1

PRESENCIA DE Mycobacterium leprae EN ARMADILLOS DE NUEVE BANDAS (Dasypus novemcinctus) EN EL MUNICIPIO DE BARBOSA, ANTIOQUIA

Investigadora: Nora Cardona Castro MD. MSc. Investigadora Instituto Colombiano de Medicina Tropical – CES Coinvestigadores: Andrea Ortiz Bernal Estudiante de Medicina Veterinaria y Zootecnia Juan Camilo Beltrán Bacteriólogo - Instituto Colombiano de Medicina Tropical - CES

Facultad De Medicina Veterinaria Y Zootecnia CES Instituto Colombiano de Medicina Tropical CES Medellín, Antioquia 15 de Noviembre de 2007 2

PRESENCIA DE Mycobacterium leprae EN ARMADILLOS DE NUEVE BANDAS (Dasypus novemcinctus) EN EL MUNICIPIO DE BARBOSA, ANTIOQUIA

Investigadora: Nora Cardona Castro MD. MSc. Investigadora Instituto Colombiano de Medicina Tropical – CES Coinvestigadores: Andrea Ortiz Bernal Estudiante de Medicina Veterinaria y Zootecnia Juan Camilo Beltrán Bacteriólogo - Instituto Colombiano de Medicina Tropical - CES

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

Tesis para obtener el Titulo de: Medica Veterinaria y Zootecnista

Medellín, Antioquia 15 de Noviembre de 2007 3

CONTENIDO

Pág.

I.

II.

RESUMEN Y PALABRAS CLAVES

8

ABSTRACT AND KEY WORDS

9

10

FORMULACION DEL PROBLEMA

1. Planteamiento del problema

10

2. Justificación

10

3. Preguntas de Investigación

11

12

MARCO TEORICO

1. GENERALIDADES DEL ARMADILLO DE NUEVE

12

BANDAS. 1.1

Clasificación taxonómica

12

1.2

Descripción y morfología

12

1.3

Distribución geográfica y habitad

13

4

1.3.1

Distribución geográfica

13

1.3.2

Hábitat

14

1.4

Comportamiento

14

1.5

Hábitos alimenticios

15

1.6

Reproducción

15

1.7

Utilidad e importancia.

16

2. GENERALIDADES DE LA LEPRA

17

2.1

Clasificación y presentación

17

2.2

Presentaciones inusuales

18

2.3

Transmisión

18

2.4

Diagnóstico

19

2.5

Situación de Antioquia

19

3. EL ARMADILLO Y LA LEPRA

20

III.

HIPOTESIS

21

IV.

OBJETIVOS

22 5

V.

•

General

22

•

Específicos

22

23

METODOLOGIA

1. Enfoque metodológico de la investigación

23

2. Tipo de estudio

24

3. Universo y muestra

24

4. Diseño muestral

24

5. Descripción de las variables

24

5.1.

Diagrama de variables

25

5.2.

Tabla de variables

26

6. Técnicas de Recolección de Información

26

6.1.

Fuentes de Información

26

6.2.

Instrumento de Recolección de Información

26

6.3.

Proceso de obtención de la Información

27

7. Control de errores y sesgos

28

8. Técnicas de procesamiento y análisis de los datos

28

6

Extracción de ADN

28

Amplificación de ADN

29

PCR Anidada

30

Electroforesis

31

VI.

CONSIDERACIONES ETICAS

32

VII.

RESULTADOS

33

Figura 1

33

Figura 2

34

Figura 3

34

Tabla 1

35

VIII.

DISCUSION

37

IX.

CONCLUSIONES

38

BIBLIOGRAFIA

39

ANEXOS

42

7

RESUMEN Y PALABRAS CLAVE

Resumen:

En Colombia es común el consumo de armadillos de nueve bandas (Dasypus novemcinctus), ignorando que puede ser reservorio de Mycobacterium leprae, agente causal de la lepra y que este animal también puede sufrir esta enfermedad. Conocer si los armadillos de zonas de Antioquia usados para consumo son reservorios de M. leprae será la primera investigación sobre la presencia de esta bacteria en armadillos en Colombia.

Durante un periodo de dos años, se estudiaron 22 armadillos de nueve bandas de los que se obtuvo biopsias de oreja de manera indolora utilizando Acepromazina y Lidocaína. Las biopsias fueron procesadas para extracción del ADN y la amplificación usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada, con los iniciadores LP1-LP2 y LP3-LP4. Los productos de la PCR fueron secuenciados y se confirmó que 10 armadillos fueron positivos para M. leprae. El 45% de los armadillos evaluados son hospederos de M. leprae, es necesario hacer investigaciones más profundas para detectar si son transmisores de la lepra y presentan sintomatología que demuestra que están infectados y sufren la enfermedad. Palabras Clave: Armadillo de nueve bandas, M. leprae, PCR, PCR Anidada

8

ABSTRACT AND KEY WORDS

Abstract: In Colombia, the consumption of the nine banded armadillo (Dasypus novemcinctus) is a very common practice, ignoring the fact that it’s reservoir of Mycobacterium leprae, the causal agent of leprosy. Also this animal can also suffer this disease. Investigate about the presence of M. leprae in these animals used for consumption in a region of Antioquia is the first investigation about the presence of Mycobacterium leprae in armadillos from Colombia.

