INSTITUTO TECNOLÓGICO Superior de Apatzingán RESIDENCIAS PROFESIONALES CENTRO NACIONAL DE RECURSOS GENÉTICOS INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES, AGRÍCOLAS Y PECUARIAS

PROYECTO “Fomento y Operación del Subsistema de Recursos Genéticos Forestales dentro del Centro Nacional de Recursos Genéticos del INIFAP”

ALUMNO José Antonio Ramírez Sánchez

NOMBRE DE LA CARRERA Ingeniería Bioquímica

ASESOR EXTERNO Dra. Esmeralda Judith Cruz Gutiérrez

ASESOR INTERNO Biol. María Elisa Villaseñor Zamorano

Apatzingán Michoacán; Diciembre del 2015

Fomento y Operación del Subsistema de Recursos Genéticos Forestales dentro del Centro I.T.S.A. Nacional de Recursos Genéticos del INIFAP __________________________________________________________________________________________________________________

CONTENIDO 1.

INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 1 1.1

Megadiversidad ............................................................................................................. 1

1.2

Erosión genética............................................................................................................. 3

1.3

Conservación de recursos fitogenéticos. ....................................................................... 3

1.4

Subsistema de Recursos Genéticos Forestales (REGEFOR) ........................................... 4

1.5

Especie de importancia para el subsistema REGEFOR: Terminalia amazonia .............. 6

2.

JUSTIFICACIÓN....................................................................................................................... 7

3.

OBJETIVOS ............................................................................................................................. 8 3.1

Objetivo general............................................................................................................. 8

3.2

Objetivos específicos ..................................................................................................... 8

4.

PROBLEMAS A RESOLVER ...................................................................................................... 9

5.

METODOLOGÍA.................................................................................................................... 10 5.1

Recepción ..................................................................................................................... 10

5.2

Análisis de pureza ........................................................................................................ 11

5.3 Evaluación de la integridad física con el equipo de Rayos X ............................................ 11 5.4 Análisis de crecimiento fúngico y extracción de alas y testa. .......................................... 11 5.5 Desinfección superficial y establecimiento in vitro. ......................................................... 12 5.6 Enraizamiento in vitro ...................................................................................................... 14 5.7 Fase de aclimatación ........................................................................................................ 15 6.

DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS ............................................................... 15

7.

RESULTADOS ....................................................................................................................... 18 ii

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7.1

Desinfección superficial y establecimiento In vitro. .................................................... 18

7.2

Enraizamiento. ............................................................................................................. 20

7.3

Aclimatación. ............................................................................................................... 22

8.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .............................................................................. 23

9.

COMPETENCIAS DESARROLLADAS Y/O APLICADAS. ........................................................... 24

10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Y VIRTUALES ...................................................................... 25 ANEXOS ....................................................................................................................................... 31 LISTA DE CUADROS ......................................................................................................................iiii LISTA DE DIAGRAMAS ................................................................................................................. ivv LISTA DE TABLAS ......................................................................................................................... ivv

LISTA DE CUADROS Cuadro 1. Riqueza de especies para distintos grupos taxonómicos en México ....................... 22 Cuadro 2. Cuadrados medios y significancia estadística del porcentaje de contaminación y germinación de las semillas de T. amazonia introducidas a cultivo In vitro. ............................ 19 Cuadro 3. Germinación y contaminación de semillas de T. amazonia introducidas al cultivo In vitro. ........................................................................................................................................... 20 Cuadro 4. Cuadrados medios y significancia estadística del porcentaje de contaminación y germinación de las semillas de T. amazonia introducidas a cultivo In vitro. ............................ 21 Cuadro 5. Efecto de concentraciones de sales en el medio de cultivo, sobre el enraizamiento In vitro de brotes de T. amazonia. ............................................................................................ 22

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LISTA DE DIAGRAMAS Diagrama 1. Diagrama de flujo para el desarrollo de un protocolo de establecimiento, multiplicación y aclimatación de especies forestales In vitro. .................................................. 10 LISTA DE TABLAS Tabla 1. Contaminación y germinación in vitro. ....................................................................... 31 Tabla 2. Número de raíces y longitud promedio de tratamientos para enraizamiento in vitro. 31

