INTRODUCCIÓN En el laboratorio de Genética Microbiana de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas se realizan actividades de investigación y docencia para las que se requieren cepas bacterianas y de bacteriófagos que deben mantener sus características fenotípicas y genotípicas, con objeto de asegurar resultados confiables y repetibles en los proyectos de investigación así como en el desarrollo de trabajo experimental docente que se haya diseñado. Como en cualquier laboratorio de Microbiología, tanto en el trabajo de investigación como en el de docencia se requiere. a) Material de vidrio y de plástico que debe mantenerse limpio (libre de cualquier contaminante químico) y estéril. La esterilización del material puede llevarse a cabo mediante: 1) Calor húmedo (Autoclave): El calor excesivo mata a los microorganismos al coagular al protoplasma y desnaturalizar las enzimas esenciales, este proceso se acelera en presencia de agua puesto que las proteínas se coagulan a temperaturas más bajas cuando están bien hidratadas. En autoclave el material se somete entonces a temperaturas y presiones altas durante un determinado tiempo para eliminar la posibilidad de que un microorganismo se reproduzca. 2) Calor seco: El horno de calor seco es una cámara de doble pared, construida para resistir altas temperaturas y equipada con ventiladores para asegurar la circulación constante de aire dentro de la cámara. Para la realización de experimentos con los microorganismos a veces son necesarias soluciones amortiguadoras las cuales deben de igual manera esterilizarse antes de ser utilizadas. En este caso los métodos de esterilización pueden ser: Filtración: Consiste en dejar pasar dichas soluciones a través del material adecuado. Los soportes comunes de filtración son: ® Tierra de diatomeas ® Porcelana no vitrificada ® Discos de asbesto ® Polvo de vidrio ® Membranas de nitrocelulosa con poro de 0.45 o 0.22µm que deben esterilizarse antes de su uso.

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b) Medios de cultivo. Todos los medios contienen elementos esenciales para la sobrevivencia de los microorganismos; se han clasificado de diferente manera acuerdo a su uso. -Medio selectivo: Son medios de cultivo que tienen inhibidores de crecimiento para algunos microorganismos, por ejemplo pueden tener antibióticos específicos para cierta (s) bacteria (s). Es decir en un medio inoculado con una variedad de microorganismos solo algunos pueden crecer y reproducirse y todos los demás son suprimidos. - Medio enriquecido: Se usa para incrementar el crecimiento de ciertas especies bacterianas e inhibir el desarrollo de microorganismos no deseados para recuperar microorganismos patógenos de muestras en las cuales hay una fuerte concentración de comensales. -Medio mínimo: En este tipo de medio solo se agregan las sustancias estrictamente necesarias para que los microorganismos puedan sobrevivir. Es claro que los medios de cultivo también deben esterilizarse y en este caso siempre se usa la esterilización por calor húmedo. A pesar de que los aspectos anteriores se controlen en la forma adecuada cabe la posibilidad de que tanto el material como los reactivos y medios de cultivo puedan contaminarse y den falsos resultados. Por lo que se requiere de un control estricto de las cepas bacterianas y las condiciones en las que se trabaja. En el caso del material biológico se deben conservar los cultivos en condiciones que permitan la conservación de sus características tanto fenotípicas como genotípicas. Existen varias formas de conservar las cepas por ejemplo: La congelación; en este caso las cepas se mantienen a -70 grados centígrados en presencia de un crioprotector, la liofilización es otra forma de conservación de cepas, ésta consiste en un congelamiento y desecación de las cepas al vació, la siembra por picadura en medios ricos con altas concentraciones de agar y en el caso de los hongos la conservación en esferas de arena estéril.

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Justificación del trabajo:

Todos los laboratorios dedicados a hacer investigación en el campo de la Microbiología, están obligados a contar con un cepario con objeto de almacenar y preservar material biológico, indispensable para los trabajos de investigación que se llevan a cabo en los mismos. Por lo tanto es muy importante dar mantenimiento al cepario, ésto se cumple a través de actividades como, conservación, evaluación periódica y caracterización de las cepas existentes con el fin de garantizar el estado idóneo de éstas; al tiempo que se asegura que los experimentos realizados con ellas sean confiables y repetibles.

