5)µ4& &OWVFEFMPCUFOUJPOEV
%0$503"5%&-6/*7&34*5²%&506-064& %ÏMJWSÏQBS Institut National des Sciences Appliquées de Toulouse (INSA de Toulouse) Cotutelle internationale avec "Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco" (CIATEJ)
1SÏTFOUÏFFUTPVUFOVFQBS Ivanna Yvonne Rivera Espinosa le jeudi 28 November 2013
5JUSF
Purification, caractérisation, expression hétérologue et applications des enzymes lipolytiques de Carica papaya
²DPMF EPDUPSBMF et discipline ou spécialité
ED SEVAB : Ingénieries microbienne et enzymatique
6OJUÏEFSFDIFSDIF Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés (LISBP)
%JSFDUFVS T EFʾÒTF MM. MARTY ALAIN. Mme. SANDOVAL FABIAN GEORGINA Mme. FERREIRA-DIAS VICENTE SUZANA Mme. REYES DUARTE DOLORES MM. ALCALDE GALEOTE MM. GUTIÉRREZ ORTEGA ABEL Mme. DUQUESNE SOPHIE
Professeur INSAT Professeur CIATEJ Jury : Professeur Professeur Professeur Professeur Chargée de recherche
Directeur de thèse Directrice de thèse UTL UAM CSIC CIATEJ INSAT
Président du Jury Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur
AGRADECIMIENTOS
Hoy después de un poco más de cuatro años ha llegado el momento de agradecer a todos aquellos que han hecho posible el desarrollo de este trabajo.
Primero que nada quiero agradecer a mis directores de tesis, la Dra. Georgina Sandoval y Profesor Alain Marty, por todo su apoyo incondicional, paciencia y guía a lo largo del desarrollo de este trabajo.
Así mismo quiero agradecer todo el apoyo y consejos recibido por parte de mis asesores el Dr. Abel Gutiérrez y Dra. Sophie Duquense, quieres siempre estuvieron dispuestos a brindarme un consejo en el momento que fue necesario.
A todos los colaboradores del proyecto el Dr. Juan Carlos Mateos, Dr. Jorge Rodriguez, Dr. Francisco Plou, Dra. Suzana Ferreira, Dra. Carla Tecelao, Karla Barrera, Antonio Martinez-Richa, Dra. Paula Quintana, Dra. Alicia Baldessari, M. en C. Aurora HuertaRobles, Benita Ortega-Berlanga, Dra. Gutiérrez-Mora, Dr. Ángel G. Alpuche-Solís, Dra. Carla Sánchez-Hernández, M. en C. Marcela Robles, miembros de los equipos de lipasas del INSA y biocatálisis de CIATEJ con quienes ha sido un placer trabajar y a quienes agradezco sinceramente la oportunidad brindada.
A cada uno de los miembros del jurado por sus valiosas aportaciones y tomarse el tiempo para evaluar este trabajo.
A la Dra. Dolores Reyes Duarte y el Dr. Miguel Alcalde por aceptar ser revisores de este trabajo y sus valiosas aportaciones para el enriquecimiento del presente trabajo.
A los proyectos CONACYT CB-2008-01-104429 y ECOS M08-A03 por el financiamiento otorgado y la oportunidad de llevar a cabo la colaboración entre CIATEJ e INSA en este trabajo.
I
A mi familia por alentarme siempre a ser mejor persona, escucharme y simplemente estar para mí siempre. Los quiero, este también es su logro no lo habría hecho sin ustedes.
A todos mis amigos y compañeros de los laboratorios del LISBP y Biocatálisis industrial por su apoyo incondicional y todos los momentos compartidos, los voy a extrañar.
II
RESUMEN Una de las actividades catalíticas más interesantes presentes en el látex de Carica papaya es la actividad lipolítica (3.1.1.X).Las enzimas lipolíticas pueden catalizar reacciones de hidrólisis sobre varios sustratos e igualmente, en condiciones termodinámicas favorables, pueden catalizar reacciones de síntesis. Adicionalmente, son activas en presencia de solventes orgánicos, por lo que son biocatalizadores atractivos para aplicaciones industriales. Sin embargo, la mayor parte de la actividad lipolítica del látex se encuentra asociada a la matriz insoluble del látex, formando un biocatalizador auto-inmovilizado.Por esta razón, hasta la fecha no ha sido posible elucidar qué enzima o enzimas son responsables de la actividad lipolítica observada en el látex de C. papaya.
En consecuencia, la presente investigación está dedicada al estudio de la actividad lipolítica en Carica papaya. Para ello, se realizaron estudios de purificación parcial del látex de Carica papaya, así como la evaluación de las propiedades catalíticas de las fracciones parcialmente purificadas en la hidrólisis de triglicéridos, resolución de mezclas racémicas de octil éster del ácido 2-bromo-fenilacético y síntesis de biopolímeros y lípidos estructurados. Paralelamente, se realizó un análisis genómico mediante la búsqueda con motivos conservados que codifican para diversas proteínas lipolíticas, así como ensayos de transcriptómica para buscar la expresión in vivo de secuencias seleccionadas en las hojas de la planta, que permitieron encontrar por primera vez una expresión in vivo de una lipasa en C. papaya (CpLip2). Esta proteína y otras dos previamente identificadas en el látex de papaya (CpEst y CpLip1), fueron
III
expresadas de forma funcional empleando respectivamente Nicotiana sp., Yarrowia lipolytica y Pichia pastoris como sistemas de expresión. Finalmente algunas de las propiedades bioquímicas y catalíticas de las proteínas expresadas fueron determinadas.
PALABRAS
CLAVE:
Carica
papaya,
lipasa,
esterasa,
expresión
heteróloga,
biotecnología, transcriptómica.
IV
ABSTRACT Lipolytic activity (EC 3.1.1.X) is one of the most interesting catalytic activities from Carica papaya latex. Indeed lipolytic enzymes can catalyze not only hydrolysis but also various synthesis reactions due to their activity in organic solvents, which make them especially attractive for industrial applications. Nevertheless, most of the lipolytic activity present in latex is tightly associated to the insoluble fraction of the latex and up to now it has not been possible to determine which enzymes are responsible for the lipolytic activity of C. papaya latex.
This PhD work is dedicated to the study of the lipolytic activity present in Carica papaya. Partial purification of lipolytic activity from C. papaya latex was carried out to evaluate the catalytic properties of the partially purified fractions in the hydrolysis of triglycerides, the resolution of racemic mixtures of 2-bromo-phenylacetic octyl ester, biopolymers and structured lipids synthesis. Bioinformatic analysis was also realized on C. papaya genome by searching conserved motifs for lipolytic proteins. Finally, assays of in vivo transcriptomic in the leaves of stressed C. papaya allowed the isolation of a new lipase produced in vivo (CpLip2, gene 1973.2). This protein, as well as two previously identified lipolytic enzymes from C. papaya, CpEst (gen 25.180) and CpLip1 (gen 55.143) were functionally expressed using Nicotiana sp.,Yarrowia lipolytica and Pichia pastoris as expression hosts, respectively. Finally, some of the biochemical and catalytic properties of these produced recombinant proteins were evaluated.
KEYWORDS: Carica papaya, lipase, esterase, heterologous expression, biotechnology, transcriptomic analysis. V
RESUMÉ Parmi les activités catalytiques les plus intéressantes présentes dans le latex de Carica papaya on trouve l'activité lipolytique (EC 3.1.1.X). En effet les enzymes lipolytiques peuvent catalyser des réactions d’hydrolyse sur divers substrats mais également, dans des conditions thermodynamiques favorables, des réactions de synthèse. De plus, elles sont actives en présence de solvants organiques, ce qui fait de ce type d’enzymes des biocatalyseurs spécialement attractifs pour des applications industrielles. Enfin, cette activité lipolytique est associée à la matrice insoluble du latex, et constitue donc une activité immobilisée. Cependant et pour cette même raison, il n'a pas été possible jusqu'à présent d'élucider la ou les séquences protéiques dans le latex responsables de cette activité lipolytique.
En conséquence, cette thèse est dédiée à l'étude de l'activité lipolytique du latex de C. papaya. Pour cela, la purification partielle du latex de C. papaya a été réalisée. Ainsi, les propriétés catalytiques des fractions partiellement purifiées ont pu être déterminées pour l'hydrolyse de triglycérides, la résolution de mélanges racémique d'octyl ester de l'acide 2-bromo-phenylacétique, la synthèse de biopolymères et des lipides structurés. Parallèlement à cela, une recherche dans le génome de C. papaya des séquences codant les motifs conservés dans les protéines lipolytiques, ainsi que des essais d'expression in vivo dans les feuilles de la plante en conditions de stress a été effectuée, ce qui a permis d’isoler pour la première fois une lipase, CpLip2, exprimée in vivo chez C. papaya. Cette protéine, ainsi que 2 autres protéines déjà identifiées dans le latex de C. papaya, CpEst et CpLip1, ont été produites sous forme fonctionnelle en employant respectivement Nicothiana sp., Yarrowia lipolytica et VI
Pichia pastoris comme systèmes d'expression. Finalement, certaines des propriétés biochimiques et catalytiques de ces protéines recombinantes ont pu être déterminées.
MOTS CLÉ : Carica papaya, lipase, esterase, expression hétérologue, biotechnologie, transcriptomique.
VII
LISTA DE PUBLICACIONES Publicación 1: Plant Lipases: Partial Purification of Carica papaya Lipase. Rivera I, Mateos-Diaz JC, Sandoval G. (2012). Sandoval G (ed) Methods in molecular biology, Lipases and phospholipases, 1: 547 pp 115-122, Springer ISBN: 1940-6029.
Publicación 2: Caracterización de diversas fracciones del látex Carica papaya como biocatalizadores en la hidrólisis de triglicéridos. Ivanna Rivera, Georgina Sandoval. 2014. Grasas y Aceites. El DOI 10.3989/gya.049313.
Publicación 3: Lipase from Carica papaya latex presents high enantioselectivity towards the resolution of prodrug of 2-bromo-phenylacetic acid octyl ester. Rivera I, Mateos JC, Marty A, Sandoval G, Duquesne S (2013). Tetrahedron Letters 54 : 5523–5526 (2013).
Publicación 4: Biopolymer Synthesis Catalyzed by Tailored Lipases. Georgina Sandoval, Ivanna Rivera, Karla A. Barrera-Rivera, Antonio Martinez-Richa. Macromolecular Symposia 289:135–139 (2010).
Publicación 5: Carica papaya latex: A low-cost biocatalyst for human milk fat substitutes production. Carla Tecelao, Ivanna Rivera, Georgina Sandoval, Suzana Ferreira-Dias. European Journal of Lipid Science and Technology, 114(3):266–276 (2012).
VIII
Publicación 6: Genomic analysis of different lipase families in Carica papaya Ivanna Rivera, Sophie Duquesne, Georgina Sandoval and Alain Marty. The Protein Journal (En corrección).
Publicación 7: Functional expression of Cpest lipolytic enzyme from Carica papaya in Yarrowia lipolytica and its application to resveratrol acetylation. Ivanna Rivera, Sophie Duquesne, Georgina Sandoval, Alain Marty and Francisco Plou. FEBS (En corrección).
Publicación 8: Functional
expression,
extracellular
production,
purification,
biochemical
characterization and structure model of Carica papaya LIPASE 1. Ivanna Rivera, Marcela Robles, Juan Carlos Mateos-Díaz, Abel Gutiérrez-Ortega and Georgina Sandoval. FEBS (Enviado).
Publicación 9: Identification, cloning and expression of a new GDSL lipase from Carica papaya. Ivanna Rivera, Aurora Huerta-Robles, Benita Ortega-Berlanga, Antonia Gutiérrez-Mora, Ángel G. Alpuche-Solís, Carla Sánchez-Hernández, Georgina Sandoval, Abel GutiérrezOrtega. BioMed Research International (Enviado).
IX
CONFERENCIAS Y POSTERS CONFERENCIA 1: Functional expression of Carica papaya Lip1 lipase in Pichia pastoris. Ivanna Rivera, Marcela Robles Machuca, Abel Gutierrez-Ortega, Georgina Sandoval. XV Congreso de Biotecnología y Bioingeniería SMBB. Cancún, México, Julio 2013.
POSTER 1: Nuevas aplicaciones de la lipasa de látex de papaya. Ivanna Rivera, Juan Carlos Mateos-Diaz, Sophie Duquesne, Alain Marty and Georgina Sandoval. II Congreso SOLABIAA (Sociedad Latinoamericana de Biotecnología Ambiental y Algal. Cancún, México, Diciembre 2010.
POSTER 2: Enantiomeric resolution of 2-bromophenyl acetic acid octyl ester catalyzed by Carica papaya latex. Ivanna Rivera, Juan Carlos Mateos-Diaz, Sophie Duquesne, Alain Martyand Georgina Sandoval. Zing Biocatalyst Conference. Cancún, México, Diciembre 2012.
POSTER 3: Carica papaya Lip1 lipase expression in Pichia pastoris. Ivanna Rivera, Marcela Robles Machuca, Abel Gutierrez-Ortega, Georgina Sandoval. Zing Biocatalyst Conference. Cancún, México, Diciembre 2012.
X
POSTER 4: Identification of a new GDSL lipase gene from Carica papaya that is regulated by jasmonic acid. Ivanna Rivera, Aurora Huerta-Robles, Antonia Gutiérrez-Mora, Carla Sánchez-Hernández, Georgina Sandoval, Abel Gutiérrez-Ortega. XV Congreso de Biotecnología y Bioingeniería SMBB. Cancún, México, Junio 2013.
POSTER 5: Estudio structural y clonación de una lipasa de Carica papaya empleando una levadura como sistema de expresión. Rivera I., Duquesne S., Alain Marty A., Sandoval G. 4th Congreso Internacional Biología, Química y Agronomía. Guadalajara, México 2013.
XI
INDICE GENERAL
1
INDICE 1.
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………………………6
2.
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA……………………………………………………………………………….12 2.1
Carica papaya ................................................................................................... 14
2.1.1
TAXONOMÍA Y MORFOLOGÍA................................................................... 15
2.1.2
GENOMA DE Carica papaya ..................................................................... 17
2.1.3
CULTIVO DE Carica papaya....................................................................... 18
2.1.4
VALOR NUTRICIONAL................................................................................ 19
2.1.5
APLICACIONES DE Carica papaya ............................................................. 19
2.1.6
LÁTEX DE Carica papaya ........................................................................... 20
2.2
TRIACILGLICEROL LIPASAS ............................................................................... 24
2.2.1
FUENTES DE TRIACILGLICEROL LIPASAS ................................................... 28
2.2.2
SELECTIVIDAD ........................................................................................... 30
2.2.3
ESTRUCTURA DE LAS TRIACILGLICEROL LIPASAS...................................... 36
2.2.4
APLICACIONES DE LAS TRIACILGLICEROL LIPASAS................................... 42
2.2.5
MECÁNISMO CATÁLITICO. ........................................................................ 47
2.3
LA LIPASA DE Carica papaya ............................................................................ 53
2.3.1 2.4
EXPRESIÓN HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS. ...................................................... 62
2.4.1
EXPRESIÓN HETEROLOGA DE LIPASAS EN SISTEMAS MICROBIANOS ...... 66
2.4.2
EXPRESIÓN HETEROLOGA DE TRIACILGLICEROL LIPASAS EN PLANTAS ... 73
2.5 3.
APLICACIONES DE LA LIPASA DE Carica papaya ....................................... 54
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................... 79
RESULTADOS…………………………………………………………………………………………………..94 3.1
PURIFICACIÓN PARCIAL Y CARACTERIZACIÓN DE ACTIVIDAD LIPOLÍTICA EN
LÁTEX DE Carica papaya ............................................................................................ 96 2
3.1.1
PUBLICACIÓN 1: PLANT LIPASES: PARTIAL PURIFICATION OF Carica
papaya LIPASE ........................................................................................................ 97 3.1.2
PUBLICACIÓN 2: CARACTERIZACIÓN DE DIVERSAS FRACCIONES DEL LÁTEX
Carica papaya COMO BIOCATALIZADORES EN LA HIDRÓLISIS DE TRIGLICÉRIDOS 106 3.2
APLICACIONES DE TRIACILGLICEROL LIPASAS DE Carica papaya .................. 116
3.2.1
PUBLICACIÓN 3: LIPASE FROM Carica papaya LATEX PRESENTS HIGH
ENANTIOSELECTIVITY TOWARDS THE RESOLUTION OF PRODRUG OF 2-BROMOPHENYLACETIC ACID OCTYL ESTER ....................................................................... 117 3.2.2
PUBLICACIÓN 4: BIOPOLYMER SYNTHESIS CATALYZED BY TAILORED
LIPASES 123 3.2.3
PUBLICACIÓN 5: Carica papaya LATEX: A LOW-COST BIOCATALYST FOR
HUMAN MILK FAT SUBSTITUTES PRODUCTION ................................................... 129 3.3
EXPRESIÓN HETERÓLOGA DE ENZIMAS LIPOLÍTICAS DE Carica papaya ....... 142
3.3.1
PUBLICACIÓN 6: GENOMIC ANALYSIS OF DIFFERENT LIPASES FAMILIES IN
Carica papaya ....................................................................................................... 143 3.3.2
PUBLICACIÓN 7: FUNCTIONAL EXPRESSION OF CpEst LIPOLYTIC ENZYME
FROM Carica papaya IN Yarrowia lipolytica AND ITS APPLICATION TO RESVERATROL ACETYLATION ................................................................................ 167 3.3.3
PUBLICACIÓN
PRODUCTION,
8:
FUNCTIONAL
PURIFICATION,
EXPRESSION,
BIOCHEMICAL
EXTRACELLULAR
CHARACTERIZATION
AND
STRUCTURE MODEL OF Carica papaya LIPASE 1 .................................................. 186 3.3.4
PUBLICACIÓN 9: IDENTIFICATION, CLONING AND EXPRESSION OF A NEW
GDSL LIPASE FROM Carica papaya ....................................................................... 211 4.
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS…………………………………………………………………..237
5.
RESUMÉ………………………………………………………………………………………………………..243
3
INDICE DE TABLAS
Tabla 1 Clasificación taxonómica de Carica papaya...................................................... 15 Tabla 2 Principales fracciones de Carica papaya. .......................................................... 15 Tabla 3 Propiedades nutricionales de Carica papaya. .................................................. 19 Tabla 4 Clasificación de las hidrolasas de acuerdo a la Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica. .......................................................................................... 24 Tabla 5 Propiedades algunas triacilglicerol lipasas en hidrólisis de triglicéridos. ......... 34 Tabla 6 Aplicaciones industriales de algunas triacilglicerol lipasas .............................. 45 Tabla 7 Características de los diferentes sistemas de expresión de proteínas. ............. 64 Tabla 8 Diversos inductores utilizados en diversos sistemas microbianos. ................. 65 Tabla 9 Triacilglicerol lipasas expresadas en E. coli. ...................................................... 67 Tabla 10 Diversas levaduras utilizadas como sistema de expresión de proteínas ....... 69 Tabla 11 Expresión heteróloga de triacilglicerol lipasas en Pichia pastoris. ................. 71 Tabla 12 Expresión heteróloga de tricacilglicerol lipasas en Yarrowia lipolytica........... 72 Tabla 13 Diferencias entre las funciones de un virus completo y fragmentado ........... 74
4
INDICE DE FIGURAS Figura 1 Producción mundial de papaya. ...................................................................... 14 Figura 2 Látex de Carica papaya (se observa escurriendo sobre el fruto). ................... 20 Figura 3 Clasificación de las esterasas de acuerdo a cuatro diferentes criterios. ......... 27 Figura 4 Ácidos grasos que pueden ser identificados de forma selectiva por triacilglicerol lipasas. ...................................................................................................... 30 Figura 5
Identificación de los enlaces éster potenciales en la molécula de
triacilglicéridos................................................................................................................ 31 Figura 6 Esquema de un ejemplo de molécula quiral. .................................................. 33 Figura 7 Esquema tridimensional del plegamiento de las / hidrolasas . .................. 37 Figura 8 Variaciones en el foldeo α/β hidrolasa en triacilglicerol lipasas. ................... 38 Figura 9 Ilustración de los dos principales tipos de oxianión. ....................................... 39 Figura 10 Conformaciones
abierta y cerrada de la triacilglicerol lipasa de T.
lanuginosus ..................................................................................................................... 40 Figura 11 Topologías del sitio activo de las triacilglicerol lipasas. ................................. 41 Figura 12 Mecanismo catalítico de las triacilglicerol lipasas. ...................................... 47 Figura 13 Mecanismo ping-pong bi-bi con inhibición competitiva por el sustrato nucleofílico B.. ................................................................................................................ 48 Figura 14 Diagrama esquemático de un plásmido ........................................................ 62 Figura 15 Plásmidos más empleados para la expresión de proteínas recombinantes en P. pastoris. ...................................................................................................................... 70 Figura 16 Plásmidos usados para la clonación en Yarrowia lipolytica. .......................... 72 Figura 17
Esquema del módulo formado para la expresión a partir de vectores
provirales ........................................................................................................................ 75 Figura 18 Ejemplo de los módulos para la clonación vía vectores provirales. ............... 75 Figura 19 Estrategia general para la expresión heteróloga de proteínas en plantas vía vectores provirales ......................................................................................................... 77
5
1. INTRODUCCIÓN
6
INTRODUCCIÓN Carica papaya es una planta originaria de América central que crece en climas tropicales. Se trata de una hierba de tipo arborescente y tallo seguido, con crecimiento rápido que puede alcanzar entre 3 y 8 m de altura.
Al ser una planta de tipo latificiante, Carica papaya produce un líquido de apariencia lechosa conocido como látex. La composición exacta del látex de papaya no ha sido descrita en su totalidad; sin embargo, diferentes estudios han revelado que contiene aproximadamente un 15% de sólidos y 85% de agua (Silva et al. 1997).
Esta resina contiene una gran diversidad de metabolitos secundarios como alcaloides, terpenoides, compuestos fenólicos furanocumaricos, alcoholes triterpenicos, ácidos grasos insaturados, esteroles y almidones. Además contiene una gran cantidad de proteínas, muchas de las cuales son enzimas como proteasas, oxidasas, lecitinas, proteínas unidas a quitina, chitinasas, glucosidasas y fosfatasas.
Dentro del látex de Carica papaya ha sido reportada una actividad hidrolítica particularmente interesante por su capacidad de llevar a cabo reacciones de síntesis muy particulares conocida como la lipasa de Carica papaya (Quintana, et al. 2011, Tecelao, et al. 2012; Rivera, et al. 2013).
Las triaclilglicerol lipasas son una clase de enzimas que están encargadas del rompimiento de los enlaces éster de triglicéridos. Estas enzimas son conocidas por su amplia
gama de aplicaciones en diversas industrias incluyendo la industria 7
farmacéutica, química fina, cosméticos, bioenergía y alimentos. Por lo que estas enzimas son especialmente atractivas como biocatalizadores (Casas-Godoy et al. 2012).
Sin embargo, en el caso de Carica papaya la cantidad de biocatalizador obtenido mediante la extracción de látex resulta insuficiente para satisfacer la demanda de biocatalizador a escala
industrial. Una de las estrategias para la producción de
proteínas, en especial enzimas; a gran escala es la elucidación de su secuencia peptídica para su expresión en un huésped adecuado.
Tomando en cuenta lo anterior, este trabajo de investigación está dedicado al estudio de la actividad lipolítica presente en Carica papaya, con el propósito de obtener nuevos catalizadores con potenciales aplicaciones industriales teniendo en cuenta dos antecedentes principales:
1. La identificación de actividad lipolítica en el látex de Carica papaya y su interesante capacidad de llevar a cabo diversas síntesis. 2. El conocimiento del genoma completo de Carica papaya.
El esquema general del presente trabajo de investigación se muestra a continuación.
8
Esquema 1. Diagrama general del presente trabajo de investigación.
En una primera etapa el trabajo estuvo dedicado a la caracterización y purificación parcial de la actividad lipolítica presente en el látex de Carica papaya. La segunda etapa consistió en evaluar diferentes aplicaciones del látex parcialmente purificado como biocatalizador en diferentes reacciones. Una tercera etapa está dedicada a la clonación y la expresión funcional de
enzimas lipolíticas de Carica papaya
previamente identificadas en Caraca papaya, una GDSL lipasa expresada en Yarrowia lipolytica y una triacilglicerol lipasa expresada en Pichia pastoris.
La última parte de esta tesis estuvo dedicada a la identificación de nuevas triacilglicerol lipasas en Carica papaya. Para ello se realizó un análisis de genómico mediante la búsqueda de los sitios conservados con el objetivo de identificar posibles candidatos para análisis la expresión de estos candidatos en la hoja de Carica papaya; así como la expresión funcional del candidato identificado en Nicotiana tabaccum y Nicotiana benthamiana.
9
Así mismo, este trabajo de tesis se encuentra organizado en tres capítulos principales: La revisión bibliográfica (capítulo 2), la cual se encuentra organizada en 4 secciones. 1. Carica papaya. 2. Triacilglicerol lipasas. 3. La lipasa de Carica papaya. 4. Expresión heteróloga de triacilglicerol lipasas.
La segunda parte presenta los resultados en forma de artículos, clasificados en tres secciones principales. 1. Purificación parcial y caracterización. 2. Aplicaciones de enzimas lipolíticas de Carica papaya. 3. Expresión y caracterización de enzimas lipolíticas de Carica papaya.
La sección de purificación parcial y caracterización consta de dos artículos 1. Plant Lipases: Partial Purification of Carica papaya Lipase 2. Caracterización de diversas fracciones del látex Carica papaya
como
biocatalizadores en la hidrólisis de triglicéridos. La sección de aplicaciones consta de 3 artículos: 1. Lipase from Carica papaya latex presents high enantioselectivity towards the resolution of prodrug of 2-bromo-phenylacetic acid octyl ester. 2. Biopolymer Synthesis Catalyzed by Tailored Lipases 3. Carica papaya latex: A low-cost biocatalyst for human milk fat substitutes production.
10
La sección de expresión heteróloga de enzimas lipolíticas de Carica papaya está constituida de cuatro artículos. 1. Genomic analysis of different lipase families in Carica papaya. 2. Functional Expression of CpEst lipolytic enzyme from Carica papaya in Yarrowia lipolytica and its Application to Resveratrol Acetylation. 3. Functional expression, extracellular production, purification, biochemical characterization and structure model of Carica papaya Lipase 1. 4. Transcriptomic analysis of selected putative lipase genes in Carica papaya and expression of a new GDSL lipase (CpLip2) in Nicotiana sp.
Finalmente el cuarto capítulo corresponde a las conclusiones generales de la investigación y las perspectivas para futuros trabajos.
11
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
12
2.1 Carica papaya
13
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 Carica papaya Carica papaya es un arbusto de tallo seguido, semileñosa, tropical y de crecimiento rápido cuyo fruto se conoce comúnmente como papaya o papayon, mamón, melón papaya, lechosa, melón de árbol o fruta bomba.
Carica papaya es una planta tipo latificiante de la familia de las caricáceas originaria del Caribe y América central, además también es cultivado en regiones tropicales y subtropicales tales como Hawái, Sudáfrica, África Británica del Este, Ceylán, India, Islas Canarias y Australia. A nivel mundial, el cultivo de papaya alcanza 11,581’ 779,000 de toneladas; siendo México uno de los principales productores ocupando el sexto lugar a nivel mundial 634, 369 toneladas (figura 1) y es el primer lugar como país exportador de esta fruta con 59,638 toneladas.
Toneladas
5,000,000 4,000,000 3,000,000 2,000,000 1,000,000 0
Figura 1 Producción mundial de papaya (FAO, 2011).
14
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1.1
TAXONOMÍA Y MORFOLOGÍA
La familia de las Caricáceas es una familia de plantas laticifiantes con 35 miembros, los cuales se encuentran clasificados en cuatro géneros: Carica, Cylicomorpha, Jarilla y Jacaratia (Kumar LSS 1944), de los cuales se encuentran 22 especies. Sin embargo, el género Carica es el más conocido y estudiado. La clasificación taxonómica de esta especie se encuentra en la tabla 1. Tabla 1
Clasificación taxonómica de Carica papaya.
CLASIFICACIÓN TAXÓNOMICA DE Carica papaya Reino
Plantae
Orden
Brassicales
Familia
Caricaceae
Género
Carica
Especie
Papaya
El papayo puede alcanzar entre 3 y 8 m de altura, desde el punto de vista morfológico, Carica papaya puede clasificar en cuatro fracciones principales como se muestra en la tabla 2, las cuales presentan las siguientes características:
Tabla 2 Principales fracciones de Carica papaya.
PRINCIPALES FRACCIONES DE Carica papaya.
Peciolo
Flor
Fruto
Hoja
15
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA El tallo de Carica papaya es simple o a veces se bifurcado de forma cilíndrica de 2-10 m alto y 10 a 30 cm de diámetro, con un tronco hueco color marrón de tipo fibroso caracterizado por la presencia de cicatrices grandes y prominentes causadas por la caída de las hojas e inflorescencias.
El peciolo de 25-75 cm en el diámetro es liso y más o menos robusto, su base es profundamente cortante con la superposición de aproximadamente 7 a 11 lóbulos grandes, cada uno de estos lóbulos presentan un ápice agudo y nervado, así como una base amplia algo apretada.
Las hojas se encuentran unidas al peciolo por una fístula frágil de 25-100 cm de largo y 0,5 -1.5 cm de espesor. La superficie superior de la hoja es verde oscura o verde amarilla, brillante y visiblemente marcada por venas hundidas y nervaduras blanco amarillentas y reticulantes. En la parte inferior se presentan nervaduras prominentes de color verde o amarillo opaco.
Mención aparte merece la flor de Carica papaya, existen diversos tipos de flores cuyas características dependen su género: Las flores femeninas tienen un cáliz muy pronunciado y fácil de distinguir debido a su forma de corona de cinco puntas. Encima del cáliz está el ovario cubierto por cinco sépalos. Estos sépalos son blancos amarillos y con ligeros toques de violeta en la punta.