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1. INTRODUCCIÓN 1.1 Megadiversidad México es un País Megadiverso, considerado entre los 17 Países con esa categoría, ocupa el 4° lugar mundial en biodiversidad, con un 10% del total de especies vivientes registradas en la actualidad. Lo anterior, no solo es motivo de orgullo Nacional, sino que también significa una grave responsabilidad, de cara al acelerado proceso de erosión genética que se ha experimentado a nivel global. El nivel de esta responsabilidad se magnifica si consideramos el hecho de que México es lugar de origen de géneros y especies animales y vegetales de importancia económica, social, ambiental y cultural (INIFAP, 2012). Su territorio alberga fauna y flora de dos regiones biogeográficas (neoártica y neotropical). Es un país tropical montañoso con un elevado número de endemismos, y presenta ambientes marinos templados en el Pacífico y tropicales en el Golfo de México y Caribe, lo cual significa que nuestro territorio es privilegiado en cuanto a la variedad de ecosistemas y variación genética en las especies. Asimismo, el país concentra entre 10 y 15% de las especies terrestres en sólo 1.3% de la superficie ambiental. México ocupa el segundo lugar mundial en cuanto al número de especies de reptiles, el cuarto lugar en anfibios, el segundo lugar en mamíferos, el undécimo en aves y posiblemente el cuarto lugar en angiospermas (plantas con flores). Además de ser una de las mayores del mundo, la biodiversidad de México cobra también importancia mundial, ya que muchas de las plantas cultivadas por el hombre son de origen mexicano (Plascencia et al., 2011). La diversidad mexicana se resume en el Cuadro 1.

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Cuadro 1. Riqueza de especies para distintos grupos taxonómicos en México Grupo taxonómico

Número de Especies Invertebrados

Artrópodos

85,740

Crustáceos

4,600

Insectos

77,900

Arácnidos

3,240

Subtotal

171,480 Vertebrados

Peces

2,122

Anfibios

361

Reptiles

804

Aves

1,250

Mamíferos

478

Subtotal

5,015 Plantas

Angiospermas

22,351

Gimnospermas

145

Pteridofitas

1,026

Briofitas (musgos y hepáticas)

1,480

Algas (macroalgas)

945

Subtotal

25,947

Hongos

6,000 – 120,000

Fuente: SEMARNAT, 2005.

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1.2 Erosión genética El término “erosión genética”, en ocasiones, se utiliza en un sentido estricto, es decir, para hacer referencia a la pérdida de genes o alelos. También se usa en un sentido más amplio, para referirse a la pérdida de variedades. De este modo, mientras que la erosión genética no implica necesariamente la extinción de una especie ni de una subpoblación, sí representa una pérdida de variabilidad y, por lo tanto, una pérdida de flexibilidad (FAO, 2011).

De acuerdo con el plan de acción del Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos para las Especies Subvaloradas y Subutilizadas (ETSS), se requiere un esfuerzo global que permita la revalorización y detenga la pérdida de estos recursos, con acciones concretas como recabar y compartir información, definir prioridades de atención, promover la producción y el uso, mantener la diversidad, acompañar la cadena de valor, fortalecer vinculaciones y capacidades, desarrollar políticas efectivas y mejorar la conciencia en la población (IPGRI, 2002).

1.3 Conservación de recursos fitogenéticos. La Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO), define a los Recursos Fitogenéticos como: Cualquier material de origen vegetal, incluido el material reproductivo y de propagación vegetativa que contiene unidades funcionales de la herencia, y que tiene valor real o potencial para la alimentación y la agricultura. Abarca también aquellas plantas que tienen valor real o potencial por sus propiedades medicinales, que son de importancia para la industria forestal (recursos genéticos forestales), o que son 3

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empleados como especias, hortalizas, para usos artesanales, fabricación de muebles o como plantas ornamentales (Maselli, 2013).

Los recursos fitogenéticos son la base de la subsistencia de la humanidad. Suplen las necesidades básicas y ayudan a resolver problemas como la pobreza y el hambre. Debido a su sobre explotación estos recursos se han ido agotando. Dada su vital importancia es necesario conservarlos para beneficio de las generaciones futuras y presentes.

Los recursos fitogenéticos se pueden conservar dentro o fuera de su hábitat natural, o combinando ambas alternativas. Fuera de su hábitat natural, los recursos fitogenéticos se conservan en bancos y colecciones de germoplasma (Jaramillo et al., 2000).

1.4 Subsistema de Recursos Genéticos Forestales (REGEFOR) En México el Centro Nacional de Recursos Genéticos (CNRG) resguarda recursos genéticos agrícolas, forestales, pecuarios, acuáticos y microbianos. Cuenta con un banco de germoplasma de semillas ortodoxas que resguarda 24100 accesiones de especies agrícolas y forestales, mientras que el Banco de Tejidos Propagados in vitro cuenta con 390 accesiones y 9500 unidades de germoplasma. Asimismo, se resguardan 8200 muestras de ADN en el Laboratorio de Genómicas, se conservan en el Área de Criogenia, 23600 unidades de germoplasma pecuario y acuático y de la misma manera se resguardan 2000 cepas microbianas de interés agrícola (INIFAP, 2012).