During 2 years we studied the ear biopsies from 22 nine-banded armadillos for the detection of M. leprae, the biopsies were obtained without causing pain using a combination of Acepromacine and Lidocain. The biopsies were processed for DNA extraction and amplification by nested polymerase chain reaction (nested PCR), using the LP1-LP2 and LP3-LP4 primers. Sequencing of amplified products revealed that 10 of the 22 armadillos were positive for M. leprae. Forty five percent of nine-banded armadillos evaluated are hosts of M. leprae. It is necessary to do deeper investigations to find out if they are transmitting leprosy and establish what the symptoms they develop if they are affected with leprosy. Key Words: Nine banded armadillo, M. leprae, PCR, Nested PCR

9

I. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

1. Planteamiento del problema: El armadillo es considerado como uno de los posibles reservorios del Mycobacterium leprae. Informes de otros países como Argentina y Estados Unidos lo han demostrado.

En Colombia el armadillo habita en zonas donde la lepra es endémica, lo que sugiere que posiblemente algunos armadillos también tengan la presencia del bacilo en su cuerpo y crea la pregunta de investigación: ¿Se encuentran los armadillos infectados naturalmente con Mycobacterium leprae en zonas donde se han reportado casos de la enfermedad en humanos?

2. Justificación: Los armadillos son hospederos de M. leprae y se consideran fuentes de infección para personas que cohabitan con ellos, los cazan, consumen su carne y sangre o los usan como mascotas.

Conocer si hay armadillos infectados en su medio natural en zonas donde hay pacientes con lepra, serviría para evidenciar una posible causa de infección en esta población.

La detección de armadillos infectados sería un factor que ayude a esclarecer el ciclo de transmisión de la lepra en Antioquia.

10

3. Preguntas de Investigación: •

¿Son los armadillos hospederos de M. leprae?

•

¿El protocolo usado en biopsias de humanos para la extracción y amplificación del ADN de Mycobacterium leprae, será el mismo para los armadillos?

•

¿Es necesario realizar la PCR anidada para confirmar los resultados?

11

II. MARCO TEORICO

1. GENERALIDADES DEL ARMADILLO DE NUEVE BANDAS

1.1.

Clasificación Taxonómica:

A continuación se presenta la clasificación taxonómica del armadillo en el reino animal. Phylum: Chordata Subphylum: Vertebrata Clase: Mammalia Orden: Xenarthra (Anteriormente Edentada) Familia: Dasypodidae Género: Dasypus Especie: Dasypus novemcinctus (Linnaeus, 1758)(1)

1.2.

Descripción y Morfología:

Los armadillos tienen escamas dérmicas osificadas. El caparazón está caracterizado por siete a once bandas transversales móviles (normalmente 9). Solamente las orejas y el abdomen carecen de caparazón (1, 2).

Junto al ano hay dos agujeros (como ombligos) que producen una secreción odorífera (1). ROSNER (1. 1901) aseguró que la poliembrionia del armadillo es debida a un crecimiento peculiar de los folículos ováricos de tal manera que los cuatro folículos adyacentes se fusionan en una cavidad folicular después de la ruptura de los cuatro huevos. 12

Las hembras de la familia Dasypodidae carecen de vagina, que se encuentra reemplazada por un seno urogenital, comunicado con el exterior mediante una larga hendidura vestibular. Los testículos se encuentran alojados en la entrada del canal inguinal delante de la vejiga, no poseen envoltura escrotal; el pene posee tres prominencias lobuladas, la central es la única que posee conducto excretor (2).

La temperatura de los armadillos es muy baja y variable para un mamífero que va desde los 28°C hasta los 35°C. Los armadillos no sudan y, en consecuencia, son más proclives a sufrir estrés por calor (1, 2, 3). SZABUNIEWICZ y MacCRADY, 1969 (1) reportaron que la tasa respiratoria de Dasypus novemcinctus es de 18-24 respiraciones por minuto. El ritmo cardiaco varia entre 50-210 pulsaciones por minuto (3).

Las medidas para los adultos son: Longitud de la cabeza y cuerpo es de 384-573 mm. Longitud de la cola es de 276-430 mm. Longitud de la oreja es de 35-57mm. El peso de los armadillos va desde los 2.9 a 8 kilogramos y puede llegar a vivir de 12-15 años (1, 2, 3). Posee de 7-9 dientes homodontos en cada maxila. No hay caninos ni incisivos, los dientes son reducidos, de forma cilíndrica y de crecimiento continuo, aunque el término “edentado” quiere decir “ausencia de dientes”. Los dientes en los adultos no tienen esmalte. La fórmula dentaria es generalmente 8/8 (4).