16
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Las flores masculinas se cultivan sobre los tallos largos de más de un pie de longitud y al final de los cuales se encuentran racimos que consisten en 15 a 20 flores. Las flores están integradas por un tubo largo hecho por pétalos unidos dentro de los cuales se encuentran 10 estambres colocados en dos grupos de cinco cada uno.
De igual forma, existen arbustos de Carica papaya de tipo hemafrodita en los cuales se observan tres clases diferentes clases de flores. La primera llamada pentandria, es similar a la flor femenina pero los pétalos son vistosos con cinco estambres separados. La segunda es conocida como elongata y está formada por diez hilos colocados en dos hornadas, cuya flor es alargada y de forma cilíndrica como el ovario del cual se obtiene el fruto. El último tipo de flor es el intermedio de forma irregular no una flor bien formada.
Finalmente, el fruto es de forma ovoide oblonga, piriforme o casi cilíndrica de 0 a 25 cm o más en la longitud y 7-15 cm o más en el diámetro. Su pulpa es jugosa, carnosa y longitudinalmente acanalada sobre la cima; su color puede variar del color amarillento o verde amarillo cuando el fruto aún no está maduró a un color amarillo o de naranja cuando ha alcanzado la madurez. Dentro de la pulpa así mismo se pueden encontrar numerosas semillas parietales de color negro incluidas en un aril transparente.
2.1.2
GENOMA DE Carica papaya
El genoma es la totalidad de la información genética que posee un organismo o una especie en particular. El genoma en los seres eucarióticos comprende el ADN contenido en el núcleo, organizado en cromosomas y el genoma mitocondrial.
17
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Los organismos diploides como el caso de Carica papaya poseen dos copias del genoma en sus células debido a la presencia de pares de cromosomas homólogos. Mientras otros tipos de los organismos o células haploides solo contienen una copia, finalmente existen organismos poliploides, con grupos de cromosomas homólogos. El genoma de Carica papaya consiste de 372 megabases (Mb), con una herencia de tipo diploide y constituido por nueve pares de cromosomas con un sistema primitivo de cromosomas sexuales. Este genoma también muestra homología con las especies Arabidopsis y Populus (Ming et al. 2008).
Debido a que su constitución es relativamente sencilla el genoma de Carica papaya se ha propuesto como un sistema modelo para explorar el genoma de diferentes plantas tropicales y árboles frutales.
2.1.3
CULTIVO DE Carica papaya
El objetivo principal del cultivo de Carica papaya es la obtención del fruto, el cual se emplea como alimento. Así mismo, al ser un cultivo de tipo tropical Carica papaya se desarrolla mejor en un suelo bien drenado, aireado y rico en materia orgánica sólida a un pH entre pH 5.5 y pH 6.7 (Norton 1987), temperatura entre 22-26°Cy precipitación uniformemente distribuida de 100 a 150cm. Su ciclo de vida es de aproximadamente de dos años dividido en dos fases: La primera de germinación-floración (3 a 8 meses) y una segunda de generación (9 a 15 meses). Durante una producción óptima se pueden lograr hasta 2 700 plantas por hectárea (Teixeira da Silva et al. 2007). Así mismo el cultivo de Carica papaya puede ser iniciado a partir de la siembra directa de las semillas (cuya germinación surge 2 a 4 semanas posterior a la siembra) ó a partir de plántulas (6-8 semanas después de la germinación).
18
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1.4
VALOR NUTRICIONAL
El fruto de Carica papaya es apreciado en la industria alimenticia debido en gran medida a sus propiedades nutrimentales, las cuales pueden variar dependiendo diferentes factores como la variedad y lugar de cultivo. En general las propiedades nutricionales de Carica papaya se presentan en la tabla 3.
Tabla 3
Propiedades nutricionales de Carica papaya.
CONSTITUYENTE
VALOR APROXIMADO
CONSTITUYENTE
VALOR APROXIMADO
Agua
89%
Potasio
257 mg
Calorías
39 kcal
Magnesio
10 g
Proteína
0.61 g
Sodio
3 mg
Grasa
0.14 g
Ácido nicotínico
0.34 mg
Carbohidratos
9.8 g
Ácido Pantoténico
0.22 mg
Calcio
24 mg
Vitamina A
1094IU
Hierro
0.1 mg
Vitamina E
0.73 mg
Fosforo
5 mg
USDA Nutrient Database for Standard Reference, Release 18 (2005).
2.1.5
APLICACIONES DE Carica papaya
Como se mencionó anteriormente, la función principal del cultivo de Carica papaya es la obtención del fruto para su consumo como fruta fresca, sin embargo se puede emplear en una gran variedad de formas.
En la industria alimenticia el fruto es empleado en la elaboración de conservas. Así mismo, en la industria farmacéutica es utilizado como laxativo, diurético, digestivo,
19
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA antibiótico y cardiotónico. Las hojas verdes y los frutos son cocinados como vegetal en la elaboración de diversos platillos.
El peciolo es empleado en la producción de alimento para peces y la fabricación artesanal de flautas. De igual forma, las semillas contienen aceite que es aprovechado en la industria de jabón y en la industria farmacéutica como desparasitante.
El látex extraído de distintas partes de la planta (principalmente del fruto), es usado en la industria alimenticia como ablandador carne o la clarificación de la cerveza, además es utilizado como vermicida y en la fabricación de chicle.
2.1.6
LÁTEX DE Carica papaya
Carica papaya al ser una planta de tipo latificiante, produce un líquido de apariencia lechosa conocido como látex de papaya (figura 2). El látex de papaya está formado por un pequeño número de células iniciales en estado embrionario, las cuales se elongan y ramifican para formar un conjunto multicelular de forma tubular (Dussourd and Denno 1991; Hagel et al. 2008).
Figura 2 Látex de Carica papaya (se observa escurriendo sobre el fruto).
20
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA La composición exacta del látex de papaya no ha sido descrita en su totalidad, además su composición puede variar de acuerdo con el clima, variedad y una gran cantidad de factores ambientales (Moutim et al. 1999; Silva et al. 1997). Sin embargo, diferentes estudios han revelado que contiene aproximadamente un 15% de sólidos y 85% de agua (Silva et al. 1997).
Esta resina contiene además una gran diversidad de metabolitos secundarios y proteínas normalmente involucrados en la defensa de la planta contra agentes externos (Farrell et al. 1991).
Estos metabolitos secundarios incluyen alcaloides,
terpenoides, compuestos fenólicos furanocumáricos, alcoholes triterpénicos, ácidos grasos insaturados, esteroles y almidones.
Así mismo, contiene una gran cantidad de enzimas incluyendo proteasas, oxidasas, lecitinas, proteínas unidas a quitina, quitinasas, glucosidasas y fosfatasas. A pesar de que el rol de la mayoría de estos compuestos permanecen sin dilucidar, como se mencionó anteriormente algunos estudios sugieren que muchos de ellos se encuentran involucrados en el mecanismo de defensa contra insectos herbívoros y la presencia de fitopatogénos (Rodrigues et al. 2012).
Este fluido y la variedad de compuestos que contiene pueden ser catalogados en dos fracciones de acuerdo a su solubilidad en agua la fracción soluble contiene un 10% de carbohidratos, igual porcentaje en sales, 5% de lípidos y 30% de biomoléculas representativas como la glutatión y cistein-proteasas, además de
10% de otras
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CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA proteínas. Sin embargo, la fracción insoluble, permanece prácticamente sin dilucidar y corresponde al 25% de la materia seca total del látex.
Además, dentro de esta fracción ha sido reportada una enzima hidrolítica muy interesante por su capacidad de llevar a cabo reacciones de síntesis muy particulares (Campillo-Alvarado and Tovar-Miranda, 2013) como la producción de polímeros, y lípidos análogos a la leche materna (Sandoval et al. 2010, Quintana et al. 2011, Tecelao et al. 2012) y de las cuales se hablara en la parte 4 del presente capítulo. Esta enzima es una carboxiléster hidrolasa conocida como la lipasa de Carica papaya (Giordani et al. 1991)
22
2.2 Triacilglicerol lipasas
23
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.2 TRIACILGLICEROL LIPASAS Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas, siempre que sean termodinámicamente posibles; por lo tanto, función de las enzimas es incrementar la velocidad de reacción actuando sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en moléculas diferentes conocidos como productos.
Las hidrolasas son el grupo más abundante de enzimas en la naturaleza y se refiere, al conjunto de enzimas capaces de catalizar la hidrólisis de diversos tipos de enlace químico, por lo que la Comisión de enzimas de la unión Internacional de Bioquímica esta clase de enzimas a su vez se subclasifican de acuerdo al tipo de enlaces sobre los que son capaces de actuar de la siguiente manera (tabla 4).
Tabla 4 Clasificación de las hidrolasas de acuerdo a la Comisión de Enzimas de la Unión
Internacional de Bioquímica.
NÚMERO SÍSTEMATICO EC 3.1 EC 3.2 EC 3.3 EC 3.4 EC 3.5 EC 3.6 EC 3.7 (Moss GP).
TIPO DE ENLACE QUE SON CAPACES DE HIDROLIZAR. Enlaces éster Enlaces glicosidicos Glicosilasas. Actúan sobre enlaces éter. (Peptidasas) Enlaces peptídicos. Enlaces carbono-nitrógeno no peptídicos. Anhídridos de los ácidos. (Helicasas, GTPasa) Enlaces carbono-carbono
NÚMERO SISTEMÁTICO EC 3.8 EC 3.9
TIPO DE ENLACE QUE SON CAPACES DE HIDROLIZAR. Enlaces haluro. Enlaces fósforo-nitrógeno.
EC 3.10
Enlaces azufre-nitrógeno.
EC 3.11 EC 3.12
Enlaces carbono-fósforo. Enlaces azufre-azufre.
EC 3.13
Enlaces carbono-azufre.
24
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Las éster hidrolasas mejor conocidas como esterasas son enzimas que catalizan de forma natural el rompimiento de enlaces éster, algunos ejemplos de este grupo de enzimas
encontramos las feruloil esterasas, tanasas, clorogenato esterasas,
acetilcolinestearasas. Así como las carboxilesterasas y las lipasas, las cuales se encargan de la degradación de triglicéridos.
Clásicamente ambas enzimas se definen de la siguiente manera: Las carboxilesterasas (E.C. 3.1.1.1) son un grupo de enzimas que de forma natural catalizan la hidrólisis de ésteres de ácidos carboxílicos de cadena corta; mientras las lipasas o triacilglicerol éster hidrolasas (E.C. 3.1.1.3), son enzimas cuya función biológica es catalizar la hidrólisis de ésteres, de forma preferencial los triacilglicéridos de cadena larga, para producir ácidos grasos libres, di y monoacilglicéridos y glicerol (Casas-Godoy et al. 2012).
Sin embargo, las características que distinguen a una lipasa de una esterasa, como la presencia o ausencia del fenómeno de activación interfacial y la presencia de una estructura flexible que cubre al sitio activo conocida como “lid “en la estructura tridimensional de la proteína han sido objeto de controversia. Por lo que en 2012 se propone la clasificación de las esterasas de acuerdo a cuatro criterios basados en las características de los sustratos que son capaces de hidrolizar (Ali et al. 2012).
En una primera etapa esta clasificación toma en cuenta la fisicoquímica de los sustratos que la enzima es capaz de hidrolizar distinguiendo entre dos clases de
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CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA esterasas; las esterasas lipolíticas y no lipolíticas de acuerdo con su capacidad de hidrolizar sustratos de tipo lipídico. En segunda instancia, las esteras se catalogan de acuerdo a la química de los sustratos se distingue entre carboxil éster hidrolasas, fosforidiéster hidrolasas y tioéster hidrolasas. Estas enzimas catalizan la hidrólisis de ésteres de ácidos carboxílicos, uno de los dos enlaces en diésteres fosfóricos, mono esteres fosfóricos y tioésteres fosfóricos respectivamente.
De entre estas enzimas, una de las más interesantes debido sus posibles aplicaciones son las carboxil éster hidrolasas, la cual es una familia de enzimas constituida por las glicerol lipasas y las colesterol lipasas, que actúan en la hidrólisis de ésteres de glicerol y colesterol respectivamente.
Finalmente de entre las glicerol lipasas se distingue entre las triacilglicerol lipasas, galacto lipasas y fosfolipasas, que actúan sobre triglicéridos, glicerogalactolípidos y glicerofosfolípidos. Es importante destacar que la mayoría de las triacilglicerol lipasas pueden hidrolizar triglicéridos, diglicéridos y monoglicéridos in vitro, de manera tal que al final se toma en cuenta el tipo de organismo de procedencia, mamíferos, plantas, microrganismos y organismos de origen marino. El esquema general de esta clasificación se encuentra en la figura 3.
26
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Figura 3 Clasificación de las esterasas de acuerdo a cuatro diferentes criterios. 1: Fisicoquímico, 2: Químico, 3: Anatómico y tisular (para triacilglicerol lipasas de mamíferos). 4: Celular para PLA 2. AchE acetilcolinesterasa, AFEST Archaeglobus fulgidus esterasa, ATGL triacilglicerol lipasa del tejido adiposo, BFAE Brefeldin A esterasa, CEL carboxil éster lipasa, EST2 Alicylobacillus acidocaldarius esterasa, GL lipasa gástrica, HerE heroin esterasa, HSL lipasa hormona sensible, LPL Liporotein lipasa, MGL monogliceril lipasa, PLA 2 fosfolipasa A1, PLA2 fosfolipasa A2, PLC fosfolipasa C, PLD fosfolipasa D, PL lipasa pancreática, TGHTAG hidrolasa (Ali et al. 2012).
27
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.2.1
FUENTES DE TRIACILGLICEROL LIPASAS
Las triacilglicerol lipasas se producen en una gran cantidad de organismos de todos los reinos. Sin embargo; debido a la facilidad de crecimiento y producción, abundancia y el conocimiento de su genética hacen de los microrganismos la fuente más abundante de carboxil esterasas lipolíticas. (Jaeger and Eggert 2002; Treichel et al. 2010). Algunas de las más conocidas son las lipasas de Candida antarctica B, Rhizomucor miehei, Candida rugosa y Thermomyces lanuginosus.
En eucariotas, las triacilglicerol lipasa participan en el metabolismo de lípidos, por lo que se producen en el sistema digestivo y el páncreas, algunos ejemplos son la lipasa pancreática humana (Mukherjee 2003), la lipasa pancreática de cerdo (Mendes et al. 2012), y las lipasas pancreáticas de oveja y canino (Manunta and Marongiu 1966).
En el reino vegetal, las triacilglicerol lipasas se encuentran almacenadas en la semilla de plantas oleaginosas, como maíz, girasol, semilla de colza, semilla de ricino, granos de sésamo, debido a su alto contenido de triglicéridos que funcionan como fuente de energía de reserva que es procesada gracias a la presencia de enzimas lipolíticas.(Huang 1987; Rivera et al. 2012).
Así mismo, en plantas algunas de estas enzimas se encuentran involucradas en diversos procesos metabólicos cuya función es la defensa en contra de diversos factores bióticos y abióticos. A continuación se describirá un poco más esta clase de triacilglicerol lipasas.
28
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.2.1.1 TRIACILGLICEROL LIPASAS DE PLANTAS Como se mencionó anteriormente, en el reino vegetal las triacilglcierol lipasas se encuentran principalmente en la semilla de plantas oleaginosas, tales como el maíz, girasol, semilla de colza, semilla de ricino, granos de sésamo, debido a su alto contenido de triglicéridos. Estos triglicéridos los cuales son almacenados en forma de cuerpos oleosos por lo que funcionan como fuente de reserva de energía, la cual se consume rápidamente durante el proceso de germinación. De hecho, la actividad lipolítica en las semillas oleaginosas normalmente aparece durante la germinación (Barros et al. 2010), cuya primera etapa implica la movilización de los ácidos grasos que es controlada por diferentes enzimas lipolíticas.
En el caso de cereales como el trigo, la mayoría de la actividad lipolítica (75-80%) se encuentra en el salvado y el 20-25% en el germen (O`Connor et al. 1992).
Otras fuentes de triacilglicerol lipasas de plantas son los laticífiantes; un grupo de células que contiene látex (un líquido de apariencia lechosa) que se encuentra en diferentes plantas como parte de su mecanismo de defensa y cuya composición varía dependiendo de la variedad de la planta, así como de sus condiciones de crecimiento. Dentro de esta clase de plantas se incluyen especies como Asclepciadaceae, Moraceae, Apocynaceae, Euphorbaceae, Caricacea y Bromeliácea (Paques and Macerdo, 2006)
En la sección 1 del capítulo 3 se presenta una revisión de las diversas características y propiedades de las lipasas de plantas.
29
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.2.2
SELECTIVIDAD
La selectividad de las triacilglicerol lipasas se encuentra estrechamente relacionada con su capacidad para llevar a cabo las diversas reacciones que son capaces de catalizar, así como con sus características estructurales.
2.2.2.1 Topo selectividad La topo selectividad describe la preferencia por un tipo de sustrato, ya sea un triglicérido, diglicérido o monoglicérido, de ahí que durante la reacción podemos tener diglicéridos y monoglicéridos como productos de hidrólisis, además de ácidos grasos y glicerol.
La quimio selectividad describe la preferencia por un grupo químico
específico (Casas-Godoy et al. 2012).
Esta característica también se refiere a la preferencia de la enzima para actuar sobre un ácido graso (figura 4) con determinado número de carbonos en presencia de otros ácidos con longitud distinta; así como a la preferencia por el grado de insaturación (cantidad de dobles enlaces presentes en la cadena) y a las sustituciones potenciales del sustrato que se desea emplear.
Figura 4 Ácidos grasos que pueden ser identificados de forma selectiva por triacilglicerol lipasas.
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CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA La topo selectividad puede así mismo ser un factor de diferenciación entre las diferentes isoformas de una triacilglicerol lipasa como en el caso de las diversas isoformas de
la lipasa de Candida rugosa, las cuales difieren en pequeñas
modificaciones en los aminoácidos que lo componen.
2.2.2.2 Regio selectividad Se refiere al ataque preferencial de una lipasa en alguna de las tres posiciones de los enlaces éster entre el glicerol y los ácidos carboxílicos dentro del esqueleto de la molécula de triglicérido (figura 5).
Figura 5 Identificación de los enlaces éster potenciales en la molécula de triacilglicéridos.
De acuerdo con dicha preferencia, las triacilglicerol lipasas pueden ser clasificadas como: sn-1,3ó sn-2 específicas, cuando tienen preferencia por estas posiciones del triglicérido y como no específicas cuando son capaces de hidrolizar todas las posiciones de forma indistinta.
La mayoría de las triacilglicerol lipasa de origen microbiano presentan preferencia por las posiciones 1 y 3 del triacilglicérido sn-1,3 como las lipasas de Rhizopus arrihizus,
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CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Aspergillus niger, Rhizomucor miehei, Yarrowia lipolytica, Thermomyces lanuginosus y Rhizopus delemar, por lo que son catalogadas como sn-1, 3específicas.
Hasta la fecha se han encontrado pocas triacilglicerol lipasas sn-2 específicas ejemplos de ellas son la lipasa C de Geotrichum sp. FO401B (Ota et al. 2000) y la lipasa de Staphylococcus (Horchani et al. 2010). Así mismo, existen lipasas como la lipasa de Candida antarctica B, Staphylococcus aureous y Corynebacterium que son capaces de hidrolizar de manera indiscriminada las tres posiciones de los enlaces éster por lo que son conocidas como enzimas no regioselectivas o no regio específicas (Casas-Godoy et al. 2012).
2.2.2.3 Enantioselectividad La enantioselectividad se refiere a la capacidad de las triacilglicerol lipasas de discriminar entre ambos enantiómeros de una molécula quiral dentro de en un sistema reaccional en el cual se encuentra involucrada una mezcla racémica (mezcla de ambos enantiómeros).
Una molécula quiral es aquella que gracias a un eje asimétrico puede adoptar dos formas enantiomericas (R y S) no superponibles y las cuales son imágenes especulares una de otra como se muestra en la figura 6.
32
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Figura 6 Esquema de un ejemplo de molécula quiral.
La mayoría de los medicamentos fabricados en la industria farmacéutica corresponden a moléculas quirales en las cuales solo uno de los enantiómeros presenta la actividad deseada. Sin embargo, la mayoría de estos compuestos se encuentran solo en forma de mezcla racémica y es necesaria la separación del compuesto de interés (Smith 2009), por lo que la enantioselectividad de las triacilglierol lipasas es una propiedad especialmente útil en esta industria.
Existen una gran cantidad de ejemplos de triacilglicerol lipasas enantioselectivas como son el caso de Lip2 de Yarrowia lipolytica, Candida rugosa y Pseudomona cepacia. Esta propiedad depende de dos factores principales: la enzima empleada y el sistema reaccional utilizado, ya que simples cambios en la termodinámica de la reacción pueden llevar incluso a la inversión de la enantiopreferencia de la enzima. En la tabla 5 se encuentran las características de algunas triacilglicerol lipasas conocidas.
33
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Tabla 5
Propiedades algunas triacilglicerol lipasas en hidrólisis de triglicéridos.
ENZIMA
T. OPT
PH OPT.
PREFERENCIA POR LONGITUD DE CADENA
REGIOSELECTIVIDAD REFERENCIAS
LIPASAS MICROBIANAS Candida antarctica B
No especifíca
(Casas-Godoy et al. 2012)
Rhizomucor miehei
65°C
7
sn-1, sn-3
(Schmid and Verger 1998; Uvarani et al. 1998)
Pseudomona cepacia
40°C
9
No especifica
(Dalal et al. 2008; Schmid and Verger 1998)
Yarrowia lipolytica (Lip2)
37-40 °C
6-7.5
Cadena mediana
(Aloulou et al. 2007) (Fickers et al. 2011)
4.5
Cadena corta y mediana
(Noma and Borgstro.B 1971; Tuter 1998)
LIPASAS DE ORIGEN VEGETAL Ricino Arroz
80°C
11
Maíz
sn-2
(Bhardwaj et al. 2001)
Cadena larga
(Lin and Huang 1984; Lin et al. 1986) (Fiorillo et al. 2007)
Euphobria characias
60°C
5
Cadena corta y mediana
Carica pentagona
50°C
8
Cadena corta
Jatropha curcas
37°C
7.5
sn-1,sn-3 sn-1,sn-2
(Cambon et al. 2008; Chen et al. 2005) (Abigor et al. 2002; Staubmann et al. 1999)
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CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
ENZIMA
T. OPT
PH OPT.
PREFERENCIA POR LONGITUD DE CADENA
REGIOSELECTIVIDAD REFERENCIA
LIPASAS DE ORIGEN ANIMAL Lipasa pancreática humana
sn-1,sn-3
(Schmid and Verger 1998)
Lipasa gástrica humana
sn-1, sn3
(Schmid and Verger 1998)
Lipasa pancreatica porcina
sn-1,sn3
(Schmid and Verger 1998)
35
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.2.3
ESTRUCTURA DE LAS TRIACILGLICEROL LIPASAS
El esclarecimiento de la estructura de las enzimas; en este caso de las triacilglicerol lipasas, es clave en los estudios básicos de la relación entre la función y propiedades bioquímicas de las enzimas. De forma general, desde el punto de vista estructural las lipasas pueden dividirse en dos familias de acuerdo a las características de la secuencia consenso del sitio activo.
2.2.3.1 α/β hidrolasas Como se mencionó anteriormente, las esterasas lipolíticas pertenecen a la familia de las α/β hidrolasas, cuya estructura consenso consiste en una hoja plegada β central casi paralela formada por ocho hojas plegadas β; de las cuales solo una de ellas antiparalela (β2), además de estar dispuestas en forma lineal y en su mayoría (β3-β8) se encuentran conectadas por las hélices α que se encuentran a los extremos de la hoja β central (Svendsen 2000).
Existen distintas variaciones a este modelo como el número de hélices α presentes en la secuencia, la presencia de inserciones y la forma de los subdominios de unión al sustrato. Una de las modificaciones más importantes de las lipasas es la presencia de puentes disulfuro (Casas-Godoy et al. 2012).
En la figura 7 se muestra un esquema tridimensional tradicional de las α/β hidrolasas. Las hélices α están indicadas por cilindros (letras A a F) y las hojas β son indicadas por flechas. La posición topológica del sitio activo se indican por círculos; El nucleótido es
36
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA el residuo después de β5, el residuo Asp/Glu residuo después de β7, y el residuo de histidina se encuentra en el loop entre β8 y α F.
Figura 7 Esquema tridimensional del plegamiento de las / hidrolasas (Jaeger et al. 1999).
2.2.3.2 El sitio catalítico Una gran cantidad de triacilglicerol lipasas presentan un sitio catalítico conservado constituido por tres aminoácidos, un aminoácido que funciona como nucleófilo (serina), un residuo ácido (aspartato ó glutamato) y una histidina (Casas-Godoy et al. 2012).
Dentro de la estructura de la tridimensional la serina catalítica se localiza en la hoja β5 antes de la siguiente hélice α, el residuo de aspartato o glutamato se encuentra posicionado después de la hoja β7 y la histidina catalítica se encuentra dentro del loop en seguida de la hoja β8. Las variaciones a esta estructura se muestran en la figura 8.
37
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Figura 8 Variaciones en el foldeo α/β hidrolasa en triacilglicerol lipasas. (a) Candida rugosa Lip1 (PDB 1LPO (Grochulski et al. 1994)). La flecha marca la cadena de oligosacáridos unidas al aminoácido Ser 351, (b) La lipasa de Bacillus subtilis caracterizada por la ausencia de “lid” en su estructura y (c) La lipasa pancreática con el dominio del sitio de unión a la colipasa en el extremo izquierdo.
Un segundo grupo de triacilglicerol lipasas presenta un sitio activo con una secuencia consenso altamente conservada G-X-S-X-G en el cual la serina catalítica se desplazada por una secuencia GDSL usualmente localizada cerca del extremo N terminal de la proteína (Akoh et al. 2004).
2.2.3.3 La cavidad oxianión Uno de los pasos críticos durante el mecanismo catalítico de las triacilglicerol lipasas es la estabilización del intermediario tetraédrico. Este equilibrio se alcanza mediante la formación de enlaces puentes de hidrógeno con los dos aminoácidos que conforman la
38
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA llamada cavidad oxianión. Específicamente este enlace se lleva a cabo entre el protón del extremo amida y el oxígeno del grupo carbonilo del sustrato.
El primero de estos residuos se encuentra en el extremo N terminal, mientras el segundo residuo se encuentra localizado en el codo nucleófilico. De acuerdo a la secuencia que rodea este primer residuo se han identificado dos tipos de cavidad oxianión como se muestra en la figura 9.
Figura 9 Ilustración de los dos principales tipos de oxianión. (a) GX en la lipasa Rhizomucor miehei (PDB entrada 4TGL.). (b) Tipo GGGX en la lipasa Candida rugosa (Pleiss et al. 2000).
El primer tipo de cavidad oxianión llamado GX se encuentra vinculado con la selectividad por sustratos de cadena larga o mediana; mientras el GGGX se vincula con la presencia por cadenas cortas de sustrato. De igual manera, Fisher identificó un tercer tipo de agujero oxianión en la lipasa de Candida antarctica, llamado tipo ϒ, el cual está estrictamente formado por el extremo hidroxilo de tirosina.
En el caso de las triacilglicerol lipasas de tipo GDSL la cavidad oxianión presenta una estructura particular; donde la serina catalítica sirve como donador de protones junto
39
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA con los residuos de glicina y asparagina altamente conservados. Además el no presentan el codo nucleofílico (Akoh et al. 2004).
2.2.3.4 Elementos estructurales Algunas triacilglicerol lipasas conjuntamente con una triada catalítica presentan una estructura flexible conocida como “lid”; la cual cubre el sitio activo y esta compuesta de una o varias hélices α, unidas al esqueleto principal de la proteína. Esta estructura flexible se abre en presencia de una interfase lípido/agua generando un cambio conformacional que permite el acceso del sustrato al sitio activo de la enzima (fenómeno es conocido como activación interfacial). En la figura 10 se muestra la configuración abierta y cerrada de la triacilglicerol lipasa de Thermomyces lanuginosus.
Figura 10 Conformaciones abierta y cerrada de la triacilglicerol lipasa de T. lanuginosus Estructura abierta (PDB: 1EIN) (E) y estructura cerrada (PDB: 1DT3) (F). Los residuos catalíticos están coloreados en amarillo. (Lafaquiere 2010).
En el caso de las triacilglicerol lipasas de tipo GDSL, esta clase de enzimas no poseen una “lid”. 40
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.2.3.4.1
Sitio activo
El sitio activo se encuentra localizado dentro de un bolsillo en la parte superior de la de la hoja β central y se encuentra rodeado en su superficie en su mayoría por residuos hidrófobos los cuales interactúan con el sustrato. Igualmente, el sitio de unión al sustrato varía en forma, superficie, forma, profundidad del bolsillo y propiedades fisicoquímicas de los aminoácidos que lo conforman como se muestra en la figura 11.
a) Lipasas con el sitio activo localizado cerca de la superficie de la proteína: Rhizomucor and Rhizopus
b) Lipasas con sitio activo en forma de embudo: Burkholderia cepacia y Candida antarctica
c) Lipasas con sitio activo en forma de herradura: Candida rugosa
Figura 11 Topologías del sitio activo de las triacilglicerol lipasas. Las superficies del sitio activo fueron modeladas usando los datos cristalográficos de la base de datos PDB. Los aminoácidos que conforman la triada catalítica se encuentran coloreados. (Ser: azul, Asp o Glu: rojo e His: naranja) (Lafaquiere 2010).
41
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA De acuerdo a su geometría se han identificado tres diferentes grupos de sitio de unión al sustrato. El primer grupo presenta un sitio de hidrófobo en forma de herradura cerca de la superficie de la proteína. El segundo grupo pertenece a un bolsillo en forma de embudo y finalmente el tercer grupo corresponde a una geometría en forma de túnel.