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Al mismo tiempo la Comisión Nacional Forestal (CONAFOR) cuyo objetivo es desarrollar, favorecer e impulsar las actividades productivas, de conservación y restauración en materia forestal, así como participar en la formulación de los planes, programas, y en la aplicación de la política de desarrollo forestal sustentable, produce y distribuye semilla y material vegetativo de procedencia conocida para la producción de planta de calidad y para el programa de reforestación, además de fomentar la conservación, tanto in situ como ex situ de los recursos genéticos forestales. Ambas instituciones (CNRG y CONAFOR) implementaron el subsistema de Recursos Genéticos Forestales con el objetivo de

realizar protocolos de establecimiento,

multiplicación y aclimatación de 39 especies forestales (19 coníferas y 20 latifoliadas), a partir de material vegetativo y semillas obtenidas de árboles plus con mayor diversidad genética representantes de cada especie dentro del cual se está realizando la multiplicación masiva mediante diferentes técnicas con el fin de obtener clones que mantengan su integridad genética para la reforestación en los diferentes estados de la Republica.

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1.5 Especie de importancia para el subsistema REGEFOR: Terminalia amazonia Entre las especies forestales nativas de México, Terminalia amazonia (Gmel.) Excell (sombrerete, tepesuchil, amarillón, guayabo volador,) ha generado mucho interés por su gran potencial de rápido crecimiento, adaptabilidad a condiciones difíciles, como colinas y planicies costeras, suelos rojos o amarillos, lateríticos profundos, derivados de materiales aluviales o ígneos, características que la convierten en una especie clave para los programas de reforestación (Russo y Speranza, 2001). En México esta especie está restringida a la vertiente del golfo, desde el centro de Veracruz y norte de Oaxaca, al sur de la sierra, hasta el norte de Chiapas y la selva lacandona, así como en la región de los Chimalapas. Es una de las especies dominantes de la selva alta perennifolia. Su madera se emplea localmente para construcciones pesadas como puentes o vigas de casas (Pennington y Sarukhán, 2005). A pesar de que esta especie produce semilla sexual, presenta algunos inconvenientes como baja existencia de árboles semilleros, bajo porcentaje de germinación, largo periodo de germinación y semilla vana (Montero y Kanninen, 2005); en viveros la germinación comienza a los 20 días después de la siembra y se prolonga hasta los 55 días, obteniendo hasta un 14% de germinación, aplicando el tratamiento pregerminativo de sumersión de las semillas durante 24 horas en agua (Escuela Nacional de Ciencias Forestales, 2003). Como el éxito de las plantaciones forestales radica en la producción de maderas de excelente calidad y al igual que toda actividad agrícola, la siembra de material genético sobresaliente es el factor más decisivo en los resultados finales del proceso. Por lo tanto, la tendencia de la forestería moderna está dirigida hacia la siembra y cultivo de especímenes de alto rendimiento adaptados a ambientes específicos que permitan obtener los mayores 6

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rendimientos. La aplicación de técnicas biotecnológicas en este campo ha favorecido la producción masiva y el establecimiento de plantaciones de algunas especies forestales (Suárez, 2006). La micropropagación, utilizando material seminal como punto de partida, permite la producción de plantas con características genéticas similares (pero no idénticas) a la planta que les dio origen, contribuyendo así a que se mantenga la variación genética necesaria para la biodiversidad. Siendo además la micropropagación in vitro una de las técnicas más factibles de utilizar a corto plazo en el sector forestal pues permite un rápido aumento en el número de plantas, la producción de plántulas durante todo el año y la obtención de plantas con elevada calidad sanitaria (Scherer, 2006). 2. JUSTIFICACIÓN  Los recursos genéticos son un patrimonio invaluable para los países que los poseen, pues constituyen la base biológica de sus actividades económicas como la agricultura y producción forestal. La pérdida de ellos tendría grandes implicaciones para el desarrollo económico, social y cultural de un país.

 Mantener la biodiversidad disponible para futuras generaciones, es de vital importancia debido al desgaste del planeta y lo es más en cuestiones de recursos forestales, debido a que estos tardan mayor tiempo en alcanzar el nivel fisiológico de madurez.  Colaboración en la producción, protección y restauración de los recursos forestales

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3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo general Realizar un protocolo de establecimiento, multiplicación y aclimatación de la especie forestal Terminalia amazonia a partir de material vegetativo y semillas obtenidas de árboles plus representantes de la especie, realizando la multiplicación masiva mediante diferentes técnicas con el fin de obtener clones que mantengan su integridad genética para la reforestación en los diferentes estados de la Republica.