13

1.3.

Distribución Geográfica y Hábitat:

1.3.1. Distribución Geográfica: La distribución geográfica es muy extensa y va desde el sur de los Estados Unidos (Texas y Florida), noreste y sur de México, a través de Centro América, Colombia, Ecuador, Venezuela y Guyanas, hasta Uruguay y la porción noroccidental de Argentina, también se incluyen las islas de Trinidad y Granada (1, 2).

En Colombia abundan en los Llanos Orientales, las costas Atlántica y Pacífica, región Andina y selvas del Amazonas (5). Dasypus novemcinctus es la especie de armadillo más común y más difundida de la Zona Cafetera del departamento de Caldas (2).

1.3.2. Hábitat: Habita tanto en los lugares boscosos como las áreas abiertas, naturales y artificiales, en todos los pisos geográficos, excepto en el páramo. No solo habita bosque sino también en los llanos, rastrojos y parajes rocosos y otros lugares secos. Durante el día tiende a permanecer en la madriguera que fabrica con sus garras delanteras, generalmente entre las raíces de alguna planta. Estas madrigueras pueden tener más de una entrada y contener un nido hecho de vegetación (2, 5, 6). La invasión de un hábitat por parte de los armadillos es rápida paralela a los ríos debido a que los valles del rió sirven como conductos de dispersión (1).

El armadillo de nueve bandas se ubica en pendientes húmedas de la parte alta del este de los Andes, bosque tropical del Amazonas y el Orinoco, pastizales de latitudes bajas y moderadas sabanas, bordes de bosques y matorrales. No se encuentra en los bosques enanos y pastizales ocupados por otra especie de armadillo, el Dasypus pilosus (1). 14

1.4.

Comportamiento:

Se describe como crepuscular o nocturno. El frío restringe los movimientos del animal y no va muy lejos en climas muy fríos. En el verano, el armadillo parece evitar las horas más calientes del día, saliendo cuando se oculta el sol o inmediatamente después de la lluvia o neblina extrema, si la temperatura cae (1, 7). Son corredores ágiles y buenos nadadores, hasta tiene la habilidad de caminar bajo el agua a través de pequeños riachuelos (6). La respuesta nerviosa del armadillo ante el peligro es saltar hacia arriba hasta 20 cm. También tiene la habilidad para ingerir aire en el tracto digestivo y así aumentar su flotabilidad cuando nada (1).

El poder auditivo de este mamífero es pobre y su visión tampoco está bien desarrollada pero tiene un excelente sentido del olfato (1, 6).

Responde a altas temperaturas con jadeos y a las bajas temperaturas temblando, yaciendo en una postura en forma de bola y utilizando vaso constricción que le permite un gradiente de 4.5°C a través de su armadura dorsal (1).

1.5.

Hábitos Alimenticios:

El armadillo inicia su día forrajeando. Pero estos animales son omnívoros por lo que su dieta también incluye hormigas, gorgojos y termitas; comejenes, lombrices de tierra, algunas serpientes y vertebrados pequeños; como crías de conejos, pero también se alimenta de hongos, tubérculos y frutos (1, 6).

15

1.6.

Reproducción:

Al tener un año de edad, el armadillo ya alcanza su pubertad (1).

Los toques dorsales por parte de los machos llevan a una respuesta por parte de la hembra con movimientos de la cola; lo cual probablemente colabora también en llevar información odorífera al macho acerca de la receptividad de la emisora. Después del movimiento de la cola, el macho con mayor probabilidad se acerca y la huele de cerca (1).

El periodo de gestación va de 150 a 240 días que incluyen una dipausa embriónica de tres a cuatro meses. Nacen cuatro crías del mismo sexo, pesando cerca de 85 gramos cada una. En estado silvestre la lactancia se da más o menos durante tres meses. La camada permanece generalmente junta por nueve meses (1, 2, 7).

1.7.

Utilidad e Importancia:

El 90% de la dieta del armadillo consiste en animales, de los cuales 75-80% son insectos, muchos del orden Coleóptera (cucarrones) que son plagas importantes de los cultivos (1).

El sistema muscular del armadillo está bien desarrollado y constituye la mayor porción del peso del animal. Los músculos asociados con las patas delanteras y traseras son muy poderosos y están especialmente adaptados para cavar. Esta gran masa de músculo ha permitido el uso del animal como fuente de alimento (1, 7). En nuestro país, su carne es muy apreciada por los llaneros y de su caparazón se elaboran curiosos instrumentos musicales, recipientes, cuencos y vasijas (1).

