INSTITUTO TECNOLOGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY CAMPUS MONTERREY DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA

COMPARACIÓN DE NAPROXENO EN MEDICAMENTO DE PATENTE Y GENÉRICO INTERCAMBIABLE TESIS PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE: MAESTRO EN CIENCIAS ESPECIALIDAD EN QUÍMICA

POR: LIZETTE SUSANA HERNÁNDEZ CÁRDENAS

MONTERREY, N. L.

DICIEMBRE DE 2002

INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY CAMPUS MONTERREY DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA

COMPARACIÓN DE NAPROXENO EN MEDICAMENTO DE PATENTE Y GENÉRICO INTERCAMBIABLE

TESIS PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE MAESTRO EN CIENCIAS ESPECIALIDAD EN QUÍMICA

POR: LIZETTE SUSANA HERNÁNDEZ CÁRDENAS

MONTERREY, N.L.

DICIEMBRE 2002

ÍNDICE 1. Resumen

1

2. Glosario de términos

2

3. Introducción

4

4. Marco teórico

5

4.1 Antiinflamatorios no esteroideos

5

4.2 Naproxeno

6

4.3 Cromatografía líquida de alta resolución

11

4.4 Aplicación de HPLC en el análisis de suero

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4.5 Farmacocinética

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5. Material y equipo

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6. Metodología

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6.1 Procedimiento de extracción

20

6.2 Preparación de fase móvil

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6.3 Validación del método analítico

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6.4 Procedimiento de extracción de medicamentos

24

6.5 Procedimiento de análisis de naproxeno en suero

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7. Discusión de resultados

28

7.1 Resultados de la validación del método analítico

28

7.2 Resultados del análisis de medicamentos

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7.3 Resultados de la experimentación con voluntarios

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8. Conclusiones

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9. Bibliografía

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10. Anexos

40

Anexo 1: Tabulación de resultados Anexo 2: Norma oficial mexicana NOM-EM-003-SSA1-1998 Anexo 3: Certificado de análisis y toxicidad del estándar de naproxeno Anexo 4: Método analítico programado en el HPLC Anexo 5 Ejemplo de blanco y cromatogramas de naproxeno

1 RESUMEN El proyecto consiste en determinar la cinética de degradación del naproxeno (antiinflamatorio no esteroidal) en suero para poder establecer una comparación entre el medicamento de patente y el genérico intercambiable. Para lograr este objetivo se requiere hacer la validación de un método analítico, analizar la concentración de naproxeno en tabletas, evaluar el medicamento estándar en suero y después evaluar el de patente y el genérico intercambiable en voluntarios, estos análisis se llevaron a cabo utilizando un cromatógrafo de líquidos de alta resolución (HPLC) con detector de ultravioleta. Al analizar las tabletas de naproxeno, encontramos que las de patente mostraron recuperaciones cercanas al 100% en los lotes evaluados, en las de medicamento genérico un lote resultó con baja recuperación, y en las tabletas de medicamento similar, todos los lotes presentaron recuperaciones variables, lejanas a la concentración teórica. De los resultados obtenidos observamos que la velocidad de absorción en el medicamento de patente, para ambos voluntarios, fue mayor que la velocidad del genérico intercambiable. La velocidad de eliminación es muy similar en cada voluntario, independientemente del naproxeno suministrado. El área bajo la curva de la gráfica de concentración vs. tiempo del medicamento de patente es mayor que el genérico intercambiable. La concentración máxima se obtiene alrededor de 2 a 4 horas después de la ingesta y en ambos voluntarios el naproxeno de patente alcanza con mayor rapidez esta concentración. Los resultados obtenidos en esta investigación nos sirven como preámbulo para futuras investigaciones que evalúen un mayor número de casos y que de preferencia se incluyan los medicamentos similares dentro de la investigación.

2 GLOSARIO DE TÉRMINOS [1] Biodisponibilidad: Proporción del fármaco que se absorbe a la circulación general después de la administración de un medicamento y el tiempo que se requiere para hacerlo. Bioequivalencia: Ésta se presenta si dos medicamentos son equivalentes farmacéuticos y su biodisponibilidad, tras su administración en la misma dosis, es parecida hasta tal punto que sus efectos, con respecto tanto a la eficacia como a la seguridad, son esencialmente los mismos. Calibración: Conjunto de análisis que determinan, bajo condiciones específicas, la relación entre los valores indicados por un instrumento y los valores conocidos correspondientes a un patrón de referencia. Curva de calibración: Conjunto de concentraciones que describen el intervalo de trabajo en el cual se cuantificará el compuesto a analizar. Especificidad: La capacidad de un método para medir el compuesto a analizar en presencia de otros compuestos que están presentes en la muestra. Por ejemplo metabolitos, productos de degradación, etc. Estabilidad: La capacidad del compuesto a analizar, de conservar su concentración, desde el momento del muestreo hasta su análisis. Exactitud: La proximidad de los resultados obtenidos experimentalmente al valor real. Límite de cuantifícación: La concentración más baja del compuesto a analizar en la muestra, que puede ser cuantificada cumpliendo con los criterios de precisión y exactitud establecidos en el método específico. Límite de detección: La concentración más baja del compuesto a analizar en la muestra, cuya respuesta en el proceso analítico puede ser claramente diferenciada de los niveles básales de ruido. Linealidad: Es la capacidad de un método para dar resultados, directamente o por una transformación matemática bien definida, que son proporcionales a la concentración del compuesto a analizar dentro del intervalo de trabajo establecido. Matriz biológica: Material único de origen biológico el cual puede ser preparado de una manera reproducible; por ejemplo: sangre, suero, plasma, orina, heces, saliva, etc. Material de referencia: Material en el cual uno o más valores de sus propiedades son suficientemente homogéneos y bien definidos, que son proporcionales a la concentración del compuesto a analizar dentro del intervalo de trabajo establecido. Medicamento innovador: Aquel medicamento que cuenta con la patente original a nivel mundial.

Medicamento de referencia: Medicamento indicado por la Secretaria de Salud como tal, que cuenta con el registro de dicha dependencia, se encuentra disponible comercialmente y es seleccionado conforme a los siguientes criterios: Es medicamento innovador, o Producto con una correlación in vitro-in vivo establecida Producto cuya bioequivalencia está determinada Producto que cuente con el registro más antiguo ante la autoridad sanitaria Medicamento genérico intercambiable: El medicamento con el mismo fármaco o sustancia activa y forma farmacéutica, con igual concentración o potencia, que utiliza la misma vía de administración y con especificaciones farmacopéicas iguales o comparables, que después de cumplir con las pruebas requeridas, ha comprobado que sus perfiles de disolución o su biodisponibilidad u otros parámetros, según sea el caso, son equivalentes a las del medicamento innovador o de referencia, y que se encuentre registrado en el catálogo de medicamentos genéricos intercambiables y se identifique con su denominación genérica. Método: Grupo de procedimientos involucrados en la colección, procesamiento, almacenamiento, y análisis de uno o varios compuestos a analizar en una matriz biológica. Precisión: La concordancia de los valores obtenidos en un análisis, bajo condiciones establecidas previamente. Se evalúa como precisión intra análisis (en un solo día) e Ínter análisis (en varios días). Recobro: El resultado, expresado como por ciento, de la comparación de la respuesta del compuesto a analizar, adicionado de manera controlada a una matriz biológica y procesado de acuerdo con el método analítico, con respecto a la respuesta obtenida con una solución del mismo compuesto que no ha sido sometida al proceso. Repetibilidad: La precisión intra análisis. Reproducibilidad: Asegura la capacidad del método analítico de proporcionar resultados experimentales reproducibles cuando se somete a modificaciones que pueden presentarse durante la aplicación rutinaria, tales como diferentes analistas, diferentes instrumentos equivalentes, diferentes lotes de reactivos y/o consumibles, etc. Sustancia de referencia: Sustancia de uniformidad reconocida destinada a utilizarse en comprobaciones analíticas físicas, químicas o microbiológicas en el transcurso de las cuales sus propiedades se comparan con la sustancia en evaluación. Validación: Evidencia experimental documentada de que un método analítico cumple con el propósito para el que fue diseñado.