Así mismo, las triacilglicerol lipasas de tipo GDSL se distinguen por tener un sitio de unión al sustrato caracterizado por ser altamente flexible, por lo que en general son catalizadores más versátiles, capaces de aceptar una mayor gama de condiciones de reacción y sustratos (Akoh et al. 2004)
2.2.4
APLICACIONES DE LAS TRIACILGLICEROL LIPASAS
A nivel industrial las enzimas son empleadas en campos como alimentos, farmacéutica y química fina. Además, gracias su versatilidad las triacilglicerol lipasas son de las enzimas más interesantes en el mercado.
Una de las aplicaciones más antiguas de esta clase de enzimas, es la modificación de aceites y grasas para la industria alimenticia, además de ser ampliamente utilizadas en la producción de lácteos durante la elaboración de quesos, yogurt y mantequillas además de la síntesis de ésteres, lactonas, metil quetonas y ácidos que son utilizados como saborizantes.
42
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Otra de las aplicaciones de las triacilglicerol lipasas es la producción de lípidos estructurados (sustitutos de leche materna, aceites enriquecidos en ácidos poliinsaturados, sustitutos de mantequilla de cocoa), como una forma de mejorar las propiedades nutricionales de algunos lípidos existentes, proporcionándoles una mayor capacidad de absorción, además de ayudar a una mejor nutrición y prevenir enfermedades relacionadas con el colesterol alto y la obesidad (Casas-Godoy et al. 2012; Holm and Cowan 2008).
En la industria de detergentes, las triacilglicerol lipasas son empleadas como aditivos en diversas formulaciones de detergentes de numerosos tipos. Además, son utilizadas en la producción de algunos derivados de lípidos para la llamada tecnología verde (Casas-Godoy et al. 2012).
En la industria farmacéutica; las esterasas lipolíticas son utilizadas en la resolución de diversas moléculas quirales, como los antiinflamatorios no estereoidales (como ibuprofeno y ketroprofeno), prostanglandinas, cefalosporinas, penicilinas, etc. También diversas investigaciones sobre el mecanismo de acción ha permitido la producción de algunos inhibidores de esta enzima para el tratamiento de la obesidad (Schmid et al. 1998).
En la industria de celulosa y papel las lipasas son utilizadas en diversos pretratamientos que se dan a la pulpa con la finalidad de mejorar la calidad y la productividad del
43
CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA proceso de producción de papel, por ejemplo mediante la eliminación de triglicéridos y ceras (Sigth and Mulhopadyay 2012).
En la industria de los bioenergéticos; la producción de biodiesel, biokeroseno y biolubricantes son de las aplicaciones más estudiadas de las triacilglicerol lipasas en los últimos años (Jaeger and Eggert 2002). En la tabla 6 se muestran las aplicaciones específicas de algunas triacilglicerol lipasas comerciales.
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CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Tabla 6
INDUSTRÍA
Aplicaciones industriales de algunas triacilglicerol lipasas (adaptado de Casas-Godoy et al. 2012). TRIACILGLICEROL LIPASA PROVENIENTE DE
APLICACIONES.
Industria alimenticia
Aspergillus niger, Aspergillus oryzae
Agentes saborizantes.
Diaria
Candida rugosa, Candida utilis, Candida antarctica, Agentes aromáticos en leche, queso y mantequilla. Penicillum roquefortii, Penicillum camembertii
Grasas y aceites
Páncreas porcino, Pseudomonas sp., Rhizomucor Sustituto de mantequillas, triglicéridos de bajas calorías, diglicéridos miehei, Rhizomucor javanicus, Rhizopus oryzae para aceites de cocina.
Detergentes
Acetinobacter sp, Aspergillus oryzae, Candida sp, Remoción de grasas. Producción de jabón, Líquido de limpieza para Chromobacterium sp, Pseudomona mendocina, lentes de contacto y pieles. Solventes para secado en seco y Pseudomona alcaligenes, Thermomyces lavavajillas. lanuginosus
Química fina
Achromobacter sp.
Biodegradación de aceites
Acinetobacter Rhodococcus sp.
Bioremediación
Acinetobacter calcoaceticus
Energía
Aspergillus niger, Candida rugosa, Candida Biodiesel, reducción de la viscosidad del biodiesel, lubricantes. antarctica, Thermomyces lanuginosus, Rhizomucor javanicus, Pseudomona camambertii, Pseudomona cepacia, Rhizopus oryzae, Rhizopus niveus
Polímeros
Rhizopus nodosus, Candida rugosa
Resolución de mezclas racémicas. sp.,
Mycobacterium
sp., Degradación de derrames de aceites, n-alcanos, hidrocarburos aromáticos e hidrocarburos aromáticos policíclicos. Remoción de capas de aceite.
Poliésteres biodegradables, lubricantes.
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CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA INDUSTRÍA
TRIACILGLICEROL LIPASA PROVENIENTE DE
Cosméticos y perfumes
Rhizomucor miehei, Candida rugosa, Candida Emoliente en cremas y aceites de baño. Cremas anti obesidad. antarctica B Emulsificantes, espumantes.
Industria de pulpa y papel
Candida rugosa, Pseudomonas sp.
Energía
Aspergillus niger, Candida rugosa, mellonella, Serratia marcescens.
Productos de panadería y confitería.
Thermomyces lanuginosus.
Biodegradación de aceites
Acinetobacter Rhodococcus sp.
Tratamiento de agua
Candida rugosa, Pseudomona Pseudomona aeruginosa, Yarrowia Rhizopus oryzae.
Farmacéutica
Alcaligenes sp., Arthrobacter sp. , Aspergillus sp., Bloques de construcción para farmacéuticos, agroquímicos y pesticidas. Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Candida Enfermedades digestivas antárctica, Candida rugosa, Chromobacterium viscosum, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas fluorescens, Lipasa pancreática de cerdo, Rhizopus delemar, Rhizomucor miehei, Saccharomyces cerevisae, Streptomyces sp.
sp.,
APLICACIONES.
Blanqueamiento de papel. Reducción de la contaminación del agua residual. Galleria Poliésteres biodegradables.
Emulsificantes, mayonesas y aderezos
Mycobacterium
sp., Degradación de derrames de aceites, alcanos, hidrocarburos aromáticos e hidrocarburos aromáticos policiclícos.
cepacia, Desgrasado, degradación de la carga orgánica., Limpieza de drenajes. lipolytica, Reacondicionamiento del agua. Tratamiento aguas residuales por medio de plantas.
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CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.2.5
MECÁNISMO CATÁLITICO.
La mayoría de las triacilglicerol lipasas hidrolizan enlaces éster en términos de su triada catalítica (Schmid et al. 1998), Como se observa en la figura 12, el mecanismo catalítico de las triacilglicerol lipasas comienza con una primera etapa de acilación. Esta etapa consiste en la transferencia de un protón entre el aspartato, la histidina y serina que tiene como consecuencia la activación del grupo hidroxilo de la serina catalítica. Mientras la“lid” (en el caso en el que la enzima la posea) provee el acceso del sustrato a la triada catalítica.
Free enzyme
Figura 12 Mecanismo catalítico de las triacilglicerol lipasas.
Posteriormente, el residuo hidroxilo de la serina (con su subsecuente incremento de la nucleofilicidad) ataca el grupo carbonilo del sustrato formando el primer intermediario tetraédrico con la carga negativa en el oxígeno del grupo carbonilo. La cavidad oxianión estabiliza, distribuye la carga y reduce el estado de energía del intermediario
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CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA mediante la formación de al menos dos puentes de hidrogeno. El segundo paso deacilación se lleva a cabo cuando el nucleófilo (por ejemplo, agua en el caso de hidrólisis) ataca a la enzima liberando el producto.
Desde el punto de vista cinético, las reacciones catalizadas por triacilglicerol lipasas, describen un modelo cinético descrito como Ping–Pong, Bi-Bi se muestra figura 13. P K1
EA
E+A B
B
K2
K-1
EAc K-2
K4
K3
EAcB K-3
E+Q K-4
K5
K-5
EB Figura 13 Mecanismo ping-pong bi-bi con inhibición competitiva por el sustrato nucleofílico B. (Chulalaksananukul et al. 1990).
Donde A es el primer sustrato, que se fija sobre la enzima para formar el complejo enzima-sustrato EA y liberar el primer producto producido P. El segundo sustrato nucleofílico B se fija sobre el complejo acilo- enzima EAc formando el complejo enzima-sustrato-acilo EAcB para posteriormente liberar el segundo producto Q y regenerar la enzima. En este esquema se muestra la relación de inhibición donde el sustrato nucleofílico B resulta ser un inhibidor competitivo, que forma un complejo inerte EB con la enzima, en una etapa exterior al mecanismo de formación del producto (Sandoval et al. 2002).
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CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.2.5.1 Mejoramiento de las condiciones de reacción En general el estudio del mejoramiento de las reacciones enzimáticas se puede realizar a partir de dos tecnologías las cuales son complementarias entre sí.
2.2.5.1.1
Ingeniería de solventes
La llamada ingeniería de solventes permite asegurar el correcto funcionamiento de la triacilglicerol lipasa mediante la modificación del microambiente que
rodea el
biocatalizador.
La solubilidad de los sustratos lipídicos aumenta en presencia de solventes orgánicos incrementando los porcentajes de conversión y
facilitando la recuperación del
producto de la cinética. Usualmente los solventes orgánicos pueden ayudar a mantener una actividad acuosa baja, lo que tiene como consecuencia la reducción de los impedimentos termodinámicos o barrera cinética de la reacción.
Un sistema bifásico consiste de dos fases macroscópicas, una fase acuosa y una fase orgánica. En la primera generalmente se encuentra la enzima disuelta y la fase orgánica está compuesta por uno o varios solventes no polares, donde se encuentran la mayoría de los sustratos. La presencia de estas dos fases suele ser ventajosa para la recuperación del catalizador y permite prevenir la inhibición por la presencia del solvente. En este caso, la reacción se lleva a cabo en la fase acuosa, pero siempre existe la transferencia de masa entre las fases (Krishna and Karanth 2002).
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CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Tomando en cuenta el coeficiente de partición (log P) de los solventes. Cuando estos tienen un log Poct ≥ 2 como el caso de diversos solventes típicamente empleados en biocatálisis tales como hexano, ciclohexano e isooctano generalmente los sustratos presentan mayor solubilidad.
Un medio libre de solvente se puede emplear altas concentraciones de sustrato incrementando de esta forma la producción la volumétrica, lo que junto con una mayor facilidad de recuperación de los productos lo hace especialmente atractivo para la industria (Sandoval et al. 2002; Yahya R.M. et al. 1998). Sin embargo, la desventaja de este sistema es la transferencia de masa debido a la alta viscosidad de los sustratos de tipo lipídicos.
Un sistema bifásico consiste de dos fases macroscópicas, una fase acuosa y una fase orgánica. En la primera generalmente se encuentra la enzima disuelta y la fase orgánica está compuesta por uno o varios solventes no polares, donde se encuentran la mayoría de los sustratos. La presencia de estas dos fases suele ser ventajosa para la recuperación del catalizador y permite prevenir la inhibición por la presencia del solvente. En este caso, la reacción se lleva a cabo en la fase acuosa, pero siempre existe la transferencia de masa entre las fases (Krishna and Karanth 2002).
2.2.5.1.2
Ingeniería del biocatalizador
El segundo de estos enfoques es la denominada ingeniería del biocatalizador, la cual permite mediante la modificación de la estructura tridimensional de la proteína con el
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CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA objetivo de potencializar sus propiedades catalíticas. Un ejemplo de estas técnicas para la optimización de las propiedades de los biocatalizadores son diversas técnicas moleculares como la mutagenesis dirigida y aleatoria, las cuales son ampliamente utilizadas para incrementar la termoestabilidad de triacilglcierol lipasas.
Así mismo, uno de los métodos más empleados para mejorar las propiedades del biocatalizador es la inmovilización que consiste en confinar la enzima, en este caso la triacilglicerol lipasa; en una porción específica del espacio, dando lugar a derivados insolubles cuyas propiedades como estabilidad y posibilidad de reciclaje incrementan las propiedades catalíticas de la enzima (Sheldon 2007).
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CAPITULO 1: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.3: La lipasa de Carica papaya
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2.3 LA LIPASA DE Carica papaya Una de las lipasas/esterasas más interesantes provenientes de plantas es la actividad lipolítica presente en el látex de Carica papaya, conocida en la mayoría de la literatura como la lipasa de Carica papaya (Giordani et al. 1991, Caro et al. 2004, Pinyaphong and Phutrakul 2009, Rivera et al. 2012).
Debido a la complejidad de la estructura polimérica del látex de Carica papaya el aislamiento de proteínas sobre todo de la fracción del látex insoluble en agua; como es el caso de la mayoría de la actividad lipolítica, es un proceso complejo. Por lo que se considera que la lipasa de Carica papaya como una enzima naturalmente inmovilizada (Abdelkafi et al. 2011; Giordani et al. 1991).
En diversos esfuerzos que se han realizado para aislar la actividad lipolítica de Carica papaya el empleo de detergentes como NLS (N- Lauroylsarcosine, detergente aniónico) (Rivera et al. 2012) y CHAPS (detergente zwitteriónico) (Abdelkafi et al. 2009b) permite la extracción de una fracción de la actividad sobre cadenas cortas en hidrólisis de triglicéridos.
Actualmente, se ha demostrado que la actividad lipolítica de látex de papaya en realidad está constituida de una mezcla de al menos tres enzimas lipolíticas cuyas características no han sido completamente elucidadas. Una esterasa (Abdelkafi et al. 2009b), una lipasa (Dhouib et al. 2011) y una fosfolipasa (Abdelkafi et al. 2012).
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Por otro lado, uno de los atractivos principales para el estudio de las propiedades de la actividad lipolítica del látex de Carica papaya es su eficiencia en reacciones de síntesis e hidrólisis catalizadas por lipasas ha sido ampliamente demostrada en diversos ramos como la producción de lípidos estructurados, modificación de lípidos y resolución de compuestos quirales de interés farmacéutico.
2.3.1
APLICACIONES DE LA LIPASA DE Carica papaya
2.3.1.1 Aplicaciones en la industria alimenticia La manteca de cacao tiene diversas aplicaciones, la más importante es la producción de chocolate; sin embargo gracias a que su punto de fusión es alrededor de la temperatura del cuerpo humano también puede ser empleada como matriz para supositorios. A este respecto, el látex de Carica papaya ha sido empleado con éxito en la producción de sustitutos de este triglicerido obteniendo propiedades fisicoquímicas similares a las de la manteca de cacao mediante la transesterificación de aceite palma y diferentes donadores del acilo (metil estearato, etil estearato y ácido esteárico) (Pinyaphong and Phutrakul 2009).
Por otro lado, un reto para la industria alimenticia es la producción de una clase especial de lípidos estructurados; el lípido análogo a la leche materna humana, debido a que el uso de aceites vegetales o lípidos de leche de bovino provoca deficiencia de calcio y adsorción de ácidos grasos en infantes.
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En este rubro se ha demostrado la eficacia del látex de papaya alcanzando porcentajes de incorporación (22.1% mol) comparables a los de lipasas comerciales en la acidólisis de ácido palmítico con ácido oleico o PUFA omega 3 (Tecelao et al. 2012). Así mismo, Mukherjee y Kiewitt, estudiaron el enriquecimiento/ fortificación de la leche materna humana
mediante la transesterificación de tripalmitina con ácidos grasos
poliinsaturados de aceite de colza (Mukherjee and Kiewitt 1998).
2.3.1.2 Lípidos estructurados La modificación de la estructura de diferentes lípidos; principalmente triglicéridos con el objetivo de incrementar sus propiedades nutricionales ha sido objeto de un gran número de estudios; así mismo la producción de lípidos estructurados es una de las aplicaciones más significativas de la lipasa de Carica papaya donde se demostró que la incorporación de estos ácidos grasos ocurren en las posiciones sn-1, sn-3, fortaleciendo que el látex de papaya presenta una regioselectividad sn-1, sn-3 como lo describen (Villeneuve et al. 1995).
Las grasas de origen animal en general contienen una mayor cantidad de ácidos grasos saturados en comparación con los aceites vegetales, lo que aumenta los niveles de colesterol y los riesgos de enfermedades cardiovasculares. Por lo que la reducción de los niveles de ácidos grasos saturados es uno de los objetivos principales de la producción de lípidos estructurales. En la transformación de grasa de pollo, se obtuvo una reducción de un 23% la presencia de ácidos grasos insaturados evaluando la reacción de transesterificación con ácido caprilico. (Lee and Foglia 2000).
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Los lípidos estructurados de bajo peso molecular se caracterizan por la presencia de residuos de ácidos grasos de cadena corta y ácidos grasos de cadena larga en una misma cadena de triglicéridos con aplicaciones en el campo de nutrición. Como el caso de la interesterificación de triacetina y aceite refinado de soya en la cual se obtuvo un 60% de conversión con el látex de papaya (Mangos et al. 1999).
En la interesterificación de tripalmitina con etil esteres de diferente largo de cadena (Gandhi and Mukherjee 2001) reportaron preferencia por cadenas medianas y largas, además de esterificarse de forma preferencial en la posición hidroxilo primaria y hasta 30% de incorporación.
En la síntesis de alquil esteres de trilaurina con alcoholes alifáticos secos en un medio libre de solvente se optimizaron los parámetros de reacción mediante la el estudio del efecto de diversos parámetros tales como la actividad de agua, temperatura, cantidad de biocatalizador, tiempo de reacción, radio molar (alcohol/ triglicérido) y tipo de alcohol (Steinke et al. 2000).
Así mismo en la sustitución de diversos aceites de naturales, el aceite de copra fue el más eficaz tanto en la reacción de alcoholisis como en la esterificación de los correspondientes ácidos grasos con n-butanol (Caro et al. 2004).
Con el aceite de pescado obtenido a partir de partes de desecho se ha probado en sistemas libres de solvente y con solvente, con la metanolisis de este aceite se
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obtuvieron propiedades similares a las obtenidas para el biodiesel obtenidas con el aceite de cocina reciclado (Pinyaphong P. 2011).
Por otro lado diversos tratamientos han logrado mejorar la eficacia catalítica del látex de papaya en diversas reacciones como la metanolisis de trioleina donde un pretratamiento consistente en lavados con isopropanol mejoran la capacidad catálitica de 10.8 a 63.6% de conversión.
2.3.1.3 Resolución de moléculas quirales Los antiinflamatorios no esteroideos (abreviado AINE) son un grupo químicamente heterogéneo de fármacos principalmente antiinflamatorios, analgésicos y antipiréticos, por lo que reducen los síntomas de la inflamación, el dolor y la fiebre respectivamente. Todos ejercen sus efectos por acción de la inhibición de la enzima ciclooxigenasa.
La lipasa de Carica papaya ha sido empleada para la resolución de diversos derivados de naproxeno. En la reacción de hidrólisis en presencia de análogos de naproxeno, se presenta preferencia por el enantiómero (S) cuando este se encuentra sustituido por un metilo e hidroxilo (Chen and Tsai 2005; Ng and Tsai 2005).
Cuando se emplea 2, 2,2-trifluoruro es usado la preferencia es por el éster del enantiómero (R) con una enantioselectividad menor comparada con la de otros sus sustituyentes como el cloro en el cual se obtiene un valor de enantioselectividad de 46 (Wang et al. 2007). La sustitución del metil éster de (R, S)-2-fluoro naproxeno por el
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metil éster del (R, S)-2-fluoro-2-(4-metoxifenil) propionato así mismo mantiene la preferencia por el enantiómero (R).
En la esterificación selectiva en solventes anhidros la lipasa de Carica papaya, los ácidos cloroxipropionicos y n-propanol, n-butanol, n-hexanol y trimetilmetanol como donadores de acilo se encontró enantiopreferencia por el enantiómero (R) y un incremento en el % de conversión de acuerdo con el aumento en la longitud de la cadena del alcohol empleado (Cheng and Tsai 2004).
Así mismo en este grupo de trabajo realizó estudios con una fracción parcialmente purificada (eliminando enzimas solubles en agua) para el análisis del efecto de la posición del sustituyente en la reacción donde el valor más alto de valor enantiomérico se obtuvo en la posición 4, mientras en la posición 3 se obtiene un valor enantiomérico 85% menor (Cheng and Tsai 2007).
Otra clase de compuestos quirales interesantes son los aminoácidos no proteicos homoquirales, los cuales funcionan como bloques para la síntesis de aminoácidos biológicamente activos. En la resolución de N-Z- DL-amino ácido 2, 2, 2-trifluoroetil esteres la lipasa de Carica papaya presenta preferencia por el enantiómero L, en la reacción de transesterificación con metanol como donador de acilo y ciclohexano como solvente, se alcanzaron valores enantioméricos mayores a 200 con nueve de los diez aminoácidos empleados como sustratos (Miyazawa et al. 2005).
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2.3.1.4 Otras aplicaciones La policaprolactona es un biopolímero con aplicaciones importantes en medicina como un biomaterial implantable. En particular, especialmente en dispositivos implantables de largo plazo, debido a lo lento de su degradación en comparación con otros polímeros biodegradables. Asimismo tiene aplicación como dispositivo para suministro de fármacos y suturas quirúrgicas. A este respecto, el látex de Carica papaya presenta capacidades catalíticas comparables a aquellas de algunas lipasas comerciales (Sandoval et al. 2010).
Así mismo la lipasa de Carica papaya látex ha sido empleada en la síntesis de terpenos, mediante transesterificación y esterificación. En la esterificación de fitoestanol y sitoestanol con ácido oleico en solventes orgánicos. Sin embargo usando ácido láurico como donador de acilo, se alcanzaron bajos niveles de esterificación. Así mismo, el efecto del largo de cadena y de la posición de la insaturación de los donadores y aceptores de acilo han sido descritos (You et al. 2011).
Los ésteres de ceras tienen diversas aplicaciones en la industria farmacéutica, cosmética y lubricantes, por lo que la preparación de sus análogos son de interés comercial. La producción de estos análogos de esteres de ceras catalizado por la lipasa de Carica papaya ha sido descrita para la reacción de esterificación del ácido 2oxoglutarico con alcoholes de diferente largo de cadena, las mejores condiciones de reacción fueron 55°C utilizando hexano, además en la acetilados usando étil acetato como donador de acilo durante 96 h a 55°C (Quintana et al. 2011).
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En el tratamiento de la insuficiencia pancreática se han estado diversas alternativas a la lipasa pancreática humana, una de las más interesantes es la lipasa de Carica papaya ya que es capaz de trabajar a pH 6 y en presencia de sales biliares, además de presentar una regio selectividad similar a la lipasa pancreática humana (Abdelkafi et al. 2009a).
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2.4: Expresión heterológa de triacilglicerol lipasas
61
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.4 EXPRESIÓN HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS. La expresión heteróloga de una proteína se refiere a la expresión de un gen en una especie distinta cuyo ADN ha sido modificado. Este proceso inicia con la identificación de una secuencia de ADN de interés con el fin de propagarlo en otro organismo que carece de la secuencia. De esta forma, se pueden producir mayores cantidades de la proteína codificada por el gen de interés. El procedimiento general consiste en 4 pasos principales.
1. Selección del gen de interés. 2. Obtención del plásmido (figura 14). 3. Clonación en el vector de expresión. 4. Expresión en un huésped adecuado.
Figura 14 Diagrama esquemático de un plásmido
Existe una gran variedad de sistemas de expresión heteróloga de proteínas el clásico sistema bacteriano, levaduras, células vegetales, células de insecto y células animales.
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CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Sin embargo; por su facilidad de uso, capacidad de crecimiento, bajo costo de cultivo y gran disponibilidad de vectores el sistema más usado para la expresión heteróloga son las células procariontes. A pesar de ello, la expresión de proteínas en sistemas eucariontes permite la obtención de una proteína de mayor calidad gracias a las modificaciones post-traduccionales que son llevadas a cabo por este tipo de sistemas y que en algunas ocasiones son necesarias para el correcto plegamiento de la proteína.
Con base en lo anterior podemos decir que no existe un huésped universal, que funcione en el caso de todas las proteínas, por lo que su selección es una de las etapas más importantes para la producción de heteróloga de proteínas recombinantes; en la tabla 7 se muestran las características generales de los diversos sistemas de expresión.
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CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Tabla 7 Características de los diferentes sistemas de expresión de proteínas.
CARACTERÍSTICAS
Crecimiento celular Complejidad del medio crecimiento Costo del medio de crecimiento Nivel de expresión Secreción Plegado de proteínas
SISTEMA DE EXPRESIÓN Células de insecto Células vegetal Lento Lento Complejo Simple
Bacterias
Levaduras
Rápido Simple
Rápido Simple
Bajo
Bajo
Alto
Bajo
Alto
Alto No, secreción periplásmica Usualmente se requiere renaturalización
Bajo a alto Excreción al medio
Bajo a alto Excreción al medio
Bajo a alto Excreción en el medio
Bajo a moderado Excreción en el medio
El algunos casos se Plegado correcto requiere renaturalización
MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES
de
origen Células de animal Lento Complejo
origen
Plegado correcto
SISTEMA DE EXPRESIÓN Bacterias
Levaduras
Células de insecto
N-glicosilación
No
Altamente manosilada
O-glicosilación Fosforilación Acetilación Acilación ϒ-Carboxilaxión
No No No No No
Si Si Si Si No
Simple, sialico Si Si Si Si No
Sin
Células vegetal ácido Simple, sialico Si Si Si Si Si
de
origen Células de animal sin ácido Compleja
origen
Si Si Si Si Si
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CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Otro de los factores principales a considerar para la selección del huésped es la clase de promotores disponibles, ya es un factor clave en la eficiencia de la transcripción del gen de interés. Los promotores constitutivos son ampliamente utilizados ya que facilitan el aislamiento del producto final y no se requieren estrategias de fermentación complejas o el uso de inductores complejos.
En cambio el uso de vectores inducibles permite la disociación del crecimiento celular de la expresión del gen de interés minimizando la selección de células mutantes que no expresan el gen de interés. En la tabla 8 se muestran algunos promotores constitutivos e inducibles de los diferentes sistemas de expresión antes mencionados.
Tabla 8
Diversos inductores utilizados en diversos sistemas microbianos.
ESPECIE
VECTOR CONSTITUTIVO
VECTOR INDUCTIBLE
S. cervisiae.
GAPDH, PGK
GAL1-10, ADH2
K. lactis.
PGK
LAC4,ADH4
Y. lipolytica
TEF
POX
P. stipitis.
XYL1
P. pastoris
AOX1
H polymorpha.
MOX
C. boidinii.
AOD1
P. methanolica
AUG1
Así mismo, la cantidad necesaria a obtener de proteína de interés dependerá de su aplicación oscilando desde miligramos en el caso de la caracterización funcional o estructural a kilogramos en el caso de aplicaciones farmacéuticas. En el caso específico de triacilglicerol lipasas la producción heteróloga de esta clase de enzimas es una de
65
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA las estrategias más promisorias para la incrementar la productividad de los diferentes bioprocesos, la reducción de costos y efectuar estudios estructurales de proteínas con el objetivo de implementar nuevas aplicaciones industriales de estas enzimas.
2.4.1
EXPRESIÓN HETEROLOGA DE LIPASAS EN SISTEMAS
MICROBIANOS
2.4.1.1 Sistemas de expresión bacterianos Como se mencionó anteriormente, hasta la fecha Escherichia coli es el sistema de expresión más utilizado, sobre todo cuando las modificaciones post traduccionales no son esenciales para el producto, además de contar con una amplia gama de promotores. Además que existe un amplio conocimiento de la genética y fisiología de este sistema; ya que su genoma se encuentra completamente secuenciado.
Una de las principales ventajas de la expresión en E. coli es su alta recuperación (hasta un 30% sin base a la proteína total).
Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente E. coli no tiene capacidad para llevar a acabo glicosilaciones, acilación de los ácidos grasos, fosforilaciones o formación de enlaces disulfuro comúnmente requeridos para el correcto plegamiento de la proteína, así como para sus características funcionales sobre todo en el caso de enzimas.
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CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA En este sistema bacteriano, las proteínas pueden ser expresadas en diversas fracciones. La proteína expresada puede acumularse en el periplasma o en el medio extracelular facilitando el proceso de obtención y purificación de la proteína ya que no es necesario un tratamiento posterior para su obtención.
No obstante, en algunos casos la proteína queda atrapada en cuerpos de inclusión lo que le confiere protección a la proteína contra la proteólisis, no obstante los subsecuentes pasos requeridos para la recuperación de la proteína (como la solubilización y replegamiento) disminuyen la obtención de producto e incrementa el costo del proceso.
A pesar de que este sistema de expresión usualmente no es el más adecuado en el caso de lipasas de organismos superiores (células eucariontes, una gran cantidad de lipasas han sido expresadas en este sistema. Algunos ejemplos de lipasas expresadas en E coli se muestran en la tabla 9. Tabla 9
Triacilglicerol lipasas expresadas en E. coli.
ENZIMA
PLÁSMIDO UTILIZADO
REFERENCIA
Candida antarctica B Rhizopus oryzae
pET22b(+), pET41a (+) pET22b (+) pET11, pET15, pET22
(Hong et al. 2012; Larsen et al. 2008) (Di Lorenzo et al. 2005)
Staphylococcus aureous
pSAL3, pET14b, pOPT
(Horchani et al. 2009)
Burkholderia cepacia
pDsbA, pDsbC, pENTR, Pehly
(Narayanan et al. 2011)
Pseudomonas fluorescens
pET28b
(Zhang et al. 2009)
Geobacillus thermoleovorans
pET28a, PET3b
(Quintana-Castro et al. 2009)
67
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Otro de los sistemas bacterianos que han sido utilizados para la expresión heteróloga de lipasas es Bacillus subtilis que presenta la ventaja se de obtener una rápida transformación con diferentes bacteriófagos y plásmidos, además de excreta las proteínas directamente al medio con altas densidades de crecimiento en un medio simple y barato.