3.2 Objetivos específicos  Realizar protocolos de establecimiento, multiplicación y aclimatación de la especie Terminalia amazonia.  Determinar el método apropiado para la desinfección y el establecimiento de la especie T. amazonia proveniente de material seminal y de material vegetativo.

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4. PROBLEMAS A RESOLVER 4.1 Contaminación en la micropropagación: Uno de los problemas principales en la generación de protocolos de establecimiento in vitro es la contaminación del medio de cultivo destinado al desarrollo de los tejidos vegetales. Es por esto que se debe determinar el método adecuado para la desinfección, seleccionando los desinfectantes, el tiempo de desinfección según las características de la especie a tratar.

4.2 Enraizamiento del tejido vegetal: La micropropagación es uno de los métodos más eficientes para la producción masiva de especies vegetales, sin embargo el desarrollo del tejido radical in vitro de algunas de las especies es muy escaso o nulo (tal es el caso de las coníferas), es por ello que se deben realizar pruebas para seleccionar adecuadamente los medios de cultivo, sus concentraciones y complementar si fuera necesario con fitohormonas.

4.3 Aclimatación de los explantes. Los explantes desarrollados en condiciones in vitro son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso dependerá de la aclimatación. Es necesario formular un protocolo a seguir para la aclimatación y desarrollo ex vitro de los explantes.

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5. METODOLOGÍA

Diagrama 1. Diagrama de flujo para el desarrollo de un protocolo de establecimiento, multiplicación y aclimatación in vitro de especies forestales.

5.1 Recepción La recepción son las actividades relacionadas con la llegada y entrada de las accesiones de semilla al Laboratorio Agrícola Forestal Sección Semillas Ortodoxas. El registro es la asignación de un número de identificación único llamado número de accesión que permite ubicar cada muestra de semilla recibida en un banco de germoplasma y distinguirla de las demás (Rao et al., 2007).

.

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5.2 Análisis de pureza En el análisis de pureza; se determina el porcentaje de semilla pura (sin daños físicos), porcentaje de material inerte y el porcentaje de otras semillas en la muestra. Para ello, se pesó y registró la muestra total, se separó la semilla pura de la materia inerte (semillas dañadas físicamente, cortadas, picadas, quebradas y residuos de cascarillas), se registraron y pesaron ambas muestras. Una vez pesadas, la materia inerte se desechó y la semilla pura se almacenó para sus análisis posteriores (Rao et al., 2007).

5.3 Evaluación de la integridad física con el equipo de Rayos X Las semillas se sometieron a un análisis de integridad física mediante rayos X. Se colocaron de 30 piezas en la cámara de rayos X; la integridad se evaluó mediante las imágenes obtenidas, las cuales se observaron en la pantalla de una computadora y se clasificaron entre semillas llenas, semillas vacías, semillas dañadas físicamente y semillas dañadas por insecto. Al final se seleccionaron solo las semillas llenas y se desecharon las vacías (ISTA, 2014).

5.4 Análisis de crecimiento fúngico y extracción de alas y testa. Se eligieron 20 semillas al azar y se visualizaron bajo un estereoscopio cortes internos y externos para analizar el porcentaje del posible crecimiento de hongos, y así seleccionar el mejor pretratamiento de desinfección. Una vez determinado un alto porcentaje de crecimiento fúngico (80%) en las muestras se optó por retirar ala y testa componentes de la semilla de Terminalia amazonia, para así reducir su carga microbiana.

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5.5 Desinfección superficial y establecimiento in vitro. Para determinar el mejor método de desinfección superficial, se evaluó el efecto de un tratamiento control absoluto consistente de un enjuague con agitación constante de detergente Útil® a una concentración de 5 g L-1 en agua bidestilada estéril por 10 minutos, seguido de una inmersión con agitación constante en el fungicida selectivo comercial Amistar® a una concentración de 3 g L-1 suplementados con 5 gotas de Tween 20® L-1. Posteriormente se evaluó el efecto en la germinación y contaminación a dos tiempos (15 y 24 días) en 20 repeticiones y ocho tratamientos de desinfección, el control de contaminación y un control de germinación el cual se llevó a cabo colocando la semilla en cajas Petri de plástico con papel absorbente humedecido con agua bidestilada a razón de 5 semillas por caja. La exposición de las semillas con los reactivos fue en constante agitación y en condiciones asépticas en el interior de una cámara de flujo laminar, después de la utilización de cada reactivo se realizaron dos enjuagues con agua bidestilada estéril. Los tratamientos de desinfestación utilizados se muestran a continuación. Tratamiento 1. a) Inmersión en NaClO al 20% v/v suplementado con 5 gotas de Tween 20® L -1 durante 20 minutos. b) Inmersión en Etanol 70% v/v durante 1 minuto.