3 INTRODUCCIÓN Los medicamentos o fármacos son sustancias que curan enfermedades y alivian los síntomas que éstas causan. En la antigüedad, los medicamentos se extraían de las plantas y de ciertos animales. Hace más de 5,000 años, los chinos ya practicaban la herbolaria, que es el estudio de las plantas con valor medicinal. Actualmente esta ciencia está floreciendo en algunos países. Muchos medicamentos que se consumen en México se desarrollaron en laboratorios y su fabricación requirió diversos procesos químicos. Otros medicamentos son formas sintéticas de sustancias naturales; copias químicas idénticas a los modelos originales. Sin embargo, algunos medicamentos importantes aún se obtienen de fuentes animales o vegetales. Muchas sustancias se pueden fabricar en el laboratorio por medio de ingeniería genética. En este proceso que permite modificar los genes (reguladores del funcionamiento celular) de otros microorganismos, para cambiar los productos de la actividad celular. En la mayoría de los casos, los medicamentos que se producen en el laboratorio son más seguros y más efectivos que los que se obtienen de las plantas o de los animales. Todo nuevo medicamento debe obtener su registro sanitario de la Secretaría de Salud, a través de la Dirección General de Control de Insumos para la Salud (DIGECIS), que según el diario oficial de la federación del 31 de diciembre de 1992 es el organismo encargado de "elaborar y expedir las normas oficiales mexicanas para el proceso, uso, importación y exportación de medicamentos". [2] La DIGECIS autoriza la venta o distribución de un medicamento cuando se demuestre que las sustancias que éste contiene reúnen las características de seguridad y eficacia establecidas por la misma secretaria. La seguridad se comprueba haciendo pruebas en animales y en humanos voluntarios. La eficacia se comprueba mediante complejos análisis, como los llamados doble ciego. Un medicamento genérico intercambiable es un fármaco de calidad y eficacia demostrada, elaborado a partir de sustancias conocidas y que se comercializa con el nombre del principio activo correspondiente. Es decir, es un medicamento de igual composición cualitativa y cuantitativa que otro medicamento de referencia (original, de patente), cuyo perfil de eficacia y seguridad esta establecido. El medicamento genérico debe demostrar la equivalencia terapéutica con los correspondientes estudios de bioequivalencia, es decir con las mismas características cinéticas, dinámicas y técnicas que un medicamento que no está protegido por alguna patente y que se utiliza como referencia legal (estándar certificado). [1] Para poder determinar la bioequivalencia se recurre al análisis de biodisponibilidad, la cual, se basa en comparar concentraciones en suero del medicamento genérico y de patente administrado a un grupo de personas, esperando los mismo resultados, es decir, la biodisponibilidad indica la velocidad con la cual un ingrediente activo pasa de su forma farmacéutica (pastillas, cápsulas, etc.) a la sangre. Cuando dos medicamentos son bioequivalentes significa que tienen la misma biodisponibilidad. Los medicamentos genéricos intercambiables son más económicos que los medicamentos de patente. La bioequivalencia necesita de un método analítico para poderse desarrollar, actualmente se utilizan varios equipos instrumentales capaces de dar respuesta a esta necesidad, por ejemplo: cromatografía de gases, espectrometría de masas, cromatografía de

líquidos y recientemente cromatografía de líquidos de alta resolución. El análisis de medicamentos por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) presenta todas las ventajas de selectividad y sensibilidad de la propia técnica, con la más importante de permitir análisis de muestras multicomponentes. El número de trabajos de HPLC con aplicación clínica aumenta. Ya hay métodos casi clásicos en cromatografía líquida de alta resolución que detectan medicamentos y mezclas de ellos de moléculas de actividad semejante. [3] El objetivo de esta investigación es conocer la cinética de degradación del naproxeno (antiinflamatorio no esteroidal) en suero, utilizando humanos voluntarios para poder comparar el medicamento genérico con el de patente, conocer su bioequivalencia y biodisponibilidad, esto se llevará a cabo con ayuda de un HPLC con detector de ultravioleta. 4 MARCO TEÓRICO 4.1 ANTIINFLAMATORIOS NO ESTEROIDEOS Las enfermedades reumáticas son estados inflamatorios que afectan a un gran número de personas (unos 20 millones en los Estados Unidos). Este grupo de enfermedades pueden clasificarse como trastornos del tejido conectivo y pertenecen al complejo grupo de los estados autoinmunitarios. Comprenden la artritis reumatoide, osteoartritis, espondilitis anquilosante, gota, fiebre reumática, lupus eritematoso sistémico, psoriasis y poliartritis nodosa. Son estados crónicos, inflamatorios e incapacitantes, que pueden afectar a órganos únicos o a conjunto de ellos. El tratamiento se dirige principalmente al proceso inflamatorio. No obstante, la inflamación es una respuesta protectora normal y esencial, frente a cualquier estímulo nocivo que pueda amenazar al hospedador, puede variar desde una reacción localizada hasta una respuesta compleja que afecta al organismo. Como respuesta a un factor etiológico, se libera un gran número de sustancias (los denominados mediadores de la inflamación), sea sucesiva o secuencialmente, en el lugar afectado por la lesión o en diferentes orígenes celulares. Los numerosos mediadores de la inflamación que intervienen en el proceso inflamatorio y se elaboran en las células son, principalmente, la histamina, serotonina, enzimas lisosómicas, linfocinas y prostaglandinas. Los fármacos antiinflamatorios modifican la respuesta inflamatoria a las enfermedades pero no son curativos y no eliminan la causa subyacente de las mismas. Un fármaco antiinflamatorio ideal debería afectar únicamente a la inflamación normal, que es parte de las defensas del organismo frente a los microorganismos invasores y otras injurias ambientales. En los últimos veinte años, se ha llevado a cabo un gran esfuerzo de investigación dirigido al descubrimiento de antiinflamatorios no esteroideos con la eficacia terapéutica de los glucocorticoides, pero sin sus efectos indeseables. En la actualidad, las industrias farmacéuticas de los Estados Unidos tienen en fase de ensayo clínico unos sesenta compuestos, potencialmente útiles para el tratamiento de las enfermedades reumáticas. [4] Aunque se necesita una terapéutica mas adecuada de las enfermedades reumáticas, disponemos ya de fármacos que resultan beneficiosos. Estos productos alivian el dolor,

líquidos y recientemente cromatografía de líquidos de alta resolución. El análisis de medicamentos por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) presenta todas las ventajas de selectividad y sensibilidad de la propia técnica, con la más importante de permitir análisis de muestras multicomponentes. El número de trabajos de HPLC con aplicación clínica aumenta. Ya hay métodos casi clásicos en cromatografía líquida de alta resolución que detectan medicamentos y mezclas de ellos de moléculas de actividad semejante. [3] El objetivo de esta investigación es conocer la cinética de degradación del naproxeno (antiinflamatorio no esteroidal) en suero, utilizando humanos voluntarios para poder comparar el medicamento genérico con el de patente, conocer su bioequivalencia y biodisponibilidad, esto se llevará a cabo con ayuda de un HPLC con detector de ultravioleta. 4 MARCO TEÓRICO 4.1 ANTIINFLAMATORIOS NO ESTEROIDEOS Las enfermedades reumáticas son estados inflamatorios que afectan a un gran número de personas (unos 20 millones en los Estados Unidos). Este grupo de enfermedades pueden clasificarse como trastornos del tejido conectivo y pertenecen al complejo grupo de los estados autoinmunitarios. Comprenden la artritis reumatoide, osteoartritis, espondilitis anquilosante, gota, fiebre reumática, lupus eritematoso sistémico, psoriasis y poliartritis nodosa. Son estados crónicos, inflamatorios e incapacitantes, que pueden afectar a órganos únicos o a conjunto de ellos. El tratamiento se dirige principalmente al proceso inflamatorio. No obstante, la inflamación es una respuesta protectora normal y esencial, frente a cualquier estímulo nocivo que pueda amenazar al hospedador, puede variar desde una reacción localizada hasta una respuesta compleja que afecta al organismo. Como respuesta a un factor etiológico, se libera un gran número de sustancias (los denominados mediadores de la inflamación), sea sucesiva o secuencialmente, en el lugar afectado por la lesión o en diferentes orígenes celulares. Los numerosos mediadores de la inflamación que intervienen en el proceso inflamatorio y se elaboran en las células son, principalmente, la histamina, serotonina, enzimas lisosómicas, linfocinas y prostaglandinas. Los fármacos antiinflamatorios modifican la respuesta inflamatoria a las enfermedades pero no son curativos y no eliminan la causa subyacente de las mismas. Un fármaco antiinflamatorio ideal debería afectar únicamente a la inflamación normal, que es parte de las defensas del organismo frente a los microorganismos invasores y otras injurias ambientales. En los últimos veinte años, se ha llevado a cabo un gran esfuerzo de investigación dirigido al descubrimiento de antiinflamatorios no esteroideos con la eficacia terapéutica de los glucocorticoides, pero sin sus efectos indeseables. En la actualidad, las industrias farmacéuticas de los Estados Unidos tienen en fase de ensayo clínico unos sesenta compuestos, potencialmente útiles para el tratamiento de las enfermedades reumáticas. [4] Aunque se necesita una terapéutica mas adecuada de las enfermedades reumáticas, disponemos ya de fármacos que resultan beneficiosos. Estos productos alivian el dolor,