Se cree que si se dejan tostar el caparazón y la cola y se muelen, luego se hierven en agua y es bebido por mujeres en su primer embarazo, se curan las molestias que este causa (5).

16

Además se le atribuye que cura la inflamación y el dolor de oído, y mezclado con la grasa misma del armadillo; puede curar venas varices. Según muchos campesinos el asma se cura bebiendo la sangre del armadillo recién degollado (5).

Recientemente se le ha encontrado valioso para los investigadores quienes los han utilizado en los estudios de nacimientos múltiples, transplantes de órganos, defectos de nacimiento, enfermedades tales como la lepra, tifo y triquinosis (1).

17

2. GENERALIDADES DE LA LEPRA

2.1.

Clasificación y Presentación:

El organismo causante de la Enfermedad de Hansen o lepra es M. leprae. Este microorganismo tiene predilección por los nervios periféricos y las áreas frías de la piel (8).

Esta enfermedad puede causar deformaciones en las articulaciones de los pies, de las manos y de la cara (9).

Solamente cerca del 5% de las personas infectadas con la bacteria desarrollan realmente la enfermedad. Los niños en áreas endémicas están frecuentemente infectados pero pueden no mostrar signos de la enfermedad hasta que alguna perturbación del sistema inmune cause una reactivación y la enfermedad clínica (10).

La nomenclatura estándar divide casos en 5 grupos basados en hallazgos clínicos, histopatológicas e inmunológicas: Tuberculosa, Border line tuberculosa, Border line, Border line lepromatosa y lepromatosa (10).

Los pacientes con una vigorosa respuesta inmune celular a la infección tienen la forma tuberculosa de la enfermedad. La infección se limita a algunos lugares de la piel y nervios periféricos. Los pacientes generalmente tienen de una a seis placas eritematosas o moradas en la cara, tronco o extremidades. Estas lesiones son alopécicas, secas e hipoestéticas (8).

Los nervios pueden encontrarse severamente afectados en la forma tuberculosa. El nervio afectado puede sentirse engrosado a la palpación. Comúnmente los nervios involucrados incluyen el gran nervio auricular, el nervio perineal común, el nervio ulnar, el nervio 18

cutáneo radial. Como resultado hay pérdida de la sensibilidad y función motora. Las extremidades con falta de sensibilidad pueden aparecer mutiladas debido a traumas frecuentes (10).

Los pacientes con respuesta celular inmune mínima a la infección tienen la forma lepromatosa de la enfermedad. La piel se encuentra extensivamente involucrada, con muchas pápulas y máculas simétricas bilaterales que eventualmente se vuelven nodulares. La bacteria puede infectar la mucosa nasal causando engrosamiento, descarga nasal y epistaxis. El cartílago nasal puede ser destruido. Los pacientes con lepra Border line generalmente evolucionan hacia una de las dos presentaciones (8). Los nervios dañados del pie y de la mano pueden llegar a deformar los dedos en una posición de “garra”, haciendo que agarrar objetos y caminar difícil o imposible para algunos individuos. Además, los huesos de los dedos parecen sufrir una reabsorción llegando a ser más cortos e inmóviles (9).

2.2.

Presentaciones Inusuales:

La Enfermedad de Hansen puede inducir eritema nodosum leprosum que se cree es causado

por

complejos

inmunes

que

consisten

en

antígeno

mycobacterial,

inmunoglobulinas y complemento que se depositan en la piel y ocurre con lesiones nodulares, dolorosas y ampliamente diseminadas (10).

2.3.

Transmisión:

El riesgo de infección para una persona que tenga contacto casual con un paciente infectado es mínimo, el contacto prolongado y estrecho con las secreciones nasales de un paciente lepromatoso es probablemente la mayor fuente de diseminación de la enfermedad (10). 19

El papel del armadillo en la transmisión de la enfermedad no se ha establecido aún, pero se han reportado varios casos de pacientes con lepra que han tenido contacto extensivo con armadillos (10).

2.4.

Diagnóstico:

Clínico: Los pacientes con la enfermedad pueden tener solamente signos nerviosos, iniciando con dolor e inflamación del nervio afectado, seguido de pérdida de la sensibilidad y desgastamiento localizado del músculo (10). Laboratorio: La biopsia de piel debe ser de 12-15mm de longitud, incluyendo áreas centrales y periféricas de la lesión. Debe ser lo suficientemente profunda como para remover tejido subcutáneo en bloque. La baciloscopia de muestras de moco y linfa se tiñen con coloración de Zield Neelsen (10).

2.5.

Situación en Antioquia:

La prevalencia del país es de 0,8/10.000 habitantes. En los últimos 10 años se ha tenido una incidencia de 650 a 850 casos nuevos por año. En el departamento de Antioquia la prevalencia es de 0,02/10,000 habitantes, donde los más afectados se encuentran entre los 25 y 60 años de edad y aun mas del sexo masculino. El tipo de lepra de mayor prevalencia es la multibacilar. Los municipios más afectados son los del Bajo Cauca, Magdalena Medio y Urabá, registrándose además casos en las zonas del Occidente y Suroeste (11, 12).