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MATERIALES Para la realización de los experimentos que se describirán posteriormente se utilizaron medios y soluciones, los cuales se señalan a continuación: Medios ricos: Caldo Luria (L o LB) Triptona (o Peptona de caseína) NaCl Extracto de levadura Agua

10g 10g 5g 1L

Se mezclan todos los componentes hasta disolverlos completamente, después se ajusta el pH a 7.0 con una solución de NaOH 1N, se completa el volumen y se esteriliza en autoclave a 121oC durante 15 minutos, se deja en prueba de esterilidad en una incubadora a 37oC durante 24 horas y se guarda a 4oC hasta su utilización. Agar Luria (L o LB) La composición y las proporciones son las mismas que para el caldo Luria, pero además de lo anteriormente descrito se adicionan, una vez que se ajustó el pH, 15g de agar bacteriológico por litro de solución, se esteriliza en autoclave a 121oC durante 15 minutos, se deja enfriar a 50oC, se vacía en cajas de Petri estériles, se deja gelificar, se comprueba su esterilidad incubando a 37oC durante 24 horas, y se guarda a 4oC hasta su utilización. Medio 2YT Triptona (o Peptona de caseína) Extracto de levadura NaCl Agua

16.0g 10.0g 10.0g 1.0L

Mezclar todos los componentes hasta su completa disolución, esterilizar en autoclave a 121oC durante 15 minutos. Se deja en prueba de esterilidad en una incubadora a 37oC durante 24 horas y se guarda a 4oC hasta su utilización.

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Medio 2YT sólido Se mezclan los mismos componentes y en la misma proporción que en el medio líquido, pero además se agregan 15g de agar bacteriológico por litro de medio, después, se esteriliza en autoclave a 121oC durante 15 minutos, se deja enfriar a 50oC, se vacía en cajas de Petri estériles, se deja gelificar y se somete a prueba de esterilidad en una incubadora a 37oC durante 24 horas y se guarda a 4oC hasta su utilización Medio BHI Este medio ya viene formulado por lo que sólo se pesan 52g de la fórmula en polvo, se disuelven en 1 litro de agua, para disolver la fórmula completamente se calienta con el mechero. Se esteriliza en autoclave, a 121oC durante 15 minutos, se deja enfriar a 50oC, se vacía en cajas de Petri estériles; se somete a prueba de esterilidad en una incubadora a 37oC durante 24 horas y se guarda a 4oC hasta su utilización. Infusión BHI Este medio ya viene formulado por lo que sólo se pesan 44g de la fórmula en polvo y se disuelven en 1 litro de agua, para disolver la fórmula completamente se calienta con el mechero. Se esteriliza en autoclave a 121oC durante 15 minutos, se deja en prueba de esterilidad en una incubadora a 37oC durante 24 horas y se guarda a 4oC hasta su utilización. Medios selectivos: Agar Mac Conkey Este medio al igual que los anteriores se adquirió ya formulado por lo que sólo se pesan 38g del polvo, se mezclan con 1 litro de agua de garrafón y se disuelve calentando a mechero. Se esteriliza en autoclave a 121oC durante 15 minutos, se deja enfriar a 50oC, se vacía en cajas de Petri estériles, se deja gelificar, se somete a prueba de esterilidad en una incubadora a 37oC durante 24 horas y se guarda a 4oC hasta su uso. Nota: Este medio nos permite reconocer y diferenciar células lac+ de las cepas lacmediante una coloración rosa y blanquecina de las colonias bacterianas respectivamente.

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Medios mínimos. Como base para todos los medios mínimos a continuación descritos se utilizó el medio M9 el cual tiene la siguiente composición: NaCl Na2HPO4 KH2PO4 NH4Cl

0.5g 6.0g 3.0g 1.0g

Disolver uno a uno de los componentes en 1 Litro de agua desionizada. Se esteriliza en autoclave a 121oC durante 15 minutos, una vez esterilizado y frió a este medio se deben adicionar 0.1ml de una solución de cloruro de calcio CaCl2 1M estéril. Para la preparación de los medios mínimos al medio M9, se deben adicionar soluciones de aminoácidos, vitaminas y en ocasiones de bases nitrogenadas y antibióticos que se requieran para las cepas, las cuales deben prepararse y esterilizarse por separado y adicionarse en las concentraciones indicadas en la tabla 1.