hinchazón e inflamación, con lo que capacitan a muchos pacientes con cuadros reumáticos ligeros o moderados para efectuar una vida prácticamente normal. Se trata de fármacos como la aspirina, el ibuprofeno, fenilbutazona, el naproxeno y los compuestos de oro entre otros. Debido a que los fármacos antiinflamatorios no esteroideos útiles en clínica presentan una gran variedad de propiedades químicas y físicas, se ha intentado comparar las propiedades bioquímicas de estos compuestos, con el fin de determinar los posibles modos de acción. Estos fármacos son polivalentes: son capaces de modular varios de los fenómenos moleculares o celulares que se suponen intervienen en el proceso inflamatorio. [4] El concepto más convincente podría ser que los antiinflamatorios presentan como característica común la capacidad de inhibir in vivo la prostaglandina sintentasa deteniendo la biosíntesis de prostaglandinas. [5] El desarrollo de fármacos antiinflamatorios se inició a fines del siglo antepasado, con el uso de los salicilatos. El interés por las pirazolonas durante la década de 1940 dio lugar al descubrimiento de la actividad de la fenilbutazona. Los años 50's fueron la década de los corticosteroides, seguida por un esfuerzo dirigido al desarrollo de sustancias no esteroideas carentes de los efectos secundarios indeseables, que culminó en los años 60's con la introducción de la indometasina y otros derivados arilacéticos. En la década de 1970 se comenzó a disponer de nuevos ácidos arilados; muchos laboratorios han abordado también la síntesis y evaluación de compuestos neutros de clases químicas distintas, lo que puede permitir nuevos tipos de terapia antireumática, probablemente de tipo inmunoreguladora o inmuno supresora. 4.2 NAPROXENO Derivado del ácido naftalenacético El naproxeno es un ácido propiónico antiinflamatorio introducido en los Estados Unidos en 1976; sus ventas durante el siguiente año se han estimado en 28 millones de dólares. Absorción, distribución, metabolismo y excreción El naproxeno es un fármaco ácido, muy enlazado a la albúmina plasmática. Tras su administración oral, se absorbe rápida y completamente. Su vida media es de 13 horas, muy próxima a la ideal para una administración dos veces al día. El único metabolito detectado en el hombre es el 6-desmetilnaproxeno. Tanto éste como el propio fármaco se excretan por la orina, principalmente como conjugados; el glucurónido es el más abundante. Modo de acción El naproxeno, como la mayoría de los restantes antiinflamatorios no esteroideos, inhibe la síntesis de prostanglandinas; éste es el mecanismo más probable para su acción. [5]

Usos terapéuticos y efectos secundarios En animales de experimentación, el naproxeno mostró una actividad antiinflamatoria 11 veces superior a la de la fenilbutazona, acompañada de una potencia analgésica y antipirética 1 y 22 veces superior a las de la aspirina, respectivamente. El naproxeno está indicado en el tratamiento sintomático de la artritis reumatoide. Un estudio comparativo de 2.4 g/día de fenprofeno, 2.4 g/día de ibuprofeno y 750 mg/día de naproxeno, para el tratamiento de la artritis reumatoide, ha indicado que el último fármaco posee la máxima actividad antireumática, la mayor aceptación por parte del paciente y la menor incidencia de efectos secundarios. Se obtuvieron resultados similares al comparar 500 mg/día de naproxeno con 3.6 g/día de aspirina. El naproxeno también es eficaz en el tratamiento clínico de la osteoartritis, espondilitis anquilosante y gota aguda. Preparados El naproxeno, también denominado Naprosyn y ácido (+)-6-metoxi-a-metil-2naftalenácetico, se prepara en comprimidos de 250 mg para su administración oral. El fármaco, un compuesto cristalino blanco, es liposoluble, prácticamente insoluble en agua a pH bajo, aunque completamente soluble a pH elevado. La dosis recomendada de naproxeno en la artritis reumatoide es de 250 mg, orales, dos veces al día (por la mañana y por la noche) acompañado de alimentos. No se recomienda el uso de dosis superiores a los 750 mg. [4] Relaciones estructura-actividad El diseño del naproxeno se realizó con la idea de concluir todas las características químicas de los fármacos antiinflamatorios preexistentes, un sistema aromático, un grupo ácido y una cadena lateral, aunque no debía contener un átomo de nitrógeno, que podría ser responsable de algunos efectos secundarios observados. En la figura 1 se muestra la estructura general del naproxeno.

Figura 1. Estructura del naproxeno

La modificación de la cadena lateral R en el núcleo nafltalénico demostró que la posición 6 era la más adecuada, con mayor actividad que los compuestos sustituidos en otras posiciones. Además, si la cadena lateral es mayor que un grupo OCH3 (o SCH3), la actividad se reduce de nuevo. El grupo carboxilo puede sustituirse por el alcohol o el aldehido, sin pérdida de la actividad. El naproxeno, un compuesto dextrorotatorio, se obtuvo a partir del racémico mediante el uso de la cinconidina.

Síntesis orgánica del naproxeno a nivel industrial. [6] La síntesis industrial del naproxeno es muy sencilla, comienza con el p-naftol, el cual es bromado en presencia de cloruro de metileno para producir 2,6-dibromonaftol. El bromo localizado en la posición dos es removido con bisulfito de sodio. Posteriormente se eterifica con clorometano en presencia de una mezcla de agua-2-propanol, dando como resultado el 1 -bromo-6-metoxinaftaleno (BMN). El BMN es convertido a un reactivo de Grignard, que se acopla directamente a una sal del ácido bromopropiónico. El resultado es posteriormente tratado con N-alquilglucamina para asegurar la conformación S-naproxeno. La N-alquilglucamina es producida por aminación reductiva de la D-glucosa. En la figura 2 se muestra la síntesis total del naproxeno utilizada a la fecha.

Figura 2. Síntesis del naproxeno

Prostaglandinas y Tromboxanos: Mecanismo de acción de los fármacos antiinflamatorios no esteroideos Existen abundantes pruebas que apoyan la función de las prostaglandinas como mediadores en las condiciones inflamatorias, dolorosas y febriles; los mismos datos sugieren que los fármacos antiinflamatorios no esteroideos actúan mediante la inhibición de la biosíntesis de prostaglandinas. Las prostaglandinas son un grupo de derivados del ciclopentano formadas a partir de ácidos grasos poliinsaturados (ver figura 3), en la mayor parte de los tejidos de los mamíferos; presentan una diversidad de efectos fisiológicos. Las prostaglandinas se han denominado "hormonas locales", dado que influyen sobre los procesos biológicos en los lugares próximos a su punto de liberación y, por otra parte, poseen mecanismos para su inactivación en dicho punto o cerca del mismo.