No obstante, debido a algunas de sus desventajas como la inestabilidad de los plásmidos, reducido nivel de expresión y degradación por la presencia de proteasas, han hecho que este sistema no sea tan socorrido en comparación con E. Coli, ya que solo algunas triacilglicerol lipasas como la lipasa de Acinetobacter sp. (Han et al. 2003) han sido expresadas empleando Bacillus subtilis como sistema de expresión.
2.4.1.2 Levaduras En general, las levaduras al ser un organismo unicelular como sistema de expresión mantienen las ventajas de los sistemas de expresión de bacterianos como la facilidad de manipulación y capacidad de crecimiento (Valero 2012). Además de llevar a cabo modificaciones postraduccionales en algunas ocasiones necesarias para el correcto plegamiento de la proteína. Los sistemas de expresión más usados en levaduras se indican en la tabla 10.
68
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Tabla 10
Diversas levaduras utilizadas como sistema de expresión de proteínas (Porro et al. 2005).
LEVADURAS NO METALOTROFÍCAS
LEVADURAS METALOTROFICAS
S. cervisiae., P. stipitis.
H. polymorpha, P. pastoris.
K. lactis., Y. lipolytica
C. boidinii., S. occidentalis.
Z. rouxii., Z. ballii.
P. methanolica.
Saccharomyces cerevisiae es uno de los sistemas más utilizado debido al amplio conocimiento existente a nivel genético y molecular llevándola a ser el sistema eucariótico mejor caracterizado en nuestros días.
Lipasas como la lipasa de Lip2 de Yarrowia lipolytica (Darvishi 2012; Shockey et al. 2011), Baccillus subtilis Lipase A (Mormeneo et al. 2008), Lip 7 y Lip 8 de Yarrowia lipolytica (Liu et al. 2010) y Rhizopus miehei (Zhang et al. 2008). Sin embargo tiene las desventajas de tener bajos niveles de producción, baja estabilidad de los plásmidos, hiperglicosilación y bajo nivel de secreción que han hecho que se busquen alternativas a este sistema de expresión.
2.4.1.2.1
Pichia pastoris
Pichia pastoris es una levadura de células esféricas, elípticas u ovides. Una de las características principales de esta levadura es su capacidad de procesar metanol como fuente de carbono.
69
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Como sistema de expresión Pichia pastoris alcanza nivel de expresión de hasta 30% de la proteína total y cuenta con diferentes tipos de promotores que permiten la transformación. La mayoría de los promotores disponibles para este sistema de expresión se encuentran bajo el control de los genes alcohol deshidrogenasa 1 y 1 (OAX1 y OAX2) o gliceraldehido 3- fosfato deshidrogenasa; algunos de estos plásmidos se muestran en la figura 15.
a)
pPICZ
b) pGAPZ
Figura 15 Plásmidos más empleados para la expresión de proteínas recombinantes en P. pastoris.
Adicionalmente, una de las principales ventajas del empleo de Pichia pastoris como sistema de expresión es la reducida cantidad de proteínas extracelulares presentes de forma natural en el medio (Valero 2012). Por lo que P. pastoris es uno de los sistemas de expresión más utilizados en el caso de triacilglicerol lipasas, algunos ejemplos se encuentran en la tabla 11.
70
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Tabla 11
Expresión heteróloga de triacilglicerol lipasas en Pichia pastoris.
ENZIMA
VECTOR UTILIZADO
REFERENCIA
Candida rugosa Lip2
OAX1
(Ferrer et al. 2009)
Rhizopus oryzae
PAOX
(Arnau et al. 2011)
Penicillium cyclopium
Ppic
(Tan et al. 2011)
Yarrowia lipolytica Lip2
AOX1, pGAP
(Wang et al. 2012)
Candida antarctica B
PGAPzαB
Blukordehia cepacia
pGAPZα, Ppic
(Larsen et al. 2008; Rotticci-Mulder et al. 2001; Su et al. 2010) (Jia et al. 2010)
Candida antarctica A
pGAP
(Yang et al. 2012)
Yarrowia lipolytica Lip4
pPIC
(Zhao et al. 2011)
Yarrowia lipolytica Lip5
pPIC
(Zhao et al. 2011)
Geotrichum sp.
pPICz
(Pan et al. 2012)
Rhizopus chinensis
PIC9K
(Wu et al. 2011)
Thermomyces lanuginosus
OAX1
(Zheng et al. 2011)
No obstante el nivel de transformación (capacidad de llevar a cabo la inserción del gen de interés en el sistema) de P. pastoris es bajo, además de presentar una gran cantidad de células sin transformar. Un sistema de expresión interesante y el cual hasta en los últimos años está siendo explotado con más de cuarenta proteínas expresadas de forma funcional este sistema (Madzak et al. 2004b), es la levadura no convencional Yarrowia lipolytica.
2.4.1.2.2
Yarrowia lipolytica.
Yarrowia lipolytica es una levadura no convencional de tipo dimórfico capaz de crecer en sustratos de tipo lipídico y cuyo genoma se encuentra secuenciado. Yarrowia lipolytica es un sistema de expresión versátil gracias al desarrollo de promotores
71
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA eficientes, el desarrollo de un método de integración no homóloga y el uso de marcadores de selección defectivos como el caso de URA3 y LEU2. (Madzak et al. 2004a; Muller et al. 1998). Algunos de los plásmidos más empleados se muestran en la figura 16. HindIII (7 522)
hp4d
Ura3d1
Ura3d1 HindIII (557 )
pPOX2 e ntier
LIP2 HindIII (1 494)
zéta NotI (5843)
JMP8
zéta
7 528 b p
NotI (4245)
JMP60 jmp60 lip2 5934 bp
EcoRI (1637 )
HindIII (21 55)
zéta NotI (2035)
LIP2 EcoRI (3235)
KanR
Kan R
zéta NotI (3633)
TEF I-SceI (3941 )
Ura3d1
zé ta
Am pR
LoxR LIP2
EcoRI (3886)
pKS LPR Hygro rc
jmp61 JMP61
4651 bp
5898 bp
HygR NotI (4204)
zé ta
NotI (1994) I-SceI (2239)
KanR
LoxP EcoRI (2283)
Figura 16 Plásmidos usados para la clonación en Yarrowia lipolytica (ver referencias en Tabla 2.3.6).
Algunos ejemplos de las triacilglicerol lipasas expresadas en se muestran en la tabla 12.
Tabla 12 Expresión heteróloga de tricacilglicerol lipasas en Yarrowia lipolytica.
ENZIMA
PROMOTOR UTILIZADO
REFERENCIA
Candida antarctica B
POX
(Emond et al. 2010)
Candida rugosa Lip1
POX
(Piamtongkam et al. 2011)
Candida rugosa Lip3
POX
(Piamtongkam et al. 2011)
Candida rugosa Lip4
POX
(Piamtongkam et al. 2011)
Rhizopus oryzae
XPR2
(Yuzbashev et al. 2012)
Thermomyces lanuginosus
XPR2, TEF
(Muller et al. 1998)
72
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.4.2
EXPRESIÓN
HETEROLOGA
DE
TRIACILGLICEROL
LIPASAS EN PLANTAS Uno de los métodos más usados para la obtención de plantas transgénicas es la expresión transitoria (limitada a tejidos específicos de la planta). Por medio de los llamados vectores provirales. Esta metodología combina las ventajas de tres sistemas de expresión, la velocidad y nivel de expresión de los virus, la eficiencia de infección de Agrobacterium y la capacidad de llevar a cabo modificaciones postraducccionales de las plantas (Gleba et al. 2007).
Este sistema funciona mediante la introducción de un ADN foráneo en la planta gracias a presencia de una la infección bacteriana (principalmente utilizando Agrobacterium tumefaciens) que lleva a cabo la transmisión del ADN de la proteína de interés a la planta. (Gleba et al. 2004). Dentro de las ventajas que presenta es la producción de gran cantidad de la proteína de interés, alcanzado hasta un 80% de la proteína de interés en relación con la proteína total (Gleba et al. 2007).
El proceso consiste en la introducción del virus que infecta a la planta mediante la bacteria Agrobacterium. El virus puede ser introducido como un virus completo o en forma de virus deconstruido donde solo al interior de la célula vegetal el plásmido que forma el virus es ensamblado, las ventajas de ambos sistemas se presentan en la tabla 13.
73
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Tabla 13 Diferencias entre las funciones de un virus completo y un virus fragmentado
VIRUS COMPLETO
CONTROL BAJO VIRUS DECONSTRUIDO
Infección al huésped Introducida por Agrobacterium El amplicón se libera del cromosoma huésped, su ingeniería es un proceso químicamente inducible usando operones regulados por bacterias. Amplificación del Puede ser regulado por virus que no provienen de plantas. Puede ser gen provisto por la polimerasa en trans de un gen transgénico o un virus de apoyo. Movimiento de Provisto en forma trans por un huésped transgénico expresando la célula a célula proteína o el virus Movimiento Provisto en forma trans por un huésped transgénico expresando la sistémico proteína o el virus. No es necesario si el amplicon es liberado del cromosoma huésped. Supresión del virus Provisto por el gen transgénico o silenciamiento
(Gleba et al. 2004).
La transformación de la planta se lleva a cabo mediante la introducción de la bacteria transformada a los espacios intercelulares de la planta (procedimiento de infiltración). Desde allí la bacteria transfiere a las células de la planta el plásmido que lleva el segmento del ADN con el gen de interés que se integra a una zona del genoma de la planta y posteriormente se replica.
2.4.2.1 Estrategia de clonación virus deconstruidos En el caso de virus deconstruidos, este tipo de vectores pro-virales están adaptados para llevar a cabo la clonación mediante sitios de reconocimiento BSA I, esta enzima corta fuera del sitio de reconocimiento, permitiendo que se lleven a cabo fusiones exactas. De esta forma agregando los sitios al gen permitiendo así la creación de un nuevo plásmido (figura 17).
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CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Figura 17 Esquema del módulo formado para la expresión a partir de vectores provirales
En general la estrategia para la clonación consiste en la construcción de un módulo completo en el núcleo celular donde se reconstruye el virus. El virus deconstruido está formado por dos módulos y la integrasa en una tercera fracción (figura 18).
Figura 18 Ejemplo de los módulos para la clonación vía vectores provirales.
La integración de estos provectores se puede llevar a cabo de 3 formas distintas 1. Los genes de interés subclonados en el provector 3’ deben contener su propio codón de inicio mientras el provector 5’ si están diseñados para la expresión en citosol, el codón ATG no es necesario. 2. Si los dos provectores van a ser combinados para la expresión en apoplastos el codón de inicio (ATG) proviene del provector 5’. Por lo que el provector 3’
75
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA contiene el gen sin péptido señal y sin codón ATG. En este caso la conjunción del final del provector 3’ formará el último aminoácido del péptido señal. 3. Si la expresión va a ser en el citosol se puede utilizar su propio péptido señal y codón ATG en el provector 3’ y combinarlo para su expresión con el provector 5’sin péptido señal.
La integración de los dos provectores y la integrasa se lleva a cabo en el núcleo de la planta formando una solo módulo.
2.4.2.2 Agroinfiltración
y
clonación
en
Nicotiana
benthamiana En el caso del empleo de vectores provirales, el gen que codifica para la proteína de interés es introducido a la célula vegetal mediante infección bacteriana en un procedimiento conocido como infiltración.
La bacteria más utilizada para este sistema es Agrobacterium tumefaciens. Para este tipo de ensayos las plantas que serán el vector de expresión en este caso Nicotiana benthamiana y Agrobacterium crecen de forma independiente. Una vez que ambos completan su etapa de crecimiento
la bacteria es introducida en los espacios
intersticiales de la planta mediante vacío o pequeñas incisiones. Posterior a esto se lleva cabo la incubación de las plantas de 5 a 15 días para permitir el desarrollo de la infección y por lo tanto la expresión de la proteína de interés, verificando su evolución, para finalmente recolectar el tejido y extraer la proteína. La estrategia general para la
76
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA expresión heteróloga de proteínas en plantas vía vectores pro-virales ilustrada en la figura 19.
Figura 19 Estrategia general para la expresión heteróloga de proteínas en plantas vía vectores provirales
Hasta la fecha el vector de expresión más utilizado en el caso de plantas es tabaco (Nicotiana tabaccum). No obstante la expresión heteróloga en este tipo de sistemas ha sido escasamente utilizado para la expresión de lipasas; esto en gran medida debido a que el periodo para la obtención de la proteína recombinante es más largo, sin embargo es una buena alternativa para la clonación de lipasas de plantas ya que probablemente presenten el mismo tipo de modificaciones post traduccionales y por lo tanto existe una mayor posibilidad de obtener una proteína funcional.
77
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.5 Bibliografía
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CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.5 BIBLIOGRAFÍA
Abdelkafi S, Abousalham A, Fendri I, Ogata H, Barouh N, Fouquet B, Scheirlinckx F, Villeneuve P, Carriere F. 2012. Identification of a new phospholipase D in Carica papaya latex. Gene 499(2):243-249. Abdelkafi S, Barouh N, Fouquet B, Fendri I, Pina M, Scheirlinckx F, Villeneuve P, Carriere F. 2011. Carica papaya Lipase: A Naturally Immobilized Enzyme with Interesting Biochemical Properties. Plant Foods for Human Nutrition 66(1):34-40. Abdelkafi S, Fouquet B, Barouh N, Durner S, Pina M, Scheirlinckx F, Villeneuvec P, Carriera F. 2009a. In vitro comparisons between Carica papaya and pancreatic lipases during test meal lipolysis: Potential use of CPL in enzyme replacement therapy. Food Chemistry 115(2):488-494. Abdelkafi S, Ogata H, Barouh N, Fouquet B, Lebrun R, Pina M, Scheirlinckx F, Villeneuve P, Carriere F. 2009b. Identification and biochemical characterization of a GDSL-motif carboxylester hydrolase from Carica papaya latex. Biochimica Et Biophysica ActaMolecular and Cell Biology of Lipids 1791(11):1048-1056. Abigor RD, Uadia PO, Foglia TA, Haas MJ, Scott K, Savary BJ. 2002. Partial purification and properties of lipase from germinating seeds of Jatropha curcas L. Journal of the American Oil Chemists Society 79(11):1123-1126. Akoh CC, Lee GC, Liaw YC, Huang TH, Shaw JF. 2004. GDSL family of serine esterases/lipases. Progress in Lipid Research 43(6):534-552. Ali YB, Verger R, Abousalham A. 2012. Lipases or Esterases: Does It Really Matter? Toward a New Bio-Physico-Chemical Classification. In: Sandoval G, editor. Lipases and Phospholipases: Humana Press. p 31-51.
79
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Aloulou A, Rodriguez JA, Puccinelli D, Mouz N, Leclaire J, Leblond Y, Carriere F. 2007. Purification and biochemical characterization of the LIP2 lipase from Yarrowia lipolytica. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology of Lipids 1771(2):228-237. Arnau C, Casas C, Valero F. 2011. The effect of glycerol mixed substrate on the heterologous production of a Rhizopus oryzae lipase in Pichia pastoris system. Biochemical Engineering Journal 57:30-37. Barros M, Fleuri LF, Macedo GA 2010 Seed lipases: sources, applications and properties – a review. Braz J Chem Eng 27:15–29 Bhardwaj K, Raju A, Rajasekharan R. 2001. Identification, purification, and characterization of a thermally stable lipase from rice bran. A new member of the (Phospho) lipase family. Plant Physiology 127(4):1728-1738. Cambon E, Rodriguez JA, Pina M, Arondel V, Carriere F, Turon F, Ruales J, Villeneuve P. 2008. Characterization of typo-, regio-, and stereo-selectivities of babaco latex lipase in aqueous and organic media. Biotechnology Letters 30(4):769-774. Campillo-Alvarado, Gonzalo Tovar-Miranda, Ricardo (2013) Recent advances and applications of the lipolytic activity of Carica papaya latex. J Mol Catal B-Enzym 90:4960. Caro Y, Turon F, Villeneuve P, Pina M, Graille J. 2004. Enzymatic synthesis of mediumchain triacylglycerols by alcoholysis interesterification of copra oil using a crude papain lipase preparation. European Journal of Lipid Science and Technology 106(8):503-512.
80
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Casas-Godoy L, Duquesne S, Bordes F, Sandoval G, Marty A. 2012. Lipases: an overview. In: Sandoval G, editor. Methods in molecular biology, Lipases and phospholipases. p 3-30. Chen CC, Tsai SW. 2005. Carica papaya lipase: a novel biocatalyst for the enantioselective hydrolysis of (R,S)-naproxen 2,2,2-trifluoroethyl ester. Enzyme and Microbial Technology 36(1):127-132. Chen CC, Tsai SW, Villeneuve P. 2005. Enantioselective hydrolysis of (R,S)-naproxen 2,2,2-trifluoroethyl ester in water-saturated solvents via lipases from Carica pentagona Heilborn and Carica papaya. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic 34(1-6):51-57. Cheng Y-C, Tsai S-W. 2007. Carica papaya lipase: An effective biocatalyst for esterification
resolution
of
(RS)-2-(chlorophenoxy)propionic
acid.
Biochemical
Engineering Journal 35(3):318-324. Cheng
YC,
Tsai
SW.
2004.
Enantioselective
esterification
of
(RS)-2-(4-
chlorophenoxy)propionic acid via Carica papaya lipase in organic solvents. Tetrahedron-Asymmetry 15(18):2917-2920. Chulalaksananukul W, Condoret JS, Delorme P, Willemot RM. 1990. Kinetic-study of esterification by immobilized lipase in n-hexane. FEBS Letters 276(1-2):181-184. Dalal S, Singh PK, Raghava S, Rawat S, Gupta MN. 2008. Purification and properties of the alkaline lipase from Burkholderia cepacia ATCC 25609. Biotechnology and Applied Biochemistry 51:23-31. Darvishi F. 2012. Expression of native and mutant extracellular lipases fromYarrowia lipolytica in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Biotechnology 5(5):634-641.
81
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Dhouib R, Laroche-Traineau J, Shaha R, Lapaillerie D, Solier E, Ruales J, Pina M, Villeneuve P, Carriere F, Bonneu M and others. 2011. Identification of a putative triacylglycerol lipase from papaya latex by functional proteomics. FEBS Journal 278(1):97-110. Di Lorenzo M, Hidalgo A, Haas M, Bornscheuer UT. 2005. Heterologous production of functional forms of Rhizopus oryzae lipase in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology 71(12):8974-8977. Dussourd DE, Denno RF. 1991. Deactivation of plant defense - correspondence between insect behavior and secretory canal architecture. Ecology 72(4):1383-1396. Emond S, Montanier C, Nicaud J-M, Marty A, Monsan P, Andre I, Remaud-Simeon M. 2010. New Efficient Recombinant Expression System To Engineer Candida antarctica Lipase B. Applied and Environmental Microbiology 76(8):2684-2687. Farrell BD, Dussourd DE, Mitter C. 1991. Escalation of plant defense - do latex and resin canals spur plant diversification. American Naturalist 138(4):881-900. Ferrer P, Alarcon M, Ramon R, Dolors Benaiges M, Valero F. 2009. Recombinant Candida rugosa LIP2 expression in Pichia pastoris under the control of the AOX1 promoter. Biochemical Engineering Journal 46(3):271-277. Fickers P, Marty A, Nicaud JM. 2011. The lipases from Yarrowia lipolytica: Genetics, production, regulation, biochemical characterization and biotechnological applications. Biotechnology Advances 29(6):632-644. Fiorillo F, Palocci C, Soro S, Pasqua G. 2007. Latex lipase of Euphorbia characias L.: An aspecific acylhydrolase with several isoforms. Plant Science 172(4):722-727.
82
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Gandhi NN, Mukherjee KD. 2001. Synthesis of designer lipids using papaya (Carica papaya) latex lipase. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic 11(4-6):271-277. Giordani R, Moulin A, Verger R. 1991. Tributyroylglycerol hydrolase activity in Caricapapaya and other lattices. Phytochemistry 30(4):1069-1072. Gleba Y, Klimyuk V, Marillonnet S. 2007. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology 18(2):134-141. Gleba Y, Marillonnet S, Klimyuk V. 2004. Engineering viral expression vectors for plants: the 'full virus' and the 'deconstructed virus' strategies. Current Opinion in Plant Biology 7(2):182-188. Grochulski P, Bouthillier F, Kazlauskas RJ, Serreqi AN, Schrag JD, Ziomek E, Cygler M. 1994. Analogs of reaction intermediates identify a unique substrate-binding site in Candida-rugosa lipase. Biochemistry 33(12):3494-3500. Hagel JM, Yeung EC, Facchini PJ. 2008. Got milk? The secret life of laticifers. Trends in Plant Science 13(12):631-639. Han SJ, Back JH, Yoon MY, Shin PK, Cheong CS, Sung MH, Hong SP, Chung IY, Han YS. 2003. Expression and characterization of a novel enantioselective lipase from Acinetobacter species SY-01. Biochimie 85(5):501-510. Hasan F, Shah AA, Hameed A. 2006. Industrial applications of microbial lipases. Enzyme and Microbial Technology 39(2):235-251. Holm HC, Cowan D. 2008. The evolution of enzymatic interesterification in the oils and fats industry. European Journal of Lipid Science and Technology 110(8):679-691.
83
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Hong SY, Jung EJ, Joo JC, Yoo YJ. 2012. Soluble expression of Candida antarctica lipase B in Escherichia coli by fusion with Skp chaperone. Biotechnology and Bioprocess Engineering 17(4):687-692. Horchani H, Ben Salem N, Chaari A, Sayari A, Gargouri Y, Verger R. 2010. Staphylococcal lipases stereoselectively hydrolyse the sn-2 position of monomolecular films of diglyceride analogs. Application to sn-2 hydrolysis of triolein. Journal of Colloid and Interface Science 347(2):301-308. Horchani H, Ouertani S, Gargouri Y, Sayari A. 2009. The N-terminal His-tag and the recombination process affect the biochemical properties of Staphylococcus aureus lipase produced in Escherichia coli. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic 61(34):194-201. Huang AHC. 1987. Characteristics and biosynthesis of seed lipases in maize and other plant-species. Journal of the American Oil Chemists Society 64(5):644-644. Jaeger KE, Dijkstra BW, Reetz MT. 1999. Bacterial biocatalysts: Molecular biology, three-dimensional structures, and biotechnological applications of lipases. Annual Review of Microbiology 53:315. Jaeger KE, Eggert T. 2002. Lipases for biotechnology. Current Opinion in Biotechnology 13(4):390-397. Jia B, Liu W, Yang J, Ye C, Xu L, Yan Y. 2010.Burkholderia cepacia lipase gene modification and its constitutive and inducible expression in Pichia pastoris. Acta microbiologica Sinica 50(9):1194-201. Krishna SH, Karanth NG. 2002. Lipases and lipase-catalyzed esterification reactions in nonaqueous media. Catalysis Reviews-Science and Engineering 44(4):499-591.
84
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Kumar LSS SV. 1944. Chromosome number of Carica dodecaphylla Vell. Fl. Flum. Current Science 13:15. Lafaquiere Vincent. 2010. Compréhension et prédiction de l'énantiosélectivité des lipases. Tesis de doctorado. Instituto Nacional de Ciencias Aplicadas de Toulouse. Larsen MW, Bornscheuer UT, Hult K. 2008. Expression of Candida antarctica lipase B in Pichia pastoris and various Escherichia coli systems. Protein Expression and Purification 62(1):90-97. Lee KT, Foglia TA. 2000. Synthesis, purification, and characterization of structured lipids produced from chicken fat. Journal of the American Oil Chemists Society 77(10):1027-1034. Lin YH, Huang AHC. 1984. Purification and initial characterization of lipase from the scutella of corn seedlings. Plant Physiology 76(3):719-722. Lin YH, Yu C, Huang AHC. 1986. Substrate specificities of lipases from corn and other seeds. Archives of Biochemistry and Biophysics 244(1):346-356. Liu W-S, Pan X-X, Jia B, Zhao H-Y, Xu L, Liu Y, Yan Y-J. 2010. Surface display of active lipases Lip7 and Lip8 from Yarrowia Lipolytica on Saccharomyces Cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology 88(4):885-891. Madzak C, Gaillardin C, Beckerich J-M. 2004a. Heterologous protein expression and secretion in the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica: a review. Journal of Biotechnology 109(12):63-81. Madzak C, Gaillardin C, Beckerich JM. 2004b. Heterologous protein expression and secretion in the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica: a review. Journal of Biotechnology 109(1-2):63-81.
85
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Mangos TJ, Jones KC, Foglia TA. 1999. Lipase-catalyzed synthesis of structured lowcalorie triacylglycerols. Journal of the American Oil Chemists Society 76(10):1127-1132. Manunta G, Marongiu A. 1966. Pancreatic and intestinal lipase activity in sheep and dogs. Bollettino della Societa italiana di biologia sperimentale 42(16):1007-10. Mendes AA, Oliveira PC, de Castro HF. 2012.Properties and biotechnological applications of porcine pancreatic lipase. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic 78:119-134. Ming R, Hou SB, Feng Y, Yu QY, Dionne-Laporte A, Saw JH, Senin P, Wang W, Ly BV, Lewis KLT and others. 2008. The draft genome of the transgenic tropical fruit tree papaya (Carica papaya Linnaeus). Nature 452(7190):991-U7. Miyazawa T, Onishi K, Murashima T, Yamada T, Tsai SW. 2005. Resolution of nonprotein
amino
acids
via
Carica
papaya
lipase-catalyzed
enantioselective
transesterification. Tetrahedron-Asymmetry 16(15):2569-2573. Mormeneo M, Andres I, Bofill C, Diaz P, Zueco J. 2008. Efficient secretion of Bacillus subtilis lipase A in Saccharomyces cerevisiae by translational fusion to the Pir4 cell wall protein. Applied Microbiology and Biotechnology 80(3):437-445. Moss GP. Recommendations of the Nomenclature Committee International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the Nomenclature and Classification of Enzymes by the Reactions they Catalyse. Moutim V, Silva LG, Lopes MTP, Fernandes GW, Salas CE. 1999. Spontaneous processing of peptides during coagulation of latex from Carica papaya. Plant Science 142(2):115-121.
86
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Mukherjee KD, Kiewitt I. 1998. Structured triacylglycerols resembling human milk fat by transesterification catalyzed by papaya (Carica papaya) latex. Biotechnology Letters 20(6):613-616. Mukherjee M. 2003. Human digestive and metabolic lipases - a brief review. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic 22(5-6):369-376. Muller S, Sandal T, Kamp-Hansen P, Dalboge H. 1998. Comparison of expression systems in the yeasts Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Klyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe and Yarrowia lipolytica. Cloning of two novel promoters from Yarrowia lipolytica. Yeast 14(14):1267-1283. Narayanan N, Khan M, Chou CP. 2011. Enhancing Functional Expression of Heterologous Burkholderia Lipase in Escherichia coli. Molecular Biotechnology 47(2):130-143. Ng IS, Tsai SW. 2005. Hydrolytic resolution of (R,S)-naproxen 2,2,2-trifluoroethyl thioester by Carica papaya lipase in water-saturated organic solvents. Biotechnology and Bioengineering 89(1):88-95. Noma A, Borgstro.B. 1971. Acid lipase of castor beans - positional specificity and reaction mechanism. Biochimica Et Biophysica Acta 227(1):106-115. O’Connor J, Perry HJ, Harwood JL. 1992. A comparison of lipase activity in various cerealgrains. J Cereal Sci 16:153–163 Ota Y, Sawamoto T, Hasuo M. 2000. Tributyrin specifically induces a lipase with a preference for the sn-2 position of triglyceride in Geotrichum sp FO401B. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 64(11):2497-2499.
87
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Pan X-X, Xu L, Zhang Y, Xiao X, Wang X-F, Liu Y, Zhang H-j, Yan Y-J. 2012. Efficient Display of Active Geotrichum sp Lipase on Pichia pastoris Cell Wall and Its Application as a Whole-Cell Biocatalyst To Enrich EPA and DHA in Fish Oil. Journal of Agricultural and Food Chemistry 60(38):9673-9679. Paques FW, Macedo GA .2006. Plant lipases from latex: properties and industrial applications. Quim Nova 29:93–99 Piamtongkam R, Duquesne S, Bordes F, Barbe S, Andre I, Marty A, Chulalaksananukul W. 2011. Enantioselectivity of Candida rugosa Lipases (Lip1, Lip3, and Lip4) Towards 2Bromo Phenylacetic Acid Octyl Esters Controlled by a Single Amino Acid. Biotechnology and Bioengineering 108(8):1749-1756. Pinyaphong P, Phutrakul S. 2009. Synthesis of Cocoa Butter Equivalent from Palm Oil by Carica papaya Lipase-Catalyzed Interesterification. Chiang Mai Journal of Science 36(3):359-368. Pinyaphong P. SP, Phutrakul S. 2011. Biodiesel Fuel Production by Methanolysis of Fish Oil Derived from the Discarded Parts of Fish Catalyzed by Carica papaya Lipase.World Academy of Science, Engineering and Technology 52:466-472. Pleiss J, Fischer M, Peiker M, Thiele C, Schmid RD. 2000. Lipase engineering database Understanding and exploiting sequence-structure-function relationships. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic 10(5):491-508. Porro D, Sauer M, Branduardi P, Mattanovich D. 2005. Recombinant protein production in yeasts. Molecular Biotechnology 31(3):245-259.