Tabla 1: Concentraciones de aminoácidos, glucosa y bases nitrogenadas para la preparación de medios mínimos

Componente

Concentración %

Volumen por litro de medio

Glucosa

20

10

L-Arginina

2

10

L-Histidina

1

5

L-Isoluecina

1

5

L-Leucina

0.5

10

L-Prolina

2

10

L-Treonina

0.5

10

L-Triptofano

0.5

10

L-Metionina

1

10

L-Serina

1

10

Vitamina B1

0.2

0.2

Timina

0.1

15

Estreptomicina

10

1

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Medios para el almacenamiento de las cepas. A- Siembra por picadura (Stabs) Caldo nutritivo NaCl Agar bacteriológico Agua

10 g 5g 6g 1 L.

Se esteriliza el medio en autoclave a 121oC por 15 minutos, después de lo cual, se vacía en viales, previamente esterilizados, hasta llenar las dos terceras partes del tubo; que debe mantenerse totalmente vertical. Se deja solidificar y se guarda en refrigeración hasta su utilización. B-Medios para el almacenamiento por congelación. (Glicerol). Glicerol Agua

80 g 100 ml

Se mezclan los componentes y se esteriliza en autoclave a 121oC por 15 minutos, después se guarda en refrigeración hasta su utilización. Agar blando Agar bacteriológico Agua

0.7 g. 100 ml.

Se mezclan los componentes se calienta a fuego lento con mechero hasta disolver completamente, se distribuye en volúmenes de 3 ml en tubos de hemólisis, se esteriliza en autoclave a 121oC durante 15 minutos, se deja gelificar el medio y los tubos se someten a prueba de esterilidad en una incubadora a 37oC durante 24 horas, posteriormente se guarda a 4oC hasta su utilización Solución salina al 0.85% NaCl Agua

0.85 g 100mL.

Se mezclan los componentes, después de lo cual se esterilizan en autoclave a 121oC por 15 minutos, después se guarda en refrigeración hasta su utilización.

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METODOLOGÍA Determinación de la viabilidad de los cultivos del cepario del Laboratorio de Genética Microbiana. Los cultivos bacterianos fueron recuperados de los “stabs” que se mantenían en refrigeración. Para lo cual en varios tubos estériles de 13x 100, se agregaron 3ml de caldo nutritivo o infusión BHI o Caldo de Soya-Tripticaseina, para posteriormente sembrar en cada tubo una asada de cada una de las cepas a recuperar y se incubó a 37oC con agitación suave de 24 a 48 horas. Además se sembraron las mismas cepas en los mismos medios pero sólidos y se incubaron a 37oC por un periodo de 24 a 48 horas.

DETERMINACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS GENOTÍPICAS DE LAS CEPAS Para cada cepa se diseñaron los medios mínimos líquidos que se requerían para probar sus auxotrofias y sus resistencias o sensibilidades a antibióticos, tomando en cuenta la tabla 1 y las características reportadas para cada cepa. Las cepas se sembraron en cada uno de los medios y se incubaron a 37oC durante 48 horas, para determinar auxotrofías y durante 24 horas para establecer resistencia o sensibilidad a antibióticos. DETERMINACIÓN DEL TIPO SEXUAL DE LAS CEPAS Todas las cepas que resultaron viables se sembraron por estría cruzada en cajas conteniendo agar L, se incubaron de 18 a 24 horas. Posteriormente una asada de los cultivos crecidos fue resuspendida en 3ml de solución salina estéril, se adicionaron 0.1 ml de esta suspensión a un tubo de agar blando estéril previamente fundido, se vació en cajas de agar L, se permitió que gelificara el agar y posteriormente se colocaron de manera equidistante tres gotas (0.015ml) del bacteriófago M13 el cual reconoce pilis sexuales. Una vez absorbido el fago, las cajas se incubaron a 37oC y se hicieron observaciones a las 12, 18 y 24 horas para determinar si había o no efecto del bacteriófago.

