INTRODUCCIÓN Francisco J. Iruegas Buentello

La importancia de la Parasitología en México y el Mundo: El Programa Regional de Enfermedades Parasitarias y Desatendidas creado por la Organización Panamericana de la Salud (OPS) son un grupo de enfermedades parasitarias (filariosis linfática, oncocercosis, helmintiasis

intestinal, esquistosomiosis y leishmaniosis y otras infecciosas bacterianas) que generalmente se caracterizan por la inversión históricamente baja del sector farmacéutico y que principalmente afectan a los grupos más desprivilegiadas de la sociedad (Fig. 1).

Fig. 1. La carga de las enfermedades desatendidas en América Latina y el Caribe en comparación con otras enfermedades trasmisibles en millones de casos (OPS, 2010a).

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La esquistosomiosis (Schistoma mansoni) todavía afecta por lo menos a ocho países de Latinoamérica; Brasil lleva la mayor carga, donde se estima que al menos 2,5 millones de personas están infectadas y 6 millones están en riesgo (OPS, 2010a). La filariosis linfática (elefantitis o elefantiasis filárica) afecta a más de medio millón de personas en Latinoamérica, donde se estima que en términos mínimos 6–8 millones de personas están en riesgo, principalmente en Haití pero también en Guyana, la República Dominicana y la parte del nordeste del Brasil. La oncocercosis pone en riesgo a cerca de medio millón de personas. Lo más problemático abarca una región extensa de comunidades remotas en la zona fronteriza Venezuela-Brasil. La leishmaniosis constituye un problema creciente en las zonas rurales y periurbanas en muchos países de Latinoamérica, con casi 35,000 casos notificados en el Brasil sólo en 2003; sin embargo, la notificación insuficiente o la falta de información es común en las zonas marginales rurales y periurbanas de la Región donde estas enfermedades generalmente se encuentran. La geohelmintiasis y la esquistosomiosis son problemas de salud pública serios que afectan principalmente a la población en edad escolar y mujeres en edad fecunda, adolescentes y los jóvenes adultos en edad de trabajar. Para abordar esta carga de

morbilidad, por lo menos 75% de niños en edad escolar que viven en las áreas de riesgo para geohelmintos y esquistosomiosis van a necesitar acceso a la quimioterapia regular para 2010, donde se superponen las dos enfermedades, las normas de la OMS recomiendan el tratamiento combinado junto con mejor agua y saneamiento y educación sanitaria (OPS, 2010b). La OPS (2010) reporta para México 1.1 casos humanos de teniasis por cada 100 mil habitantes teniasis y 0,7 de cisticercosis El número de defunciones por cisticercosis fue de 200. El mayor brote de malaria en los últimos cuatro años lo padeció Oaxaca con 11.349 casos entre 1994-1998. La oncocercosis tuvo entre 1997 y el 2000 un total de 1,424 casos notificados, pero en el 2007 se reporta 001 % en el sur de Chiapas y 0 % en el Norte del mismo estado y en Oaxaca (WHO, 2009). La leishmaniosis se presentó fundamentalmente en los estados de Quintana Roo, Tabasco, Campeche y Chiapas, con una morbilidad reportada de 1.700 casos en 1999. En cuanto a la tripanosomosis americana en el 2000 se encontró que la incidencia fluctuaba entre 1 y 20 casos por 1,000 habitantes. El tamizaje serológico para la enfermedad de Chagas reportado por los bancos de sangre del país fue del 13%.

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Los helmintos trasmitidos por suelo (HTS) conocidos comúnmente como gusanos intestinales son las infecciones más comunes en el mundo que afectan a las comunidades más desprotegidas. Los agentes causales de HTS son Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura y las uncinarias. Reportes recientes indican que A. lumbricoides afecta a 1 billón de personas, T. trichiura a 795 millones y las uncinarias (Ancylostoma duodenale and Necator americanus) parasita a 740 millones. El mayor número de infecciones por HTS ocurre en África-Sahariana, América, China y este de Asia (WHO, 2009). La OMS calcula que 20–30% de todos los latinoamericanos están infectados por helmintos intestinales (parásitos intestinales), mientras que las cifras en los barrios pobres alcanzan con frecuencia el 50% y hasta el 95% en algunas tribus indígenas (OPS, 2010b). La prevalencia de HTS ha sido analizada por la WHO (2009) del 2002 al 2006. Los reportes indican rangos de prevalencia en los siguientes niveles: Argentina 9.0-38.7%; Belice: 43.652.2%; Brasil: 2-36%, Haití: 15-87%; Honduras: 12.2-97%, México: 0.01-16.3%, Nicaragua 27-80% y Venezuela: 3-19%. De ellos, solo Venezuela y México reportan prevalencias inferiores al 20%. Para otros países, los rangos oscilan de la siguiente forma: Bolivia: 4.5-65.4%, Colombia: 10.749.3%, Cuba: 4.5-47.3%, República Dominicana: 5.3-55.3%; Ecuador: 28.5-71%,

Guatemala: 12.7-68%, Guyana: 12.3-38%, Perú: 1.8-80.4%, Santa Lucia: 35-45% y Surinam: 36-43% (Fig. 2, PAHO, 2011). Por este motivo, en el curso de Parasitología Clínica de la carrera de Químico Bacteriólogo Parasitólogo tiene como objetivo general capacitar al alumno en el conocimiento de la morfología, fases de desarrollo, ciclo biológico, medidas profilácticas y diagnóstico y de las entidades parasitarias. Es importante destacar que la migración de las poblaciones humanas de zonas rurales hacia zonas urbanas o países

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Fig. 2. Prevalencia de HTS en América Latina y el Caribe (PAHO, 2011)

desarrollados, en busca de un mejoría en su calidad de vida, cambian el patrón de la distribución geográfica de las parasitosis que antes eran casi exclusivas de las zonas desprotegidas, como ejemplo, la tripanosomiosis americana, la cual era una

infección primeramente trasmitida por vectores hematófagos, es actualmente trasmitida primeramente por transfusión sanguínea en las áreas urbanas.