20

3. EL ARMADILLO Y LA LEPRA

Anteriormente se creía que solamente los humanos sufrían de lepra. Luego, en los años 60´s, los investigadores especularon que los armadillos podrían usarse en la experimentación porque M. leprae afecta las partes mas frías del cuerpo; los armadillos al tener la temperatura relativamente más baja que el resto de los mamíferos; y porque los armadillos viven lo suficiente (12-15 años) para que la lenta y crónica infección emerja (13). En 1971, un armadillo de cautiverio desarrolló la lepra 17 meses después de ser inoculado con la bacteria obtenida de un humano infectado. Si a los armadillos se les inyecta el bacilo de la lepra, pueden desarrollar lepra lepromatosa 14 meses después de la inyección, con un aumento en la cantidad de bacilos en el punto donde se inyectó de hasta mil veces el valor inyectado y mostrando sitios de infección en puntos distantes del punto de inoculación (4).

Una investigación de la Universidad Nacional del Nordeste en Argentina (13), comprobó que la lepra salvaje en el armadillo cursa con la presencia de abundantes bacilos con localizaciones preferiblemente linfo-espleno-hepática, con compromiso nervioso y dérmico. También extrajeron ADN de Mycobacterium leprae presentes en hígado, linfoglándula patelar y axilar.

21

III. HIPÓTESIS

Colombia es un país rico en costumbres y creencias y una de ellas es con respecto al armadillo, teniéndolo como animal medicinal y como fuente de alimento. En Colombia se reportan pacientes con lepra que habitan regiones que son hábitat natural de armadillos.

Hipótesis nula: Los armadillos encontrados en el Municipio de Barbosa, no están infectados con M. leprae.

Hipótesis alterna: Los armadillos encontrados en el Municipio de Barbosa, están infectados con M. leprae.

22

IV. OBJETIVOS

General

•

Detectar por medio de la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), la presencia de ADN específico de Mycobacterium leprae en armadillo de nueve bandas.

Específicos

•

Estandarizar la técnica de PCR para detección de ADN específico de M. leprae en biopsia de oreja de armadillos de nueve bandas.

•

Describir la población de armadillos que se incluirán en el proyecto, con respecto a características morfológicas y posibles lesiones tegumentarias.

23

V. METODOLOGÍA

1. Enfoque Metodológico: Los armadillos de nueve bandas (Dasypus novemcinctus) que son encontrados por campesinos en el Municipio de Barbosa, podrían ser hospederos de M. leprae, por lo que fue necesario utilizar guantes y tapabocas debido a que se estaba trabajando con un animal silvestre que puede ser reservorio de varias enfermedades (no solamente de lepra). Se evitó la inmovilización de los armadillos durante periodos fríos o de cambios rápidos en la temperatura, ya que son mamíferos de baja temperatura corporal y las bajas temperaturas medio ambientales podrían afectarlos de manera negativa (7). Cada uno de los armadillos contó con su propia jeringa, aguja y hoja de bisturí para la administración de las drogas y la adquisición de la biopsia con el fin de evitar tanto la contaminación de las muestras como el paso de enfermedades de un armadillo a otro.

Se evitó al máximo el estrés del animal por medio del tranquilizante Acepromazina a dosis de 0.1 a 0.3 mg/kg y tapando los ojos con vendas. La anestesia general es un gran riesgo, por lo que se usó anestesia local (Lidocaína tópica) en la oreja para remover una biopsia de 0.5 cm. Luego se aplicó Curagán ®, un antimiasítico, para evitar la formación de miasis en la herida y se monitoreó el ejemplar hasta por 7 horas para garantizar su recuperación completa.

Después de que el armadillo se recuperó de este procedimiento, fue liberado en la misma zona donde fue encontrado para que volviera a sus propias cuevas y no sufriera cambios bruscos en su hábitat. 24

2. Tipo de Estudio: Descriptivo

3. Universo y Muestra: Se trabajó con 22 armadillos de nueve bandas que fueron encontrados por varios campesinos en el Municipio de Barbosa en un período de dos años.

4. Diseño Muestral: La muestra estudiada fue por conveniencia, debido a las dificultades e impedimentos éticos para trabajar con fauna silvestre. Además se inicio anterior al convenio de la Universidad CES con el CAV (Centro de Atención y Valoración de la Fauna)

5. Descripción de las Variables: Las variables que se tienen en cuenta son: •

Ejemplar: con los números del 1 al 22 se identificaron los animales de acuerdo con el orden de ingreso.

•

Sexo: se sexó por observación directa de los órganos genitales que son característicos en esta especie.