88
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Quintana-Castro R, Diaz P, Valerio-Alfaro G, Garcia HS, Oliart-Ros R. 2009. Gene Cloning, Expression, and Characterization of the Geobacillus Thermoleovorans CCR11 Thermoalkaliphilic Lipase. Molecular Biotechnology 42(1):75-83. Quintana PG, Sandoval G, Baldessari A. 2011. Lipase-catalyzed synthesis of mediumand long-chain diesters of 2-oxoglutaric acid. Biocatalysis and Biotransformation 29(5):186-191. Rivera I, Mateos-Diaz JC, Sandoval G. 2012. Plant Lipases: Partial Purification of Carica papaya Lipase. In: Sandoval G, editor. Methods in molecular biology, Lipases and phospholipases. p 115-22. Rodrigues SP, Ventura JA, Aguilar C, Nakayasu ES, Choi H, Sobreira TJP, Nohara LL, Wermelinger LS, Almeida IC, Zingali RB and others. 2012. Label-free quantitative proteomics reveals differentially regulated proteins in the latex of sticky diseased Carica papaya L. plants. Journal of Proteomics 75(11):3191-3198. Rotticci-Mulder JC, Gustavsson M, Holmquist M, Hult K, Martinelle M. 2001. Expression in Pichia pastoris of Candida antarctica lipase B and lipase B fused to a cellulosebinding domain. Protein Expression and Purification 21(3):386-392. Sandoval G, Condoret JS, Monsan P, Marty A. 2002. Esterification by immobilized lipase in solvent-free media: Kinetic and thermodynamic arguments. Biotechnology and Bioengineering 78(3):313-320. Sandoval G, Rivera I, Barrera-Rivera KA, Martinez-Richa A. 2010. Biopolymer Synthesis Catalyzed by Tailored Lipases. Macromolecular Symposia 289:135-139. Schmid RD, Verger R. 1998. Lipases: Interfacial enzymes with attractive applications. Angewandte Chemie-International Edition 37(12):1609-1633.
89
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Schmid U, Bornscheuer UT, Soumanou MM, McNeill GP, Schmid RD. 1998. Optimization of the reaction conditions in the lipase-catalyzed synthesis of structured triglycerides. Journal of the American Oil Chemists Society 75(11):1527-1531. Seitz EW. 1974. Industrial application of microbial lipases - review. Journal of the American Oil Chemists Society 51(2):12-16. Sheldon RA. 2007. Enzyme immobilization: The quest for optimum performance. Advanced Synthesis & Catalysis 349(8-9):1289-1307. Shockey J, Chapital D, Gidda S, Mason C, Davis G, Klasson KT, Cao H, Mullen R, Dyer J. 2011. Expression of a lipid-inducible, self-regulating form of Yarrowia lipolytica lipase LIP2 in Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology 92(6):12071217. Sigh and Mukhopadyay.2012. Overview of Fungal Lipase: A Review. Applied Biochemistry and Biotechnology 166(2):486-520. Shu Z, Duan M, Yang J, Xu L, Yan Y. 2009. Aspergillus niger Lipase: Heterologous Expression in Pichia pastoris, Molecular Modeling Prediction and the Importance of the Hinge Domains at Both Sides of the Lid Domain to Interfacial Activation. Biotechnology Progress 25(2):409-416. Silva LG, Garcia O, Lopes MTP, Salas CE. 1997. Changes in protein profile during coagulation of latex from Carica papaya. Brazilian Journal of Medical and Biological Research 30(5):615-619. Smith SW. 2009. Chiral Toxicology: It's the Same Thing...Only Different. Toxicological Sciences 110(1):4-30.
90
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Staubmann R, Ncube I, Gubitz GM, Steiner W, Read JS. 1999. Esterase and lipase activity in Jatropha curcas L-seeds. Journal of Biotechnology 75(2-3):117-126. Steinke G, Kirchhoff R, Mukherjee KD. 2000. Lipase-catalyzed alcoholysis of crambe oil and camelina oil for the preparation of long-chain esters. Journal of the American Oil Chemists Society 77(4):361-366. Su GD, Huang DF, Han SY, Zheng SP, Lin Y. 2010. Display of Candida antarctica lipase B on Pichia pastoris and its application to flavor ester synthesis. Applied Microbiology and Biotechnology 86(5):1493-1501. Svendsen. A. 2000. Review lipase protein engineering. Biochemica et biöphysica ata. 1543:223-238. Tan Z, Li J, Wu M, Tang C, Zhang H, Wang J. 2011.High-level heterologous expression of an alkaline lipase gene from Penicillium cyclopium PG37 in Pichia pastoris. World Journal of Microbiology & Biotechnology 27(12):2767-2774. Tecelao C, Rivera I, Sandoval G, Ferreira-Dias S. 2012. Carica papaya latex: A low-cost biocatalyst for human milk fat substitutes production. European Journal of Lipid Science and Technology 114(3):266-276. Teixeira da Silva JA, Rashid Z, Tan Nhut D, Sivakumar D, Gera A, Teixeira Souza Jr M, Tennant PF. 2007. Papaya (Carica papaya L.) Biology and Biotechnology Tree and Forestry Science and Biotechnology:48-66. Treichel H, de Oliveira D, Mazutti MA, Di Luccio M, Oliveira JV. 2010. A Review on Microbial Lipases Production. Food and Bioprocess Technology 3(2):182-196. Tuter M. 1998. Castor bean lipase as a biocatalyst in the esterification of fatty acids to glycerol. Journal of the American Oil Chemists Society 75(3):417-420.
91
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Uvarani G, Jaganathan L, Shridas P, Boopathy R. 1998. Purification characterization of lipase from Rhizomucor miehei. Journal of Scientific & Industrial Research 57(1011):607-610. Valero F. 2012. Heterologous expression systems for lipases: a review. Methods in molecular biology 861:161-78. Villeneuve P, Pina M, Montet D, Graille J. 1995. Carica-papaya latex lipase - sn-3 stereoselectivity or short-chain selectivity - model chiral triglycerides are removing the ambiguity. Journal of the American Oil Chemists Society 72(6):753-755. Wang P-Y, Chen T-L, Tsai S-W. 2007. Enzymatic hydrolytic resolution of (R,S)- ±chlorophenyl acetates in biphasic media. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 48(1-2):16-22. Wang X, Sun Y, Ke F, Zhao H, Liu T, Xu L, Liu Y, Yan Y. 2012. Constitutive Expression of Yarrowia lipolytica Lipase LIP2 in Pichia pastoris Using GAP as Promoter. Applied Biochemistry and Biotechnology 166(5):1355-1367. Wu D, Yu XW, Wang TC, Wang R, Xu Y. 2011. High Yield Rhizopus chinenisis Prolipase Production in Pichia pastoris: Impact of Methanol Concentration. Biotechnology and Bioprocess Engineering 16(2):305-311. Yahya R.M. Ahmad AWA, Moo-Young Murray. 1998. Ester synthesis in lipase- catalyzed reactions. Enzyme and microbial technology. 23:438-450. Yang C, Wang F, Lan D, Whiteley C, Yang B, Wang Y. 2012. Effects of organic solvents on activity and conformation of recombinant Candida antarctica lipase A produced by Pichia pastoris.Process Biochemistry 47(3):533-537.
92
CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA You PY, Su EZ, Yang XP, Mao DB, Wei DZ. 2011. Carica papaya lipase-catalyzed synthesis of terpene esters. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic 71(3-4):152158. Yuzbashev TV, Yuzbasheva EY, Vibornaya TV, Sobolevskaya TI, Laptev IA, Gavrikov AV, Sineoky SP. 2012. Production of recombinant Rhizopus oryzae lipase by the yeast Yarrowia lipolytica results in increased enzymatic thermostability. Protein Expression and Purification 82(1):83-89. Zhang AJ, Gao RJ, Diao NB, Xie GQ, Gao G, Cao SG. 2009. Cloning, expression and characterization of an organic solvent tolerant lipase from Pseudomonas fluorescens JCM5963. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic 56(2-3):78-84. Zhang W-G, Han S-Y, Wei D-Z, Lin Y, Wang X-N. 2008. Functional display of Rhizomucor miehei lipase on surface of Saccharomyces cerevisiae with higher activity and its practical properties. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 83(3):329-335. Zhao H, Xiao X, Xu L, Liu Y, Yan Y. 2011. Heterologous expression and characterization of Yarrowia lipolytica lipase 4 and lipase 5 in Pichia pastoris. Acta microbiologica Sinica 51(10):1374-81. Zheng Y-Y, Guo X-H, Song N-N, Li D-C. 2011. Thermophilic lipase from Thermomyces lanuginosus: Gene cloning, expression and characterization. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic 69(3-4):127-132.
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CAPITULO 2: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
3. RESULTADOS
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CAPITULO 3: RESULTADOS
3.1:Purificación parcial y caracterización de actividad lipolítica en látex papaya
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CAPITULO 3: RESULTADOS
3.1 PURIFICACIÓN PARCIAL Y CARACTERIZACIÓN DE ACTIVIDAD LIPOLÍTICA EN LÁTEX DE Carica papaya
El látex de Carica papaya es una mezcla compleja que contiene una gran cantidad de proteínas dentro de las cuales podemos identificar diversas enzimas. La capacidad del látex de Carica papaya de hidrolizar triglicéridos ha sido ampliamente reportada desde 1930. Sin embargo, al encontrarse fuertemente asociada a la fracción insoluble, el aislamiento y purificación de la proteína o proteínas responsables de esta actividad es un proceso complicado. Por lo que, hasta la fecha no se ha logrado aislar en su totalidad esta actividad. Lo que permitiría la identificación de las proteínas presentes en el látex de papaya, así como la evaluación de su capacidad catalítica.
Por lo que la primera etapa de este trabajo de investigación está dedicada a la obtención de un protocolo de purificación parcial de la actividad lipolítica látex de Carica papaya, en el cual el primer paso consiste en el enriquecimiento de la actividad lipolítica mediante la eliminación de la mayoría de las proteínas solubles en agua y posteriormente extraer una fracción de la actividad lipolítica sobre triglicéridos de un tamaño de cadena corta mediante el empleo de detergente.
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CAPITULO 3: RESULTADOS 3.1.1 PUBLICACIÓN 1: PLANT LIPASES: PARTIAL PURIFICATION OF Carica papaya LIPASE
Esta primera publicación se encuentra dedicada a la obtención de un protocolo de purificación parcial de la actividad lipolítica presente en el látex de Carica papaya. A partir de este protocolo se pueden obtener dos fracciones parcialmente purificadas. La primera corresponde a la fracción conocida como CPL-p en la cual mediante el empleo de agua se eliminan la mayoría de las enzimas solubles en agua presentes en el látex.
Una segunda fracción es obtenida a partir del uso de un detergente iónico, a partir de cuyo uso es posible eliminar parte de la actividad lipasa presente en el látex. Este protocolo forma parte del libro Lipasas y fosfolipasas.
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CAPITULO II: RESULTADOS 3.1.2 PUBLICACIÓN FRACCIONES
DEL
2:
CARACTERIZACIÓN LÁTEX
Carica
DE
papaya
DIVERSAS COMO
BIOCATALIZADORES EN LA HIDRÓLISIS DE TRIGLICÉRIDOS
A pesar de que en una variedad de reportes se presenta la capacidad del látex de Carica papaya
como biocatalizador eficiente en síntesis catalizada por enzimas
lipolíticas, no existen estudios comparativos de las capacidades catalíticas de las distintas fracciones de látex en hidrólisis de triglicéridos.
Por lo que en una segunda etapa, los dos biocatalizadores obtenidos mediante el proceso de purificación parcial fueron caracterizados en la reacción de hidrólisis de triglicéridos y comparados con el látex de Carica papaya liofilizado, determinando diferentes parámetros como preferencia por tamaño de cadena de triglicérido, pH óptimo, temperatura óptima y termoestabilidad. Este trabajo fue sometido a la revista Grasas y Aceites.
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GRASAS Y ACEITES 65 (1) January–March 2014, e003 ISSN-L: 0017-3495 doi: http://dx.doi.org/10.3989/gya.049313
Caracterización de diversas fracciones del látex Carica papaya como biocatalizadores en la hidrólisis de triglicéridos I. Rivera y G. Sandoval* Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ), 44270 Guadalajara, Jalisco, México * Autor para correspondencia:
[email protected],
[email protected]
Submitted: 22 April 2013; Accepted: 9 September 2013; Published on line: 13/02/2014
SUMMARY: Characterization of different lipolytic fractions in Carica papaya. Carica papaya latex contains interesting enzymes; the best known is papain, but lipolytic activity is also present. Due to the complexity of the latex polymeric matrix, it has not been possible to completely isolate enzymes responsible of lipolytic activity. The aim of this work was to characterize the lipolytic activity in the raw latex (CPLtx) and two partially purified fractions of papaya latex (without protease, CPL-p and without esterase CPL-e). Thermostability, optimal temperature and pH in the hydrolysis of two model triglycerides (tributyrin and triolein) and the selectivity towards triglycerides with different chain lengths were determined. The lipolytic activity of these biocatalysts in the hydrolysis of tributyrin and olive oil was similar to other commercially available immobilized microbial lipases (RM IM and Novozyme 435). KEYWORDS: Carica papaya; hydrolysis; latex; lipase; triglycerides
RESUMEN: El látex de Carica papaya es fuente de interesantes enzimas, la más conocida es la papaína, pero la actividad lipolítica también está presente. No obstante, debido a la complejidad de la matriz polimérica del látex, hasta la fecha no ha sido posible aislar las enzimas responsables de la actividad lipolítica del látex. Este trabajo está dedicado a la caracterización de la actividad lipolítica en el látex crudo (CPLtx) y dos fracciones parcialmente purificadas de látex de papaya (sin proteasas, CPL-p y sin esterasas, CPL-e), a las cuales se determinaron la termostabilidad, temperatura y pH óptimos en la hidrólisis de dos triglicéridos modelo (tributirina y trioleina), así como la selectividad hacia triglicéridos con diferentes longitudes de cadena. Los tres presentaron actividades lipolíticas en hidrólisis de tributirina y aceite de oliva comparables con otras lipasas microbianas inmovilizadas disponibles comercialmente (RM IM y Novozyme 435). PALABRAS CLAVE: Carica papaya; hidrólisis; látex; lipasa; triglicéridos Citation/Cómo citar este artículo: Rivera I, Sandoval G. 2014. Caracterización de diversas fracciones del látex Carica papaya como biocatalizadores en la hidrólisis de triglicéridos. Grasas Aceites 65 (1): e003. doi: http://dx.doi.org/10.3989/ gya.049313 Copyright: © 2014 CSIC. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-Non Commercial (by-nc) Spain 3.0 Licence.
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2 • I. Rivera y G. Sandoval
1. INTRODUCCIÓN Carica papaya es una planta de tipo arborescente que produce un exudado de apariencia lechosa conocido como látex, que es producido en una clase de células especializadas llamadas latificiantes como un sistema de defensa contra diversos tipos de depredadores (El Moussaoui et al., 2001). Este exudado se coagula rápidamente después de ser liberado formando un látex. El látex está constituido por una mezcla compleja de distintos compuestos incluyendo terpenos, alcaloides, fitoesteroles, compuestos fenólicos, etc. (Silva et al., 1997). Así mismo, dentro de esta matriz existe una gran cantidad de proteínas, incluyendo diversas cistein endopeptidasas como la papaína y caricaina (El Moussaoui et al., 2001); adicionalmente una de las actividades enzimáticas más interesantes, que se encuentra asociada a la fracción del látex insoluble en agua, es la actividad lipolítica conocida como la lipasa de Carica papaya (Giordani et al., 1991). Las lipasas se definen como triacilglicerol acilhidrolasas capaces de hidrolizar los enlaces éster de cadena larga de la estructura de acilglicerol a ácidos grasos y glicerol (Casas-Godoy et al., 2012). Esta clase de enzimas se puede encontrar en una gran cantidad de organismos desde microrganismos, animales y plantas, aunque en su mayoría son obtenidas de microorganismos debido a su facilidad de manejo y velocidad de crecimiento. El reino vegetal también es una fuente interesante de lipasas debido a que algunas de sus características son especialmente atractivas para su empleo en la industria como en el caso de la lipasa ácida de Riccinus cummunis (Noma and Borgstro, 1971; Tuter, 1998). En el caso del látex de Carica papaya, la actividad lipolítica se encuentra fuertemente asociada a la fracción del látex que es insoluble en agua (Abdelkafi et al., 2011, Rivera et al., 2012), por lo que diversos esfuerzos se han realizado con el objetivo de aislar la mayor parte de la actividad lipolítica presente en el látex. Sin embargo la proteína o proteínas responsables de la mayoría de la actividad lipolítica permanece sin ser aislada en su totalidad. La mayoría de los esfuerzos para llevar a cabo la purificación de estas proteínas se centran en la eliminación de las enzimas solubles en agua (principalmente proteasas), mediante diversos lavados con agua (Ng and Tsai, 2005; Rivera et al., 2012) y el empleo de detergentes como el NLS y CHAPS permite el aislamiento de una fracción de la actividad lipolítica presente en el látex de Carica papaya (Abdelkafi et al., 2009; Rivera et al., 2012). La eficiencia de este biocatalizador ha sido demostrada en diversas transformaciones como: la modificación de lípidos, resolución de compuestos quirales que forman parte de una mezcla racémica (Chen et al., 2005; Rivera et al., 2013), así como
en la producción de mantequillas (Pinyaphong and Phutrakul 2009) y lípidos estructurados (Lee and Foglia, 2000), diésteres del ácido oxoglutárico (Quintana et al., 2011) y sustitutos de leche materna (Tecelao et al., 2012). No obstante, no existen estudios comparativos de las capacidades catalíticas de las distintas fracciones del látex de papaya en hidrólisis de triglicéridos, por lo que investigaciones al respecto permitirán determinar la eficiencia catalítica de los diversos biocatalizadores con actividad lipolítica presentes en el látex. Así mismo, una aplicación interesante para este tipo de biocatalizadores es la producción de monoglicéridos y diglicéridos mediante la hidrólisis selectiva de diversos aceites. Otra de las aplicaciones interesantes para este tipo de biocatalizadores es la formulación de diversas clases de detergentes como los detergentes quirúrgicos, lavavajillas y detergentes para ropa. Este trabajo está dedicado a la caracterización de la capacidad catalítica en hidrólisis de triglicéridos de diferentes fracciones del látex de Carica papaya: el látex crudo (CPLtx) y dos fracciones parcialmente purificadas de látex de papaya (sin proteasas, CPL-p y sin esterasas, CPL-e). 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Materiales 2.1.1. Obtención de los biocatalizadores de papaya El látex de papaya (CPLtx) obtenido de cultivos de Carica papaya variedad Maradol localizados en el occidente de México, fue colectado directamente de acuerdo a la metodología descrita por Rivera et al. (2012). Las fracciones CPL-p (sin proteasas) y CPL-e (sin proteasas y sin esterasas), fueron obtenidas de acuerdo con la metodología de Rivera et al. (2012). Una vez obtenidas cada una de las fracciones fueron liofilizadas y almacenadas a –4° C hasta su empleo como catalizador. Se utilizaron también las lipasas inmovilizadas de Rhizomucor miehei (Novozyme RM IM) y Candida antarctica B (Novozyme 435). 2.2. Métodos 2.2.1. Determinación de actividad lipasa La actividad lipasa fue medida mediante la titulación de los ácidos grasos liberados durante la reacción hidrólisis de triglicéridos de diferente tamaño de cadena. Las reacciones de hidrólisis fueron llevadas a cabo en un incubador (Envirogenie Scientific Industries, USA) a 30–70 °C con agitación de tipo magnético a 500 rpm. La mezcla de reacción está compuesta por 2.5 mL de triglicérido, 0.2% de tween 80 y 1 mL de solución amortiguadora 50 mM Tris-HCl, a diferentes pHs (5–10).
Grasas Aceites 65 (1), January–March 2014, e003. ISSN-L: 0017–3495 doi: http://dx.doi.org/10.3989/gya.049313
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Caracterización de diversas fracciones del látex Carica papaya como biocatalizadores en la hidrólisis de triglicéridos • 3
La actividad lipasa se expresó de la siguiente forma 1U=1µmol ácidos grasos libres (FFA) liberados por minuto. 2.2.2. Caracterización de las actividades lipolíticas La especificidad por longitud de cadena fue evaluada mediante la determinación de la actividad de hidrólisis e triglicéridos con diferente tamaño de cadena (tributirina C4:0, trioctanoina C8:0 y aceite de oliva extra virgen con un contenido mayoritario de trioleína C18:1 y acidez menor al 2%). La temperatura óptima fue evaluada mediante la hidrólisis a diferentes temperaturas entre 30 °C y 70 °C y un pH 8.5 en el caso de hidrólisis de triglicéridos de cadena corta y pH 9 en el caso de hidrólisis de triglicéridos de cadena larga. La estabilidad térmica fue evaluada mediante la incubación de los tres biocatalizadores durante diversos tiempos (15, 30, 45 y 60 minutos) a una temperatura de 50 °C, posteriormente la actividad lipolítica en hidrólisis de tributirina y aceite de oliva fueron evaluadas bajo condiciones estándar las cuales fueron 35 °C y pH 8.5 en el caso de tributirina y 35 °C y pH 9 para aceite de oliva. El pH óptimo fue determinado mediante la determinación de la actividad lipolítica en hidrólisis de tributirina y aceite de oliva bajo diferentes pH y una concentración de 50mM. Los tampones utilizados fueron: citrato de sodio (pH 5–6), TrisHCl (pH 7–9), carbonato de sodio pH 10. 2.2.3. Cinéticas de hidrólisis de aceite de oliva
aplicaciones y comparación de sus propiedades con las de otros biocatalizadores similares en su tipo. 3.1. Preferencia por tamaño de cadena de triglicéridos De los tres biocatalizadores empleados en este trabajo, como se observa en Figura 1, la fracción CPLtx presenta mayor actividad cuando se emplean cadenas cortas de triglicéridos, esto coincide con lo encontrado previamente por otros autores (Giordani et al., 1991; Abdelkafi et al., 2009). En cuanto a la fracción CPL-p (sin proteasas), hidroliza tanto cadenas cortas como medianas, incrementando la actividad relativa en cadenas medianas un 10% con respecto a la fracción CPLtx; por lo que esta fracción se ve enriquecida con una mayor capacidad de hidrólisis sobre triglicéridos de cadena mediana. Para la fracción CPL-e (sin proteasas y sin esterasas), se observa un enriquecimiento en la actividad de hidrólisis sobre cadenas largas en un 40%–50% con respecto a las dos fracciones anteriores CPLtx y CPL-p. Los extractos solubles de proteasas y esterasas no mostraron actividad sobre los triglicéridos. De forma general, la fracción CPLtx presenta preferencia por triglicéridos de cadena corta, mientras las fracciones CPL-p y CPL-e se ven enriquecidas en actividad sobre cadena mediana y larga respectivamente, lo cual puede indicar la presencia de al menos dos proteínas que presentan actividad lipolítica dentro del látex de Carica papaya, una con selectividad hacia cadena corta de triglicéridos
Las cinéticas de hidrólisis se llevaron a cabo en un equipo pH-stato 799 GPT Titrino acoplado a un baño a 40 °C, la mezcla de reacción estaba compuesta por 0.5g de aceite de oliva, 0.2% de tween 80 y 2.5 mM Tris-HCl pH 9.0 en un volumen total de reacción de 20 mL y una agitación de 500 rpm. Las cinéticas de reacción fueron evaluadas mediante la determinación de la cantidad de ácidos grasos liberados durante el transcurso de la reacción por titulación, restando el blanco de una muestra sin enzima (solo con tampón). 2.2.4. Análisis estadístico Todas las determinaciones fueron realizadas por duplicado, las barras en las figuras representan el error estándar. La independencia de cada medición fue evaluada mediante el análisis de dos vías (con un procedimiento GLM) en el software SAS versión 9.0. 3. RESULTADOS La caracterización de la actividad de hidrólisis de los tres biocatalizadores permite la identificación de algunas de sus propiedades con vistas a sus posibles
Figura 1. Preferencia por tamaño de cadena en hidrólisis de triglicéridos catalizada por diferentes biocatalizadores del látex de Carica papaya. pH 8.5, temperatura 35 °C. Las barras de error representan el error estándar de dos mediciones.
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4 • I. Rivera y G. Sandoval
Tabla 1. Relación entre las actividades lipolíticas de los diferentes biocatalizadores de latex de Carica papaya BIOCATALIZADOR
TC8/TC4
TC18/TC4
CPLtx
0.81
0.52
CPL-p
1.09
0.60
CPL-e
1.7
1.9
(Abdelkafi et al., 2009; Rivera et al., 2012) y al menos una proteína con preferencia sobre cadena mediana o larga de triglicéridos. La relación entre las actividades determinadas con los diferentes largos de cadena que se muestra en la Tabla 1 es un indicativo de la presencia de la proteína con preferencia sobre cadena corta de triglicéridos. Demostrando de un cambio en la preferencia de la mezcla de enzimas presentes en cada fracción. Estos resultados demuestran también que a partir del tratamiento con detergentes como en el caso de la fracción CPL-e, además de haber alcanzado la purificación parcial de la actividad lipolítica del látex de Carica papaya, de igual forma se ha logrado el aislamiento de una esterasa (Abdelkafi et al., 2009, Rivera et al., 2012 ). Sin embargo, la mayoría de la actividad lipolítica permanece fuertemente asociada a la fracción insoluble del látex lo que complica su aislamiento; posiblemente debido a ello, hasta la fecha no se ha logrado su purificación. Sin embargo mediante proteómica se ha identificado la presencia de una triacilglicerol lipasa en el látex (Dhouib et al., 2011), la cual posiblemente corresponde a al menos una fracción de la preparación CPL-e. 3.2. pH óptimo Las tres fracciones presentan una mayor actividad lipolítica en medio alcalino (Figura 2), con un pH óptimo de 8.5 en hidrólisis de triglicéridos de cadena corta (tributirina) como se observa en la figura 2a y en el caso de hidrólisis de triglicéridos de cadena larga las tres fracciones CPLtx, CPL-p y CPL-e presentan un pH óptimo de 9 (Figura 2b). Un pH óptimo alcalino es una característica que estas fracciones comparten con algunas lipasas de plantas como la lipasa de Jatropha curcas (Staubmann et al., 1999), Carica pentagona (Dhuique-Mayer et al., 2001) y salvado de arroz (Bhardwaj et al., 2001). Además, las enzimas lipolíticas alcalinas son especialmente atractivas a nivel industrial para su empleo en la producción de detergentes (Hasan et al., 2010). Así mismo, la alcalinidad es una de las diferencias principales entre los biocatalizadores evaluados en el presente trabajo y una gran cantidad de las lipasas microbianas. Los resultados obtenidos coinciden con lo reportado previamente para látex crudo (Abdelkafi et al., 2011).
3.3. Temperatura óptima y termoestabilidad La temperatura es un parámetro importante en toda reacción enzimática, generalmente la velocidad inicial de una reacción enzimática se incrementa de forma proporcional con la temperatura hasta el punto en el que la proteína se desnaturaliza. En la Figura 3 se muestra la temperatura óptima de los tres biocatalizadores estudiados en este trabajo, todas las fracciones (CPLtx, CPL-p y CPL-e) presentan una actividad máxima en hidrólisis de tributirina de 40 °C (figura 3a), así mismo, cuando se utilizan triglicéridos de cadena larga (aceite de oliva) la temperatura óptima es de 50 °C para las tres fracciones (Figura 3b). En una publicación anterior de Abdelkafi et al. (2011), se determinó que la temperatura óptima en la reacción de hidrólisis de aceite de oliva para la fracción CPLtx fue de 50 °C, al igual que en el presente trabajo y aquí observamos que las fracciones CPL-p y CPL-e presentaron la misma temperatura óptima en la hidrólisis de aceite de oliva. La diferencia en la determinación de la temperatura óptima cuando se emplean diversos largos de cadena en la hidrólisis de triglicéridos es indicativo de la presencia de al menos una segunda proteína con actividad lipolítica, una con preferencia hacia cadenas cortas de triglicéridos y la segunda con preferencia por cadenas medianas a largas. De igual forma, algunas de las lipasas de plantas como la lipasa de Babaco (Carica pentagona) (Cambon et al., 2008; Dhuique-Mayer et al., 2001) y coco (Ejedegba et al., 2007) también presentan temperaturas óptimas entre 40 °C y 50 °C, lo cual es atractivo para diversas aplicaciones industriales. Sin embargo, antes de seleccionar las condiciones de la reacción, otro parámetro importante es la termoestabilidad. Las fracciones CPL-p y CPL-e presentan un incremento estadísticamente significativo en la termoestabilidad en comparación a la de la fracción inicial CPLtx (valor de p menor a 0.1 en todos los casos), tanto en la reacción de hidrólisis de triglicéridos de cadena corta como triglicéridos de cadena larga (Figura 4). En el caso de la hidrólisis de triglicéridos de cadena corta, la vida media (t1/2) es menor a 15 minutos para la fracción CPLtx y de 12 minutos para las fracciones CPL-p y CPL-e. Los resultados obtenidos demuestran una mayor termoestabilidad en la hidrólisis de cadenas largas de triglicéridos, obteniendo una t1/2 de 15 minutos para la fracción CPLtx, 30 minutos para la fracción CPL-p y aproximadamente de 35 minutos para la fracción CPL-e. Como no se tienen referencias de la termoestabilidad de otras lipasas de plantas, comparando con lipasas microbianas se encontró por ejemplo que la lipasa 2 de la levadura Yarrowia lipolytica (no inmovilizada) presenta una vida media a 50 °C de 5.4 minutos (Bordes et al., 2011) y de 7 minutos para la lipasa (no inmovilizada) de Rhizopus arrhizus
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Figura 2. pH óptimo de hidrólisis de triglicéridos catalizada por diferentes biocatalizadores del látex de Carica papaya., 35 °C. Las barras de error representan el error estándar de dos mediciones.