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Bibliografía Hotez PJ, ME Bottazzi, CF-Paredes, SK Ault, MR Periago. 2008. The Neglected Tropical Diseases of Latin America and the Caribbean: A Review of Disease Burden and Distribution and a Roadmap for Control and Elimination. PloS Negl Trop Dis.2:e300. OPS, 2010a. Enfermedades parasitarias y desatendidas. La carga de las enfermedades desatendidas en América Latina y el Caribe en comparación con otras enfermedades transmisibles. http://www.paho.org/Spanish/AD/DP C/CD/psit-nd-graph.htm y OPS (PAHO), 2010b. Enfermedades parasíticas y desatendidas: El Programa Regional de la OPS.Programas de prevención, control

y/o eliminación: http://www.paho.org/Spanish/AD/DP C/CD/psit-program-page.htm PAHO, 2011. Prevalence and intensity of infection of Soil-transmitted Helminths in Latin America and the Caribbean. Countries: Mapping at second administrative level 20002010. Washington, D.C.: WHO, 2009. Intestinal Worms: Soiltransmitted helminthes. http://www.who.int/intestinal_worms /en/index.html. Acceso el 18 de marzo, 2010.

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PRÁCTICA 1 MICROSCOPÍA L. Galaviz Silva Introducción El microscopio es un instrumento que sirve en el campo diagnóstico e investigación para detectar microorganismos que no es posible ver a simple vista y para el estudio morfológico de protozoarios y helmintos. Estos constan de tres sistemas elementales, que son el sistema mecánico, óptico y de iluminación. Desde los modelos más antiguos, hasta los equipos más modernos, podemos encontrar estos tres sistemas. De hecho, el conocimiento de las células y organismos microscópicos es paralelo al desarrollo del microscopio. El primero en utilizar la palabra microscopium fue Atanasio Kircher (1601-1680). No se sabe con certeza cuando se descubrieron las propiedades de los cristales curvos para modificar los haces de luz y formar o amplificar imágenes. Las evidencias indican que desde el siglo XIII, en Italia, ya se usaban estas propiedades de los cristales, pero fue hasta 1665 cuando se describe su aplicación en el estudio de la célula, aplicándose inicialmente en una rebanada de corcho por Robert Hooke. Siguiendo a estas observaciones, otros

personajes de la misma época, utilizaron el mismo tipo de instrumentos para describir protozoarios, células vegetales y tejidos animales (Gama, 2007). En 1830, al desarrollar una óptica más adecuada se constató que todos los tejidos, animales y vegetales, estaban constituidos por células y que el embrión de las plantas se derivaban de una célula única. Esta primera aplicación, más formal, fue llevada por Matthias Schleiden en 1838. Un año más tarde, el investigador Theodore Schwann, colega de Schleiden, publicó uno de los trabajos más completos sobre las bases celulares de la vida. Propuso que todos los tejidos estaban formados por células y que estas eran la unidad funcional de los organismos vivos. Schwann, junto con su colega establecieron la Teoría Celular (Gama, 2010). El microscopio, a diferencia del estereoscopio, nos proyecta una imagen bidimensional e invertida en un doble plano. De esta manera, la imagen que es transportada en el haz de luz, al pasar por la

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lente del objetivo sufre el primer aumento e inversión (imagen intermedia), y al pasar por la lente del ocular se invierte en el segundo plano, siguiendo las leyes de la propagación rectilínea de la luz (Gu, 2002; Inoué, 2007). El poder de resolución del microscopio significa su capacidad para separar dos puntos que aparentemente son uno solo y es función de la apertura numérica del objetivo, del condensador y de la longitud de onda de la luz. La apertura numérica es también el aumento útil de las imágenes y el límite de resolución de las lentes. El aumento útil significa la cantidad de veces que puede ampliarse un objeto distinguiendo en él más detalles que originalmente han escapado de nuestra vista (resolución), pero finalmente, cuando llegamos al límite de resolución de la lente ya no se observarán más detalles del objeto por más aumentos que se le apliquen. A esto se le llama amplificación vacía y se refiere al límite de resolución. La apertura numérica de las lentes, se refiere al ángulo de que se forma por el axis óptico de los rayos de la luz (A) que inciden en el objetivo, también llamado ángulo de apertura. La magnitud de este ángulo no está indicada en grados, sino en el valor del ángulo seno, que es un valor numérico. Esto explica el origen del término que es “apertura numérica”. Esto es el seno de la mitad del ángulo de apertura multiplicada por el índice de refracción (n) del medio que llena el espacio

entre el cubreobjetos y la lente (Inoué, 2007).

Donde n es el índice de refracción del medio que llena el espacio entre el cubreobjetos y el objetivo. Este oscila entre 1 en el caso del aire, hasta 1.51 si es aceite de inmersión. A partir de esta ecuación, es obvio que cuando el medio es el aire, (n=1), entonces la apertura numérica depende solamente del ángulo , cuyo máximo valor es 90°. El sin del ángulo por lo mismo, tiene un valor máximo de 1.0 (sen (90°))= 1, el cual es la apertura numérica máxima de un lente operando con aire usando objetivos “secos” (Davidson, 2010). Analizando la ecuación de apertura numérica, aparentemente el índice de refracción es factor limitante, para lograr aperturas mayores de 1.0. Por eso, para obtener mayores aperturas numéricas se debe incrementar el indice de refracción del medio que llena el frente de la lente del objetivo y el cubreobjetos. Ahora se han desarrollado objetivos que permiten medios alternativos como el agua (n=1.33), glicerina (n=1.47) y aceite de inmersio´n, (n=1.51). De acuerdo a la marca del microscopio, varía la banda de color que identifica el medio de inmersión recomendado (Kapitza, 1997; Juskaitis, 2007).

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3. El estudiante aplicará las normas para el mantenimiento y cuidado del microscopio.

u´ u´

Aire

Aceite

Material Fig. 3. Esquema de la apertura numérica (u´). IR del aire = 1. IR del aceite= 1.515 U´ y u´: Angulo de apertura de los rayos. No en grados, sino en forma de un valor seno, que es un valor numérico = Apertura numérica

Objetivo general Mostrar al alumno la aplicación de las técnicas microscópicas en Parasitología, el uso correcto y el mantenimiento del microscopio de luz ó microscopio óptico, debido a que el diagnóstico de certeza de las parasitosis, se basa en este importante instrumento. Objetivos particulares: 1. Dar a conocer al estudiante las técnicas microscópicas de campo claro, contraste de fases, campo oscuro, interferencia y polarización. 2. El estudiante será capaz de esquematizar estructuras microscópicas y conducir un estudio morfométrico de los protozoarios aplicando las medidas de longitud correspondientes.