Tratamiento 2. a) Inmersión en NaClO al 20% v/v suplementado con 5 gotas de Tween 20® L -1 durante 20 minutos. b) Inmersión en Etanol 90% v/v durante 1 minuto.

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Tratamiento 3. a) Inmersión en NaClO al 20% v/v suplementado con 5 gotas de Tween 20® L -1 durante 20 minutos.

Tratamiento 4. a) Inmersión en NaClO al 25% v/v suplementado con 5 gotas de Tween 20® L -1 durante 20 minutos. b) Inmersión en Etanol 70% v/v durante 1 minuto.

Tratamiento 5. a) Inmersión en NaClO al 20% v/v suplementado con 5 gotas de Tween 20® L -1 durante 20 minutos. b) Inmersión en Etanol 90% v/v durante 1 minuto.

Tratamiento 6. a) a) Inmersión en NaClO al 25% v/v suplementado con 5 gotas de Tween 20® L-1 durante 20 minutos.

Tratamiento 7. a) Inmersión en Etanol 70% v/v durante 1 minuto.

Tratamiento 8. a) Inmersión en Etanol 90% v/v durante 1 minuto.

El material seminal tratado fue establecido en medio de cultivo descrito por Lloyd y McCown, (WPM) (1980) al 100 % de fuerza iónica, complementados con 2 % p/v de sacarosa, 1 mL L -1 de Plant Preservative Mixture (PPM)TM (Plant Cell Technology, Washington DC, USA), 1 g L-1 de Polivinil Pirrolidona (PVP)TM (Sigma, St. Louis, MO, USA) y solidificados con 7.5 g L-1 de 13

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AgarTM. El pH de los medios se ajustó a 5.8 antes de la esterilización en autoclave (121˚ C, 18 psi, durante 15 min). Cada semilla fue establecida en tubos de vidrio de 40 mL de capacidad conteniendo aproximadamente 5 mL de medio de cultivo a razón de una por tubo; posteriormente los tubos fueron cubiertos con tapas de plástico, sellados con Parafilm®, su rango de temperatura ideal está entre los 21 a 24 °C (Torres, G., Luján, R y Barca, S. A. 2002) es por ello que fueron almacenados a una temperatura de 24°C ± 1 con una intensidad lumínica de 40 µmol m-2 s-1 por un período de 16 horas diarias suministrada con lámparas de luz blanca fluorescente.

5.6 Enraizamiento in vitro Una vez germinado y evaluado el material seminal, los explantes fueron transferidos a condiciones ambientales similares pero en un medio control absoluto WPM y tres diferentes porcentajes de fuerza iónica (100%, 50% y 25%) adicionados con 2 % p/v de sacarosa, 1 mL L1

PPMTM, 1 g L-1 de PVPTM y solidificados con 7.5 g L-1 de AgarTM. El pH de los medios se ajustó

a 5.8 antes de la esterilización en autoclave (121 C, 18 psi, durante 15 min). Los tratamientos fueron distribuidos utilizando un diseño completamente al azar y después de tres semanas de cultivo, se registró el número de explantes que produjeron raíces y el número promedio de raíces producidas por cada explante.

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5.7 Fase de aclimatación Después de ser evaluada la etapa de enraizamiento, las plantas enraizadas fueron trasladadas hacia una cámara de aclimatación, donde se destaparon los frascos y se removió el agar de las raíces con agua corriente. Las plántulas fueron transferidas al azar a charolas de germinación de plástico con 48 compartimentos, conteniendo cada compartimento 30 g de sustrato estéril y húmedo compuesto de una mezcla de tres partes de peat moss, una parte de agrolita y una parte de vermiculita. Cada plántula trasplantada, se cubrió con un frasco de plástico (10 cm3) transparente para después almacenarse en la cámara a una temperatura de 26°C ± 1 y una humedad relativa del 70 % y a los siete días se removió el frasco. La aclimatación, se evaluó en el porcentaje de supervivencia y el desarrollo de las plantas. 6. DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS Análisis de Pureza: Se realizó el análisis de pureza en las especies Terminalia amazonia y Pseudotsuga menziesii. En este paso, se pesa la muestra inicial o accesión, con la ayuda de un diafanoscopio se separan en semilla pura, material inerte y otras semillas. Se registraron los resultados en formatos propios del CNRG. Evaluación de la integridad física mediante rayos X: Se usó un equipo de rayos X Faxitron® con la siguiente configuración; tiempo: 300 s; kV: 20. La mayoría de las semillas de las especies forestales tuvieron un tamaño medio y se colocaron en la tercera rejilla de la cámara de rayos X.