FOSFOLÍPIDOS

Figura 3. Síntesis de prostaglandinas Propiedades farmacológicas de las prostaglandinas Las prostaglandinas presentan un gran número de acciones fisiológicas y farmacológicas, relacionadas con la dosis, en ocasiones antagonistas y, hasta la fecha, no interpretadas por completo. Las prostaglandinas manifiestan distintos efectos sobre diversos sistemas: inflamación (efecto sobre el tracto gastrointestinal, cardiovasculares y renales), tracto respiratorio, sistemas hemopoyético, sistema nervioso y aparato reproductor. En algunos casos, puede resultar importante el establecimiento de un equilibrio entre dos prostaglandinas. Por ejemplo, se ha propuesto que la prostaciclina, que inhibe la agregación plaquetaria y produce vasodilatación, podría funcionar en conjunción con el tromboxano A2, compuesto relacionado con las prostaglandinas que induce la agregación de las plaquetas y es vasoconstrictor; el equilibrio entre ambos compuestos daría lugar a un estado normal de los vasos sanguíneos. Este mismo equilibrio podría resultar de importancia en la prevención de las úlceras gástricas y en el control de la inflamación. Prostaglandinas: Modo de acción de los antiinflamatorios no esteroideos La capacidad del naproxeno y otros antiinflamatorios no esteroideos para inhibir la biosíntesis de prostaglandinas se contempla en la actualidad como el mecanismo fundamental de la acción de tales fármacos. Se ha postulado que las prostaglandinas son mediadores de la inflamación. Estos compuestos se liberan cuando se produce una lesión o perturbación de las membranas celulares. En apariencia, las células no almacenan prostaglandinas; por consiguiente, la liberación de las mismas depende de su biosíntesis. Parece que la mayor parte de los distintos tipos de células poseen en sus microsomas el equipo enzimático necesario para la síntesis de prostaglandinas. Los antiinflamatorios no esteroideos inhiben la síntesis y liberación de las prostaglandinas (ver figura 4), aunque en general no reducen la inflamación, dolor y fiebre originadas por la inyección de prostaglandinas externas.

La teoría en que se basa el mecanismo propuesto para la acción antiinflamatoria consiste en que la actividad de la fosfolipasa A2 induce la liberación de ácido araquidónico, que lleva a la síntesis de algunas o todas las prostaglandinas y tromboxanos (según cual sea el tejido afectado). Tales compuestos contribuyen de diversas formas a la producción de inflamación, dolor y fiebre. Los fármacos antiinflamatorios no esteroidales inhiben la etapa de la ciclooxigenasa, con lo que se evita la formación de endoperóxidos de prostaglandina (PGÜ2 y PGty y tromboxano (A2) y de las restantes prostaglandinas; así pues, se reducen los síntomas de la inflamación. Existen pruebas que establecen que dicho mecanismo bioquímico es el fundamental para la acción antiinflamatoria, analgésica y antipirética del naproxeno y otros fármacos relacionados. Este mismo mecanismo también podría explicar los efectos secundarios de las aspirina y compuestos similares, como los síntomas gástricos graves y la hipersensibilidad en pacientes alérgicos. [4] Existe gran diversidad de compuestos, ácidos o no, que son inhibidores de la síntesis de prostaglandinas, in vitro. No obstante, sólo los antiinflamatorios ácidos no esteroideos se acumulan en el tejido inflamado en concentraciones suficientes como para inhibir eficazmente la biosíntesis de prostaglandinas. Así, un aspecto importante de la acción de los antiinflamatorios ácidos no esteroideos podría ser dicho comportamiento farmacocinético específico, que da lugar a niveles elevados en el tejido inflamado. Análisis naproxeno por cromatografía líquida de alta resolución. Existen muchos métodos actualmente para medir naproxeno en plasma, suero u orina. J.P. Deseager y Vanderbist [7] en 1976 desarrollaron un método analítico en cromatografía de gases utilizando derivatización y un detector de ionización de flama con relativa sensitividad (GC/FID). En 1978 Antilla y Held [7] publicaron diferentes métodos utilizando estudios fluorimétricos, sin embargo, a pesar de la alta sensibilidad de este detector, los procedimientos de preparación de la muestra son muy laboriosos y no específicos. Muchos métodos han sido desarrollados para medir naproxeno por HPLC, pero no son recomendables para ser análisis rutinarios ya que involucran grandes volúmenes de muestra o tratamiento previo de ésta como desproteinización, doble extracción, filtración en fase sólida, etc. En 1978 Dusci y Hackett desarrollaron un método de análisis de naproxeno en suero utilizando HPLC, en el cual utilizaban muy poco volumen de muestra (100 |j,L) y un proceso de desproteinización-extracción con acetonitrilo en un mismo paso, seguido de una concentración de la muestra con corriente de nitrógeno para después ser analizada directamente en el HPLC, el solvente de elución fue 60% acetonitrilo en 45mM de fosfato diácido de potasio a un pH=3 ajustado con ácido orto fosfórico. [8] Nielsen-Kudsk, en 1980, reportó un estudio de análisis de antiinflamatorios por HPLC, en el cual con 0.1 mL de la muestra se podía realizar el análisis en plasma. La preparación de la muestra consiste en la precipitación de las proteínas del plasma y una extracción simultánea del medicamento con acetonitrilo, y cuando sea necesario, concentración de la muestra por evaporación. El solvente de elución utilizado en el HPLC fue metanol al 55% en 50mM de ácido ortofosfórico a un pH=4 ajustado con hidróxido de sodio. [9]

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Figura 4. Diagrama de bloqueo de prostaglandinas

En 1981, Broquaire y Rovei, establecieron un nuevo método para el análsis de naproxeno en plasma, el cual consistía en desproteinizar el plasma con cloruro de potasio seguido de una sola extracción con cloroformo del medicamento del plasma acidificado, posteriormente se concentraba hasta sequedad y se adicionaba 1 mL de acetonitrilo para ser analizado en HPLC. La fase móvil que utilizaron fue acetonitrilo-ácido ortofosfórico (pH=3) (45:55, v/v). En este método se utilizó el ácido 2-naftalenacético como estándar interno. [7] 4.3 CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN. Cromatografía líquida de alta resolución, por sus siglas en inglés HPLC (ver figura 5), es la más poderosa de todas las técnicas cromatográficas. Puede obtener fácilmente separaciones y análisis que suelen ser difíciles o imposibles utilizando otras formas de cromatografía. En el método original un absorbente, comúnmente alúmina o sílica, es empacado dentro de una columna y es eluído con un líquido apropiado. La mezcla que se quiere separar se introduce en la columna y es llevada a lo largo de ésta por el líquido de elución. Si un componente de la mezcla (soluto) es absorbido ligeramente en la superficie de la fase estacionaria, éste viajara a lo largo de la columna más rápido que aquel que es fuertemente

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absorbido lista separación de solutos es posible si existe diferencia en su grado de adsorción por el sólido. [ 1 0 ]

Figura 5 HPLC

Fin cromatografía liquida existen otros mecanismos de adsorción que pueden causar separación de solutos, dependiendo de que se escoja como líquido o fase estacionaria. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) apareció alrededor de 1960. y desde que empezó a desarrollarse el tamaño de partícula de la fase estacionaria fue haciéndose cada ve/ menor. La fase estacionaria que se utiliza ahora es llamada empaque microparticulado y es comunmente, partículas porosas de sílica, esféricas o irregulares, y con diámetros nominales de 10, 5 o 3 um. los diferentes tipos de mecanismos mencionados anteriormente pueden realizarse por enlace químico entre los diferentes grupos funcionales en la superficie de la partícula de sílica, para producir lo que llamamos fases de enlace. Comercialmente existe una gran variedad de ellos, pero cerca del 75% del trabajo que se realiza en HPLC en este momento se hace con fase de enlace, en donde grupos alquilos C-18 son pegados en la superficie de las partículas de sílica. Piste tipo de empaquetamiento es llamado fase de enlace ODS (octadecilsilano). Con este tipo de fases estacionarias los mecanismos de adsorción no son claros, y existe mucho trabajo teórico y experimental para aclarar estos mecanismos. 1 1 1 1 Con este empacado de columna, el pequeño tamaño de partícula permite una considerable resistencia al flujo de solvente, así que la fase móvil es bombeada a través de la columna a alta presión fípicamente. la columna es de 10-25 cm de larga y tiene 4.6 mm de diámetro interno. Aunque estas columnas son caras, son reutilizables. así que el costo se puede d i v i d i r entre un gran número de análisis. La columna y todos los accesorios deben de soportar las presiones que se utilizan y ser resistentes químicamente a los solventes de la fase móvil Ll material de las columnas es comúnmente acero inoxidable, aunque en algunas ocasiones se pueden encontrar de plástico o vidrio. Ln HPLC' la fase móvil es normalmente bombeada a través de la columna a un (lujo de 1-5 c m V m i n Si la composición de la fase móvil es constante, el método es llamado "¡socrático" Ln cambio, si la composición de la fase móvil cambia en un predeterminado momento durante la elución se le llama "de gradiente" La elución por gradiente es utilizada en situaciones similares como un programa de temperatura en cromatografía de gases, y es necesaria cuando los tiempos de retención de los solutos es muy largo que no pueden ser separados en un tiempo razonable usando un solo solvente o mezcla de ellos. 12