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DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD DE FERMENTAR LACTOSA DE LAS CEPAS VIABLES Para la determinación de la capacidad de fermentar lactosa, a todas las cepas se les sembró en cajas de Petri conteniendo agar Mac Conkey, el cual es un medio que permite por una reacción colorida determinar si una cepa esta degradando lactosa pues, si lo hace se observa un color rosado en las colonias bacterianas si no, las colonias se aprecian totalmente blancas. (Ver figura 1 y 2). SIEMBRA POR PICADURA Las cepas se sembraron por estría cruzada en cajas conteniendo agar L se dejaron incubar de 18 a 24 horas a 37oC para obtener un cultivo fresco. Una vez crecidas las cepas se tomó una muestra con el asa recta y se sembró por picadura en los viales conteniendo los medios de conservación (“stabs”), cabe destacar que de cada cepa se sembraron dos viales.

CONGELADO DE LAS CEPAS

Cada una de las cepas fue inoculada en 1.4ml de medio L, e incubada a 37oC durante 18 a 24 horas, una vez crecido, al cultivo fresco de toda la noche se le adicionaron 0.57ml de glicerol al 80% estéril, se congeló y los viales se mantuvieron a -15oC.

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Figura 1: Se muestra un cultivo bacteriano con la capacidad de fermentar lactosa, sembrado por estría cruzada en medio Mac Conkey.

Figura 2: Se muestra un cultivo bacteriano que no puede fermentar lactosa, sembrado en Agar Mac Conkey. Observe como las colonias se ven completamente blancas comparadas con las de la figura anterior que son mas bien rosadas.

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RESULTADOS Tabla No. 2 VIABILIDAD DE LAS CEPAS CONSERVADAS EN EL LABORATORIO DE GENÉTICA MICROBIANA Cepa AB2463 JM103 W3350 CSH23(a) CSH23 (b) CSH141 E3(a) E3(b) E3(c) E3(d) E3(e) JC4046 JC4087 SB392(a) SB392(b) SB392(c) SB393 (a) SB393 (d) XLBLUE TA216(a) TA216(b) C600(a) C600(b) C600(c) CSH62(a) CSH62(b) CSH62(c) CSH70(a) CSH70(b) JC158(a) JC158(b) JC158(c) JC158(d)

Viabilidad + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -

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Tabla No. 2-. CONTINUACIÓN Cepa JC4079 (a) JC4079 (b) JC4079 (c) JC4079 (d) KL16(a) KL16(b) KL16(c) P10(a) P10(b) P10 (c) 3000(a) 3000(b) 3000(c) 5051 B188 (a) B188 (b) BL16W

Viabilidad + + + + + + + + + + + + + +

Las cepas que a su lado derecho tienen una letra entre paréntesis, son cepas de las que se encontró mas de un “stab”, y se probaron todos, el símbolo (-) indica que el cultivo no creció ni aun después de 48 horas de incubación y el signo (+), indica que el cultivo celular en cuestión, creció antes de hasta 48 horas de incubación en agitación a 37ºC. Como se observa en la tabla no todos los cultivos resultaron viables.

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Tabla No. 3 CARACTERÍSTICAS GENOTÍPICAS DE LAS CEPAS VIABLES ANALIZADAS CEPA

TIPO SEXUAL

AB2463 F-

MARCADORES DE AUXOTROFIA

MARCADORES PARA ANTIBIÓTICOS SmR

? ?

JM103 W3350 CSH23 CSH141 E3 JC4046 JC4087 SB392 SB393 XLBLUE TA216 C600 CSH62 CSH70 JC158 JC4079 Kl16 P10 3000 5051

FFF’ F’ F’ F’ F’ F’ F’ F’ F’ Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr

Thr-,Leu-,Pro-,His-,Thi-,Gal,Lac-,Mtol-,Rec-,UVs Met-,Timina-,LacGalPro-,Lac-,B1-/F lac+,Pro+ ∆lac Pro- /F Lac+,Pro+ Lac-/F lac+ His+ /F HisMet-,His-Arg-Leu-/ F His+ His-/ F lac- ambar His-,Arg-,Ile-,Lac+/ F Lac- ocre ? His-/ F lac - opalo Protótrofa B1Met-,Arg-,B1Lys-, Ser-, Lac-, Trp-,LacB1Thr-, Leu-, lac-, B1- , Mal-. B1B1-

B188 BL6W

? ?

? ?