(Niu et al., 2006), mientras que los biocatalizadores estudiados en este trabajo presentan una vida media de 3 a 7 veces mayor. Sin embargo, la mayor termoestabilidad de las fracciones del látex, puede ser debida a que los compuestos que forman parte de la estructura y composición de látex proporcionan estabilidad a las diferentes proteínas, los cuales permanecen en la fracción insoluble durante el proceso de purificación parcial, es decir, están naturalmente inmovilizadas. Por otra parte, en la naturaleza se pueden encontrar lipasas naturalmente más termoestables como la lipasa de Thermomyces lanuginosa que presentan una vida media de 50 min a 70 °C (Zheng et al., 2011). En la Figura 5 se compara la actividad de hidrólisis de tributirina y aceite de oliva de las fracciones
del látex de papaya con otras lipasas microbianas inmovilizadas disponibles comercialmente (lipasas de Rhizomucor miehei, RM IM y Candida antarctica B, Novozyme 435). En hidrólisis de tributirina, las fracciones presentan actividades 1.5 a 2 veces la actividad presente en la lipasa RM IM y 3–5 veces menores a la actividad de la lipasa Novozyme 435 que es conocida por tener preferencia a este tamaño de triglicérido. En hidrólisis de aceite de oliva, RM IM muestra mayor actividad, comparable a la de la fracción CPL-e y mayor a las de las fracciones CPL-p y CPLtx. Los tres biocatalizadores de papaya tuvieron una mayor actividad en este sustrato que la lipasa de Novozyme 435.
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Figura 4. Termoestabilidad en hidrólisis de triglicéridos catalizada por diferentes biocatalizadores del látex de Carica papaya. a) pH 8.5, 40 °C. b) pH 9, 50 °C. Las barras de error representan el error estándar de dos mediciones. Figura 3. Temperatura óptima en hidrólisis de triglicéridos catalizada por diferentes biocatalizadores del látex de Carica papaya. a) pH 8.5, b) pH 9. Las barras de error representan el error estándar de dos mediciones.
3.4. Cinéticas de hidrólisis de aceites de oliva Para la elección de las condiciones en que se evaluaría la cinética de hidrólisis de aceite de oliva se consideraron los datos de las figuras 3 y 4. Aunque la temperatura óptima en hidrólisis de aceite de oliva fue de 50 °C (Figura 3), se seleccionó una temperatura de 40 °C con el objetivo de incrementar su termoestabilidad. En cuanto al pH, la figura 3 muestra que el óptimo fue 9.0. En estas condiciones se observa que la fracción CPL-e presenta la mayor velocidad de hidrólisis (velocidad inicial de 0.40 mg/s·g de biocatalizador), el doble de la obtenida con el látex no purificado (0.24 mg/s·g). 4. CONCLUSIONES El látex de Carica papaya presenta una mezcla de enzimas lipolíticas, que se observa en el cambio de selectividad de las tres fracciones CPLtx (cruda), CPL-p (sin proteasas) y CPL-e (sin proteasas ni
esterasas). CPLtx presenta preferencia por triglicéridos de cadena corta en la reacción de hidrólisis de triglicéridos, mientras CPL-p y CPL-e mostraron una mayor actividad en hidrólisis de triglicéridos de cadena mediana y larga respectivamente. Sin embargo, muy probablemente en la fracción CPL-e todavía quede algo de esterasa remanente atrapada en la matriz del látex, por lo que serían necesarios estudios electroforéticos adicionales, así como algunos otros ensayos de extracción que permitan descartar esta posibilidad. La temperatura óptima de las tres fracciones en hidrólisis de triglicéridos con longitud de cadena corta es de 40 °C, mientras que sobre triglicéridos de cadena larga es de 50 °C. Una de las características importantes a determinar en una preparación enzimática es el pH óptimo de la misma, en este trabajo las tres fracciones CPLtx, CPL-p y CPL-e presentan un pH óptimo de 8.5 en hidrólisis de triglicéridos de cadena corta y un pH óptimo de 9.0 en hidrólisis de triglicéridos de cadena larga; lo cual hace que estas fracciones del látex de Carica papaya sean especialmente atractivas para su aplicación en detergentes. Así mismo, los resultados obtenidos indican la presencia de al menos dos proteínas con actividad
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Caracterización de diversas fracciones del látex Carica papaya como biocatalizadores en la hidrólisis de triglicéridos • 7
mayor conocimiento de las propiedades catalíticas de estos biocatalizadores y estos conocimientos pueden ser aplicados con la finalidad de favorecer la actividad de una de las dos enzimas, de acuerdo con las características de ambas proteínas, la síntesis a realizar y del producto deseado. En cuanto a la cinética de hidrólisis de aceite de oliva la fracción CPL-e presenta una velocidad inicial 1.6 y 1.17 mayor que la obtenida con CPLtx y CPL-p respectivamente. Sin embargo los ácidos grasos liberados al final de la reacción son similares para las tres fracciones (25 a 27 mg de ácidos grasos). Es importante destacar que este trabajo muestra por primera vez de forma comparativa la caracterización de estas tres fracciones del látex de papaya con actividad lipolítica, además de la evaluación de la cinética de hidrólisis de triglicéridos. Así mismo, por primera vez se muestran las propiedades catalíticas de la fracción CPL-e. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen el financiamiento del proyecto CB-2008-104429 del CONACYT (México). BIBLIOGRAFÍA
Figura 5. Hidrólisis de triglicéridos catalizada por diferentes biocatalizadores. a) pH 8.5, 35 °C; b) pH 9, 35 °C. Las barras de error representan el error estándar de dos mediciones.
lipolítica en el látex de Carica papaya. El conocimiento de las propiedades fisicoquímicas de cada una de las fracciones permite la obtención de un
Figura 6. Cinética de hidrólisis de aceite de catalizada por diferentes biocatalizadores. 0.5 g de aceite de oliva, Tampón 2.5 mM Tris HCl, 40 °C, 500 rpm.
Abdelkafi S, Barouh N, Fouquet B, Fendri I, Pina M, Scheirlinckx F, Villeneuve P, Carriere F. 2011. Carica papaya Lipase: A Naturally Immobilized Enzyme with Interesting Biochemical Properties. Plant Food Human Nutr. 66, 34–40. Abdelkafi S, Ogata H, Barouh N, Fouquet B, Lebrun R, Pina M, Scheirlinckx F, Villeneuve P, Carriere F. 2009. Identification and biochemical characterization of a GDSL-motif carboxylester hydrolase from Carica papaya latex. BBAMol Cell Biol Lipids. 1791, 1048–1056. Bhardwaj K, Raju A, Rajasekharan R. 2001. Identification, purification, and characterization of a thermally stable lipase from rice bran. A new member of the (Phospho) lipase family. Plant Physiol. 127, 1728–1738. Bordes F, Tarquis L, Nicaud JM, Marty A. 2011. Isolation of a thermostable variant of Lip2 lipase from Yarrowia lipolytica by directed evolution and deeper insight into the denaturation mechanisms involved. J Biotechol. 156, 117–124. Cambon E, Rodriguez JA, Pina M, Arondel V, Carriere F, Turon F, Ruales J, Villeneuve P. 2008. Characterization of typo-, regio-, and stereo-selectivities of babaco latex lipase in aqueous and organic media. Biotechnol Lett. 30, 769–774. Casas-Godoy L, Duquesne S, Bordes F, Sandoval G, Marty A. 2012. Lipases: an overview. in Sandoval G (Ed). Methods in molecular biology, Lipases and phospholipases. 547. Springerlink. pp. 3–30. Chen CC, Tsai SW, Villeneuve P. 2005. Enantioselective hydrolysis of (R,S)-naproxen 2,2,2-trifluoroethyl ester in watersaturated solvents via lipases from Carica pentagona Heilborn and Carica papaya. J Mol Catal B-Enz. 34, 51–57. Dhouib R, Laroche-Traineau J, Shaha R, Lapaillerie D, Solier E, Ruales J, Pina M, Villeneuve P, Carriere F, Bonneu M, Arondel V. 2011. Identification of a putative triacylglycerol lipase from papaya latex by functional proteomics. Febs J. 278, 97–110. Dhuique-Mayer C, Caro Y, Pina M, Ruales J, Dornier M, Graille J. 2001. Biocatalytic properties of lipase in crude latex from babaco fruit (Carica pentagona). Biotechnol Lett. 23, 1021–1024.
Grasas Aceites 65 (1), January–March 2014, e003. ISSN-L: 0017–3495 doi: http://dx.doi.org/10.3989/gya.049313
113
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Ejedegba BO, Onyeneke EC, Oviasogie PO. 2007. Characteristics of lipase isolated from coconut (Cocos nucifera linn) seed under different nutrient treatments. Afr. J. Biotechnol. 6, 723–727. El Moussaoui A, Nijs M, Paul C, Wintjens R, Vincentelli J, Azarkan M, Looze Y. 2001. Revisiting the enzymes stored in the laticifers of Carica papaya in the context of their possible participation in the plant defense mechanism. Cell Mol. Life Sci. 58, 556–570. Giordani R, Moulin A, Verger R. 1991. Tributyroylglycerol hydrolase activity in Carica-papaya and other lattices. Phytochemistry. 30, 1069–1072. Hasan F, Shah AA, Javed S, Hameed A. 2010. Enzymes used in detergents: Lipases. Afr. J. Biotechnol. 9, 4836–4844. Lee KT, Foglia TA. 2000. Synthesis, purification, and characterization of structured lipids produced from chicken fat. J. Am. Oil Chem. Soc. 77, 1027–1034. Ng IS, Tsai SW. 2005. Partially purified Carica papaya lipase: a versatile biocatalyst for the hydrolytic resolution of (R,S)2-arylpropionic thioesters in water-saturated organic solvents. Biotechnol. Bioeng. 91, 106–113. Wei-Ning Niu, Zhao-Peng Li, Da-Wei Zhang, Ming-Rui Yu, Tian-Wei Tan Niu. 2006. Improved thermostability and the optimum temperature of Rhizopus arrhizus lipase by directed evolution. J. Mol. Catal. B-Enz. 43, 33–39. Nieto S, Gutiérrez J, Sanhueza, Valenzuela A. 1999. Preparation of sn-2 long-chain polyunsaturated monoacylglycerols from fish oil by hydrolysis with a stereo-specific lipase from Mucor miehei. Grasas Aceites 50, 111–113. Noma A, Borgstro B. 1971. Acid lipase of castor beans positional specificity and reaction mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 227, 106–110. Pinyaphong P, Phutrakul S. 2009. Synthesis of Cocoa Butter Equivalent from Palm Oil by Carica papaya Lipase-Catalyzed Interesterification. Chiang Mai J. Sci. 36, 359–368.
Quintana PG, Sandoval G, Baldessari A. 2011. Lipase- catalyzed synthesis of medium- and long-chain diesters of 2-oxoglutaric acid. Biocatal. Biotransf. 29, 186–191. Rivera I, Mateos-Diaz JC, Sandoval G. 2012. Plant Lipases: Partial Purification of Carica papaya Lipase. in Sandoval G (ed). Methods in molecular biology, Lipases and phospholipases. pp 547. 1940–6029. Springerlink. pp. 115–122. Rivera I, Mateos JC, Marty A, Sandoval G, Duquesne S. 2013. Lipase from Carica papaya latex presents high enantioselectivity towards the resolution of prodrug (R, S)2-bromophenylacetic acid octyl ester. Tetrahedron Lett. In press. Silva LG, Garcia O, Lopes MTP, Salas CE. 1997. Changes in protein profile during coagulation of latex from Carica papaya. Braz. J. Med. Biol. Res. 30, 615–619. Singh AK, Mukhopadhyay M. 2012. Olive oil glycerolysis with the immobilized lipase Candida antarctica in a solvent free system. Grasas Aceites 63, 202–208. Staubmann R, Ncube I, Gubitz GM, Steiner W, Read JS. 1999. Esterase and lipase activity in Jatropha curcas L-seeds. J. Biotechnol. 75, 117–126. Tecelao C, Rivera I, Sandoval G, Ferreira-Dias S. 2012. Carica papaya latex: A low-cost biocatalyst for human milk fat substitutes production. Eur. J. Lipid Sci. Tech. 114, 266–276. Tuter M. 1998. Castor bean lipase as a biocatalyst in the esterification of fatty acids to glycerol. J. Am. Oil Chem. Soc. 75, 417–420. Wang YJ, Sheu JY, Wang FF, Shaw JF. 2012. Lipase-Catalyzed Oil Hydrolysis in the Absence of Added Emulsifier. Biotechnol. Bioeng. 31, 628–633. Zheng Y-Y, Guo X-H, Song N-N, Li DC. 2011. Thermophilic lipase from Thermomyces lanuginosus: Gene cloning, expression and characterization. J. Mol. Catal. B: Enz. 69, 127–132.
Grasas Aceites 65 (1), January–March 2014, e003. ISSN-L: 0017–3495 doi: http://dx.doi.org/10.3989/gya.049313
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CAPITULO II: RESULTADOS
3.2 Aplicaciones de las triacilglicerol lipasas de Carica papaya
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CAPITULO 3: RESULTADOS
3.2 APLICACIONES DE TRIACILGLICEROL LIPASAS DE Carica papaya La capacidad catálitica del látex de Carica papaya (CPLtx) para llevar a cabo diversas reacciones de síntesis de interés industrial ha sido reportada. Sin embargo, hasta la fecha no existen reportes en los cuales se compare la capacidad cátalica del látex con las fracciones parcialmente purificadas obtenidas en este trabajo.
Además como se trata de una mezcla de enzimas es necesario investigar cual de estas enzimas es reponsable de la capacidad catalítica mostrada por CPLtx en cada una de las reacciones se síntesis, con la finalidad de identicar el mecanismo de reación por medio del cual es capaz de realizar la catálisis.
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CAPITULO 3: RESULTADOS 3.2.1 PUBLICACIÓN 3: LIPASE FROM Carica papaya LATEX PRESENTS
HIGH
ENANTIOSELECTIVITY
TOWARDS
THE
RESOLUTION OF PRODRUG OF 2-BROMO-PHENYLACETIC ACID OCTYL ESTER
La capacidad catalítica del látex de Carica papaya (CPLtx) para llevar a cabo diversas reacciones de síntesis de interés industrial ha sido reportada. Sin embargo, hasta la fecha no existen reportes en los cuales se compare la capacidad catálitica del látex con las fracciones parcialmente purificadas obtenidas en este trabajo.
Una de las aplicaciones más interesantes de las triacilglicerol lipasas es la resolución de compuestos quirales, lo cual es muy apreciado en la industria farmacéutica, debido a que la mayoría de los medicamentos que se producen en esta industria son moléculas quirales formada por la mezcla de ambos enantiómeros.
Sin embargo en muchas ocasiones es sólo uno de los enantiómeros el que cuenta con el efecto por lo que para ser empleados en la como medicamentos, estos compuestos deben de alcanzar un valor de enantioselectividad (E) mayor a 200.
Por otro lado, la producción enzimática de este tipo de compuestos es altamente apreciada debido a que las condiciones de reacción en las que trabajan son simples comparadas con la catálisis química. Así mismo, actualmente no se encuentran trabajos en los cuales se utilicen triacilglicerol lipasas vegetales en el la resolución de
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CAPITULO 3: RESULTADOS mezclas racémicas de precursores de medicamentos como el éster octilico del ácido of 2-bromofenil acético.
Tomando en cuenta lo anterior, la capacidad del catalítica del látex de papaya en la hidrólisis del éster octilico del ácido of 2-bromofenil acético fue evaluada en la siguiente publicación se encuentra publicada en la revista de arbitraje internacional Tetrahedron Letters.
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Tetrahedron Letters 54 (2013) 5523–5526
Contents lists available at ScienceDirect
Tetrahedron Letters journal homepage: www.elsevier.com/locate/tetlet
Lipase from Carica papaya latex presents high enantioselectivity toward the resolution of prodrug (R,S)-2-bromophenylacetic acid octyl ester Ivanna Rivera a,b,c,d, Juan Carlos Mateos d, Alain Marty a,b,c, Georgina Sandoval d, , Sophie Duquesne a,b,c,⇑, a
Université de Toulouse, INSA, UPS, INP, LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077 Toulouse, France INRA, UMR792 Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400 Toulouse, France CNRS, UMR5504, F-31400 Toulouse, France d CIATEJ, Av. Normalistas 800, Colinas de la Normal, 44270 Guadalajara, Jalisco, Mexico b c
a r t i c l e
i n f o
Article history: Received 1 July 2013 Revised 23 July 2013 Accepted 29 July 2013 Available online 6 August 2013 Keywords: Lipase Carica papaya latex Enantioselectivity 2-Halogenocarboxylic acid
a b s t r a c t Besides the well-known papain, lipolytic activity is another interesting enzymatic activity present in latex from Carica papaya. This lipolytic activity is strongly attached to the latex solid phase, resulting in a naturally immobilized biocatalyst. In this work we describe the kinetic resolution of (R,S)-2-bromophenylacetic acid octyl ester by Carica papaya crude latex and two partially purified latex fractions. Several parameters, such as substrate concentration and solvent effects were studied. The best results were obtained using decane as solvent with 50 mM of substrate and 50 mg/mL enzyme/reaction medium; under these conditions, a high enantioselectivity (E >200) was obtained with crude latex. A twofold increase of the initial rate maintaining E >200 was obtained using purified fractions without protease and without esterase. Lipase from Carica papaya latex is the most enantioselective wild-type enzyme ever described for the studied reaction. Ó 2013 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Introduction Therapeutic application of enantiopure drugs is highly attractive for pharmaceutical industry. Indeed, pure enantiomers have improved specificity and biological activity in comparison to racemic drugs and their use also avoid potential side effects associated to the use of racemic mixtures.1 Nevertheless, classical methods to obtain optically enriched compounds, such as chemical synthesis and chiral chromatography, are often expensive. As an alternative, several microbial lipases were used over the last years as enantioselective biocatalysts. Indeed, these biocatalysts have the capacity to accept a large variety of substrates, display stability and performance in organic solvents, and permit to discriminate enantiomers from chiral mixtures of pharmaceutical interest, including non-steroidal anti-inflammatory drugs.2 Amongst such chiral mixtures, 2halogenocarboxylic acid esters are important intermediates for the synthesis of various chiral drugs such as prostacyclin and prostaglandin.3 Therefore, the kinetic resolution of (R,S)-2-bromophenylacetic acid octyl ester racemates by microbial lipases is of great interest.4
⇑ Corresponding author. Tel.: +33 561559439; fax: +33 561559401.
E-mail address:
[email protected] (S. Duquesne). These two authors have equally contributed.
Although microbial lipases are the most studied source of lipases, such enzymes can also be found in plants, including oil seeds and laticifers (plant cells producing a milky fluid constituted by proteins, alkaloids, and so forth, commonly known as latex). Carica papaya latex (abbreviated here CPLtx) presents an interesting lipolytic activity, which was previously used to produce synthetic cocoa butter,5 human milk analogs,6 terpene,7 biopolymers8, and wax esters.9 It has been demonstrated that most of the lipolytic activity of CPLtx is highly associated to the latex solid phase, thus resulting in a stable and naturally immobilized biocatalyst.10 Many efforts have been made in order to partially purify CPLtx lipolytic activity, through eliminating water soluble enzymes from latex (mainly proteases).11 The resulting fraction is abbreviated here as ‘CPL-p’ (Carica papaya latex without protease). Recently, detergents were used to remove from latex part of the lipolytic activity mainly due to esterase activity.12 This final preparation is abbreviated here as ‘CPL-e’ (Carica papaya latex without esterase). CPLtx and CPL-p have been successfully used for the racemic resolution of different non-steroidal anti-inflammatory drugs.13 The objective of this work was to optimize the resolution of (R,S)-2-bromophenylacetic acid esters by CPLtx and to compare the performance of CPLtx, CPL-p, and CPL-e on the enantioselective hydrolysis. The effect of substrate concentration, organic solvents, and pH was studied, using (R,S)-2-bromophenylacetic acid octyl ester as substrate (Scheme 1).
0040-4039/$ - see front matter Ó 2013 Elsevier Ltd. All rights reserved. http://dx.doi.org/10.1016/j.tetlet.2013.07.151
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5524
I. Rivera et al. / Tetrahedron Letters 54 (2013) 5523–5526
Results and discussion Hydrolytic activities of C. papaya crude and partially purified latex (CPLtx, CPL-p, and CPL-e) were evaluated and their performance on the kinetic resolution of (R,S)-2-bromophenylacetic acid octyl esters with optimized conditions was compared.12a Hydrolytic activity of CPL preparations First, in order to characterize the enzymatic preparations, protease, esterase, and lipase activities were evaluated with specific substrates. Table 1 shows the ratio of these hydrolytic activities. As expected, a high decrease in proteolytic activity was achieved during the preparation of CPL-p (98%) and only 0.9% protease activity remained in CPL-e. In this later, lipase is the predominant activity after removal of 43% esterase activity. In previous works dealing with enantioresolution using C. papaya preparations, only CPLtx and CPL-p were tested. Here we decided to compare each partially purified fraction, including CPL-e, to discriminate which of protease, lipase, or esterase activity is responsible for the observed enantioselectivity. Kinetic resolution of (R,S)-2-bromophenylacetic acid octyl ester using CPLtx CPLtx’s ability to discriminate between enantiomers in the racemic mixture of (R,S)-2-bromophenylacetic acid octyl esters was evaluated in a biphasic medium (water:decane 1:1). Different reaction parameters were evaluated in order to determine their effects over activity and enantioselectivity. Unlike lipases that operate in acidic or neutral media,14 CPLtx was previously shown to operate in basic media.15 This constitutes a major advantage for applications as detergents, dish washing, and dry cleaning products.16 High activity in alkaline media might also be an advantage for substrate solubility in synthesis reactions.17 Considering the studied reaction, the highest hydrolysis activity toward the best-recognized enantiomer was indeed obtained at pH 8.5 and 9.0 (Table 2). These results are in agreement with those obtained by Abdelkafi et al. on triglycerides,15 where the highest activity was also obtained between pH 8.5 and 9.0. pH 8.5 was thus retained for the following experiments. At pH 8.5, CPLtx exhibited the highest initial rate (2.36 ± 0.10 lmol h 1 g enzyme 1) of hydrolysis toward the preferred (S)-enantiomer and a very high enantioselectivity (>200), which makes this enzyme the most efficient wild-type lipase for the resolution of this racemic mixture. Indeed, reported enantioselectivity values of wild-type enzymes were much lower than those obtained using CPLtx (E = 72 for (S)-selective lipase Lip2 from Yarrowia lipolytica and E = 53 for (R)-selective lipase from Burkholderia cepacia).4c,18 It was necessary to improve these microbial lipases’ selectivity by site-directed mutagenesis in order to reach high initial rates and E-values >200.4b,18 Selection of a proper reaction medium is a key parameter to optimize any enzymatic reaction, as it can affect both the initial rate and enzyme selectivity.19 Screening of solvents with different
Table 1 Hydrolytic activities of CPL preparations and ratio of lipase versus protease and esterase activities Hydrolytic activity
Proteasea Esteraseb Lipasec Lipase/protease Lipase/esterase
Biocatalyst CPLtx
CPL-p
CPL-e
353 ± 2 U/g 1137 ± 37 U/g 593 ± 1 U/g 1.7 0.5
7 ± 0.003 U/g 1248 ± 68 U/g 753 ± 0.0 U/g 108 0.6
3 ± 0.001 U/g 486 ± 3 U/g 921 ± 32 U/g 307 1.9
Mean and standard deviation of two independent experiments are presented. a Measured by casein hydrolysis, 1 U = 1 equiv tyrosine liberated. b Measured by tributyrin hydrolysis, 1 U = 1 lmol acid liberated/min. c Measured by triolein hydrolysis, 1 U = 1 lmol acid liberated/min.
Table 2 Effect of pH on the racemic resolution of (R,S)-2-bromophenylacetic acid octyl ester catalyzed by CPLtx pH
Initial reaction rate for the S enantiomer, rSa (lmol h 1 g enzyme 1)
E (rS/rR)
7.0 8.0 8.5 9.0
1.45 ± 0.04 2.02 ± 0.00 2.4 ± 0.10 2.3 ± 0.10
30 168 >200 >200
50 mM Substrate in decane, solvent:buffer 1:1, 50 mg/mL of biocatalyst, 25 °C a Mean and standard deviation of two independent experiments are presented.
hydrophobicity was thus performed. The highest initial rate was obtained using decane, the most hydrophobic solvent tested, probably due to a good emulsification process where the interface water/solvent is favorable to lipase catalytic performances (Table 3). Previous efforts have been carried out in order to relate CPLtx catalytic performances (reaction rate and enantioselectivity toward 2-mathylalkanoic acid,20a propionic acid,20b and naproxen 2,2,2-trifluoroethyl thioester13b) and the properties of the solvent used. As in our case, no explicit correlation could be found between solvent properties and initial rates of reaction. Determination of the optimal substrate concentration is essential to obtain high initial rate and E-value. As shown in Table 4, substrate concentration has only a slight influence on the performance of CPLtx in the studied range of concentrations. Nevertheless, over 100 mM, a slight decrease in reaction rates is observed, probably due to substrate inhibition. Kinetic resolution of (R,S)-2-bromophenylacetic acid octyl ester by CPL-p and CPL-e Finally, the performances of partially purified fractions CPL-p and CPL-e were analyzed (Table 5). Results showed that the initial rate of hydrolysis of the preferred (S)-enantiomer increased when the partially purified fractions of latex were used, due to an enrichment of these fractions in lipolytic activity (see Table 1). Indeed, the reaction proceeded 2.1 and 2.4-fold faster when CPL-p and
Scheme 1. Hydrolysis of (R,S)-2-bromophenylacetic acid octyl ester 1 into (R)-2-bromophenylacetic acid octyl ester 2, (S)-2-bromophenylacetic acid 3, and octyl alcohol 4 (provided that lipase is S enantioselective).
120
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I. Rivera et al. / Tetrahedron Letters 54 (2013) 5523–5526 Table 3 Solvent effects on the racemic resolution of (R,S)-2-bromophenylacetic acid octyl ester catalyzed by CPLtx Solvent (Log P)a
Initial reaction rate S-enantiomer, rSb (lmol h 1 g enzyme 1)
E (rS/rR)
Cyclohexane (3.2) Octane (4.0) Heptane (4.6) Decane (5.6)
1.2 ± 0.31 1.1 ± 0.23 1.6 ± 0.15 2.4 ± 0.10
>200 >200 >200 >200
50 mM Substrate in the solvent, solvent:buffer 1:1, 50 mg/mL of biocatalyst, 25 °C. a Log P (solvent partition coefficient) values taken from Chemspider (www.chemsider.com). b Mean and standard deviation of two independent experiments are presented.
Table 4 Effects of substrate concentration on the racemic resolution of (R,S)-2-bromophenylacetic acid octyl ester catalyzed by CPLtx Substrate (mM)
Initial reaction rate S-enantiomer, rSa (lmol h 1 g enzyme 1)
E (rS/rR)
50 100 250
2.4 ± 0.10 2.9 ± 0.10 2.5 ± 0.10
>200 >200 >200
Substrate dissolved in decane, solvent:buffer 1:1, 50 mg/mL of biocatalyst, 25 °C. a Mean and standard deviation of two independent experiments are presented.
Table 5 Comparison of the kinetic resolution of (R,S)-2-bromophenylacetic acid octyl ester catalyzed by CPLtx, CPL-p, and CPL-e Biocatalyst
Initial reaction rate S-enantiomer, rSa (lmol h 1 g enzyme 1)
E (rS/rR)
CPLtx CPL-p CPL-e
2.4 ± 0.10 5.0 ± 0.39 5.6 ± 0.30
>200 >200 >200
Figure 1. Time course of kinetic resolution of (R,S)-2-bromophenylacetic acid octyl ester catalyzed by CPLtx and CPL-p. Assays were performed in the same conditions as in Table 5. All assays were carried out in duplicate.
50 mM Substrate in decane, solvent:buffer 1:1, 50 mg/mL of biocatalyst, 25 °C. a Mean and standard deviation of two independent experiments are presented.
CPL-e were used respectively, which correlates with a 1.2 and 1.6fold increase in the lipase activity assayed on triolein. Moreover, CPL-p and CPL-e have similar performances, which implies that the enzyme or enzymes that perform the reaction are still in the non-soluble fraction of latex. These results are consistent with the fact that soluble extracts (containing proteases and esterases) did not show any activity toward the enantiomeric resolutions tested. In the case of (R,S)-2,2,2-naproxen trifluoethyl thioester, Ng and Tsai also observed that specific activity was enhanced when CPL-p was used (compared to non-purified latex), while enantioselectivity was conserved.13c Figure 1 shows the time course of reactions for both CPLtx and CPL-p at 4 and 25 °C. When assessed at 25 °C, CPLtx showed an important decrease in the hydrolysis rate after 6 h reaction, which was not observed with CPL-p. This is probably due to the degradation of lipolytic enzymes by proteases. In accordance, this phenomenon is less pronounced at 4 °C and for CPL-p (fraction partially purified where most of proteases have been removed). After 48 h reaction with CPL-p at 25 °C (47.8% total conversion), enantiomeric excesses of substrate and product are 87.8% and 95.8%, respectively. At this time, 98.0% of the (R)-enantiomer can be recovered with a purity of 93.9%, and 93.6% with 97.9% purity for the (S)-enantiomer.
Interestingly, enantiomeric excess observed for CPL-e was almost the same as that observed for CPL-p; this coincided with the results obtained when initial reaction rates were evaluated with both fractions (Table 5). Summary & conclusion There are only few reports of microbial lipases efficient in the kinetic resolution of (R,S)-2-bromophenylacetic acid octyl ester. Those mainly include Lip1 and Lip3 from Candida rugosa, Lip2 from Yarrowia lipolytica, and lipase from Burkholderia cepacia.4 Here we demonstrate that the catalytic performances of Carica papaya latex CPLtx and its partially purified fractions CPL-p and CPL-e are more efficient than those described wild-type microbial lipases. CPLtx is therefore the most enantioselective wild-type enzyme for the studied reaction. CPLtx is an efficient and highly enantioselective biocatalyst for the kinetic resolution of (R,S)-2-bromophenylacetic acid octyl ester with preference for the (S)-enantiomer and E >200. In the case of the partially purified fractions CPL-p and CPL-e, a twofold increase in the initial rate was obtained, while E >200 was maintained. As CPL-p and CPL-e have the same performances, but the purification process for CPL-p is simpler, this is the preferred biocatalyst to continue further studies.