•

Peso: en kilogramos

•

Talla: en centímetros

25

•

Lesiones dérmicas antiguas. No se tienen en cuenta las lesiones recientes de las patas debido a que estos animales son escavadores y pueden lastimarse muy fácil.

•

Resultado de la PCR Anidada: positiva o negativa

•

Frecuencia

Respiratoria

y

Cardiaca:

respiraciones

por

minuto

y

palpitaciones por minuto. •

Resultado de la secuenciación: secuenciación del producto de la PCR anidada.

5.1.

Diagrama de variables

26

Sexo Secuencia ción

Peso

PCR anidada

Número de ejemplar

Armadillo de nueve bandas

Presencia de lesiones

Talla

Temperatur a

Frecuenci a respiratori

5.2. Ejemplar

Frecuenci a cardíaca

Tabla de variables Sexo

Peso

Long.

Long.

Kg

Capar

Total

cm

cm

Tº

RPM*

*Respiraciones por minuto **Pulsaciones por minuto

27

PPM**

Lesiones

PCR

Secuenciación

Anidada

de ADN

6. Técnicas de Recolección de Información:

6.1.

Fuentes de Información:

Como fuentes de información se tiene el Marco Teórico de trabajos realizados en otros países. En Colombia no se ha realizado este trabajo, por lo que será la primera fuente de información para otros investigadores interesados en el tema.

6.2.

Instrumento de Recolección de Información

1. Los armadillos se pesaron, sexaron y clasificaron; se realizó un examen físico general con énfasis en la piel (buscando lesiones visibles).

2. Se tranquilizaron usando Acepromazina (Tranquilan®.) y se utilizó anestesia local usando Lidocaína al 2% (Roxicaina al 2%).

3. Una biopsia de 0.5 a 1 cm se obtuvo asépticamente con bisturí número 20, de la oreja y se almacenó en etanol al 70%. Materiales: •

Jeringas de insulina

•

Lidocaína al 2% sin Epinefrina. (Roxicaina al 2%)

•

Acepromazina (Tranquilan)

•

Guantes

•

Estetoscopio

•

Termómetro

•

Algodón, gasas, alcohol

•

Curagán®

•

Hojas de Bisturí

•

Recipiente con etanol al 70% 28

6.3.

•

Nevera con hielos

•

Block de notas, cámara o filmadora.

Proceso de obtención de la información

Es de suma importancia recordar que se está trabajando con un animal silvestre al que no se le conocen que enfermedades presenta actualmente por lo que se trabajó con guantes y tapabocas. Además de que se estaba tratando a un ser vivo que ha estado estresado por las cuestiones basadas en su persecución y manipulación, por ello es importante la tranquilización del animal evitando causarle dolor.

Los armadillos se tranquilizaron con el producto Tranquilán (Acepromazina) a dosis de 0.1 a 0.3 mg/kg y se les tapó los ojos con vendas. Luego de aproximadamente 10 a 15 minutos el animal se encontraba tranquilo y manipulable. Ya tranquilizado se procede a la aplicación de Roxicaina 2% (lidocaína sin epinefrina) en la base de la oreja.

Para la toma de biopsia se realizó una incisión con bisturí número 20, en la punta de la oreja de aproximadamente 0.5 cm. La biopsia se almacenó en un vial con etanol al 70% y fue enviada al ICMT CES. Una vez formada la costra en la oreja se aplicó Terramicina tópica (Oxitetraciclina y Polimixina B) y Curagán (Diazinon y violeta de metilo. Larvicida antiséptico).

7. Control de Errores y Sesgos Las muestras fueron procesadas de acuerdo a estándares para evitar contaminación, y se procesaron por duplicado. La PCR se procesó con controles de amplificación con biotina, controles positivos y negativos. También se realizo la prueba de β-actina para confirmar la realización de una extracción adecuada con controles positivos y negativos.

29

8. Técnicas de procesamiento y análisis de los datos

Extracción de ADN: En la cabina de seguridad biológica se ingresaron las cajas de petri estériles, las biopsias, unas agujas de jeringas, un marcador y varias hojas de bisturí estériles. A cada muestra se le asignó un código de identificación. La biopsia de oreja se dividió en pedazos pequeños para aumentar la actividad de la enzima.

Luego de dividir la biopsia hasta obtener el tamaño adecuado para su digestión, las muestras se lavaron con 400µl de agua desionizada y destilada

y se incubaron a

temperatura ambiente por 30 minutos. Después se vorterizaron y centrifugaron las muestras por 10 minutos a 15,300 rpm. Se removió el sobrenadante y se adicionó 180µl del Buffer ALT (tissue lysis buffer). Luego se le adicionaron 20µl de QIAGEN Proteinasa K y se mezcló con la muestra. Luego pasaron al vortex para mezclar el Buffer con la enzima y se incubó en un bloque de calor seco a 55ºC por 30 minutos. La muestra se agitó en el vortex cada 30 minutos durante 2 horas y se dejó en incubación a 55°C toda la noche.