Sms Sms Sm? SpcR Sms Sms Sms Sms ? Sms ? ? Sms Sms Sms Sms Sms Sms Sms Sms Sms

En esta tabla se muestran las características genotípicas de las cepas, reportadas en la bibliografía. F-: Célula receptora F’ y Hfr: Célula donadora

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Tabla No. 4

VERIFICACIÓN DE LOS MARCADORES DE AUXOTROFIA DE LAS CEPAS VIABLES CEPA

INGREDIENTES DEL MEDIO

AB2463

M9+Glc M9+Glc+Leu,Pro,His,Arg,Thi, M9+Glc+Thr+Pro+His+Arg+Thi M9+Glc+Thr+Leu+His+Arg+Thi M9+Glc+Thr+Leu+Pro+Arg+Thi M9+Glc+Thr+Leu+Pro+His+Thi M9+Glc+Thr+Leu+Pro+His+Arg M9+Glc+Thr+Leu+Pro+His+Arg+Thi

JM103

M9+Glc M9+Glc+Met M9+Glc+Timina M9+Glc+Met+Timina

Met,Timina Timina Met Control

+++

W3350 CSH23 (a)

M9+Glc M9+Glc M9+Glc+B1

Control B1 Control

+++ +++

CSH23 (b)

M9+Glc M9+Glc+B1

B1 Control

+++

CSH141

M9+Glc M9+Glc+Pro

Pro Control

+ +++

E3 (b)

M9+Glc

Control

+++

JC4046

M9+Glc M9+Glc+His

His Control

++ +++

JC4087

M9+Glc M9+Glc+Met+His+Arg M9+Glc+Met+His+Leu M9+Glc+Met+Arg+Leu M9+Glc+His+Arg+Leu M9+Glc+Met+His+Arg+Leu M9+Glc M9+Glc+His

Met,His,Arg,Leu Leu Arg His Met control His Control

+++ +++

SB392(a)

AUXOTROFIAS A PROBAR Todas Thr Leu Pro His Arg Thi control

CRECIMIENTO +++

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Tabla No. 4.- CONTINUACIÓN CEPA

INGREDIENTES DEL MEDIO

AUXOTROFIAS A PROBAR

CRECIMIENTO

SB392 (b)

M9+Glc M9+Glc+His

His Control

+ +++

SB393 (d)

M9+Glc M9+Ile+Arg M9+Glc+Ile+His M9+Arg+His M9+His+Ile+His M9+Glc

Ile,Arg,His His Arg Ile Control Control

+ + +++ +++

C600 (b)

M9+Glc M9+Glc+His M9+Glc

His Control Control

+++ +++

C600(c)

M9+Glc

Control

+++

CSH62 (b)

M9+GLc M9+Glc+B1 M9+Glc M9+Glc+Met+Arg M9+Glc+B1+Met M9+Glc+B1+Arg M9+Glc+B1+Met

B1 Control B1,Met,Arg B1 Arg Met Control

+++ + +++

M9+Glc M9+Glc+Met+Arg M9+Glc+B1+Met M9+Glc+B1+Arg M9+Glc+B1+Met

B1,Met,Arg B1 Arg Met Control

+ +++

XLBLUE TA216(b)

CSH70 (a)

CSH70 (b)

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Tabla No. 4.- CONTINUACIÓN

CEPA

INGREDIENTES DEL MEDIO M9+Glc M9+Glc+Lys M9+Glc+Ser M9+Glc+Ser+Lys M9+Glc M9+Glc+Lys M9+Glc+Ser M9+Glc+Ser+Lys M9+Glc M9+Glc+Lys M9+Glc+Ser M9+Glc+Ser+Lys M9+Glc M9+Glc+Trp M9+Glc+Leu M9+Glc+Trp+Leu

AUXOTROFIAS A PROBAR Lys, Ser Ser Lys Control Lys, Ser Ser Lys Control Lys, Ser Ser Lys Control Trp, Lys Lys Trp Control

CRECIMIENTO

JC4079(b)

M9+Glc M9+Glc+Trp M9+Glc+Leu M9+Glc+Trp+Leu

Trp, Leu Leu Trp Control

+++

JC4079(c)

M9+Glc M9+Glc+Trp M9+Glc+Leu M9+Glc+Trp+Leu

Trp, Leu Leu Trp Control

+++

KL16 (a)

M9+Glc M9+Glc+B1 M9+Glc M9+Glc+B1 M9+Glc M9+Glc+B1

B1 Control B1 Control B1 Control

+++ +++ +++

JC158 (a)