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Experimental
References and notes
The procedure for the preparation of (R,S)-2-bromophenylacetic acid octyl ester, was described previously.3d CPLtx collection from fruits of ‘Maradol’ variety was carried out according to Rivera et al.12a Partial purification of CPLtx to give a fraction without protease (CPL-p) and without esterase (CPL-e) was also carried out as described previously by Rivera et al. and lyophilized. 12a Proteolytic activity was measured using casein as a substrate.21 Esterase activity in latex was measured by hydrolysis of tributyrin while lipase activity was measured by hydrolysis of olive oil. Hydrolysis reactions were performed in a thermostated and mechanically stirred Envirogenie Scientific Industries (USA) at 30 °C containing 2.5 mL tributyrin, 1 mL 50 mM Tris–HCl, 50 mM NaCl, and 0.2% triton pH 8.5 buffer solution with the corresponding amount of enzyme (usually 50 mg). Free fatty acids released were titrated with NaOH and lipase activity was expressed as 1 U = 1 lmol free fatty acid (FFA) released per minute. Hydrolysis of racemic substrate was carried out as described by Piamtongkam et al.4d with the following modifications: substrate 100 mM, buffer Tris–HCl, 100 mM NaCl and 0.2% triton TX100, pH 8.5 (of buffer solution), and 50 mg/mL of enzyme. The mixture was shaken in a Vortex Genie 2 (Brumat, France). Reactions were carried out at 25 °C. Progress of the reaction was followed at regular time intervals by taking samples after phase separation by centrifugation (50 lL diluted in 500 lL hexane). The enantioselectivity value (E-value) was defined as the ratio of the initial rate of (S)-enantiomer production to the initial rate of (R)-enantiomer production (E = rS/rR). Enantiomeric excess (ee) was calculated as defined below: ees = {[R] [S]}s/{[R] + [S]}s (s = substrate). Initial rates were determined by linear regression from concentrations measured by HPLC as follows: the HPLC was equipped with a chiral column: Chiralpack OJ (25 cm 4.6 mm) (Daicel Chemical Industries Ltd, Japan) connected to a UV detector (at 254 nm). A flow rate of 1.0 mL/min was used. The mobile phase was composed of a mixture of n-hexane/isopropanol (80:20 v/v).
1. Smith, S. W. Toxicol. Sci. 2009, 110, 4–30. 2. Carvalho, P. d. O.; Contesini, F. J.; Ikegaki, M. Braz. J. Microb. 2006, 37, 329–337. 3. (a) Holland, G. W.; Jernow, J. L.; Rosen, P. U.S. Patent 4410720, 1983.; (b) Holland, G. W.; Jernow, J. L.; Rosen, P. U.S. Patent 4246402, 1981.; (c) Holland, G. W.; Jernow, J. L.; Rosen, P. U.S. Patent 4187381, 1980.; (d) Guieysse, D.; Salagnad, C.; Monsan, P.; Remaud-Simeon, M. Tetrahedron: Asymmetry 2003, 14, 317–323. 4. (a) Bordes, F.; Cambon, E.; Dossat-Letisse, V.; Andre, I.; Croux, C.; Nicaud, J. M.; Marty, A. ChemBioChem 2009, 10, 1705–1713; (b) Cambon, E.; Piamtongkam, R.; Bordes, F.; Duquesne, S.; Andre, I.; Marty, A. Biotechnol. Bioeng. 2010, 106, 852–859; (c) Cancino, M.; Bauchart, P.; Sandoval, G.; Nicaud, J. M.; Andre, I.; Dossat, V.; Marty, A. Tetrahedron: Asymmetry 2008, 19, 1608–1612; (d) Piamtongkam, R.; Duquesne, S.; Bordes, F.; Barbe, S.; André, I.; Marty, A.; Chulalaksananukul, W. Biotechnol. Bioeng. 2011, 108, 1749–1756. 5. Pinyaphong, P.; Phutrakul, S. Chiang Mai J. Sci. 2009, 36, 359–368. 6. Tecelao, C.; Rivera, I.; Sandoval, G.; Ferreira-Dias, S. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2012, 114, 266–276. 7. You, P.; Su, E.; Yang, X.; Mao, D.; Wei, D. J. Mol. Catal. B Enzym. 2011, 71, 152– 158. 8. Sandoval, G.; Rivera, I.; Barrera-Rivera, K. A.; Martinez-Richa, A. Macromol. Symp. 2010, 289, 135–139. 9. (a) Quintana, P. G.; Sandoval, G.; Baldessari, A. Biocatal. Biotransform. 2011, 29, 186–191; (b) Steinke, G.; Weitkamp, P.; Klein, E.; Mukherjee, K. D. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 647–651. 10. (a) Giordani, R.; Moulin, A.; Verger, R. Phytochemistry 1991, 30, 1069–1072; (b) Campillo-Alvarado, G.; Tovar-Miranda, R. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2013 http:// dx.doi.org/10.1016/j.molcatb.2013.01.015. 11. Cambon, E.; Rodriguez, J. A.; Pina, M.; Arondel, V.; Carriere, F.; Turon, F.; Ruales, J.; Villeneuve, P. Biotechnol. Lett. 2008, 30, 769–774. 12. (a) Rivera, I.; Mateos-Diaz, J. C.; Sandoval, G. In Methods in Molecular Biology, Lipases and Phospholipases; Sandoval, G., Ed.; Springer: New York Heidelberg Dordrecht London, 2012; pp 115–122. Vol. 861; (b) Abdelkafi, S.; Ogata, H.; Barouh, N.; Fouquet, B.; Lebrun, R.; Pina, M.; Scheirlinckx, F.; Villeneuve, P.; Carriere, F. BBA-Mol. Cell Biol. Lipids 2009, 1791, 1048–1056. 13. (a) Ng, I. S.; Tsai, S. W. Biotechnol. Bioeng. 2005, 89, 88–95; (b) Chen, C. C.; Tsai, S. W. Enzyme Microb. Technol. 2005, 36, 127–132; (c) Ng, I. S.; Tsai, S. W. Biotechnol. Bioeng. 2005, 91, 106–113. 14. Joshi, G. K.; Vinay, S. Res. J. Biotechnol. 2007, 2, 50–56. 15. Abdelkafi, S.; Barouh, N.; Fouquet, B.; Fendri, I.; Pina, M.; Scheirlinckx, F.; Villeneuve, P.; Carriere, F. Plant Food Hum. Nutr. 2011, 66, 34–40. 16. (a) Hasan, F.; Shah, A. A.; Hameed, A. Enzyme Microb. Technol. 2006, 39, 235– 251; (b) Casas-Godoy, L.; Duquesne, S.; Bordes, F.; Sandoval, G.; Marty, A. In Methods in Molecular Biology, Lipases and Phospholipases; Sandoval, G., Ed.; Springer: New York Heidelberg Dordrecht London, 2012; pp 3–30. Vol. 861. 17. Rees, G. D.; Robinson, B. H.; Stephenson, G. R. BBA-Lipid Metab. 1995, 1257, 239–248. 18. Lafaquiere, V.; Barbe, S.; Puech-Guenot, S.; Guieysse, D.; Cortes, J.; Monsan, P.; Simeon, T.; Andre, I.; Remaud-Simeon, M. ChemBioChem 2009, 10, 2760–2771. 19. Sandoval, G. C.; Marty, A.; Condoret, J. S. AIChE J. 2001, 47, 718–726. 20. (a) Chang, C. S.; Hsu, C. S. Biotechnol. Lett. 2003, 25, 413–416; (b) Cheng, Y. C.; Tsai, S. W. Tetrahedron: Asymmetry 2004, 15, 2917–2920. 21. Sigma–Aldrich. Universal Protease Activity Assay: Casein as a Substrate. December 2012 http://www.sigmaaldrich.com/life-science/ Accessed learning-center/lifescience-video/universal-protease.html.
Acknowledgments I.R. thanks CONACYT (Mexico) and projects ECOS-ANUIES M08A03, and CB-2008-01-104429 for financial support.
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CAPITULO 3: RESULTADOS 3.2.2 PUBLICACIÓN 4: BIOPOLYMER SYNTHESIS CATALYZED BY TAILORED LIPASES
La capacidad catalítica de diversas enzimas lipolíticas en la formación de polímeros ha sido reportada previamente sobre todo para la enzima comercial de Candida antarctica B N435. Sin embargo, hasta la fecha no existen reportes en los cuales se compare la capacidad catalítica de enzimas lipolíticas vegetales incluyendo el látex y las fracciones parcialmente purrificadas obtenidas en este trabajo en reacciones de polimerización.
La policaprolactona (PCL) es un poliéster alifático biodegradable con un bajo punto de fusión de alrededor de 60°C y una temperatura de transición vítrea de alrededor de 60°C. Este polímero tiene principalmente dos aplicaciones: como aditivo en la fabricación de poliuretanos especiales y resinas. No obstante su aplicación principal es en la industria biomédica como un biomaterial implantable y como un dispositivo para suministro de fármaco, sutura o barrera de adhesión.
Sin embargo, en muchas ocasiones las condiciones de reacción para la formación de estos polímeros por lo que el látex de papaya CPLtx y su fracción parcialmente puríficada CPL-p son hasta la fecha las únicas enzimas de plantas con actividad lipolítica capaces que han sido reportadas en este tipo de reacción. El cual fue evaluado en la siguiente publicación de la revista de arbitraje internacional Macromolecular Symposia.
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CAPITULO 3: RESULTADOS 3.2.3 PUBLICACIÓN 5: Carica papaya LATEX: A LOW-COST BIOCATALYST
FOR
HUMAN
MILK
FAT
SUBSTITUTES
PRODUCTION
Una de las aplicaciones más estudiadas del látex de Carica papaya como catalizador es la producción de diversos lípidos estructurales; los cuales son ampliamente conocidos por sus beneficios a la salud. Por otro lado, es bien conocido los benéficios de la leche materna como la transmisión de inmunidad pasiva y la disminución del riesgo de infecciones respiratorias, digestivas, de las vías aéreas superiores, otitis y obesidad.
Así mismo, muchos de los trabajos existentes respecto a la producción de lípidos estructurados señalan las ventajas de este biocatalizador en comparación con enzimas lipolíticas provenientes de microorganismos, sin embargo hasta la fecha un trabajo en el cual se determinarán las mejores condiciones de reacción para la producción de sustitutos de leche materna no se había realizado empleando este biocatalizador.
Por lo que el presente en el presente trabajo se evaluó diversas condiciones de reacción como radio molar y temperatura para la determinación de las mejores condiciones de reacción para esta síntesis. Este trabajo fue aceptado en la revista de arbitraje internacional European Journal of Lipid Science and Tecnology.
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Research Article Carica papaya latex: A low-cost biocatalyst for human milk fat substitutes production Carla Tecela˜o1,2, Ivanna Rivera3, Georgina Sandoval3 and Suzana Ferreira-Dias2 1
School of Tourism and Maritime Technology, Marine Resources Research Group, Polytechnic Institute of Leiria, Peniche, Portugal 2 Instituto Superior de Agronomia, CEER-Biosystems Engineering, Technical University of Lisbon, Tapada da Ajuda Lisbon, Portugal 3 Centro de Investigacio´n y Asistencia en Tecnologı´a y Disen˜o del Estado de Jalisco (CIATEJ), Guadalajara, Jalisco, Mexico
This work aims at evaluating the potential of Carica papaya lipase (CPL) self-immobilized in papaya latex as a biocatalyst for the synthesis of human milk fat substitutes (HMFS), to be used as a low-cost alternative to commercial lipases. Two different CPL preparations, one extracted from the papaya fruit (CPL I) and the other from petiole leaves (CPL II) of papaya tree, were tested as catalysts for the acidolysis between tripalmitin and (i) oleic acid or (ii) omega-3 PUFA, batchwise, at 608C, in solvent-free media. After 24 h, molar incorporation was higher for oleic acid (22.1 mol%) when CPL I was used. This biocatalyst was selected for further studies. RSM was used to model reaction conditions: medium formulation (molar ratio oleic acid/tripalmitin, MR, 1.2:1–6.8:1) and temperature (58–728C). Acyl migration decreased with MR increase. In batch operational stability assays at 608C, using MR of 2:1 and 6:1, the highest stability was observed for a MR of 2:1. Practical applications: The use of this biocatalyst is a feasible way to valorize papaya agro-residues which represent an important environmental problem in the producing countries. The obtained results were rather promising since, with this almost zero-cost biocatalyst, it was possible to produce a high added-value product (HMFS). Under optimized conditions, the obtained results were comparable with those obtained with expensive immobilized commercial lipases. Keywords: Acidolysis / Carica papaya wastes / Human milk fat substitutes / Latex / Lipase
Received: June 27, 2011 / Revised: November 18, 2011 / Accepted: December 2, 2011 DOI: 10.1002/ejlt.201100226
1 Introduction In human milk fat (HMF), the sn-2 position of TAGs is essentially occupied by saturated fatty acids (70% of all palmitic acid), while unsaturated fatty acids are esterified at sn-1 and sn-3 positions. This is in contrast to what occurs in vegetable oils and ruminant milk fat, where unsaturated
Correspondence: Professor Suzana Ferreira-Dias, Instituto Superior de Agronomia, CEER-Biosystems Engineering, Technical University of Lisbon, Tapada da Ajuda, 1349-017 Lisbon, Portugal E-mail:
[email protected] Fax: þ351 21 3653200 Abbreviations: CPL, Carica papaya lipase; CCRD, central composite rotatable design; FFA, free fatty acids; HMF, human milk fat; HMFS, human milk fat substitutes; OPO, 1,3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol
ß 2011 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
fatty acids are predominantly in sn-2 position [1]. The fatty acid profile of HMF has a crucial effect on its digestion and intestinal absorption in the infants. In fact, the presence of palmitic acid in the sn-2 position provides a more efficient absorption of palmitic acid, as sn-2 monoacylpalmitate [2]. The use of vegetable oils or cow milk fat as a substitute of HMF in infant formulas may cause a deficient calcium and fatty acid absorption, due to the formation of insoluble calcium soaps with saturated fatty acids released by the action of the sn-1,3 specific pancreatic lipase [3]. The production of structured lipids resembling HMF has been a challenge for the food industry. The synthesis of human milk fat substitutes (HMFS) has been carried out making use of lipases (TAG acylhydrolases, E.C. 3.1.1.3.) as biocatalysts. Lipases are versatile enzymes that naturally catalyze the hydrolysis of acylglycerols at oil/water interfaces but, in non-aqueous media under low-water activity, they are also effective www.ejlst.com
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catalysts for esterification and interesterification reactions. Lipases present recognized advantages compared to classical chemical catalysts namely operations under mild conditions (normal pressure and temperatures below 708C) and high selectivity (regio-, stereo-, typo-, and substrate selectivities), leading to a decrease in side products formation [4]. Nowadays, BetapolTM, a commercial structured lipid made of vegetable oils by position-specific enzymatic interesterification, is used as HMFS in both premature and term infant formula. This product is manufactured by Lipid Nutrition, Wormerveer, in the Netherlands (http://www.lipidnutrition. com, May 2011). In the reported studies, HMFS have been obtained by sn1,3 lipase-catalyzed (i) acidolysis of tripalmitin, butterfat, or lard (rich in palmitic acid in sn-2 position) with free fatty acids (FFA) from different sources [3, 5–10] or (ii) interesterification of tripalmitin with blends of vegetable oils [11, 12]. Also, several research groups have focused on multistep reactions for the synthesis of 1,3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol (OPO), an important structured TAG in infant formulas. Schmid et al. [13] performed the highly selective synthesis of OPO by the following two-step process: (i) alcoholysis of tripalmitin in dry ethanol catalyzed by sn-1,3 regioselective immobilized lipases from Rhizopus delemar and from Rhizomucor miehei yielding 2-monopalmitin that was isolated by crystallization and (ii) esterified with oleic acid using the same lipases. Recently, Qin et al. [14] prepared OPO also by a two-step process: (i) dry fractionation of leaf lard at a crystallization temperature of 348C and (ii) enzymatic acidolysis of the fractionated leaf lard with camellia oil fatty acids catalyzed by Lipozyme RM IM. Using palm oil as starting material, it was possible to synthesize OPO by a three-step process consisting of: (i) low-temperature fractionation of palm oil FA in acetone, yielding a palmitic acid-rich fraction and an oleic acid-rich fraction, and subsequent selective enzymatic esterification of palmitic acid into ethyl palmitate, followed by (ii) esterification of ethyl palmitate with glycerol, catalyzed by Novozym 435 under vacuum, for the synthesis of tripalmitin and finally (iii) the production of OPO by acidolysis of tripalmitin with oleic acid, catalyzed by Lipozyme IM 60 [15]. Palm stearin, which is a fraction of palm oil, was chemically interesterified and used in lipase-catalyzed acidolysis with a blend of FA from rapeseed, sunflower, or palm kernel oils, stearic acid and myristic acid, in solvent-free media, for HMFS production [16]. In the majority of these studies high-cost sn-1,3 regioselective immobilized commercial lipases, most of them from microbial sources, have been used. Nevertheless, lipases extracted from plants show some advantages over the microbial counterparts, namely the lower cost, the ready availability combined with a wide versatility and stability in organic media [17, 18]. Among them, Carica papaya lipase (CPL) has emerged as a promising biocatalyst for oil and fats restructuring [19–21]. ß 2012 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
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Carica papaya L. is an unbranched tree native from the Central America which is easily adapted to tropical and subtropical climates. Brazil and Mexico are the biggest producers of papaya fruit, followed by Nigeria and India (FAO, 2011). Its genome has been recently sequenced [22]. Due to bacterial and viral diseases, papaya plantations must be remade every 1–2 years, resulting in c.a. 7 million tons of agrowastes worldwide per year. Papaya wastes contain unripe and sick fruits that are rich in hydrolases in their latex, namely papain (an endoprotease), which is water soluble, and lipases that are strongly attached to the insoluble fraction of the latex. Following washing of the papain, the highly hydrophobic lipases remain strongly attached to the insoluble fraction of the latex and therefore, self-immobilized. After drying and milling, the biocatalyst is ready for use. The use of CPL, recovered from C. papaya plantations, is a mean of upgrading these agro-wastes. The interest on CPL has greatly increased in recent years. Even though it has been reported since 1935, as probably being a mixture of enzymes, it has not yet been completely characterized so far [23]. It is a versatile naturally immobilized biocatalyst successfully tested in the following applications: (i) modification of fats and oils, based on its sn-3 stereoselectivity [24, 25] and sn-1,3 regioselectivity [20, 26], as well as on its preference for short-chain fatty acids; (ii) esterification and interesterification reactions in organic media, accepting a wide range of acids and alcohols as substrates; (iii) the asymmetric resolution of different nonsteroidal anti-inflammatory drugs, and non-natural amino acids and (iv) biopolymers [19, 27]. The use of a commercial extract of CPL as catalyst for the synthesis of HMFS, by interesterification of tripalmitin with fatty acid alkyl esters or low-erucic rapeseed oil fatty acids, in solvent-free media, has been described [26, 28, 29]. The aim of this study was to investigate the potentialities of the non-commercial CPL as biocatalyst for the synthesis of HMFS to be used as a low-cost alternative to the commercial immobilized lipases used in the majority of the studies. Firstly, two enzyme preparations, one extracted from the fruit and the other from the petiole leaves of papaya tree, were tested for the ability to catalyze the acidolysis of tripalmitin with oleic acid or omega-3 PUFA, in solvent-free media. The biocatalyst that led to the highest incorporation of fatty acids in the glycerol backbone was selected for further investigation. Modeling and optimization of reaction conditions (medium formulation and temperature) were attempted by RSM. Also, the characterization of modified TAG obtained after 24-h batch reactions of tripalmitin with oleic acid at MR oleic acid/tripalmitin of 2:1 and 6:1, concerning the total fatty acid (mol%) and the fatty acid regiodistribution (mol%), was performed. Batch operational stability tests of the biocatalyst using different molar ratios www.ejlst.com
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C. Tecela˜o et al.
Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2012, 114, 266–276
were also performed. This aspect is of great importance since one of the main constraints to the use of immobilized lipases at industrial scale has been their relatively low-operational stability.
2.2 Methods
2 Materials and methods
The hydrolytic activity of both CPL preparations, obtained from the fruit (CPL I) or from petiole leaves (CPL II), was assayed using the method described by Soares et al. [31], after modification: 50 g of extra virgin olive oil were mixed with 50 g of distilled water and 3.5 g of gum arabic. This mixture was stirred for 10 min. Then, 80 mL of phosphate buffer solution (pH 7.0; 0.1 M) were added and the final emulsion homogenized in an ultraturrax. Nine milliliters of this emulsion were put in a 20 mL closed thermostated cylindrical batch reactor, at 608C, under magnetic stirring. After 15 min, 0.05 g of enzyme preparation was added and the hydrolysis was allowed to proceed for 5 min. After this time, 20 mL of a solution of ethanol/acetone (1:1 v/v) was added in order to inactivate the enzyme. The amount of FFA released during hydrolysis was determined by direct titration with a 0.1 N sodium hydroxide aqueous solution, using phenolphthalein as indicator. In parallel, blank experiments were carried out in the absence of enzyme. Each experiment was performed in triplicate. The temperature of 608C was chosen for hydrolytic activity assays, in order to be able to compare these results with the acidolysis activity values obtained in solvent-free media, at the same temperature. One unit of hydrolytic activity was defined as 1 mmole of FFA released per minute.
2.1 Materials 2.1.1 Chemicals Tripalmitin (95% purity; MW ¼ 807.35), 20 ,70 -dichlorofluorescein and methyl myristate standard (>99%) were obtained from Fluka; extra pure oleic acid (MW ¼ 282.5) was from Merck and the commercial concentrate of TAGs rich in omega-3 PUFA, EPAX 1050TG (about 10% eicosapentaenoic acid, EPA, and 50% docosahexaenoic acid, DHA), was a gift from EPAX AS, Lysaker, Norway (http://www.epax.com/filestore/EPAX1050TG2.pdf); Portuguese extra virgin olive oil (0.7% FFA) was purchased in a local market. Silica-Gel 60 (0.25 mm width, 20 20 cm2) TLC plates were purchased from Merck. The standards of triolein, diolein (mixed isomers) and monoolein were from Sigma–Aldrich. Hog pancreas lipase (30.1 U/mg) was purchased from Fluka. The other reagents used were p.a. and obtained from various sources.
2.1.2 Enzyme preparations Carica papaya lipase extracts from unripe or sick plants are more active because they contain higher levels of defensive enzymes [19]. Plant material was collected in Cihuatlan, Jalisco (Mexico). CPL I: The latex from unripe or sick fruits was recovered by making longitudinal incisions of 3–4 mm on fruits. The endo-proteases were washed out and the strongly hydrophobic lipases remained attached to the solid fraction, selfimmobilized. The partial purification was achieved by successive cold (48C) water washes and centrifugation at 6000 r.p.m. for 20 min, followed by freeze-drying milling and sieving (mesh 10). CPL II: Preparation of the biocatalyst was carried out as for CPL I, but the starting plant material was petiole juice and centrifugation was performed at 10 000 r.p.m. for 5 min. The 30–40 mesh freeze-dried powder was kept as biocatalyst. Although delipidation could be performed by organic solvent washing, CPL I and CPL II were not delipidated because the loss of activity and stability after delipidation. Lipid content and composition of CPL I and CPL II were not determined as their concentrations are negligible compared to those of the substrates and since the reactions samples were accurately analyzed by chromatography. ß 2012 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
2.2.1 Assessment of hydrolytic activity of lipase preparations
2.2.2 Preparation of free omega-3 PUFA In order to obtain free omega-3 PUFA, EPAX 1050TG was saponified according to the method described by Sahı´n et al. [3], after modification. A mixture of EPAX 1050TG (25 g), potassium hydroxide (5.75 g), 11 mL of water and 66 mL of 95% v/v aqueous ethanol, was added to a flask equipped with a Liebig condenser and maintained in reflux at 1008C for 60 min. Distilled water (50 mL) was added to the saponified mixture and transferred to a separating funnel, where the unsaponifiable matter was extracted by n-hexane (2 100 mL) and discarded. The aqueous layer containing the saponified matter was acidified to pH 1.0 with 3 N HCl. The released FFA were extracted with n-hexane (50 mL) and dried with anhydrous sodium sulfate. Sodium sulfate was removed by paper filtration and n-hexane was evaporated in a rotavapor at 408C and a pressure lower than 200 mbar. A TLC of the obtained FFA was performed (c.f. Section 2.2.6) in order to confirm the efficiency of the process. The obtained FFA were stored at 188C under nitrogen until use.
2.2.3 Interesterification reaction Interesterification reactions were performed batchwise in closed thermostated cylindrical batch reactors (20 mL), at www.ejlst.com
132
Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2012, 114, 266–276
the desired temperature (c.f. Section 2.2.4), under magnetic stirring. The reaction medium consisted of a blend of tripalmitin and oleic acid or omega-3 PUFA. A load of 5% (w/w of total lipids) of the self-immobilized enzyme was added to the reaction medium, after complete melting. This load is currently used in interesterification experiments without problems of mass transfer limitation [32]. Prior to and at different reaction times, 1 mL samples were taken and the biocatalyst was removed by paper filtration at approximately 708C. All samples were stored at 188C for subsequent analysis. All the experiments were carried out in triplicate. For each system, molar incorporation degree (%) was calculated on the basis of the molecular weight of oleic acid or DHA (282.5 and 328.5, respectively).
2.2.4 Experimental design RSM was used to model and optimize the reaction conditions [33]. A five-level central composite rotatable design (CCRD) dictated the experimental conditions, as a function of two factors: temperature (58–728C) and reaction medium formulation (molar ratio oleic acid/tripalmitin; 1.2:1–6.8:1). A total of 11 assays with three replicates of the center point were generated. Experiments were conducted randomly, according to the methodology described in Section 2.2.3. The minimum temperature tested was dictated by the melting point of reaction media (melting point of tripalmitin ¼ 668C). The enzyme load was maintained constant at 5% (w/w of total lipids). After 24 h reaction, the medium was separated from the enzyme by paper filtration in an oven at approximately 708C and stored at 188C for subsequent analysis.
2.2.5 Batch operational stability tests The operational stability of the biocatalyst was evaluated in consecutive 23 h batches, at 608C. Interesterification was carried out as previously described (c.f. Section 2.2.3), considering two different molar ratios oleic acid/tripalmitin (2:1 and 6:1). After each batch, the biocatalyst was removed from the reaction medium by paper filtration and reused in the next batch with fresh medium, under the same reaction conditions. A total of up to seven batches were performed using the same biocatalyst sample. The molar incorporation degree of oleic acid in tripalmitin, observed at the end of each batch, was used as a measure of the activity of the biocatalyst in that batch. The first batch was used as the reference (100% activity). The residual activity (an, %) of the biocatalyst at the end of each batch n (n ¼ 1,. . .,7) was thus estimated as follows: IncorporationBatch n 100 (1) an ¼ IncorporationBatch 1 ß 2012 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
269
2.2.6 Analysis of reaction products 2.2.6.1 Evaluation of incorporation degree To determine the amount of oleic acid or omega-3 PUFA incorporated in TAG, the following procedure was followed for each sample: 0.15 g of the reaction medium was dissolved in 25 mL of chloroform p.a. and 200 mL of this solution was spotted on a continuous layer on a silica gel TLC plate. Elution was carried out in n-hexane/diethyl ether/acetic acid (70:30:1.5 by volume) as the mobile phase. Plates were sprayed with 0.2% w/v 20 ,70 -dichlorofluorescein in 95% ethanol and observed under UV at 366 nm. The various groups of compounds (TAGs, FFA, DAGs, and MAGs) were identified by comparison with standards. The TAG band was scrapped off and methylated, in order to be assayed as FAME by GC. For methylation, the silica gel containing TAG was mixed with 5 mL of methylation reagent (anhydrous methanol/n-hexane/concentrated sulfuric acid; 75:25:1 by volume), in a conical flask equipped with a Liebig condenser. This mixture was allowed to boil under reflux for 60 min in a water bath at about 808C. Then, 10 mL of distilled water and 10 mL of petroleum ether were added and the mixture was transferred to a separating funnel, vigorously agitated and allowed to settle for phase separation. The organic upper layer was recovered, washed twice with distilled water (2 10 mL) and dried with anhydrous sodium sulfate. Sodium sulfate was removed by paper filtration, the solution was transferred to a conical-bottom flask and the solvent was evaporated in a rotavapor at 308C under a pressure lower than 200 mbar. FAME were dissolved in 100 mL of 0.1% w/v methyl myristate (internal standard) in n-hexane solution and 1 mL of this solution was GC analyzed. A Finnigan TRACE GC Ultra gas chromatograph (Thermo Electron Corporation) equipped with a Thermo TR-FAME capillary column (30 m 0.25 mm ID 0.25 mm film), an auto sampler AS 3000 from Thermo Electron Corporation and a FID, was used for FAME analysis. Injector (in splitless mode) and detector temperatures were set at 250 and 2608C, respectively. Helium was used as carrier gas at a flow rate of 1.5 mL/min. Air and hydrogen were supplied to the detector at flow rates of 350 and 35 mL/min, respectively. For the analysis of samples from the system of acidolysis of tripalmitin with oleic acid, the oven temperature program was as follows: 608C for 1 min, a temperature increase to 1508C at 158C/min, a plateau at 1508C for 1 min, followed by temperature increase to 1808C at 58C/ min, a plateau at 1808C for 3 min, an increase in temperature until 2208C, at a rate of 108C/min and a final plateau at 2208C for 1 min. For the analysis of samples from the system of acidolysis of tripalmitin with omega-3 PUFA, the oven temperature program was as follows: 608C for 1 min, a temperature increase to 1508C at 158C/min, a plateau at 1508C for www.ejlst.com
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1 min, followed by temperature increase to 2208C, at a rate of 58C/min and a final plateau at 2208C for 10 min.