Posteriormente se le adicionó 200µl de buffer AL (Guanidina Hidroclorhidrato) y se incubó a 70ºC por 20 minutos, para luego ser vorterizado.

El producto se llevó a la columna de purificación, se centrifugó por un minuto a 12000 rpm, se lavó en la columna con 500 µl de buffer AW1 y se centrifugó por un minuto a 12000 rpm. Posteriormente se agregaron 500µl del Buffer AW2 y se centrifugó durante 3 minutos a 12000 rpm, siguiendo las instrucciones del fabricante del estuche de extracción de ADN. Se agregó 100 µl del Buffer AE a temperatura ambiente para recuperar el ADN de la columna y proceder a realizar la PCR anidada.

Las muestras de ADN se procesaron para PCR usando un control negativo de extracción (agua que se somete al mismo proceso de extracción) y un control positivo (ADN de M. leprae del hígado de armadillos infectados en bioterio, donado por Colorado State University, Estados Unidos). 30

Amplificación de ADN: Como control de extracción de ADN se amplificó la β-actina para comprobar que el proceso de extracción es el adecuado ya que la β-actina se encuentra en todas las estructuras celulares y por lo tanto se debe amplificar.

Primero se agregaron 12 µl de la enzima Taq Polimerasa Súper Mix que se compone de la enzima, dinucleótidos y buffer 10X (que facilita las condiciones de pH y tiene cloruro de magnesio que permite los enlaces entre nucleótidos). Después se agregó 1 µl de cada uno de los primers LP1 y LP2. LP1 es el primer Upper o Forward y LP2 es el primer Lower o Reverse. A los controles de β-actina se les adicionó 1 µl de los primers para β-actina Forward y β-actina Reverse. Finalmente se adicionaron 2µl de la muestra de ADN obtenida de armadillo.

El programa del Termociclador PTJ-100, que anteriormente era NAGTD2 para el LP1 y LP2, se modifico por RLEP2 que es un protocolo más corto. Para la β-actina se sigue utilizando el programa NAGTD2. Por lo tanto la β-actina y la LP1 y LP2 se procesan por aparte para evitar así la formación de enlaces inespecíficos.

PCR Anidada: La PCR anidada se realizó al producto de amplificación obtenido con los iniciadores LP1 y LP2, a este amplicón se le realizó PCR con los iniciadores LP3 y LP4.

A los amplicones obtenidos con LP1 y LP2, se les agregó 9µl del Buffer TE, además de utilizar un nuevo juego de primers traslapados que son LP3 y LP4. El fragmento nuevo de ADN es de 89 pares de bases.

Para la PCR Anidada se preparó una dilución de 1:400 del producto inicial de amplificación y del Buffer TE. Luego se prepararon 12µl de Súper Mix y se le adicionó 1 µl 31

de LP3 y de LP4. Finalmente se adicionan 2 µl de la dilución 1:400. También se realiza un control positivo y un control negativo. Terminado este procedimiento se llevan al Termociclador PTJ-100 y se realiza el protocolo RLEP-2 que presenta el siguiente programa: 1.

Desnaturalización a 94°C durante 2 minutos.

2.

Desnaturalización a 94°C durante 45 segundos.

3. Annealing a 64°C durante 45 segundos. 4. Extensión a 72°C durante 1:30 minutos. 5. Desnaturalización a 94°C durante 45 segundos. 6. Annealing a 63°C durante 45 segundos. 7. Extensión a 72°C durante 1:30 minutos. 8. Desnaturalización a 94°C durante 45 segundos. 9. Annealing a 62°C durante 45 segundos. 10. Extensión a 72°C durante 1:30 minutos. 11. Desnaturalización a 94°C durante 45 segundos. 12. Annealing a 61°C durante 45 segundos. 13. Extensión a 72°C durante 1:30 minutos 14. Desnaturalización a 94°C durante 45 segundos. 15. Annealing a 60°C durante 45 segundos. 16. Extensión a 72°C durante 1:30 minutos. 17. Desnaturalización a 94°C durante 45 segundos 18. Annealing a 59°C durante 45 segundos. 19. Extensión a 72°C durante 1:30 minutos. 20. Desnaturalización a 94°C durante 45 segundos. 21. Annealing a 58°C durante 45 segundos. 22. Extensión a 72°C durante 1:30 minutos. Los últimos tres pasos se repiten en 25 ciclos. 23. Extensión a 72°C durante 10 minutos 24. Es a 4°C y tiene un tiempo variable pero largo.