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Elaboración y esterilización de medio de cultivo Lloyd y McCown, (WPM) (1980) Se elaboró medio de cultivo Lloyd y McCown, (WPM) (1980) a diferentes porcentajes de fuerza iónica (150, 100, 50 y 25%) complementados con 2 % p/v de sacarosa, 1 mL L-1 de Plant Preservative Mixture (PPM)TM (Plant Cell Technology, Washington DC, USA), 1 g L-1 de Polivinil Pirrolidona (PVP)TM (Sigma, St. Louis, MO, USA) y solidificados con 7.5 g L-1 de AgarTM. El pH de los medios se ajustó a 5.8 utilizando concentraciones de ácido sulfúrico e hidróxido de sodio, ambas soluciones a 0.1 y 0.01 N, la esterilización se llevó a cabo en autoclave automática a 121˚ C y 18 psi durante 15 min. Desinfección superficial y establecimiento de material vegetal in vitro: Para la desinfección superficial se utilizó un tratamiento control absoluto para todas las muestras consistente en lavado con detergente comercial Útil® y posteriormente una inmersión en el fungicida selectivo Amistar®. Posteriormente se evaluó el efecto de diferentes tratamientos de desinfección para identificar el más adecuado para cada muestra, todos en cámara de flujo laminar. Se utilizaron dos concentraciones de cloro comercial (20 y 25% v/v) a un tiempo y en combinación con dos concentraciones de etanol (70 y 90% v/v). Para el establecimiento se utilizaron tubos de vidrio (10 cm3) con medio WPM previamente elaborados y esterilizados, en donde se colocaron las semillas a razón de una por tubo, posteriormente se sellaron con Parafilm® y se rotularon, todo lo anterior en ambiente aséptico dentro de una cámara de flujo laminar. Subcultivos de explantes cultivados in vitro a nuevos medios: Cuando un tejido cultivado in vitro alcanzaba su fase de explante y llegaba al tope del recipiente en el que se encontraba era momento de cortarlo y pasarlo a medio de cultivo nuevo, esto se hacía extrayendo el

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explante y cortando todas sus partes nodales, posteriormente cada parte nodal se colocaba en un nuevo tubo con medio para continuar con su desarrollo, todo esto en cámaras de flujo laminar. Esterilización de material contaminado: Semanalmente se extraía de las cámaras de almacenamiento de tejido in vitro todo el material que no paso la prueba de desinfección y se contaminó, bien fuera por hongo o por bacteria; se colocó todo el material en el autoclave y se le dio un ciclo de esterilización a 121°C y 18psi durante 25 minutos. Posteriormente fueron desechados los residuos y se pasó al lavado del material. Limpieza del material utilizado: Cada vez que se dejaba de utilizar, se lavó el material de cristalería y material de laboratorio. Registro de resultados: Los resultados de las pruebas evaluadas durante los 4 meses de estancia de residencias profesionales, se registraron en tablas de Excel y se presentan en el apartado de anexos mismos que se resumieron en los gráficos que se presentan en el apartado de resultados.

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7. RESULTADOS Durante el análisis de la semilla de T. amazonia bajo el estereoscopio, se encontró que presentaban un endocarpio fibroso, además de que en un 90% de las semillas se observó crecimiento de tejido fúngico (hifas, micelios y esporangios), es por esto que se optó por retirar los endocarpios fibrosos y utilizar un fungicida sistémico ya que éste afecta al hongo en varias etapas de su desarrollo, reduciendo así la carga microbiana antes de pasar a In vitro. En éste estudio se utilizaron cloro y

etanol como desinfectantes en diferentes

concentraciones ya que han probado ser muy efectivos para la eliminación de hongos y otros microorganismos (CIAT, 1991).

7.1 Desinfección superficial y establecimiento In vitro.

La semilla de T. amazonia se encuentra en el centro del endocarpio separado de éste por una delgada capa de aire, misma que brinda el espacio idóneo para la formación de ciertos tipos de hongos endógenos difíciles de eliminar si no se retira el mismo endocarpio. Esta característica particular de la especie hace suponer que en estado natural, en la estructura externa de la semilla se encuentran libres hongos y bacterias que la desintegran facilitándole el paso a la humedad, por lo tanto, si se extraen e inoculan en condiciones asépticas podrían germinar y desarrollarse in vitro sin peligro de contaminación. Sin embargo, carente de la protección que le brinda el endocarpio, la desinfección con agentes desinfectantes como el cloro puede afectar en el desarrollo y la germinación normal de la semilla. Los datos se analizaron con el paquete estadístico de SAS (SAS Institute Inc. 2013).

