se saca la película y se pone en una bandeja con líquido revelador hasta que aparezca algo, luego se pasa a otra bandeja con agua y finalmente a la bandeja con líquido fijador. Se seca la membrana y ya podemos observar nuestras proteínas. La operación se puede repetir con una nueva película si no nos ha salido bien, ya que la peroxidasa sigue actuando durante un tiempo.

¾ Otra técnica muy utilizada es la secuenciación automática (se realiza en el CIC) pero sólo es necesario preparar las muestras, las cuales se introducen en un aparato y directamente el sistema informático te ofrece un cromatograma, que puede ser analizado por diversos programas informáticos. ¾ Durante el periodo de prácticas también realicé extracción de DNA de sangre periférica. La sangre procede de pacientes del hospital que quieren colaborar; cuando llega una muestra es preciso anotar todos los datos (edad, sexo, enfermedad...). El proceso a seguir consiste en centrifugar los tubos según vienen del hospital, el resultado es un tubo en el que se pueden distinguir tres capas: una superior que es plasma, una intermedia que son glóbulos blancos y una inferior que son los glóbulos rojos. El siguiente paso es aspirar con una pasteur de plástico los glóbulos blancos y pasarlos a otro tubo, se rellena con agua destilada y se centrífuga, decantamos y nos quedamos con el pellet de células, se vuelve a repetir el proceso de rellenar de agua, centrifugación y decantación. Para realizar centrifugaciones es necesario equilibrar los tubos en una balanza antes de introducirlos en la centrífuga donde se deben colocar enfrentados o distribuidos de tal manera que no haya un desequilibrio porque puede

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estropear la balanza. Al pellet obtenido se le añade FORNACE (tampón), centrifugamos, decantamos y al botón celular se le echa FORNACE, EDTA, proteinasa (para las proteínas de la membrana), SDS (para romper los lípidos de la membrana) y se pone en el baño a 55º hasta el día siguiente. Transcurrido ese tiempo, se sacan del baño y se les echa fenol y CIAA 50:50, la mezcla se somete a centrifugación, después se recoge la fase de arriba (donde está el DNA) y se pasa a otro tubo donde se echa CIAA y se vuelve a centrifugar. Se vuelve a recoger la fase de arriba y se pasa a un tubo Corex al que se le añade etanol absoluto frío para precipitar, y se invierte el tubo hasta que aparezca el DNA, luego se pesca con una pasteur y se pasa a un eppendorf, se centrífuga, se decanta y se lava con etanol, luego se deja secar y se resuspende en agua destilada. En algunas ocasiones es necesario extraer el RNA de las muestras de sangre y para ello hay un protocolo distinto. ™ Otras tareas que he podido realizar en el periodo de prácticas son la preparación de soluciones ( en muchas ocasiones éstas vienen preparadas pero es necesario hacer diluciones, añadir algún reactivo...y para ello es muy importante hacer bien los cálculos porque si no todo el stock estaría mal preparado y sería una fuente de errores en la investigación), preparar cultivos líquidos de bacterias, sembrar placas con el asa de siembra, desmontar las pipetas para limpiarlas...

EVALUACIÓN PERSONAL Durante mi estancia en el laboratorio he conseguido ampliar mis conocimientos académicos, aunque este hecho es muy importante, no es el único, ya que he conseguido trabajar en un equipo y me he dado cuenta que la colaboración entre los miembros del mismo es necesaria, ya que hay problemas que se pueden solucionar con el hecho de hablar con la gente que ha trabajado sobre lo mismo. Algunos de los problemas que se me han presentado han sido por trabajar en un ambiente no suficientemente estéril. Esta inserción en el mercado laboral me ha aportado cierto conocimiento del funcionamiento y estructura de las empresas biomédicas; además he visto la gran importancia que cobra el campo de la bioinformática, ya que muchas técnicas no serían posibles sin la existencia de un equipo de alta tecnología que permite interpretar procesos y reacciones de elevada complejidad, que sin estas herramientas y programas sería imposible de analizar con tanta rapidez y eficacia. El trabajo en investigación es arduo, porque aparte de buscar información sobre el proyecto y estar al corriente de las publicaciones que salgan, también debes realizar una larga tarea en el laboratorio. Además, en algunas ocasiones el proceso se complica más de lo necesario porque las técnicas usadas no producen los resultados esperados o simplemente no funcionan, y aparte de la tarea de volver a repetirlas tienes que investigar el motivo por el cual dicha técnica no ha ido bien, e ir probando con pequeños ajustes hasta poner la técnica a punto. Otro factor muy importante es la organización, tanto con el material usado como en la realización de las tareas, es preferible perder un tiempo en la planificación porque muchas de las técnicas llevan tiempos de espera largos. En un proyecto de investigación

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es esencial tener claros los objetivos y llegar hasta el final de ellos, aunque las líneas de investigación pueden variar con resultados inesperados. En el laboratorio se conceden ayudas económicas a las investigaciones, por eso se deben realizar con anterioridad presupuestos para poder disponer de todo lo necesario para llevarla a cabo, y por ello se debe tener en cuenta los materiales y reactivos usados, ya que muchos de ellos son muy caros, como los Ac, de los que se hacen diluciones para que duren más tiempo. El período de realización de las prácticas ha sido muy útil porque me ha aportado soltura en el manejo de muchas técnicas, gracias a la libertad que me han dado para poder realizar las cosas por mí sola, dándome confianza y siendo consciente de los errores cometidos. La duración de las prácticas me ha parecido oportuna para tener un primer contacto con el laboratorio y conocer cómo funciona realmente, ya que las prácticas de las asignaturas que se realizan durante el curso académico no te permiten tomar tanto contacto, lo cual es lógico debido a que somos más personas y es menos tiempo. La explicación de las técnicas la he realizado a grosso modo, ya que no consideraba necesario dar tantos detalles sobre las cantidades, los tiempos necesarios...porque para eso están los protocolos que lo explican con gran profundidad y que además dependiendo de la casa comercial esos datos varían. Simplemente quería reflejar una idea general del trabajo práctico que he realizado en el laboratorio, ya que en un mes se realizan muchas tareas. Esta experiencia me ha resultado positiva, no sólo por los conocimientos adquiridos, sino que también ha conseguido dar un enfoque a la carrera que hasta entonces no había tenido, lo cual es muy importante para empezar a decidirme por mi futuro.

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