Después de pasar a través de la columna, los solutos separados son pasados a un detector en línea. La entrada del detector es una señal eléctrica, la variación de ésta es desplegada en un graficador, integrador computacional o en una pantalla VDU. Muchos de los detectores para HPLC son selectivos, esto significa que no se puede aplicar uno solo para todos los solutos presentes en una mezcla. En el presente no existe un detector universal para HPLC que se compare con un detector de ionización de flama en cromatografía de gases. Muchos de los solutos no son fácilmente detectados en HPLC, y tienen que ser convertidos a una forma detectable después de salir de la columna. Este método es llamado "derivatización post-column". Como en otras formas de cromatografía, el tiempo que tarda el soluto en pasar a través del sistema cromatográfico (tiempo de retención) es característica del soluto para unas determinadas condiciones de trabajo. Sin embargo, el utilizar el tiempo de retención para la identificación de solutos desconocidos es como tratar de identificar un compuesto orgánico simplemente midiendo su punto de fusión o ebullición. Muchos diferentes solutos pueden tener tiempos de retención iguales. La cromatografía es un excelente método para la separación de mezclas pero no provee la información necesaria para la clara identificación de los compuestos separados. Para estos detalles se tiene que recurrir a métodos espectrométricos, así que no es sorprendente tratar de combinar un HPLC con detectores que muestren el espectro de los solutos, por ejemplo espectrometría de masas (MS). Un instrumento de HPLC requiere de una bomba de alta presión, una fuente de fase móvil, una columna que contenga una fase estacionaria eficiente, una unidad de inyección que introduzca las muestras en la columna, un detector en línea y algún método que muestre la señal del detector. En la figura 6 se muestra un diagrama de bloques con los diferentes componentes del HPLC.

Figura 6. Diagrama de componentes del HPLC

La fase móvil en HPLC puede ser agua, solventes orgánicos o buffers solos o mezcla de ellos. Cualquier parte del sistema que este en contacto con la fase móvil debe ser 13

de materiales que resistan a los solventes utilizados. Las partes húmedas comúnmente son de acero inoxidable, teflón (PTFE), u otros plásticos inertes, aunque en las bombas se utilizan materiales hechos con zafiro, rubí o cerámica. Todos los componentes desde la descarga de la bomba hasta la salida de la columna deben resistir la alta presión involucrada. Otra consideración importante, desde el punto en que la muestra es inyectada hasta que es detectada, es que el volumen muerto en el equipo debe de mantenerse en el mínimo. El punto muerto significa un espacio vacío o volumen inocupado, la presencia de este puede ocasionar desastrosas pérdidas de eficiencia. 4.4 APLICACIÓN DE HPLC EN EL ANÁLISIS DE SUERO. El análisis de medicamentos por HPLC presenta todas las ventajas de selectividad y sensibilidad de la propia técnica, con la más importante de permitir análisis de muestras multicomponentes. Se puede dividir este análisis de fármacos en dos grandes apartados: a) identificación y determinación cuantitativa de medicamentos que suelen tomarse en dosis relativamente altas y por tanto, su concentración en el organismo será elevada, y b) fármacos terapéuticos, en los que debe realizarse una cuantificación exacta para determinar sus dosis correctas. [3] Existen diferencias entre el comportamiento individual de cada molécula, fármaco o metabolito, respecto a su absorción, metabolismo y excreción, por lo que, generalmente, se realizan análisis en plasma o suero. Como referencia común para aquellos fármacos con cierta toxicidad ya conocida, por ejemplo los antineoplásicos, importa controlar la dosis límite de toxicidad con respecto a concentraciones en suero. El número de fármacos analizado es muy extenso: analgésicos, antiarrítmicos, antiasmáticos, antibióticos, antineoplásicos, anticonvulsivos, antidepresivos, tranquilizantes, estabilizadores de la tensión arterial, antiinflamatorios, etc. Casi siempre se emplea HPLC en fase reversa, con fases móviles variables en su proporción agua, metanol y acetonitrilo. El número de trabajos de HPLC con aplicación clínica aumenta. Ya hay métodos casi clásicos en cromatografía líquida de alta resolución que detectan medicamentos y mezclas de ellos de moléculas de actividad semejante. Como se suelen usar técnicas de fase reversa, el agua resulta ser el eluente más común. Se introduce entonces la muestra problema de suero, previa desproteinización o a veces directamente. En ciertos casos se deben efectuar una microfiltración, evaporación previa para concentrar la muestra, extracciones previas con solventes adecuados, etc. Este último procedimiento posee la ventaja de proporcionar dos o más líquidos o fases, pudiendo cromatografiarse muestras de todos ellos y no sólo de uno, tanto en fase reversa como en fase normal. Al utilizar una fase móvil polar, con un 60% metanol o acetonitrilo y 40% de buffer de fosfatos se puede proponer un método para separar satisfactoriamente infinidad de fármacos y metabolitos en suero, prefiriéndose la detección en línea con detectores como espectrofotómetros UV-VIS, fluorimétricos, métodos electroquímicos y radioquímicos. 14

4.5 FARMACOCINETICA

La farmacocinética es la ciencia de las relaciones entre el movimiento de un medicamento a través del organismo y los procesos que lo afectan. Es una disciplina que describe la evolución en el tiempo del medicamento en el organismo. La mayoría de los medicamentos necesitan ser transportados por la sangre hasta su lugar de acción. Un medicamento administrado por vía extravasal tiene que ser absorbido para poder estar presente en el torrente circulatorio. Por tanto, la absorción debe tener lugar antes de que el medicamento aparezca en circulación tras la administración extravasal. Los medicamentos administrados por vías intramuscular, tópica, oral o rectal tienen que ser absorbidos para poder pasar a circulación general. Medicamentos administrados por vías intravenosa o intraarterial no sufren el proceso de absorción. Una vez presente en la circulación debe penetrar en los tejidos para poder actuar. Los medicamentos no suelen ser específicos de un determinado tejido de forma que alcanzan una serie de tejidos y órganos. Se dice que el medicamento está en fase de distribución cuando se encuentra en la sangre y está penetrando en órganos y tejidos. La eliminación es la salida del medicamento del organismo y puede llevarse a cabo por excreción renal y biliar del medicamento inalterado o bien por el metabolismo. Si el medicamento que hemos administrado se distribuye rápidamente entonces podemos tomar muestras de sangre, plasma o suero, para conocer la concentración del medicamento a distintos tiempos. Si representamos los valores de concentración plasmática obtenidos veremos que la concentración disminuye rápidamente al principio para luego hacerlo más lentamente hasta que la velocidad de caída es casi nula. Una relación como ésta muestra que la velocidad de eliminación del medicamento a partir del plasma varía continuamente. En otras palabras, la curva muestra una caída exponencial y la velocidad de eliminación del medicamento a partir del plasma es proporcional a la cantidad presente a cada tiempo. Otra forma de describir este proceso sería diciendo que una fracción constante del medicamento existente a cada tiempo es eliminada en la unidad de tiempo. Esto se puede expresar como kei la constante de velocidad de eliminación. [12] Para poder entenderlo debemos considerar aquellos procesos que contribuyen a la disminución del medicamento en el plasma: 1.- captación por el hígado y subsiguiente eliminación en la bilis, 2.- eliminación en la orina por filtración glomerular, 3.- eliminación en la orina por secreción tubular, y 4.- metabolismo La relación matemática que parece describir de forma bastante adecuada la relación anterior, tiene la forma general: M = MQe~k"'

donde: M es la cantidad de medicamento en el organismo a tiempo t; es la cantidad inicial de medicamento;

623877 15

ke¡ es una constante que describe la velocidad de eliminación del medicamento a partir del organismo. Por tanto, la velocidad de eliminación del medicamento varía continuamente dependiendo de la concentración a cada tiempo, es decir,

Normalmente se determina la concentración en plasma, suero o sangre total mientras que la ecuación anterior describe la cantidad total de medicamento en el organismo. Por tanto, para dar cuenta de este hecho se necesita introducir el concepto de volumen de distribución (VD). El volumen de distribución es la cantidad total de medicamento en el organismo a tiempo cero. Conviene notar que este volumen de distribución es un volumen aparente, es decir, incluye tejidos en los que el medicamento aún estando en equilibrio con el plasma, está mucho más concentrado que en el plasma. Esto explica por que el volumen de distribución excede con frecuencia el volumen total del organismo. Si CP - concentración en plasma a tiempo t, la cantidad total de medicamento en el organismo a tiempo t viene dada por: donde VD es el volumen aparente de distribución o, para cualquier valor de tiempo t