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Cuadro 2. Cuadrados medios y significancia estadística del porcentaje de contaminación y germinación de las semillas de T. amazonia introducidas a cultivo in vitro. FV

GL

CONT

GER

TRATAMIENTO

9

0.957777**

1.538333**

190

0.03210526

0.18710526

223.9743

77.93814

(TE) ERROR C.V. (%)

FV = Fuentes de variación; GL = Grados de libertad; CONT= Porcentaje de contaminación; GER = Porcentaje de germinación; *, ** = Significativo con Pr ≤ 0.05 y con Pr ≤ 0.01, respectivamente; ns = No significativo.

Entre los tratamientos de desinfección evaluados (Cuadro 2), se encontró una diferencia altamente significativa en cuanto a contaminación de la semilla (Probabilidad estadística (Pr) < 0.0001), donde los tratamientos más efectivos fueron en los que se utilizó solo Hipoclorito de Sodio a concentraciones 20 y 25% y solo etanol al 70 y 90% (T3, T6, T7 y T8) ya que permitieron el menor porcentaje en contaminación y el mayor porcentaje en cuanto a germinación (Cuadro 3), los demás tratamientos (T1,T2,T4 y T5) presentaron diferencia altamente significativa en cuanto a contaminación; sin embargo, no presentaron significancia ante la germinación . El índice de contaminación para los tratamientos con mayor efectividad se considera aceptable con respecto al control de contaminación (T9), sin embargo, con respecto al análisis Tukey en el programa estadístico SAS nos da como resultado que el mejor tratamiento con mayor índice de germinación y menor índice de contaminación fue el numero 7 (etanol 70%).

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Cuadro 3. Germinación y contaminación de semillas de T. amazonia introducidas al cultivo in vitro. Tratamiento

Semillas Germinadas

Semillas Contaminadas

(%)

(%)

T1 (CLORO 20+ALCOHOL 70)

30 d

0a

T2 (CLORO 20+ALCOHOL 90)

35 d

0a

T3 (CLORO 20)

75 a

0a

T4 (CLORO 25 +ALCOHOL 70)

30 d

0a

T5 (CLORO 25 +ALCOHOL 90)

25 d

5d

T6 (CLORO 25)

70 a

0a

T7 (ALCOHOL 70)

80 a

0a

T8 (ALCOHOL 90)

85 a

5a

CONTROL CONTAMINACIÓN

30

70

CONTROL GERMINACIÓN

95

0

(Pr < 0.0001)

7.2 Enraizamiento. Para las diferentes especies forestales se reportan diferentes concentraciones óptimas de macroelementos, microelementos y hierro. En Pinus counterei se observó un mayor índice en formación de brotes radicales con 1.5X la concentración normal de sales MS, mientras que en P. taeda este óptimo se alcanza con 0.5X (Bonga y Durzan 1985). En cipresillo (Prumnopitvs standleyi) su crecimiento no se vio afectado al inocularse en el medio MS con

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1X, 0.5X ó 0.25X la concentración de sales (Gamboa y Gamboa 1997). Esto confirma que muchas especies forestales requieren de una concentración específica de sales inorgánicas. En ésta etapa del proyecto, se determinó el efecto de la concentración de sales inorgánicas en el medio de cultivo sobre el enraizamiento del material. Se tomó como control el tratamiento con 0% WPM. Este se comparó con los tratamientos en que se aumentó la concentración de sales en el medio de cultivo, conforme éste se hizo más pobre en elementos minerales (Cuadro 5), el valor de las variables evaluadas disminuyo, obteniéndose una diferencia altamente significativa (Pr < 0.0001) en el número de raíces y su longitud promedio de los diferente tratamientos (Cuadro 4).

Cuadro 4. Cuadrados medios y significancia estadística del porcentaje de contaminación y germinación de las semillas de T. amazonia introducidas a cultivo In vitro. FV

GL

N RAIZ

LONG

TRATAMIENTO

4

5.920000**

3423.66027**

45

0.66666667

51.04037

39.25464

15991.45764

(TE) ERROR C.V. (%)

FV = Fuentes de variación; GL = Grados de libertad; N RAIZ= Número de raíces; LONG = Longitud promedio por raíz.*, ** = Significativo con Pr ≤ 0.05 y con Pr ≤ 0.01, respectivamente; ns = No significativo.