1. Microscopio estándar, foto microscopio o mini cámara digital para el ocular, microscopio de contraste de fases, estereoscopio, microscopio invertido, cámara lúcida o clara, micrómetro ocular. 1. Método para calcular el poder de resolución: Para calcular el poder de resolución, se requiere conocer la longitud de onda de la luz visible, la apertura numérica del objetivo y del condensador. Una vez que investigue estas tres variables, aplique la siguiente formula: Poder de resolución = / AN objetivo + AN condensador Poder de resolución = 0.55 μm/1.25 + 0.9 = 0.25 μm Ejemplo de apertura numérica: Si es el objetivo de 100 X, este se fabrica con una apertura numérica de 1.25 (Kapitza, 1997), entonces, el poder de resolución calculado será: Un poder de resolución de 0.25 μm, significa que este lente de 100 X, tiene la capacidad 8

de resolver áreas o distancias entre dos puntos de 0.25 μm (la cuarta parte de la milésima de un milímetro).

Imagen en dos dimensiones: largo y ancho. Imagen invertida Distancia focal. Condensador.

Actividad. Calcule el poder de resolución del microscopio que le proporcione el instructor. 2. Método para explicar la formación de la imagen Aumento y transporte de la imagen a través de la propagación rectilínea de la luz.

Aumento total: Coeficiente de aumento (CA) del objetivo x CA del ocular x C A del multiplicador de aumentos (Si lo tiene).

B´´ B´ A B A´ A´´ Fig. 4. Formación de la primera y segunda imagen.

Aumento vacío: Aumento que no proporciona más información sobre el objeto. Aumento útil: Es la apertura numérica que permite conocer el poder de resolución del microscopio (capacidad de resolver la distancia entre dos puntos, que parecen ser uno solo),

Actividad a) Investigue el aumento total y el aumento útil de los instrumentos que le proporcione el instructor. b) Anote la letra A y la B en un acetato. Obsérvelas a través del microscopio (3X, 10X) y reporte el plano de observación e inversión observado.

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3. Método para conocer las partes del Carro y pinza microscopio. Tornillos de desplazamiento, Diafragma Con el instrumento proporcionado por el Tornillo del condensador, Revolver instructor, identifique las siguientes partes según el modelo y marca: Función de los objetivos: Proporcionarnos un a) Sistema óptico: aumento estándar del objeto, de 3.2 X a 100 Ocular X. En los microsdopios Carl Zeiss®, los Objetivo objetivos vienen graduados con información Condensador que indica: Espejo a) El aumento alcanzado (3.2 X; 10 X; 40X, b) Sistema mecánico: 100 X). Permite calcular el aumento total. Estativo b) Apertura numérica: Mide el poder de Pie resolución del objetivo, permitiendo calcular Tornillo de ajuste macrométrico el aumento útil. Tornillo de ajuste micrométrico c) Distancia del ocular al objetivo: Regulada a Platina 160 mm. PRINCIPALES PARTES DEL MICROSCOPIO Sistema óptico

Sistema mecánico

Ocular

•Tubo del ocular

Objetivos

•Estativo

Condensador Filtros

•Carro y pinzas •Platina

•Piñones de desplazamiento del carro

•Diafragma •Piñones de enfoque Fig. 5. Principales partes del microscopio (Carl Zeiss©).

APROXIMADO Y FINO

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d) Grosor del cubreobjetos (si requiere): 0.17 mm. e) Línea superior de color: Aumento del objetivo. Línea amarilla=10 X; Línea azul = 40X; Línea blanca = 100 X. f) Línea inferior de color: Indica el líquido de inmersión. Naranja: Glicerina (IR 1.455; Negra: Solo aceite de inmersión (IR 1.515), Blanca: Agua (1.333); Amarillo: Ioduro de metilo (1.740). (Kapitza, 1997; Petraco & Kubic, 2004). Obviamente, esta información no está estandarizada y varía de acuerdo a la marca.

Actividad. De acuerdo al modelo y marca del microscopio, identifique las partes y nomenclatura de los oculares y objetivos.

Fig. 6. Objetivos Marza Zeiss©. Flecha: Banda de color indica el aumento. (Azúl=40X. Verde=20X)

4. Método para usar los principales accesorios del microscopio: Existen hoy en día infinidad de accesorios para efectuar trabajos de investigación y diagnóstico microscópicos. Entre ellos se describirán como ejemplo la cámara lúcida y el micrómetro ocular, aclarando que en la actualidad se cuentan con micro proyectores de laminillas, cámaras de circuito cerrado, foto microscopios, equipos con interface a equipos computacionales, etc. a) Cámara lúcida: Diseñada por Wollaston en 1806, esta se emplea para elaborar esquemas de protozoarios y helmintos directamente del microscopio con la ventaja de que se conserva la proporcionalidad del tamaño y forma de las estructuras. Consta de un adaptador para el ocular del microscopio, filtros que regulan la intensidad de luz emergente y un espejo que proyecta la mano y lápiz del investigador al interior del campo del microscopio permitiendo seguir el contorno de las estructuras calcándolo sobre papel. Al utilizar este accesorio, se coloca el espejo a 45 ° aprox. Ensamblándolo sobre el ocular del microscopio y sujetándolo con el tornillo

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correspondiente. Enseguida se enfoca la preparación y se regula la intensidad de luz con el diafragma iris, o bien, con uno de los filtros de la cámara. El tornillo de enfoque fino y diafragma se mueven repetidamente a lo largo de la sesión, según los requerimientos de la iluminación. La luz en el exterior o ambiental, deberá ser tenue para que no interfiera con la luz de la bombilla del microscopio, impidiendo ver con claridad o nitidez las estructuras a dibujar. Solo en contorno o detalles gruesos de las estructuras se dibujan con la cámara. Los detalles finos se toman directamente del microscopio, sin la cámara y si se requiere en el objetivo de inmersión (100 X). Una vez iniciada la sesión para elaborar el esquema, es muy recomendable terminarlo totalmente, pues es difícil volver a colocar el organismo en la misma ubicación del bosquejo anterior y que coincida en todos sus contornos. Actividad. Dibuje con la cámara lúcida, el protozoario o helminto proporcionado por el maestro o instructor.

b) Micrómetro ocular: Se le llama así a un disco de acrílico o cristal que lleva impresa una línea con 5 o 10 divisiones mayores, entre las cuales aparecen 10 subdivisiones. A cada una de las subdivisiones les denominamos trazos, y una vez que se cuenta la cantidad de trazos, estos se multiplican por el factor de conversión correspondiente al objetivo (10X, 40X ó 100 X) y al microscopio calibrado para este efecto. Material necesario para la calibración del microscopio. a) Micrómetro ocular, consiste en un círculo de 18 mm, con escala. b) Acercamiento a la escala del micrómetro ocular; consiste en una línea de 1 cm con 100 divisiones, c) Micrómetro objetivo para calibrar la escala del ocular. Se muestra una microescala de 2 mm con divisiones de 0.01 mm (10 mm cada una). 1. Proceso de calibración del microscopio: Posicione la escala del micrómetro ocular sobre la escala del micrómetro objetivo.