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Electroforesis: El gel de agarosa se preparó a 2.5% en TBE 1X Buffer (16.5 g de ácido Bórico, 2.232 g de EDTA y 32.4 g de Tris), y se llevó al microondas para obtener el gel diluido. Una vez listo el gel, se corrió la electroforesis a 80 voltios por 2 horas en cámara con buffer TBE1X.

Para poder observar el desplazamiento de las bandas se usó 2µl del Buffer de carga y 5 µl del ADN extraído, para luego ser dispensados en los pozos. Se utilizó 3µl del marcador de peso molecular de 20 pares de bases. El producto de amplificación esperado, que se asocia con la presencia de ADN de M. leprae es de 129 pares de bases.

Cuando la electroforesis finalizó, el gel se sumergió por 25 minutos a la mezcla de 15µl de bromuro y 150 µl de TBE1X para poder visualizar las bandas en el trasiluminador. En el trasiluminador se tomó la foto para poder observar las bandas y así analizar los resultados.

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VI. CONSIDERACIONES ETICAS

Este trabajo se desarrolló bajo las normas y principios estipulados para la investigación con animales, descritos en INTERNATIONAL GUIDING PRINCIPLES FOR BIOMEDICAL RESEARCH INVOLVING ANIMALS (1985), las cuales están basadas en los derechos de los animales (15).

Los armadillos estudiados se trataron con respeto (de acuerdo con el Articulo 2 de los derechos del animal) y evitando que sufrieran daños y lesiones debidos a manipulación y stress prolongado, y se liberaron en la zona boscosa donde habitaban una vez se recuperaron del procedimiento de toma de la muestra.

La biopsia fue tomada del pabellón auricular, no perjudica al animal, pues se tomó bajo estrictas normas de asepsia y usando anestesia local para evitar el stress y dolor (16). Los animales que se usaron para la toma de muestra fueron los encontrados con ayuda de campesinos del Municipio de Barbosa, Antioquia.

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VII. RESULTADOS

De los 22 armadillos estudiados 14 son machos y 8 son hembras, el promedio del peso corporal es de 4,2Kg, (±0.66). El promedio de la longitud del caparazón es de 30,7 cm (±5,25), la longitud total de los armadillos desde la punta de la nariz a la punta de la cola fue en promedio 67 cm (±7). Con respecto a la temperatura corporal, el promedio fue de 31°C (±2,5), la frecuencia respiratoria mostró como promedio 29,4 respiraciones por minuto (±11,3) y las pulsaciones por minuto fueron en promedio 106 por minuto (±35,7) (Tabla 1).

Cuatro armadillos hembras y 4 machos presentaron lesiones de piel y caparazón, sin embargo la presencia de estas lesiones no se asoció a la positividad de la PCR anidada, indicando que las lesiones encontradas pueden ser debidas a traumas y otras causas. De los ocho armadillos que presentaron lesiones en piel, solo 3 fueron positivos para M. leprae. Sin embargo, la apariencia clínica de las lesiones encontradas en estos tres armadillos no está relacionada a lepra, pues no presentaron úlceras ni lepromas (Tabla 1).

No se encontraron diferencias estadísticamente significativas cuando se comparó la variable sexo con la presencia de lesiones y la PCR anidada (p>0.05). Los resultados de la PCR Anidada se observan en la Figura 1, 2 y 3 mostraron bandas positivas a M. leprae. En la Tabla 1 se recopilan los resultados obtenidos en cada uno de los armadillos estudiados.

Figura 1: PCR Anidada de las muestras A1 a A8. El control negativo de extracción es CE, el control negativo de amplificación es C-A y el control positivo es C+. Se pueden observar claramente las bandas de 89 pb en A3, A4, A5, A6 y C+. Se descarta el hecho 35

de que se hayan producido por contaminación ya que las bandas no demuestran un grosor ascendente ni descendente, sino que muestran un grosor variable.

20pb A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 C-E C-A C+ 20pb

Figura 2: En esta foto se pueden observas las bandas de 89pb en A10, A11, A13, A14 y una muy delgada en la A15, además del C+.

20pb A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 C-E C-A C+ 20pb

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Figura 3: Se puede apreciar que únicamente la muestra A20 y el C+ obtuvieron bandas. 20pb A16 A17 A18 A19 A20 A21 A22 C-E C-A C+ 20pb

Tabla 1: La siguiente tabla nos muestra los resultados de la PCR anidada. También nos muestra que no hay discriminación con respecto al sexo ni tamaño del animal. Adicionalmente se aprovecha para tomar los parámetros comunes en un Examen Físico y se buscaron lesiones en piel que pudieran aparentar ulceras provocadas por M. leprae.

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Ejemplar

Sex

Peso

Long.

Long.

1

F

2 3

RPM

PPM

Lesione

PCR

secuenciac

Kg

Capar cm

Total cm

Tº

5

ND

ND

s

anidada

ión

ND

ND

ND

NO

-

M

3

21

F

5

22

71