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Cuadro 5. Efecto de concentraciones de sales en el medio de cultivo, sobre el enraizamiento in vitro de brotes de T. amazonia. CONCENTRACIÓN MEDIO

RAÍCES/BROTES

LONGITUD PROMEDIO DE

WPM (%)

(#)

RAÍCES(mm)

T4 (150)

3a

45.241 a

T3 (100)

2.6 a

42.302 a

T2 (50)

2.2 a

42.085 a

T1 (25)

1.4 b

37.715 a

C (0)

1.2 b

0.98 b

Pr < 0.0001

7.3 Aclimatación. Los inhibidores o los cambios dramáticos en el pH del sustrato a donde se van a transferir los explantes enraizados in vitro pueden afectar adversamente el desarrollo de las raíces y el éxito en el trasplante, es por eso que uno de los sustratos más utilizados es el Peat Moss, mezclado con otros materiales que se degradan menos con el tiempo ya que su pH tiene menor variación (Chen, 1992-1993). Utilizando la mezcla 3:1:1 Peat Moss, vermiculita y agrolita respectivamente, se obtuvo un 90% de supervivencia en condiciones de invernadero, lo cual indica que fueron capaces de superar los cambios del lugar in vitro (condición heterótrofa) a las condiciones naturales de ser autótrofas. Aunque la aclimatación fue gradualmente acondicionada al invernadero, también existe el uso de micorrizas para optimizar su aclimatación (Alarcón et al. 2001).

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8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

 El tratamiento más efectivo para el establecimiento in vitro, con un efecto negativo mínimo en el índice de germinación y controlando la contaminación, consistió en retirar los endocarpios, lavar con detergente Útil® 5g L-1 durante 5 minutos, inmersión en Amistar® a una concentración de 3 g L-1 suplementados con 5 gotas de Tween 20® L-1 durante una hora y sumergir en etanol 70% por 1 min seguido de 2 enjuagues en agua bidestilada estéril, todo en constante agitación y en cámara de flujo laminar.

 El mayor número de raíces por explante y longitud promedio por raíz, se presentaron a mayor concentración de medio WPM. Para un enraizamiento rápido la mejor concentración fue de 150% la concentración normal del WPM.

 El 90% de las plántulas enraizadas in vitro lograron adaptarse a condiciones de invernadero utilizando una mezcla de Peat Moss, vermiculita y agrolita 3:1:1 respectivamente.

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9. COMPETENCIAS DESARROLLADAS Y/O APLICADAS. En el siguiente listado se mencionan las competencias desarrolladas y aplicadas durante el periodo del

proyecto “Fomento Y Operación Del Subsistema De Recursos Genéticos

Forestales Dentro Del Centro Nacional De Recursos Genéticos Del INIFAP ” en el Laboratorio Agrícola Forestal Sección cultivo de tejido in vitro y criopreservación, los cuales engloban temas de distintas materias como: Estadística, Aseguramiento de la Calidad, Química a Analítica, Taller de investigación, Biología, Microbiología, Bioquímica, Instrumentación y Control, Fisicoquímica, entre otras.  Preparación de soluciones porcentuales  Consulta a fuentes de información primaria y secundaria.  Manejo de gravimetría y volumetría.  Manejo de temperaturas, luz, humedad absoluta y humedad relativa en quipos de laboratorio y tejido vegetal.  Control microbiológico.  Conocimiento en fisiología de tejido vegetal.  Conocimiento de calidad de semillas y recursos genéticos.  Diseños Experimentales y análisis estadístico de resultados.  Buenas prácticas de laboratorio.  Asepsia en el área de trabajo.  Manejo de equipo de rayos X e interpretación de imágenes.  Manejo de equipos de disección en cámaras de flujo laminar.  Bioquímica de la respiración y metabolismo del tejido vegetal. 24

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10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Y VIRTUALES

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ANEXOS Anexo 1. Resultados de tratamientos de establecimiento y enraizamiento in vitro. Tabla 1. Contaminación y germinación in vitro. Tratamientos 1 2 3 4 5 6 7 8 CONTROL CONTAMINACIÓN CONTROL GERMINACIÓN

Contaminación (%) 0 0 0 0 5 0 0 5 70 0

Germinación (%) 30 35 75 30 25 70 80 85 30 95

Tabla 2. Número de raíces y longitud promedio de tratamientos para enraizamiento in vitro. Tratamiento Control Control Control Control Control Control Control Control Control Control 1 1 1 1

Repetición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4

Número de raíces 1 1 1 1 1 1 2 1 1 2 2 2 1 1

Longitud promedio (mm) 1.91 0.85 0.52 1.10 0.40 1.73 0.79 1.34 0.72 0.44 32.75 28.56 41.48 17.14 31

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1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

2 1 1 1 1 2 2 2 2 3 4 1 2 2 2 2 4 3 3 2 3 3 3 2 2 1 6 2 3 2 4 2 3 3 2 3

40.65 21.72 51.39 46.52 58.85 38.09 35.57 41.12 43.24 48.68 42.35 50.24 39.15 33.57 39.61 47.32 49.40 45.75 37.06 44.28 41.10 35.20 44.00 41.64 40.31 47.28 36.84 42.49 48.48 46.43 46.28 49.51 48.38 47.94 52.88 36.18

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