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Enfocar. Hacer coincidir ambas líneas de los ceros. Buscar las líneas donde vuelven a coincidir ambas escalas.

Fig. 7. Escala del micrometro ocular con 100 divisiones.

Fig. 8. Portaobjetos con la escala calibradora (micrómetro objetivo), donde cada linea está separada 0.01mm (10 micrómetros) y sirve para calibrar el micrómetro ocular.

Escala del micrómetro ocular Escala del portaobjetos con la escala calibradora

Fig. 9. Calibración del micrómetro ocular. 1) Girar el ocular para hacer coincidir los ceros de ambas escalas. 2) Buscar lineas de coincidencia (flecha)

Ejemplo: 83 divisiones del micrómetro ocular corresponden a 55 divisiones del micrómetro objetivo (55 x 10 m, en objetivo 10X = 550 m). La escala de este último es de 1/100 (0.01 mm = 10 m). Dividiendo la medida del micrómetro objetivo entre el

número de líneas del micrómetro ocular, se obtiene la calibración correcta del objetivo de 10 X en micrómetros. Medida del micrómetro objetivo / Líneas del micrómetro ocular = 550 m /83 = 6.62 m.

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Realizar varios cálculos con las otras coincidencias y obtener el promedio. El valor solo es válido para el objetivo donde se calibró. Puede variar si el ocular se cambia a otro tipo de microscopio. Actividad: Tabule los valores de calibración en 10X, 40X y 100X. Diseñe una tabla de calibración siguiendo el ejemplo hipotético de abajo. Tabla 1. Ejemplo de la conversión del número de líneas a micrómetros según el objetivo. Número de líneas 1 2 3 4 5 etc. 50

CONVERSIÓN EN MICROMETROS ( m) 10X 40 X 100X 6.62 5 1 13.24 10 2 19.86 15 3 26.48 20 4 33.1 25 5 … … … 331 500 50

Mida cinco de los organelos u órganos (según se trate) del parásito y repórtelos en micrómetros. c) Método para usar la cámara digital de microscopio Moticam®. 1. Instale el programa del CD incluido en el equipo. Siga las instrucciones de acuerdo al fabricante.

3. Solamente remueva un ocular del microscopio e inserte la cámara digital ensamblada como se muestra por el instructor 4. Conecte el cable USB a la computadora y examine la imagen en su programa de video o fotografía favorito. Este es compatible con software TWAIN (Motic,. 2007)

3. Coloque la laminilla del protozoario o helminto proporcionado por el instructor bajo la lente del objetivo, seleccione el área que desea analizar y enfoque en la pantalla de la computadora.

Fig. 10. Cámara para microscopio para digitalizar imágenes de parásitos.

4. Grabe la (s) imágenes solicitadas por el instructor en Microsoft Photo Editor®, Paint ® o Publisher® en JPEG o TIFF con el nombre que desee en una unidad extraíble (tarjeta de memoria, disco flexible, etc.) 14

Actividad: Identifique con la ayuda de bibliografía, la morfología del parásito indique cada uno de sus órganos organelos, según se trate. Inclúyalo en reporte de la práctica.

la e u el

Resultados y Discusión 1) Reporte las actividades solicitadas en la práctica apoyándose con la literatura consultada. 2) Investigue sobre las aplicaciones de la microscopía de contraste de fases y la iluminación Köeler.

Cuidado del microscopio: El microscopio es un instrumento valioso y de precisión. Para que pueda funcionar eficientemente, es necesario darle un adecuado cuidado. Por ello debemos tener presentes las siguientes normas:

que se rayen. No use solventes, las superficies de los cristales también se limpian con una tela de lino o algodón, no con gamuza. 5. Inspeccione con frecuencia que los lentes estén libres de los restos de aceite de inmersión, huellas, maquillaje y trazas de grasa. 6. No coloque el microscopio en el borde de la mesa, un leve empujón o descuido podrá derribarlo. 7. Trasládelo en posición vertical, sin inclinarlo. 8. Enrolle el cable de luz apropiadamente. 9. Enfoque primero en panorámico, seco débil, fuerte y finalmente, en el de inmersión para evitar rayar o romper los objetivos. 10. No desarme jamás, el microscopio, o le quite oculares u objetivos para intercambiarlos sin no tiene la asesoría o preparación adecuada.

1. Si la lámpara está encendida no lo sacuda, pues el filamento incandescente puede romperse. 2. Si no está ocupando el microscopio, protéjalo del polvo colocándole su funda. El polvo es el peor enemigo. 3. Los oculares deben estar siempre introducidos. Evite transportarlo de lado para que no se desprendan y se rompan. 4. Elimine el polvo con algodón hidrófilo humedecido con agua o con vaho (aliento), sin tallar las lentes para evitar 15

® Zeiss: Marca Registrada por la Compañía Carl Zeiss, Alemania. ® Microsoft Photo Bibliografía Editor, Paint, Publisher: Marcas registradas

®

por Microsoft Corp. 1985-2007. Moticam es Marca registrada de Motic China Group.

Conclusiones

Literatura consultada (por el alumno)

Davidson MW. 2009. Introduction to Optical Microscopy, Digital Imaging, and Photomicrography. Molecular Expression. Optical Microscopy Primer. Florida State University. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/inde x.html . Acceso Marzo 18, 2010. Gama Fuentes, MA. 2007. Biología I. Un enfoque constructivista. Pearson Educación. México. 33a. ed. 52 pp. Gu, M. 2002. Advanced Optical Imaging Theory. 2002. Springer-Verlag. Berlin. Pp. 1-150. Inoué, S. 2007. Exploring Living Cells and Molecular Dynamics with Polarized Light Microscopy. In: Torök, P.; Kao, F. 2007. Optical Imaging and Microscopy. Techniques and Advances Systems. 2ª. Ed. Springer-Verlag, Berlin Pp. 3- 200. Juskaitis, R. 2007. 2. Characterizing High numerical aperture microscope objective lenses. In: Torök, P.; Kao, F. 2007. Optical Imaging and Microscopy. Techniques and Advances Systems. 2ª. Ed. Springer-Verlag, Berlin. 21-43 pp. Kapitza, H.G. 1997. Microscopy. from the very beginning. (Ed. Susanne Lichtenberg.) Carl Zeiss Jena Alemania. 44 pp. Motic, 2007. Motic Images Plus ver. 2.0 Software. Motic China Group. Xiamen, China. 16