Como la caída en la concentración plasmática es exponencial se suelen representar los resultados en escala semilogarítmica con el fin de obtener una línea recta. Al tener una representación lineal seremos capaces de extrapolar fácilmente la recta para así obtener la concentración del medicamento en plasma, suero o sangre total, a tiempo cero. La dosis dividida por C 0 da el volumen de distribución (VD). Cuando se utiliza este método la pendiente nos permite calcular la vida media o semivida:

Semivida. Cuando la concentración de medicamento en plasma o suero disminuye a la mitad de su valor inicial obtenemos la siguiente relación:

16

Aclaramiento. El aclaramiento sanguíneo o aclaramiento plasmático, es el volumen de sangre o plasma depurado de medicamento en la unidad de tiempo. Esta relacionado con el volumen en el que se disuelve el medicamento y con la velocidad de eliminación. ClP=kelVD Dosis oral única. Cuando se administra una dosis oral única de un medicamento a un individuo se suele manifestar primero un aumento y luego una disminución en la concentración plasmática, como se puede observar en la figura 7:

Figura 7. Concentración de medicamento vs. tiempo

El aumento en la concentración en plasma se produce durante la fasese absorción. La parte descendente de la curva se suele conocer como fase de eliminación. Sin embargo, la eliminación empieza en el mismo momento en que hay medicamento en plasma y la absorción termina cuando ya no llega más medicamento a la circulación desde el tracto grastrointestinal. No obstante, el tiempo al que acaba la absorción no coincide con el nivel máximo de concentración ya que éste solo representa el tiempo en el que la velocidad de absorción se iguala con la velocidad de eliminación. Por eso, en la fase ascendente de la curva la velocidad de absorción es mayor que la velocidad de eliminación. Durante la fase descendente la velocidad de eliminación es mayor que la velocidad de absorción. Podemos representar la fase de absorción de dos maneras: a) como la desaparición del medicamento del lugar de absorción o b) curva correspondiente a la cantidad total de medicamento presente en el organismo en puntos distintos al de absorción o bien ya eliminada. Ver figura 8 [12]. Observamos que la curva (b) es el reflejo de la curva (a). No nos debe sorprender por tanto que sea posible calcular tanto los parámetros de absorción como los de eliminación a partir de la curva de concentración plasmática frente al tiempo.

17

Es evidente que los procesos de absorción de los medicamentos puedes ser complejos. Sin embargo, la mayoría de los medicamentos siguen un comportamiento que se ajusta razonablemente bien a la absorción de primer orden.

Tiempo (b)

Figura 8. Fases de absorción

La información que podemos obtener de los datos de concentración plasmática obtenidos a diferentes tiempos tras la administración de una dosis única por vía oral son: 1 Suponiendo absorción de primer orden y eliminación de primer orden se puede calcular la constante de velocidad de absorción (&a¿,) y la constante de velocidad de eliminación (ke¡). 2 El tiempo al que se alcanza el máximo de concentración plasmática, se calcula por medio de las dos constantes de velocidad. 3 El área bajo la curva de concentración plasmática sirve como medida de la cantidad de medicamento absorbido y eliminado. Por eso es posible comparar la disponibilidad biológica (biodisponibilidad) de varias formulaciones del mismo medicamento. La ecuación para calcular la concentración plasmática del medicamento en una dosis oral única esta representada por la siguiente ecuación:

F es la fracción de la dosis MQ que se absorbe, k¡ y fo son las dos constantes de velocidad. Sin embargo, con sólo estos datos no es posible decir si k¡ = kab o ke¡ y viceversa ya que la ecuación tiene dos soluciones posibles. Por esta razón es necesario estimar ke¡ el otro experimento usando dosificación endovenosa (a menos que nos fiemos de nuestra intuición o conozcamos VD). En la práctica, muchos medicamentos se absorben más rápidamente que se eliminan y, en estos casos, k¡=kab y k2=ke¡. Esta ecuación tiene la forma:

La absorción y eliminación actúan en direcciones opuestas con lo que un proceso exponencial de absorción producirá aumento de Cp mientras que la función de eliminación producirá disminución de Cp. 18

Biodisponibilidad y bioequivalencia. Consideremos la figura 9. [12] Cada una de las tres formulaciones A, B y C que contienen la misma dosis del medicamento producen diferentes niveles máximos de concentración plasmática. Sin embargo, el área bajo la curva de A es similar a la de B lo que indica que ambos se absorben en igual extensión. Por lo cual ambos serán igualmente efectivos siempre y cuando la concentración plasmática no sea importante en eficacia.

Tiempo

Figura 9. Diferentes niveles de concentración plasmática

Si tenemos en consideración el tiempo al cual se alcanza la concentración plasmática máxima veremos que las constantes de velocidad de las dos formualciones son distintas. Como se supone que la constante de velocidad de eliminación (ke¡) es igual (para el mismo medicamento) entonces, parece evidente que la que es diferente es la constante de velocidad de absorción (kab) es decir, B se absorbe más lentamente que A. Por otra parte, la formualción C da un área bajo la curva menor lo que indica que se absorbe una proporción menor de la dosis con lo que la disponibilidad es más baja y, probablemente también la eficacia. La elección de la formulación puede estar afectada por otras consideraciones. Por ejemplo, la concentración indicada por (1) en la gráfica podría representar la concentración plasmática a la cual se manifiestan efectos secundarios no deseados y, la concentración indicada por (2) podría representar la concentración plasmática a la cual el medicamento es eficaz. Por tanto, la formulación B es superior a A es estos dos factores aún cuando sea comparable la proporción de medicamento absorbido. La formualción B tendrá una duración de acción mayor que A y no presentará los efectos secundarios que aparecen con la formulación A. La biodisponibilidad se relaciona con la cantidad de medicamento y la bioequivalencia con la eficacia. Dos formulaciones con igual biodisponibilidad pueden diferir en su eficacia. Igual biodisponibilidad no significa bioequivalencia. 5 MATERIAL Y EQUIPO Material utilizado

-

Jeringas desechables con aguja de 1 mL, plastipack estériles. Microjeringa de vidrio de 5-25 (iL. Tubos Eppendorf. Filtros para jeringa corning de 0.45 mm. 19

Biodisponibilidad y bioequivalencia. Consideremos la figura 9. [12] Cada una de las tres formulaciones A, B y C que contienen la misma dosis del medicamento producen diferentes niveles máximos de concentración plasmática. Sin embargo, el área bajo la curva de A es similar a la de B lo que indica que ambos se absorben en igual extensión. Por lo cual ambos serán igualmente efectivos siempre y cuando la concentración plasmática no sea importante en eficacia.

Tiempo

Figura 9. Diferentes niveles de concentración plasmática

Si tenemos en consideración el tiempo al cual se alcanza la concentración plasmática máxima veremos que las constantes de velocidad de las dos formualciones son distintas. Como se supone que la constante de velocidad de eliminación (ke¡) es igual (para el mismo medicamento) entonces, parece evidente que la que es diferente es la constante de velocidad de absorción (kab) es decir, B se absorbe más lentamente que A. Por otra parte, la formualción C da un área bajo la curva menor lo que indica que se absorbe una proporción menor de la dosis con lo que la disponibilidad es más baja y, probablemente también la eficacia. La elección de la formulación puede estar afectada por otras consideraciones. Por ejemplo, la concentración indicada por (1) en la gráfica podría representar la concentración plasmática a la cual se manifiestan efectos secundarios no deseados y, la concentración indicada por (2) podría representar la concentración plasmática a la cual el medicamento es eficaz. Por tanto, la formulación B es superior a A es estos dos factores aún cuando sea comparable la proporción de medicamento absorbido. La formualción B tendrá una duración de acción mayor que A y no presentará los efectos secundarios que aparecen con la formulación A. La biodisponibilidad se relaciona con la cantidad de medicamento y la bioequivalencia con la eficacia. Dos formulaciones con igual biodisponibilidad pueden diferir en su eficacia. Igual biodisponibilidad no significa bioequivalencia. 5 MATERIAL Y EQUIPO Material utilizado

-

Jeringas desechables con aguja de 1 mL, plastipack estériles. Microjeringa de vidrio de 5-25 (iL. Tubos Eppendorf. Filtros para jeringa corning de 0.45 mm. 19

-

-

Puntas para micropipeta de 5-50 uL y 40-1000 jaL. Micropipetas de 5-50 ^L y 40-1000 uL. Viales de 2 mL con caps de aluminio y septa de teflón. Viales de 40 mL con tapa rosca y septa de teflón. Pipetas pasteur desechables. Matraces de aforación de 5, 10 y 25 mL, con tapón de vidrio. Matraces erlenmeyer de 1L. Equipo de vacío para fílatración de fase móvil. Pastilla magnética para agitación. Espátula. Pinzas para cerrar y abrir caps de viales

Reactivos y estándares -

-

-

Naproxeno, Spectrum 99.5% CAS 22204-53-1. Acetonitrilo, Fisher grado HPLC. Agua, Fisher grado HPLC. Fosfato diácido de sodio (NaH^PC^). Acido ortofosfórico (H3PO4), J.T.Baker 85.1%, lote 0260-02, CAS 7664-38-2.

Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución (HPLC), marca Shimadzu, provisto de un detector de UV variable, una columna C18, y autoinyector. Centrífugas Hamilton Bell VanGuard V6500 y Adams Compact II centrifuge. Agitador magnético FisherScientific Fisher Stirring Hotplate Balanza analítica OHAUS Analytical Plus Bomba de vacío Indicador de pH marca ORION modelo 420a Agitador para muestras marca Thermolyne tipo 37600

6 METODOLOGÍA 6.1 PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN En un tubo ependorf se colocan 100 |j,L de suero o suero fortificado, según sea el caso, y se le añade lentamente 1 mL de acetonitrilo. El tubo se agita vigorosamente de forma manual durante dos minutos, después se centrifuga. El sobrenadante se retira con la ayuda de una jeringa desechable con aguja, posteriormente se retira la aguja y se coloca el filtro, la muestra se filtra y se transfiere a un vial de 2 mL y se tapa. La muestra se inyecta directamente en el HPLC, utilizando un flujo de solvente de elución de 1 mL/min y se detecta a una longitud de onda de 225 nm, bajo estas condiciones el tiempo de retención del naproxeno es de 5.7 min.

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-

-

Puntas para micropipeta de 5-50 uL y 40-1000 jaL. Micropipetas de 5-50 ^L y 40-1000 uL. Viales de 2 mL con caps de aluminio y septa de teflón. Viales de 40 mL con tapa rosca y septa de teflón. Pipetas pasteur desechables. Matraces de aforación de 5, 10 y 25 mL, con tapón de vidrio. Matraces erlenmeyer de 1L. Equipo de vacío para fílatración de fase móvil. Pastilla magnética para agitación. Espátula. Pinzas para cerrar y abrir caps de viales

Reactivos y estándares -

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Naproxeno, Spectrum 99.5% CAS 22204-53-1. Acetonitrilo, Fisher grado HPLC. Agua, Fisher grado HPLC. Fosfato diácido de sodio (NaH^PC^). Acido ortofosfórico (H3PO4), J.T.Baker 85.1%, lote 0260-02, CAS 7664-38-2.

Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución (HPLC), marca Shimadzu, provisto de un detector de UV variable, una columna C18, y autoinyector. Centrífugas Hamilton Bell VanGuard V6500 y Adams Compact II centrifuge. Agitador magnético FisherScientific Fisher Stirring Hotplate Balanza analítica OHAUS Analytical Plus Bomba de vacío Indicador de pH marca ORION modelo 420a Agitador para muestras marca Thermolyne tipo 37600

6 METODOLOGÍA 6.1 PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN En un tubo ependorf se colocan 100 |j,L de suero o suero fortificado, según sea el caso, y se le añade lentamente 1 mL de acetonitrilo. El tubo se agita vigorosamente de forma manual durante dos minutos, después se centrifuga. El sobrenadante se retira con la ayuda de una jeringa desechable con aguja, posteriormente se retira la aguja y se coloca el filtro, la muestra se filtra y se transfiere a un vial de 2 mL y se tapa. La muestra se inyecta directamente en el HPLC, utilizando un flujo de solvente de elución de 1 mL/min y se detecta a una longitud de onda de 225 nm, bajo estas condiciones el tiempo de retención del naproxeno es de 5.7 min.

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En un tubo ependorf colocar de suero

Registrar resultados

Añadir ImL de acetonitrilo grado HPLC

Analizar por HPLC; flujo de elución: ImL/min Longuitud de onda: 225nm.

Agitar por dos minutos y centrifugar

Retirar el sobrenadante y transferirlo a un vial de 2mL a través de un filtro

6.2 PREPARACIÓN DE FASE MÓVIL Preparación de la fase móvil. El solvente de elución es 60% acetonitrilo en 45 mM de un buffer de fosfato diácido de sodio a pH 3 con ácido orto fosfórico. Constantes dadas:

21

Calculo de participación para cada uno de los iones

a

'=^x X l£ - 5 - 47 * 10 "

«, = 2 - 1 8 x l °T-2.56x108.5xlO" 9

Se toma en cuenta eco y «i ya que son las más participativas. CA = 45 mM

OJ

Ya que la fase móvil es 60% acetonitrilo, se prepara solamente 400 mL de buffer NaH2PO4 = 4.764g (0.4L) = 1.9056g H3PO4 = 0.6 Ig (0.4L) = 0.244g Estas cantidades, pesadas en la balanza analítica, se disuelve en 400 mL de agua grado HPLC y se le agrega 600 mL de acetonitrilo grado HPLC, se agita y se ajusta el pH a 22

3 agregando ácido ortofosfórico gota a gota, posteriormente se filtra para eliminar residuos que puedan tapar las líneas del equipo y finalmente se le deja pasar una corriente de helio a la solución para eliminar las burbujas de aire de la fase móvil, las cuales causarían problemas con las líneas del equipo y la medición.

1.9056gdeNaH 2 PO 4 + 0.244g de H3PO4 se disuelven en 400 mL de agua grado HPLC

Agregar 600 mL de Acetonitrilo grado ^ HPLC, con agitación, ajustar a pH 3 con H3PO4

Filtrar y pasar una comente de ^ w Helio para eliminar burbujas de aire

6.3 VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO Este se lleva a cabo una vez establecidas las condiciones analíticas, e incluye los parámetros que se describen a continuación. Las definiciones se encuentran en el Glosario de términos al inicio de esta investigación. [1] Recobro: Debe evaluarse al menos por triplicado y en tres niveles de concentración de la curva de calibración, cercano al límite de cuantificación, al valor medio y a la concentración alta. El porcentaje de esta razón puede ser menor al 100%, pero debe ser reproducible en cada nivel de concentración dentro del intervalo de trabajo. Intervalo de trabajo: Se establece en función de las concentraciones del compuesto a analizar esperadas durante el análisis de muestras. Este intervalo está definido por una curva de calibración con al menos 5 niveles de concentraciones distintas, incluidas las concentraciones mínimas cuantificables y máxima del intervalo y sin incluir el blanco. Las curvas de calibración deben ser preparadas en la misma matriz biológica que las muestras. Exactitud y precisión: Se debe determinar la precisión y exactitud del método intra análisis (en un solo día) e ínter análisis (entre varios días), analizando un mínimo de tres concentraciones conocidas del compuesto, en la matriz biológica, estas concentraciones serán diferentes a las de la curva de calibración, siendo representativas del intervalo de trabajo (bajo, medio y alto). Se debe analizar cada nivel de concentración al menos por quintuplicado en la evaluación intra análisis y por duplicado en la evaluación Ínter análisis, durante un período de tres días. Estabilidad: Investigar el efecto de todos los factores que influyan en la concentración del compuesto a analizar en la matriz biológica, por ejemplo: condiciones de almacenamiento, ciclos de congelación y descongelación, etc. En este proyecto se evaluará la estabilidad en ciclos de congelación y descongelación, para esto se debe demostrar al congelar muestras de concentración conocida del compuesto a analizar en la matriz biológica; después de este proceso, se deben descongelar las muestras a temperatura ambiente sin calentar. Se deben analizar por lo menos tres niveles de concentración por duplicado. 23