JC158 (b)

JC158 (c)

JC4079(a)

KL16 (b) KL16 (c)

+++ +++ +++ +++

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Tabla No. 4.- CONTINUACIÓN CEPA P10 (a)

P10 (b)

P10 (c)

3000 (c) 5051 B188(a) B188(b)

BL16W

INGREDIENTES DEL MEDIO M9+Glc M9+Glc+B1 M9+Glc+Thr+B1 M9+Glc+Leu+Thr M9+Glc+Leu+Thr+B1 M9+Glc M9+Glc+B1 M9+Glc+Thr+B1 M9+Glc+Leu+Thr M9+Glc+Leu+Thr+B1 M9+Glc M9+Glc+B1 M9+Glc+Thr+B1 M9+Glc+Leu+Thr M9+Glc+Leu+Thr+B1 M9+Glc M9+Glc+B1 M9+Glc M9+Glc+B1 M9+Glc M9+Glc M9+Glc

AUXOTROFIAS A PROBAR Thr, Leu, B1 Thr Leu B1 Control Thr, Leu, B1 Thr Leu B1 Control Thr, Leu, B1 Thr Leu B1 Control B1 Control B1 Control Control Control Control

CRECIMIENTO +++ + +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

Se probaron todas las copias viables de cada una de las cepas, se puede observar en la tabla que en la mayoría de los casos todas las copias presentaron las mismas características excepto en el caso de KL16 y SB392.

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Tabla No.5 DETERMINACIÓN DEL CARÁCTER DE DONADORA DE LAS CEPAS VIABLES CEPA AB2463 JM103 W3350 CSH23(a) CSH23(b) CSH141 E3(b) JC4046 JC4087 SB392(a) SB392(b) SB393(d) XLBLUE TA216(b) C600(b) C600(c) CSH62(b) CSH70(a) CSH70(b) JC158(a) JC158(b) JC158(c) JC4079(a) JC4079(b) JC4079(c) KL16(a) KL16(b) KL16(c) P10(a) P10(b) P10(c) 3000© 5051 B188(a) B188(b) BL16W

SENSIBILIDAD AL BACTERIÓFAGO M13 Negativa Negativa Negativa Positiva Positiva Negativa Positiva Positiva Positiva Negativa Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Negativa

Se muestran los resultados de la prueba de gota con un bacteriófago específico de células donadoras, realizados a todos los cultivos bacterianos viables del Laboratorio de Genética Microbiana .Como se observa los resultados obtenidos corresponden a lo reportado en la bibliografía excepto en el caso de las cepas CSH141 y SB392(a), que deberían dar positiva la prueba.

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Tabla No. 6 Determinación de la respuesta a estreptomicina de las cepas viables CEPA AB2463 JM103 W3350 CSH23(a)* CSH23(b) CSH141 E3(b) JC4046 JC4087 SB392(a)* SB392(b) * SB393(d) XLBLUE* TA216(b)* C600(b) C600(c) CSH62(b) CSH70(a) CSH70(b) JC158(a) JC158(b) JC158(c) JC4079(a) JC4079(b) JC4079(c) KL16(a) KL16(b) KL16(c) P10(a) P10(b) P10(c) 3000(c) 5051 B188(a)* B188(b)* BL16W*

MEDIO RICO+SM + -

MEDIO RICO + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Se muestra la capacidad que tienen las cepas de crecer o nó en presencia de estreptomicina, las cepas que no crecieron en presencia de dicho antibiótico pero si en medio rico son estreptomicina sensibles (Sms), y las que lo hacen con o sin la presencia del antibiótico son estreptomicina resistentes (SmR). En la mayoría de los casos los resultados corresponden a lo reportado en la bibliografía pero en algunos otros (Los cuales están marcados con un *) se hizo esta prueba por primera vez.