Murphy, DB. 2002. Fundamentals of Light microscopy and electroning imaging. Wiley & Sons, Inc. Publications. 361 pp. USA. Parry-Hill M, TJ Fellers & MW Davidson. 2010. Eyepiece reticle calibration. USA. http://www.microscopyu.com/tutorials/ja va/reticlecalibration/index.html# Petraco, N. & Kubic, T. 2004. Color Atlas and Manual of Microscopy for Criminalists, Chemists, and Conservators. CRC Press. USA. 310 pp. Sterrenburg, AS. 2005. Microscopy Primer. Micscape Magazine. United Kindom.

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PRÁCTICA 2 TÉCNICAS HEMATOLÓGICAS Y TISULARES L Galaviz Silva Introducción Las técnicas para el estudio parasitológico de sangre y tejidos se emplean para el diagnostico de parásitos como son los géneros Plasmodium, Leishmania, Trypanosoma, etc. Cuando los parásitos invaden y se reproducen en el interior de los tejidos se les llama histozoicos, mientras que aquellos que habitan el interior de órganos huecos o lumen intestinal se les llama celozóicos. Entre el grupo de los metazoarios (pluricelulares) existe la superfamilia Filarioidea (nemátodos) los cuales habitan linfa y sangre, arrojando sus embriones (microfilarias) en el torrente sanguíneo. Estas son de gran importancia en medicina humana en el Sur de nuestro país, tal como es Onchocerca volvulus, causante de la oncocercosis o ceguera de los ríos, quien habita el tejido subepitelia (Garcia, 2001). Objetivo general Reforzar en el estudiante su habilidad para el manejo de órganos y tejidos en el diagnóstico de las parasitosis causadas por protozoarios. Esta práctica corresponde a la

Unidad A (Protozoarios de importancia médica) y Unidad E (Nemátodos de importancia médica) de la carta descriptiva de la materia. Objetivos particulares: 1. El alumno practicará la realización de frotis sanguíneos extendidos, gota gruesa y preparación de improntas para estudio histológico. 2. Aplicará las técnicas de fijación y tinción (Giemsa, Wright y combinada) convencionales para la preservación y estudio de las muestras. Material Para la obtención de la muestra de sangre y realización de frotis extendidos se necesita utilizar anticoagulantes, cualquiera de estos pueden prepararse en el laboratorio (según los reactivos disponibles) de la siguiente manera: A) Anticoagulante de Heller y Paul Oxalato de potasio 0.8 g Oxalato de amonio 0.2 g Agua destilada. Aforar a 100 ml

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Se emplea 1 ml de la solución por tubo de ensaye. Se deja evaporar el agua en una estufa. El residuo cristalino se mezcla con 10 ml de sangre. B) Heparina en polvo Utilizar 2 mg por cada ml de sangre. Se puede disolver en etanol absoluto o agua y evaporarlo antes de usar. C) Citrato de sodio Citrato trisódico 2g Solución salina 0.85% 100ml Utilizar 2ml por cada 8 ml de sangre.

D) EDTA. Se emplea 1-2 mg de EDTA en polvo por cada mililitro de sangre. Detalles de la preparación y el modo de acción de cada anticoagulante, se describen en Todd et al. (2005). El instructor proporcionará al alumno el siguiente material: Microscopio Jarras de tinción MetanolCanastillas de tinción Anticoagulante Colorante de Wright Colorantde Giemsa Amortiguador de Giemsa y Wright

El alumno se responsabilizará de aportar el material biológico para la práctica y el siguiente material: Portaobjetos (limpios y desengrasados) Aplicadores Franela Etanol 95° (no potable) Jeringas de 1mL y 3-5mL Cubreobjetos Gasa Algodón Pipetas Pasteur Método 1. Técnicas para realización de frotis e improntas a) Examen microscópico directo. Esta se emplea como un procedimiento preliminar para la detección de parásitos en sangre, pero de ninguna manera, es definitivo para un diagnóstico de certeza, siendo de gran ayuda para los parásitos extracelulares como tripanosomas o microfilarias. 1. Obtener sangre con jeringa preparada con anticoagulante (según el procedimiento M21 recomendado por el INDRE, 2010) lancetas o en el caso de ratones de laboratorio, por el corte del ápice caudal. Depositar 1-2 gotas en portaobjetos. 2.. Mezclar con una gota de solución salina fisiológica si no se usó anticoagulante (en mamíferos esta tiene una concentración del 0.85%). 3. Depositar el cubreobjetos. 19

4. Examinar al microscopio. En muestras recientes, los tripanosomas o microfilarias se evidencian por su movimiento entre las células sanguíneas. Es necesario que el frotis no quede excesivamente grueso, porque los eritrocitos enmascaran los parásitos dificultando su diagnóstico. b) Frotis extendido. Los frotis extendidos son útiles para el estudio morfológico de los parásitos intra e intercelulares. Además, con estos se obtienen registros permanentes de los parásitos, empleándose en las laminillas en docencia, investigación ó bien como preparaciones de referencia. Mayores

detalles de la preparación de los portaobjetos, técnica del procedimiento se citan en Todd et al. (2005) e INDRE (2010) en el Procedimiento M7. La técnica es la siguiente: 1.

Depositar una gota de sangre (aproximadamente de 2-3 mm de dm) cerca de un extremo del portaobjetos. Usar solo portaobjetos nuevos, lavados con detergente, enjuagados y desengrasados con etanol 95° o acetona, sumergiéndolos en esta solución varios días antes.

45° Fig. 11. Portaobjetos “extensor” sin esquinas cortado con un lápiz de punta de diamante.

Fig. 12. Desplazar con un hacia el extremo opuesto.