Límite de cuantifícación: Se determina al menos por quintuplicado a la concentración más baja del intervalo de trabajo. Se considera que el punto tiene validez como límite de cuantificación si su valor promedio cae dentro del ±20% del valor nominal y coeficiente de variación no mayor que el 20%. Límite de detección: Se debe determinar la concentración en la cual la señal del compuesto a analizar en la matriz biológica puede distinguirse de los niveles de ruido o de una muestra libre del compuesto de interés. 6.4 PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN DE MEDICAMENTOS Se evaluaron los tres tipos de naproxeno: de patente, genérico y similar. De cada uno de ellos se analizaron tres lotes distintos y tres pastillas de cada lote, dando un total de 27 experimentos. A continuación se presentan los datos de cada uno de los medicamentos evaluados. Naproxeno de patente: Nombre comercial: Naxen, Laboratorio: Syntex, Dosis: 250 mg, Presentación: Caja con 45 tabletas, Lotes evaluados: X00435, X00913, y X10131 Naproxeno genérico intercambiable: Nombre comercial: Naproxeno, Laboratorio: Apotex, Dosis: 250 mg, Presentación: Caja con 30 tabletas, Lotes evaluados: OLE1019, OG0814, y 1G0773 Naproxeno similar: Nombre comercial: Vantin, Laboratorio: BEST, Dosis: 250 mg, Presentación: Caja con 30 tabletas, Lotes evaluados: 010535, 010821, y 010822 El método de preparación consistió en triturar la tableta con ayuda de un mortero con pistilo, posteriormente se extrajo el naproxeno con acetonitrilo y se aforó a 25 mL dando una concentración de 1000 ppm. De esta solución se prepararon diluciones de una concentración de 1 ppm listas para ser analizadas por HPLC.

24

6.5 PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS DE NAPROXENO EN SUERO Los experimentos se realizaron de acuerdo a experimentación cruzada con dos voluntarios y evaluando naproxeno de patente y naproxeno genérico intercambiable. Los datos de los medicamentos evaluados se presentan a continuación: Naproxeno de patente: Nombre comercial: Naxen, Laboratorio: Syntex, Dosis: 250 mg, Presentación: Caja con 45 tabletas, Lote seleccionado: X00435 Naproxeno genérico intercambiable: Nombre comercial: Naproxeno, Laboratorio: Apotex, Dosis: 250 mg, Presentación: Caja con 30 tabletas, Lote seleccionado: OG0814 Programación

Días Dial Día 8

Naproxeno estudio cruzado Voluntario A Voluntario B Genérico Int. Patente Patente Genérico Int.

La toma de muestras es según la siguiente tabla de horario de tomas, se tomó en cuenta 12 horas totales ya que este es el tiempo promedio en el que el naproxeno se elimina totalmente del organismo:

Toma de muestra 1

Tiempo (hrs) 0 1 1.5 2 2.5 3 4 6 8 12

2 3 4 5 6 7 8 9 10

25

1 os voluntarios fueron cuñali/.ados (ver figura 10), es decir se introdujo una aguja dentro de la vena y se le colocó un tapón, esto fue para evitar el pincha/o en cada toma de sanare

Figura 10. Voluntario canalizado

la toma de sangre la real i/ó una enfermera especiuli/.adu (ver figura I I ) . cabe señalar que durante el transcurso de la experimentación los voluntarios permanecieron internados en el I lospital San José-Tec de Monterrey, en el cual se monitorearon sus signos vitales v se les suministraron alimentos durante el muestreo.

Figura I I Toma de muestra

la muestra de sangre se recolectó en tubos de muestreo perfectamente etiquetados y que ya contenian un gel utili/ado para la separación del suero del resto de los componentes de la sangre (ver figura 12). estos tubos ya con la sangre, fueron centrifugados, y el suero se separo \ se guardó en un tubo nuevo etiquetado (ver figura 13) Del suero \a separado se tomo una alícuota de 100 j.il . el resto del suero se almacenó en un congelador especial a una temperatura de -40 °C , la alícuota tomada se 26

extrajo con I mi de acetonitrilo, inmediatamente el suero precipitó eolor amarillo, se agitó durante 2 minutos y se centrifugó. C'on una jeringa desechable se tomó el mililitro de acetonitrilo ya con el naproxeno disuelto, se filtró, se vació a un vial de 2 mi etiquetado y se guardó en refrigeración para su posterior análisis por HPL.C

l:igur;i I 2 I uhos etiquetados con sangre untes de centntugai

Figura I i Tubos etiquetados: uno nuevo v otro con muestra

fin los resultados podemos observar la comparación entre naproxeno genérico y de patente y la comparación entre voluntarios De una dosis oral única, como este caso, la información que podemos obtener para establecer una comparación es la velocidad de absorción (kabs). la velocidad de eliminación (kel) y el área bajo la curva (ABC).

27

7 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 7.1 RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO RECOBRO Las concentraciones que se evaluaron son las siguientes: nivel bajo (NB) de 0.4 ppm, nivel medio (NM) de 1.5 ppm y nivel alto (NA) de 6.0 ppm. El porcentaje de recuperación puede ser menor o mayor al 100%, pero debe ser reproducible. En la Tabla 1 se muestran los resultados de la evaluación de este parámetro. Evaluación de la Recuperación Absoluta de Naproxeno Prom. de Prom. de Prom. de Area/A Conc./A Area/S NB 783261.7 0.4 772443.3 NM 2856242.0 3132802.7 1.5 NA 10471443.3 6.5 10904719.7

%Recup. Absoluta Prom. de Conc./S 0.4 1.7 6.8

Áreas

Conc.

98.62 109.68 104.14

98.6 112.5 104.4

Tabla 1 Evaluación de la recuperación de naproxeno

Cada renglón es el promedio de los triplicados en cada nivel. Las primeras dos columnas indican el promedio de áreas y de concentración en acetonitrilo, y las siguientes dos columnas en suero. Las dos columnas de la derecha muestran el porcentaje de recuperación absoluta comparando las áreas y las concentraciones. Con esta tabla podemos observar que las recuperaciones son muy cercanas al 100% y además son reproducibles, ya que la comparación entre porcentajes es similar. INTERVALO DE TRABAJO En la Tabla 2 se muestran, para los seis niveles calibrados, la concentración teórica de cada nivel y el área obtenida en el cromatograma; también se observan los resultados de la linealidad (r), pendiente (m) e intercepto (b). Nivel 1 2 3 4 5 6

Conc. (ppm) 0.2 0.5 1 2 4 5

Área 450499 1170468 2482797 5170343 10163311 12859644

r m b

0.9999317 3.874E-07 0.0311888

Tabla 2 Intervalo de trabajo

Como se puede observar el naproxeno tiene un comportamiento lineal a lo largo del intervalo de trabajo evaluado, ya que la constante de linealidad esta cercana a la unidad (0.9999) En la figura 14 se muestra la curva de calibración de los datos anteriores.

28

14.0 12.0

10.0 X

ro

8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 0

1

2

3

4

5

6

Concentración ppm

Figura 14 Curva de calibración EXACTITUD Y PRECISIÓN Intranálisis (Repetibilidad) En la Tabla 3 se muestran los resultados para cada nivel evaluado. En las columnas de la izquierda están las identificaciones de las muestras, y en la derecha los resultados obtenidos del análisis. Al final de cada tabla se presenta el porcentaje de desviación estándar. Nivel Bajo 0.4 ppm Muestra Área NB-1 1465223 NB-2 1197380 NB-3 1310965 NB-4 1 522501 1166399 NB-5 Desv. Est. 158134.8 1332493.6 Promedio % Desv. 11.87

Nivel Medio 1.5 ppm Muestra Área NM-1 2929466 NM-2 3390037 3368197 NM-3 NM-4 3100745 2988359 NM-5 213467.3 Desv. Est. 3155360.8 Promedio 6.77

% Desv.

Nivel Alto 6.0 ppm Muestra Área NA-1 11277905 NA-2 11581924 NA-3 11397362 NA-4 11502137 NA-5 10901465 Desv. Est. ' 266442.9 Promedio i 11332158.6 2.35 % Desv.

Tabla 3 Resultados de repetibilidad de naproxeno

Como podemos observar, el porcentaje de desviación es pequeño, siendo el de mayor variabilidad el nivel bajo, sin embargo dentro de rangos aceptables (