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Tabla 7 DETERMINACIÓN DE LA FERMENTACIÓN DE LACTOSA POR LAS CEPAS EN ESTUDIO CEPA AB2463 JM103 W3350* CSH23(a) CSH23(b) CSH141 E3(b) JC4046* JC4087* SB392(a) SB392(b) SB393(d) XLBLUE* TA216(b) C600(b) C600(c) CSH62(b)* CSH70(a)* CSH70(b)* JC158(a) JC158(b) JC158(c) JC4079(a) JC4079(b) JC4079(c) KL16(a)* KL16(b)* KL16(c)* P10(a) P10(b) P10(c) 3000(c)* 5051* B188(a)* B188(b)* BL16W*

CAPACIDAD DE FERMENTAR LACTOSA Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Positiva Negativa Negativa Negativa Negativa

En este experimento se midió la capacidad que tienen las cepas de fermentar o no el azúcar lactosa. Como ya se mencionó las cepas que pueden hacerlo se observan como en la figura1 y las que nó como en la figura 2. De nuevo en la mayoría de

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los casos los resultados corresponden a lo reportado en la bibliografía pero en algunos otros (Los cuales están marcados con un *) se hizo esta prueba por primera vez.

DISCUSIÓN Para realizar los experimentos fue necesario identificar los cultivos viables de cada una de las cepas, por lo que se crecieron en medios ricos. Una vez hecho esto, se sembró por estría cruzada, cada una de las cepas viables sobre medio rico sólido, con objeto de verificar la pureza de las mismas, ya que se tuvieron las cepas puras se cultivaron en los medios mínimos especialmente diseñados para identificar cada una de las características genotípicas reportadas en la bibliografía para cada una de ellas. Cabe destacar que para las características de sensibilidad a estreptomicina y fermentación de lactosa no había reportes en la literatura para algunas de las cepas, las cuales se muestran en las tablas 6 y 7 respectivamente. Como puede observarse en el apartado de resultados la mayoría de las cepas analizadas conserva las características genotípicas reportadas, al menos en uno de los tubos almacenados; por lo que se procedió a realizar la conservación de las cepas, cuando mas de un cultivo presentaba las características buscadas se escogió arbitrariamente alguno de ellos para preservarlo. En el caso específico de la cepa CSH141 los resultados indicaron que está perdió las características contenidas en el plásmido que porta la bacteria, por lo que puede suponerse que dicha cepa perdió el plásmido. Cabe señalar que los “stabs” tenían varios años conservados en refrigeración y como puede verse en resultados el 70.58% estaban viables y el 80.55 conservaban sus características genotípicas; esto demuestra que la técnica de conservación por picadura en el medio para el almacenamiento de cepas elaboradó con caldo nutritivo y cloruro de sodio conservando un volumen pequeño de aire, es un método muy bondadoso para la conservación del tipo de cepas que se emplean en el Laboratorio de Genética Microbiana; tendrían que hacerse otro tipo de experimentación para determinar si cepas con mayores requerimientos nutricionales pueden conservarse de esta manera.

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CONCLUSIONES Se presenta un listado de las cepas que se incorporaron como cultivos frescos al cepario del Laboratorio de Genética Microbiana de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas incluyendo las características genotípicas de cada una de ellas. CEPA

TIPO SEXUAL

AB2463 F-

MARCADORES DE AUXOTROFIA

MARCADORES PARA ANTIBIÓTICOS SmR

Sms Sms

JM103 W3350 CSH23 CSH141 E3 JC4046 JC4087 SB392 SB393 XLBLUE TA216 C600 CSH62 CSH70 JC158 JC4079 Kl16 P10 3000 5051

FFF’ F’ F’ F’ F’ F’ F’ F’ F’ Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr

Thr-,Leu-,Pro-,His-,Thi-,Gal,Lac-,Mtol-,Rec-,UVs Met-,Timina-,Lac Gal-,LacPro-,Lac-,B1-/F lac+,Pro+ ∆lac Pro- /F Lac+,Pro+ Lac-/F lac+ Lac-.His+ /F HisLac-.Met-,His-Arg-Leu-/ F His+ His-/ F lac- ambar His-,Arg-,Ile-,Lac+/ F Lac- ocre Protótrofa, Lac-. His-/ F lac - opalo Protótrofa B1-, LacMet-,Arg-,B1-, Lac-, Lys-, Ser-, Lac-, Trp-,LacB1-, Lac-, Thr-, Leu-, lac-, B1- , Mal-. B1-, Lac+ B1-, Lac-

B188 BL6W

Donadora Donadora

Protótrofa, LacProtótrofa, Lac-

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INFORME FINAL DE SERVICIO SOCIAL

NALLELYT SEGUNDO ARIZMENDI

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BIBLIOGRAFÍA

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