2. Acercar el extremo des esquinado del portaobjetos extensor a la gota de la sangre y permitir que se difunda por capilaridad en toda la orilla. 3. Inclinar el extensor en un ángulo de 45° aproximadamente y desplazarlo horizontalmente hacia la orilla opuesta de la gota con un movimiento uniforme.

movimiento uniforme

4. Secar inmediatamente el frotis agitándolo como abanico para fijar las células sanguíneas. El propósito es realizar una extensión de una sola capa de células sanguíneas. El secado es importante para evitar la crenación de las células. El secado al aire funciona como un fijador físico, comparable a los fijadores químicos como

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el metanol o formaldehído que se emplean para otros tipos de tejidos o células. Una secadora de pelo o abanico pueden ayudar a secar rápido la preparación. Si no se van a teñir inmediatamente, guardar en un sitio libre de polvo o insectos, o envolviéndolos en papel absorbente.

agua lave todos los restos de células y hemoglobina. Interrumpir el procedimiento cuando la preparación adquiera una coloración blanca u opaca. Si el portaobjetos no está libre de grasa, esta capa blanquecina no se adherirá a la superficie.

c) Frotis de gota gruesa. Esta es una técnica de “concentración” para parásitos, considerándose así por la destrucción selectiva de eritrocitos, quedando en la preparación solamente las formas parásitas y los núcleos de las células blancas (Garcia, 2001; Trujillo et al., 2001; Todd et al., 2005).

5. Colocar verticalmente sobre un papel filtro o absorbente y escurrir el exceso de agua. Teñir con el colorante de Giemsa, sin el paso de fijación por metanol. La inmersión en agua destilada, tiene como objeto lisar el resto de las células sanguíneas que quedaron intactas y eliminar la hemoglobina, por lo tanto, solo deben observarse núcleos de las células blancas y los parásitos si la muestra es positiva.

1. Si se usa lanceta, se limpia la yema del dedo o el lóbulo de la oreja con una torunda de algodón empapada en alcohol etílico al 70% y se deja secar. Si es por punción venosa, siga las instrucciones del maestro. Depositar 1-2 gotas de sangre obtenidas por lanceta. o punción venosa. en el centro del portaobjetos, desechando la primera gota (Procedimiento M9 del INDRE, 2010). 2. Macerar los eritrocitos girando sobre la muestra con la esquina de un portaobjetos por 0.5-1 cm. 3. Secar el frotis protegiéndolo de los insectos y el polvo. 4. Una vez seca la preparación, sumergir el frotis en agua destilada. Esperar a que el

d) Técnica para realización de improntas. Para los tejidos obtenidos por biopsias o por autopsias de animales, las improntas suelen ser una técnica económica y sencilla para la detección de parásitos. El órgano o tejidos a estudiar, depende del parásito estudiado. Para Leshmania donovani las improntas se realizan con muestras de bazo, hígado o nódulos linfáticos. En el caso de L. tropica se selecciona el borde indurado de la lesión. En L. braziliensis el borde indurado de las úlceras sobre la piel, nódulos o ulceraciones sobre la membrana mucosa. En estudios de T. cruzi, los tejidos se estudian por autopsia seccionando el músculo esquelético, corazón, bazo, hígado, nódulos linfáticos y 21

de ser posible el chagoma. En Sarcocystis lindermani los quistes se localizan en músculo, principalmente esófago, diafragma, abdomen y tórax. Toxoplasma gondii se puede detectar en bazo, pulmón, hígado, nódulos linfáticos, cerebro y otros tejidos en casos agudos. Pneumocystis carinii es común en pulmones. Tripanosoma gambiense y T. rhodesiense se encuentran en nódulos linfáticos. Las improntas son principalmente útiles para el estudio de protozoos en tejidos, porque quedan más libres en comparación con los cortes histológicos, donde se obtiene una masa compacta de organismos embebidos en el tejido. Las biopsias de piel son útiles para diagnosticar amebiasis cutánea y las microfilarias. En biopsias de músculo se pueden detectar a Trichinella spiralis, Cysticercus cellulosae y en muestras de colon y recto se demuestran huevos de esquistosomas.

Portaobjetos

En los helmintos también, es conveniente cuando se estudian estadios larvarios de microfilarias en piel o nódulos linfáticos. Detalles especiales sobre improntas de piel se detallan en el Procedimiento M12 del INDRE (2010). 1. Lavar la muestra de tejido con agua destilada, eliminando el exceso de líquidos tisulares. 2. Cortar un trozo de tejido. Eliminando nuevamente cualquier exceso de sangre con agua destilada y secar con papel absorbente. 3. Envolver en un extremo del portaobjetos, una tira de aproximadamente 5 cm por 1. 5 cm. 4. Adherir la muestra de tejido a la tira de papel, de manera que la zona del corte permanezca expuesta. 5. Acercar el portaobjetos limpio y libre de grasa, hasta hacer contacto con el tejido. Retirar una vez que se imprima en el portaobjetos. Secar a temperatura ambiente o en incubadora a 37°C.

Papel absorbente Trozo de tejido

Fig. 13. Técnica para improntas. Enrollar (3 o 4 vueltas) el extremo del portaobjetos con el papel absorbente y sobre él, adherir el trozo de tejido. Imprimir la “huella” del tejido sobre el otro portaobjetos.

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6. Teñir con Giemsa, Wright o combinada. Transparentar en Xilol y montar en resina sintética. Si lo prefiere en vez de montar, agregué aceite de inmersión al tejido y examine al microscopio.

e) Técnica para concentración de tripanosomas por triple centrifugación. Esta se recomienda para el examen y recuperación de parásitos en hospederos inoculados experimentalmente, o con infección natural, pero también, evadiendo el primer paso, se pueden recuperar tripanosomas de heces de triatominos para inoculación en ratones, medio de cultivo, determinación de parasitemias o elaboración de laminillas, Preparar recientemente citrato de sodio al 6% en agua destilada. 1. Mezclar 9 ml de sangre y 1ml de citrato de sodio al 6%. 2. Centrifugar a 300 x g por 10min. 3. Transferir el sobrenadante a otro tubo y centrifugar a 500 x g por 15min. 4. De nuevo, transferir el sobrenadante a otro tubo y centrifugar a 900 x g. 5. Decantar el sobrenadante y examinar el sedimento al microscopio en preparaciones húmedas o extender el sedimento en un portaobjetos y teñir con Giemsa (Garcia, 2001; Cerrada-Bravo, 2004).

2. Técnicas de tinción La preparación de los colorantes en el laboratorio se realiza con días o semanas de anticipación, debido a que estos requieren de un proceso de “maduración” en frascos ámbar protegiéndolos de la luz. La “maduración” permite que las soluciones adquieran sus propiedades adecuadas para teñir constituyentes celulares acidófilos y/o basófilos propias. Los colorantes en polvo, deberán mostrar una certificación como es la que extiende la Biological Stain Commision, University of Rochester, Medical Center, Rochester, NY y el número correspondiente de certificación. a) Técnica de Giemsa. Solución madre del colorante de Giemsa. Solución madre: Colorante de Giemsa en polvo (tipo azure B) 0.60 g Alcohol metílico absoluto, libre de acetona 50 ml Glicerina neutra 50 ml Moler pequeñas alícuotas del colorante y la glicerina en mortero y colectarlas en un en matraz de 500 ml. Tapar el envase con una torunda de algodón y tapón de papel. Colocar el matraz en baño maría a 55-60°C por 2 h. Agitar suavemente en intervalos de 30 min. Al terminar de moler el colorante y la glicerina, enjuague con el alcohol metílico

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el mortero y después guardarlo en un envase bien cerrado

de trabajo de amortiguador de fosfatos se ajusta de acuerdo al pH requerido.

Al terminar el baño maría, dejar enfriar a temperatura ambiente. Agregue el metanol y agite bien la mezcla. Filtre el colorante en papel Whatman 1 y almacene dividiéndolo en varios frascos ámbar de 30 ml para evitar una posible contaminación de la solución madre. Es recomendable dejarlo madurar por 3 semanas, agitándolo periódicamente. Esta solución, se diluye para preparar la solución de trabajo en una proporción de 1:10 a 1:50 con amortiguador de fosfatos. La dilución varía según el tiempo de tinción que se desea usar. Una regla general para la dilución contra el tiempo de tinción es la siguiente: Si la dilución es 1:20, teñir por 20 min. Si la dilución es 1:30, teñir por 30 min. El tiempo de tinción promedio oscila entre 30 a 40 min. Si este excede una hora, será recomendable aumentar la proporción de la solución madre o prolongar el tiempo de maduración. El núcleo de los leucocitos debe verse azul violeta; los neutrófilos rojopúrpura con granitos violeta en el citoplasma. En los parásitos de la malaria se observa la cromatina roja con o sin gránulos de pigmento y citoplasma azul. La solución Amortiguador de fosfato monobásico Na2HPO4 9.2 g Agua destilada 1,000 ml

Amortiguador de fosfato dibásico Na2HPO4 anhidro 9.5 g Agua destilada 1,000 ml 1. Fijar la preparación en metanol por 1 min. Escurrir el exceso de alcohol. 2. Sumergir en la solución de trabajo del colorante de Giemsa recién preparada diluida 1:10 a 1:50 en amortiguador de fosfatos (pH 7.0a 7.2). El tiempo de tinción óptimo será proporcionado por el instructor. 3. Eliminar el exceso de colorante sacudiéndolo sobre la misma cubeta de tinción. 4. Sumergir por 3 min. en amortiguador de fosfatos a pH 7.0 (o bien en una cubeta con agua de la llave con unas gotas de colorante). Lave con agua destilada o al chorro de agua para eliminar algunas partículas precipitadas del colorante y dejar secar en posición vertical. 5. Examine al microscopio impregnando la preparación en aceite de inmersión.

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Tabla 2. Preparación de amortiguador según el pH requerido

Mililitros de: pH

Na2HPO4 (9.5g/L)

NaH2PO4H2O (9.2 g/L)

Agua destilada

6.6 6.8 7.0 7.2

37.5 49.6 61.1 72.0

62.5 50.4 38.9 28.0

900 900 900 900

Esta mezcla se deja madurar por transcurso de una semana. A diferencia del Giemsa, esta se emplea como solución de trabajo directamente. b) Técnica de Wright Colorante de Wright. Colorante de Wright en polvo (certificado) 0.9 g Metanol absoluto, libre de acetona 500 ml Se muele en mortero los0.9 g de colorante con 15 ml de metanol. Se agrega el metanol gradualmente mientras se muele, agregue mas metanol, vacié gradualmente en un frasco ámbar hasta que se termine el metanol. Almacenar en un frasco bien cerrado y agite periódicamente por al menos 5 días. Filtre el papel Whatman N° 1 y distribuir alícuotas en varios envases.

1. Sumergir el frotis en el colorante de Wright (o cubrirlo en posición horizontal) por 2-3 min. 2. Eliminar el colorante sacudiéndolo en el fregadero o sobre la jarra de tinción. 3. Agregar o transferir el frotis al amortiguador de fosfatos (pH 7.0) por 48 min. Debe aparecer una película verde metálica sobre el frotis. 4. Lavar en agua corriente y luego en agua destilada. Dejar secar y examine con aceite de inmersión. c) Técnica combinada En esta técnica de emplean los colorantes de Giemsa y Wright, aprovechando al máximo las propiedades de tinción

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diferencial de ambos. Se aplica en frotis

extendidos e improntas, preferentemente.

1. Sumergir la preparación en el colorante de Wright por 3 a 5 min. Sacudir el exceso de colorante. 2. Sumergir en el colorante de Giemsa por 30-40 min. 3. Equilibrar la tinción en amortiguador de fosfatos buffer de Giemsa por 3 min. Lavar en agua de la llave y dejar secar antes de examinarlo al microscopio.

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Resultados y Discusión 1. Esquematice las células y parásito observados en el examen directo (10X, 40X y 100 X).

2. Esquematice las formas parásitas y células y sanguíneas observados en frotis extendido (10X, 40X y 100 X).

3. Esquematice las células y/o parásitos observados en la técnica de gota gruesa.

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4. Esquematice de las laminillas de colección, cuatro parásitos diferentes que habiten o se reproduzcan en sangre y tejidos. Consulte la morfología en la literatura correspondiente.

Conclusiones

Literatura consultada (por el alumno)

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Bibliografía Atias A. 1999. Parasitología Médica. Editorial Mediterráneo; Santiago de Chile 615 pp. Banoo S, D Bell, P Bossuyt , A Herring , D Mabey , F Poole , PG Smith , N Sriram , C Wongsrichanalai , R Linke , R O'Brien , M Perkins , J Cunninghan , P Matsoso , C Michael Nathanson , P Olliaro , RW Peeling & A Ramsay. 2006. Evaluation of diagnostic tests for infectious diseases: general principles. Nature Reviews Microbiology 4: S21–S31. Becerril Flores, Romero Cabello. 2008. Parasitología Médica de las moléculas a la enfermedad. Mc Graw Hill Interamericana, México 307 pp. Beaver, PC, Jung, RC & EW Cupp. 2003. Parasitología Clínica. 2003. 3° ed. Masson Doyma México, S.A. México, DF. 823 pp. Carrada-Bravo T. Trypanosoma cruzi: Historia natural y diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Rev Mex Patol Clin 2004; 51 (4): 205-219. Curso virtual de capacitación médica en el diagnóstico, manejo y tratamiento de la

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Tay J, Velasco CO, Lara AR, Gutiérrez QM. 2002. Parasitología médica. 7ª edición: Méndez Editores, México. Todd JC, Sanford I, Davidson I. 2005. El Laboratorio en el Diagnóstico Clínico. 10a ed. Editorial Marban. España. 1550 pp. Trujillo Contreras F, A Villanueva Y, M Raygoza A. 2001. Técnicas de Laboratorio para el Diagnóstico de las Enfermedades Parasitarias. Ediciones Cuellar. México. 165 pp. Uribarren Berrueta T. 2004. Recursos en Parasitología. Depto. de Microbiología y Parasitología, UNAM. México, D.F. http://www.facmed.unam.mx/ marco/index.php?dir_ver=87. Acceso Marzo 27, 2010.

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PRÁCTICA 3 PROTOZOARIOS HEMOFLAGELADOS Z J Molina Garza Introducción Los protozoarios se ordenan principalmente según el tipo de organelos de locomoción que presentan. Aquellos que poseen flagelos, se les llama comúnmente flagelados por ejemplo, y como parasitan y/o se reproducen el torrente sanguíneo se les conoce como hemoflagelados, pertenecen al Filum Euglenozoa, Clase Kinetoplastea y la familia Tripanosomatidae. Los tripanosomatidos que causan enfermedades en el ser humano y animales domésticos y silvestres son del género Trypanosoma y Leishmania. Estos son heteroxenos (con unas excepciones)alguno de sus estadios de vida viven en sangre o y/o tejidos de toda clase de vertebrados, mientras que otros estadios habitan el aparato digestivo de invertebrados hematófagos. Todas las especies se dividen por fisión binaria longitudinal (asexual), son alargadas, con un solo flagelo y membrana ondulante, o redondas y con un flagelo muy corto que no sobresale de la membrana celular, uninucleadas. El flagelo se origina en el blefaroplasto o cuerpo basal, asociado íntimamente al cinetoplasto (cuerpo parabasal) en forma de disco o salchicha.

Los organismos del género Trypanosoma y Leishmania, pasan por todas o algunas de las cuatro fases de desarrollo o estadios (Beaver et al., 2003; Uribarren Berrueta, 2004) que se describen brevemente a continuación: A) Amastigote (forma tipo, Leishmania): Células esféricas, con un núcleo, aflageladas y cinetoplasto prominente entre el núcleo y la membrana celular. Habitan el interior de las células incluyendo macrófagos. B) Promastigote (Leptomona): Cuerpo fusiforme o de hoja, flagelo solitario en el extremo anterior sin membrana ondulante, cinetoplasto inmediatamente en la base del flagelo. Esta forma es la que se desarrolla en los hospederos invertebrados del género Leishmania y Trypanosoma o en los medio de cultivo artificiales. C) Epimastigote (Blastocrithidia): Cuerpo fusiforme o de hoja, el flagelo emerge de la región medial o medio-anterior de la célula formando una pequeña membrana ondulante entre el flagelo y la membrana celular. Cinetoplasto frente al margen anterior del núcleo. En el género 31

Trypanosoma, esta fase se desarrolla en el intestino de los vectores. D) Tripomastigote (Trypanosoma): Cuerpo fusiforme o en forma de hoja, cinetoplasto cerca del extremo posterior de donde emerge el flagelo formando la membrana ondulante. Estadio o fase de desarrollo que se presenta en sangre o linfa los vertebrados y en intestino de invertebrados.

Objetivo general Proporcionar al estudiante la información práctica sobre la morfología de los protozoarios hemoflagelados de importancia médica y veterinaria en México y el mundo. Lo anterior, mediante el examen de preparaciones permanentes de los mismos, capacitándolo para efectuar diagnósticos parasitológicos de certeza y aumentar su destreza en el campo de la investigación clínica o en el campo de la biología (crecimiento y reproducción) de este grupo de protozoarios. Esta práctica concuerda con la teoría de la Unidad B (B1 a B5, Flagelados de sangre y tejidos) de la carta descriptiva de la materia. Objetivos particulares: 1. Examinar preparaciones permanentes de los agentes etiológicos de la tripanosomiosis y leishmaniosis, causantes de la

tripanosomiosis americana, enfermedad del sueño y leishmaniosis visceral o kala-azar. 2. El estudiante comprobará además, los cambios morfológicos que presentan estos protozoarios al crecer en medios de cultivo artificial o bien, al crecer en diferentes tejidos u hospederos, mediante el examen al microscopio de laminillas permanentes.

Material El instructor le proporcionará preparaciones permanentes entre portaobjetos y cubreobjetos de la colección que corresponden a Trypanosoma cruzi, T. gambiense, T. rhodesiense, Leishmania donovani, L. brazilienses, L. tropica y L. mexicana, estos obtenidos de sangre o tejido infectado, cortes histológicos así como de medios de cultivos. Cada estudiante aportará lápices para colorear, cuaderno de hojas blancas para dibujo y lápiz. Método Coloque las laminillas de colección que le proporcione el instructor en el microscopio y esquematice los protozoarios en los objetivos de 10X, 40X y 100X, coloreándolos según las estructuras. Identifique o consulte 32

la morfología característica de cada uno y señale con una flecha el nombre de cada organelo. Resultados y discusiones. En cada una de los siguientes esquemas, señale el nombre del estadio o fase de

desarrollo, estructuras subcelulares, tipo de tejido o células donde se localiza y la técnica de tinción. Indique las características diagnósticas de cada parásito.

1. Trypanosoma cruzi en corazón.

2. T. cruzi en frotis sanguíneo

3. T. rhodesiense en frotis sanguíneo

4. T. gambiense en frotis sanguíneo

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5. Trypanosoma en cultivo.

6. T. gambiense. Corte histológico de cerebro

7. Leishmania donovani en hígado

8. Leishmaniosis mexicana cutánea.

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9. L. tropica en cultivo

10. L. donovani en cultivo.

Literatura consultada (por el alumno)

Bibliografía

Beaver, PC, Jung, RC & EW Cupp. 2003. Parasitología Clínica. 2003. 3° ed. Masson Doyma México, S.A. México, DF. 823 pp.

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