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Concerning the statistical analysis of FA composition of structured TAG, ANOVA of molar values was carried out, using LSD post hoc multiple comparison tests.
2.2.6.2 Fatty acid composition in the sn-2 position 2.2.8 Validation of the model The fatty acid composition in the sn-2 position of the modified TAGs was determined according to the following protocol, adapted from Sahı´n et al. [6, 7]: each sample (1 g of fat) obtained after 24-h enzymatic acidolysis was dissolved in chloroform (5 mL) and 300 mL of this solution was spotted in a continuous layer on a silica gel TLC plate and developed as previously described (c.f. Section 2.2.6.1). The band corresponding to the TAG fraction was scrapped off, the TAG fraction was extracted by diethyl ether (3 5 mL) and the solvent evaporated in a rotavapor. TAGs were re-suspended in 2 mL 0.1 M Tris-HCl aqueous buffer (pH 8.0) with 0.5 mL of 0.1% w/v sodium cholate aqueous solution and 0.2 mL of 22% w/v calcium chloride aqueous solution. Pancreatic lipase (50 mg) was added to this mixture and the hydrolysis was carried out at 408C. After 5 min, the reaction was stopped by the addition of 1 mL 6 N HCl aqueous solution; 3 mL of ethyl ether was added and the mixture was centrifuged for 5 min at 1200 g. The upper organic layer was recovered, the solvent evaporated, the extract was re-suspended in 300 mL of diethyl ether and spotted in a continuous layer on a silica gel TLC plate and developed. The band corresponding to the sn-2 MAGs was scrapped off, methylated and GC analyzed as previously described (c.f. Section 2.2.6.1).
2.2.7 Statistical analysis The software StatisticaTM, version 5, from Statsoft, Tulsa, USA, was used to analyze the results of the CCRD and the results of FA composition of structured TAG (total FA and in the sn-2 position). Both linear and quadratic effects of each factor under study, as well as their linear interaction, on acidolysis reaction were calculated. Their significance was evaluated by ANOVA. A three-dimensional surface, described by a second-order polynomial equation, was fitted to the experimental values of the CCRD. First- and secondorder coefficients of this equation were estimated from the experimental data by using the statistical principle of least squares. The goodness of fit of the model was evaluated by the determination coefficients (R2) and adjusted R2 (R2adj ). The R2 value provides a measure of how much of the variability in the observed response values can be explained by the experimental factors and their interactions. R2adj is an unbiased estimate of the coefficient of determination and is always smaller than R2. High values of both R2 and R2adj suggest a good fit of the model to the experimental data. In practice, R2 should be at least 0.75 or greater; values above 0.90 are considered to be very good [33]. ß 2012 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
In order to validate the polynomial model fitted to the experimental data points and to investigate when the reaction equilibrium was reached, a time-course was carried out at 608C for 48 h, using a molar ratio oleic acid/tripalmitin of 6:1 (c.f. Section 2.2.3), The incorporation value obtained after 24 h reaction time was compared with that predicted by the model.
3 Results and discussion 3.1 Hydrolytic activity and fatty acid selectivity in acidolysis The hydrolytic activity of both enzyme preparations from C. papaya, one obtained from the fruit (CPL I) and the other extracted from petiole leaves (CPL II) of papaya tree, was determined at 608C using virgin olive oil as substrate. The enzymes from the fruit and from petiole leaves presented hydrolytic activities of 387 U/g (std ¼ 56.6) and 207 U/g (std ¼ 28.3), respectively. These enzymes were used as catalysts for the acidolysis of tripalmitin with oleic acid or omega-3 PUFA, at 608C, using 2:1 mole ratio (FFA/tripalmitin). For each system, the molar incorporation degree is presented in Table 1. After 24 h reaction, the highest levels were observed with CPL I (22.1 mol%), when oleic acid was used as the acyl donor. The biocatalyst was less efficient when omega-3 PUFA were incorporated in tripalmitin, reaching only 8.4 mol% incorporation. With CPL II, only residual incorporation of oleic acid was attained (3.2 mol%) and no incorporation of omega-3 PUFA was detected. These results show that hydrolytic activity is not directly related with the acidolysis activity of the lipases, as previously reported [34, 35]. When CPL II was previously tested as catalyst for the hydrolysis of PNP esters, a preference toward long chain fatty acids was observed (unpublished data). Conversely, CPL I usually prefers short chain fatty acids over long chain fatty
Table 1. Average incorporation values (mol%) of oleic acid or omega-3 PUFA in tripalmitin, upon 24-h acidolysis reaction catalyzed by CPL extracted from the fruit (CPL I) or from the petiole leaves (CPL II; WSD; three repetitions) Acyl donor type
CPL I
CPL II
Oleic acid Omega-3 PUFA
22.1 0.25 8.74 0.00
3.20 0.00 n.d.
n.d., not determined. www.ejlst.com
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acids [25]. Lower hydrolytic and acidolysis activities of CPL II, observed in the present study, may be explained by a thermal deactivation of this enzyme. Therefore, CPL extracted from the fruit (CPL I) was selected for further experiments on acidolysis of tripalmitin with oleic acid. With this enzyme, a time-course reaction was performed under the same operational conditions (Fig. 1): quasi-equilibrium was attained after 30 h reaction with oleic acid incorporation of about 24.1 mol%. The oleic acid incorporation in tripalmitin (22.1 mol%), achieved after 24 h reaction using CPL I, was not much lower than the obtained values, reported in our previous work (c.a. 27 mol%), where three commercial immobilized lipases (Novozym 435, Lipozyme RM IM and Lipozyme TL IM, from Novozymes, Denmark) were used. The incorporation of omega-3 PUFA in tripalmitin, catalyzed by CPL I, was similar to that obtained when Lipozyme TL IM (c.a. 8 mol%) was used [9]. The observed preference of CPL toward oleic acid instead of omega-3 PUFA is in accordance with the reported typoselectivity of this lipase in the esterification of FFA with 1butanol. In these studies, CPL presented the ability to discriminate against fatty acids with cis-4 (e.g., DHA; C22:6 omega-3), and cis-6 (e.g., GLA, C18:3 omega-6), while acyl exchanges of cis-5 fatty acid (e.g., EPA, C20:5 omega-3), or cis-9 (e.g., oleic acid, C18:1 omega-9, or ALA, C18:3 omega3) were preferred [36]. In fact, DHA was the major fatty acid present in EPAX 1050TG, used as the source of omega-3 PUFA in this study. Also, the preference of CPL toward FFA over alkyl esters as acyl donors, has been demonstrated in several transesterification reactions [25, 37]. Moreover, studies concerning the selectivity of CPL toward different fatty acid alkyl esters in the interesterification of tripalmitin, have been reported [28, 29]. Carica papaya lipase was also used as catalyst for the interesterification between tripalmitin and ethyl esters
271
(C2–C14 saturated acids and C18:1), in solvent-free media at 638C (668C in the cases of ethyl myristate and ethyl oleate), using a substrate ratio of 2:1 (ethyl ester/tripalmitin). After 24 h reaction, the incorporation of the acyl moieties increased with time and chain length of the ethyl ester, except for ethyl oleate [29]. In the interesterification of tributyrin with unsaturated TAG, in n-hexane, catalyzed by crude papain, triolein reacted faster than polyunsaturated TAG such as trilinolein and tri-alinolein [38].
3.2 Modeling reaction conditions In order to model acidolysis of tripalmitin with oleic acid, catalyzed by CPL I, a set of 11 experiments following a CCRD as a function of both temperature (T) and MR was performed. The obtained results are presented in Table 2. The effect of enzyme load on oleic acid incorporation degree was not investigated since (i) using a crude C. papaya latex extract, some variation was expected on enzymatic activity with variety, geographic localization, and plantation [39]; and (ii) the optimized values for temperature and molar ratio do not depend on the amount of enzyme used. Therefore, the optimization of latex load must be carried out for each extract used. To investigate the role of the factors T and MR on the acidolysis reaction, linear and quadratic effects of each factor, as well as their linear interaction on the oleic acid incorporation (mol%) values were calculated (Table 3). Only the variable MR showed a significant positive linear effect on oleic acid incorporation. Quadratic negative effect was observed for the variable temperature, indicating a convex response surface. Although no significant effects for the interaction T MR and for MR quadratic term were detected, these variables could not be neglected for oleic acid incorporation. In fact, variables that exhibited a significant effect Table 2. Central composite rotatable design followed in the experiments as a function of temperature (T) and the molar ratio (MR) of oleic acid/tripalmitin used and respective values of oleic acid incorporation (mol%), after 24 h reaction, catalyzed by CPL I Experiment no.
Figure 1. Time-course of oleic acid incorporation obtained in the acidolysis reaction of tripalmitin and oleic acid (MR ¼ 2:1, oleic acid/ tripalmitin), catalyzed by CPL I. ß 2012 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
T (8C)
MR (oleic acid/ tripalmitin)
Oleic acid incorporation (mol%)
60 60 70 70 58 72 65 65 65 65 65
2:1 6:1 2:1 6:1 4:1 4:1 1.2:1 6.8:1 4:1 4:1 4:1
28.4 41.5 28.3 34.3 28.0 33.0 29.9 38.7 37.1 38.4 39.0
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Table 3. Effects and respective p levels (values between brackets) of temperature (T) and molar ratio (MR) of oleic acid/tripalmitin used in CCRD and respective linear interactions on the values of oleic acid incorporation (mol%), after 24 h reaction, catalyzed by CPL I Oleic acid incorporation (mol%)
Factor T (linear term) T (quadratic term) MR (linear term) MR (quadratic term) T MR
0.074 (0.970) 7.34 (0.022) 7.93 (0.008) 3.48 (0.179) 3.57 (0.230)
( p 35% were kept.
161
CAPITULO 3: RESULTADOS 3.4
COMPARATION WITH MICROBIAL LIPASES
Genomic analysis for Thermomyces lanuginosus, Rhizomucor miehei and Rhizopus niveusand Candida antarctica B lipases in Carica papaya in order to observe a relationship between microbial lipases and Carica papaya lipases. It is corroborating that several microbial lipases are homologues to plant lipases with the same domain, which can be useful in future analysis of the tridimensional structure prediction of plant lipases. Only members of the Class 3 Lipase family are found to be homologues with the selected microbial lipases. Table 9 shows the eleven members of the Class 3 Lipase family are homologues to three selected lipases.
Table 9 Carica papaya lipases homologues to microbial lipases. Protein
% Similarity
% Identity
% Hydrophobicity
Thermomyces lanuginosus (Gene Bank O59952 PDB code 1GT6) 229.15
50.9
25.0
36.92
672.1
52.5
23.0
33.02
49.30
48.5
22.1
38.72
52.88
38.1
20.1
34.52
22.75
50.3
22.3
30.59
36.137
42.3
18.7
36.08
55.143
46.3
19.5
35.77
16.128
55.4
28.2
37.12
107.70
47.7
19.3
34.93
7.64
49.1
22.0
33.33
25.136
46.4
18.6
35.76
209.20
46.8
21.3
35.11
164.12
46.8
20.7
32.46
Rhizopus niveus (Gene bank P61872 PDB code 1LGY) 229.15
47.4
19.8
36.92
162
CAPITULO 3: RESULTADOS 672.1
48.5
23.7
33.02
49.30
54.9
27.2
38.72
52.88
65.2
30.4
34.52
22.75
47.8
21.0
30.59
36.137
54.9
27.5
36.08
55.143
39.5
19.1
35.77
16.128
45.5
20.9
37.12
107.70
54.1
27.4
34.93
164.12
48.7
22.5
32.46
37.13
61.8
32.5
36.21
Rhizomucor miehei (Gene bank P19515 code 3GTL) 229.15
44.7
19.5
36.92
672.1
47.7
20.6
33.02
49.30
37.0
19.3
38.72
52.88
57.7
26.9
34.52
22.75
45.0
20.9
30.59
36.137
54.5
31.2
36.08
55.143
36.5
21.8
35.77
16.128
49.3
24.5
37.12
164.12
45.5
213
32.46
37.13
60.7
28.7
36.21
209.2
45.5
22.3
35.11
25.136
48.2
19.9
35.76
Candida antarctica B (PDB code 3ICV) None data retrieved
4. CONCLUSIONS Our current genomic analysis, presents fundamental information on the organization of the 55 and 23 members of the GDSL and class 3 lipase genes families. These families
163
CAPITULO 3: RESULTADOS or proteins are involved in response to abiotic or biotic stress and different stages of growing.
Further data such as 3-D modeling and recombinant expression of these proteins are required in order to understand their physiological roles and specificity. However this study provides a platform for selection of candidate genes for further detailed studies.
5. REFERENCES. 1.
Casas-Godoy, L., et al., Lipases: an overview. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 2012. 861: p. 3-30.
2.
Villeneuve, P., et al., Customizing lipases for biocatalysis: a survey of chemical, physical and molecular biological approaches. Journal of Molecular Catalysis BEnzymatic, 2000. 9(4-6): p. 113-148.
3.
Akoh, C.C., et al., GDSL family of serine esterases/lipases. Progress in Lipid Research, 2004. 43(6): p. 534-552.
4.
Abdelkafi, S., et al., Identification and biochemical characterization of a GDSLmotif carboxylester hydrolase from Carica papaya latex. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology of Lipids, 2009. 1791(11): p. 10481056.
5.
Dhouib, R., et al., Identification of a putative triacylglycerol lipase from papaya latex by functional proteomics. FEBS Journal, 2011. 278(1): p. 97-110.
6.
Abdelkafi, S., et al., Identification of a new phospholipase D in Carica papaya latex. Gene, 2012. 499(2): p. 243-249.
164
CAPITULO 3: RESULTADOS 7.
Rivera, I., J.C. Mateos-Diaz, and G. Sandoval, Plant Lipases: Partial Purification of Carica papaya Lipase. Methods in molecular biology, Lipases and phospholipases, 2012. 861: p. 115-22.
8.
Ming, R., et al., The draft genome of the transgenic tropical fruit tree papaya (Carica papaya Linnaeus). Nature, 2008. 452(7190): p. 991.
9.
Ling, H., Sequence analysis of GDSL lipase gene family in Arabidopsis thaliana. Pakistan journal of biological sciences: PJBS, 2008. 11(5): p. 763-7.
10.
Volokita, M., et al., Combining Comparative Sequence and Genomic Data to Ascertain Phylogenetic Relationships and Explore the Evolution of the Large GDSL-Lipase Family in Land Plants. Molecular Biology and Evolution. 28(1): p. 551-565.
11.
Cao, D., et al., Gibberellin mobilizes distinct DELLA-dependent transcriptomes to regulate seed germination and floral development in arabidopsis. Plant Physiology, 2006. 142(2): p. 509-525.
12.
Riemann, M., et al., GER1, a GDSL motif-encoding gene from rice is a novel early light- and jasmonate-induced gene. Plant Biology, 2007. 9(1): p. 32-40.
13.
Lee, K.A. and T.J. Cho, Characterization of a salicylic acid- and pathogeninduced lipase-like gene in Chinese cabbage. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2003. 36(5): p. 433-441.
14.
Oh, I.S., et al., Secretome analysis reveals an Arabidopsis lipase involved in defense against Alternaria brassicicola. Plant Cell, 2005. 17(10): p. 2832-2847.
165
CAPITULO 3: RESULTADOS 15.
Broun, P., et al., WIN1, a transcriptional activator of epidermal wax accumulation in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004. 101(13): p. 4706-4711.
16.
Kannangara, R., et al., The transcription factor WIN1/SHN1 regulates cutin biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Plant Cell, 2007. 19(4): p. 1278-1294.
17.
Eastmond, P.J., Cloning and characterization of the acid lipase from castor beans. Journal of Biological Chemistry, 2004. 279(44): p. 45540-45545.
18.
Ishiguro, S., et al., The defective in anther dehiscence1 gene encodes a novel phospholipase A1 catalyzing the initial step of jasmonic acid biosynthesis, which synchronizes pollen maturation, anther dehiscence, and flower opening in Arabidopsis. Plant Cell, 2001. 13(10): p. 2191-2209.
19.
Szalontai, B. and G. Jakab, Differential expression of prlips, a pathogenesisrelated gene family encoding class 3 lipase-like proteins in arabidopsis. Acta Biologica Hungarica, 2010. 61: p. 156-171.
20.
Lu, Y.T., M.A.N. Dharmasiri, and H.M. Harrington, Characterization of a cdnaencoding a novel heat-shock protein that binds to calmodulin. Plant Physiology, 1995. 108(3): p. 1197-1202.
21.
Li, W., et al., Analysis of Arabidopsis genes encoding putative class III lipases. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology, 2012. 21(2): p. 261-267.
22.
Reddy, V.S., G.S. Ali, and A.S.N. Reddy, Genes encoding calmodulin-binding proteins in the Arabidopsis genome.Journal of Biological Chemistry, 2002. 277(12): p. 9840-9852.
166
CAPITULO 3: RESULTADOS 3.3.2 PUBLICACIÓN 7: FUNCTIONAL EXPRESSION OF CpEst LIPOLYTIC ENZYME FROM Carica papaya IN Yarrowia lipolytica AND ITS APPLICATION TO RESVERATROL ACETYLATION
La expresión heteróloga de proteínas es una estrategia interesante para la caracterización y obtención de proteínas en una mayor cantidad. Yarrowia lipolytica es una levadura no convencional con propiedades interesantes como sistema de expresión ya que es capaz de realizar modificaciones post-traduccionales de los organismos superiores, además de presentar un rápido crecimiento y un alto nivel de excreción al medio.
Por lo que en el siguiente artículo se selecciono una proteína lipolítica previamente aislada del látex de Carica papaya para ser expresada utilizando Yarrowia lipolítica como sistema de expresión. Esta proteína conocida como CpEst fue posible expresada de forma funcional y excretrada al medio de cultivo; además de presentar preferencia por triglicéridos de cadena corta.
167
CAPITULO 3: RESULTADOS FUNCTIONAL EXPRESSION OF CPEST LIPOLYTIC ENZYME FROM CARICA PAPAYA IN YARROWIA LIPOLYTICA AND ITS APPLICATION TO RESVERATROL ACETYLATION Ivanna Riveraa,b, Sophie Duquesnea, Georgina Sandovalb Alain Martya and Francisco Plouc a
Université de Toulouse; INSA, UPS, INP; LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077
Toulouse, France INRA, UMR792 Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400 Toulouse, France b
Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco
(CIATEJ). Av. Normalistas # 800 Colinas de la Normal. 44270 Guadalajara, Jalisco. México. c
Applied Biocatalysis Group, CSIC Institute of Catalysis, 28049 Madrid, Spain
ABSTRACT Lipolytic activity present in Carica papaya latex has been widely reported since 1925. Until today, only one lipolytic enzyme, CpEst, was isolated directly from latex and partially characterized. Other enzymes isolated by proteomic analysis were hardly produced as recombinant in heterologous host. Both strategies only enabled a low quantity of enzyme to be obtained, preventing their application in synthesis reactions. Heterologous expression of CpEst presents an alternative to tedious purification processes from latex, and therefore an opportunity to better characterized and study the catalytic performance of this protein towards different synthesis reactions.
168
CAPITULO 3: RESULTADOS In this work, Carica papaya esterase (CpEst) was successfully cloned and produced using Yarrowia lipolytica as an expression host. Thermal stability and optimal temperature of 35°C and pH 8.5°C for the soluble extract were determined. Finally this enzyme was immobilized and tested in resveratrol acetylation where 73% of total conversion was obtained after 260 hours of reaction.
KEY WORDS: Carica papaya esterase, Yarrowia lipolytica, recombinant protein, acetylation.
1. INTRODUCTION Lipases are defined as triacylglycerol acylhydrolases capable of hydrolyzing carboxyl esters of long chain acylglycerols into acids and glycerol (Casas-Godoy et al. 2012). Lipases are very versatile biocatalysts capable of catalyzing synthesis reactions of industrial interest such as esterification, transesterification and aminolysis (Villeneuve et al. 2000). Classical structure of most lipases/esterases includes a catalytic triad composed of a serine, an aspartate/glutamate and a histidine, and a GXSXG conserved motif (Villeneuve et al. 2000). A second group, the family of GDSL esterase/lipase has a flexible active site with a serine-containing motif closer to the N-terminus and four conserved catalytic residues (Ser-Gly-Asn-His) located in five consensus regions (Akoh et al. 2004).
The lipolytic activity present in Carica papaya latex has been widely reported and evaluated as an efficient biocatalyst in different fields such as lipid modification (Tecelao et al. 2012) and enantiomeric resolution of chiral compounds (Ng and Tsai 169
CAPITULO 3: RESULTADOS 2005, Rivera et al. 2013). C. papaya latex is therefore considered one of the most interesting sources of plant lipases. Nonetheless, the majority of this activity is attached to the latex insoluble fraction which makes difficult the isolation and characterization process (Rivera et al. 2012). Until today two proteins have been isolated and partially purified form latex polymeric matrix (Abdelkafi et al. 2009; Abdelkafi, et al. 2012). Of these proteins, CpEst is the only protein with lipolytic activity; this protein corresponds to an esterase with GDSL esterase/lipase motif with a molecular weight of 38 kDa and 343 aminoacid residues (Abdelkafi et al. 2009).
In recent years, Y. lipolytica appeared as one of the most suitable host for heterologous production of proteins. As an expression host, this nonconventional yeast presents several advantages in comparison with other expression systems, such as high level of extracellular secretion, possible post-translational modification, high transformation yield, together with available genetic tools (Madzak et al. 2004). In addition several microbial lipases such as Lip1, Lip3 and Lip 4 from Candida rugosa (Piamtongkam et al. 2011), lipases from Thermomyces lanuginosus (Muller et al. 1998), Rhizopus oryzae (Yuzbashev, Yuzbasheva et al. 2012) and Candida antarctica B (Emond et al. 2010) were successfully cloned and produced using Y. lipolytica as an expression system.
In terms of catalytic properties lipolytic enzymes have been widely reported in different synthesis reactions including resveratrol acetylation. Resveratrol (trans3,5,40-trihydroxystilbene) is a polyphenolic phytochemical that possesses a variety of
170
CAPITULO 3: RESULTADOS antioxidant, anti-inflammatory, antitumor, cardioprotective, neuroprotective and immunomodulatory bioactivities, as well as a delaying effect on aging (Torres et al. 2010). However, wider application of resveratrol is limited by its bioavailability. In order to overcome this problem, syntheses of more bioavailable resveratrol analogues or derivatives with comparable or improved bioactivity are very important. Therefore, lipases able to modify resveratrol are of major nutraceutical, pharmaceutical and cosmetic interest.
In this work, we cloned and produced CpEst as a functional protein using Y. lipolytica as an expression system. This strategy enabled us to evaluate some of its biochemical properties including thermal and pH stability and optimal temperature and pH of the soluble enzyme. We also developed an immobilization process and assayed the enzymatic efficiency of the immobilized biocatalyst in resveratrol acetylation.
2. MATERIALS AND METHODS 2.1 PLASMID CONSTRUCTION AND Y. Lipolytica TRANSFORMATION Protein sequence of CpEst was obtained on Universal Protein Resource Knowledgebase UniProt ID: P86276 (Abdelkafi et al. 2009). The codon usage of the mature protein-coding sequence of CpEst was optimized for Y. lipolytica and synthesized by Genscript.
The sequence encoding CpEst without its signal peptide was fused with the gene fragment encoding the signal peptide and pro domain of lipase Lip2 from Y. lipolytica,
171
CAPITULO 3: RESULTADOS preproLip2, to enable production of extracellular CpEst. The fusion gene was inserted into expression vector JMP62-Tef-UraEx, a derivative of the expression vector described in (Nicaud JM et al. (2002) Protein expression and secretion in the yeast Y. lipolytica. FEMS Yeast Res 2: 371-379). It contains the ura3d1 marker for selection of Ura+ transformants in Y. lipolytica and the kanamycin gene (KanR) for selection in E. coli. The gene of interest is under the control of the constitutive TEF promoter. Plasmid sequence was confirmed by sequencing by GATC.
Recombinant protein was produced by heterologous expression in Y. lipolytica. The construction was Not I-linearized and transformed into Y. lipolyticastrain JMY1212 (Bordes et al. 2007, Cambon et al. 2010) as described elsewhere (Duquesne et al. 2012). Selection of URA+ transformants was carried out on YNBcasa plates (0.17 % w/v YNB, 1 % glucose w/v, 0.5 %w/v ammonium chloride, 0.2 % w/v casamino acids, and 100 mM sodium–potassium phosphate buffer, pH 6.8).
2.2 ENZYME PRODUCTION The selected transformed strain was incubated in 25 mL YPD broth (10 g/L yeast extract, 20 g/L peptone, 20 g/L glucose) for 24 hours. 250 mL of production medium YT2O2 (10 g/L yeast extract, 20 g/L tryptone, 20 g/L, phosphate buffer 50 mM, pH 6.8, 20 g/ L oleic acid) where inoculated with 10% preculture in 1000 mL baffled flasks and shaken at 250 rpm and 30 °C for two days. Culture broth was centrifuged at 11,000 × g for 30 min at 4 °C and finally the supernatant was tested for lipase activity.
172
CAPITULO 3: RESULTADOS 2.3 LIPASE ACTIVITY Lipase activity was measured through hydrolysis of tributyrin. Hydrolysis reactions were performed at 35°C in a thermostated and mechanically stirred Envirogenie Scientific Industries (USA) containing 2.5 mL tributyrin from Sigma Aldrich, 1mL 50 mM Tris-HCl pH 8.5 and the corresponding amount of enzyme.
Lipase activity was expressed as 1U= 1µmol free fatty acid (FFA) released per minute.
2.4 CHARACTERIZATION OF CpEst SPECIFICITY, OPTIMAL REACTION CONTITIONS and THERMAL STABILITY Characterization of CpEst was carried out by measuring the enzymatic activity towards tributyrin using 600 µL of supernatant from Y. lipolytica. Substrate specificity was evaluated by measuring the activity towards triglycerides of different length chain: tributyrin (C4), trioctanoin (C8) from Sigma Aldrich, and olive oil (C18). Optimal temperature was determinate by measuring the lipolytic activity at different temperatures in the range of 30°C to 75°C under pH 8.5. Thermal stability was evaluated by preincubating the enzyme at different temperatures (50°C and 70°C) and taking samples at diverse time intervals (0, 15, 30, 45 and 60 minutes) to quantify the residual activity.
Optimal pH was evaluated by measuring the activity using buffers at 50 mM concentration. The buffers used were sodium citrate buffer (pH 5-6), tris- HCl buffer (pH 7- 9), sodium carbonate buffer pH 10.
173
CAPITULO 3: RESULTADOS Solvent effect was determined by incubating the enzyme in the presence of 20% solvent during one hour and quantifying the residual activity after treatment.Relative activity was calculated as a percentage of the activity obtained under pH 8.5 and 35°C.
2.5 IMMOBILIZATION OF THE ENZYME AND RESVERATROL ACETYLATION Recombinant CpEst was immobilized by adsorption of the enzyme onto Lewatit CNP105 at 4°C according to Sandoval et al. (2010).
Resveratrol acetylation was carry out by addition of 500 mg/mL of the enzyme to the reaction medium previously described by Torres et al. (2010). The reaction was performed at 60°C with orbital stirred.
Progress of the reaction was followed by HPLC equipped with a column: Phenomenex Gemini 5u C6-phenyl connected to a UV detector (at 310 nm). A flow rate of 1.0 mL/min was used. The mobile phase was composed of methanol (A) and water with 0.1% of acetic acid (B), according with the following gradient program: Time (min)
%A
%B
0-8
50
50
8-9
70
30
9-19
70
30
19-20
50
50
20-30
50
50
174
CAPITULO 3: RESULTADOS 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1 PRODUCTION OF RECOMBINANT CpEST Amino acid sequence, catalytic triad and structural characteristics of CpEst have been previously reported by Abdelkafi et al. (2009). Here, the native CpEst signal peptide (26 amino acids) was replaced by preproLip2 from Y. lipolytica lipase 2. This enzyme was produced extracellularly, and so, biochemical and catalytic characteristics were determined directly from supernatant of Y. lipolytica strain JMY1212 transformed with JMP62-Tef-UraEx-CpEst.
3.2 SUBSTRATE PREFERENCE Substrate specificity of recombinant CpEst was assayed using triglycerides of C4 to C18 chain length. In accordance with previous results obtained by Abdelkafi et al. (2009), CpEst preferentially hydrolyzes short chain length triglycerides such as tributyrin (TC4), reaching the highest activity of 3.0 ± 0.26 U/mL. Nevertheless, recombinant CpEst was shown here to hydrolyze medium (TC8) and long (TC18) chain triglycerides with 60% (TC8/TC4 = 0.6) and 50% (TC18:1/TC4 = 0.5) of hydrolytic activity relative to TC4 (figure 2).
175
CAPITULO 3: RESULTADOS
3,5
3,0
U/ mL
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0 Tributiryn
Trioctanoin
Triolein
Figure 2 Substrate preference for recombinant CpEst. 2.5 mL 20% triglyceride emulsion, 1mL 50 mM Tris-HCl pH 8.5 buffer, 35°C
This result differs from the results obtained by Abdelkafi et al. (2009) with CpEst purified from latex. Indeed, they reported a ratio of 0.047 and 0.083 for OO/TC4 and TC8/TC4 hydrolysis, respectively. This might signify that other minor esterases where purified together with CpEst. Our recombinant expression strategy is thus of great interest to deeply characterize CpEst catalytic performances, as more enzyme could be produced by this recombinant production strategy. For instance, to have 1800 units (on TC8), easily produced by one liter of culture, it will be necessary to collect and purify almost 700 g of latex.
3.3 EFFECT OF pH As shown in figure 3, recombinant CpEst remains active in a pH range from pH 5 to 10 with an optimal activity at pH 8.5. After pH 10 only the 40% of the activity is retained. CpEst retains average 30% activity at very extreme pH (pH2 and pH11). Several conditions, and particularly pH, are important for the micro environmental medium
176
CAPITULO 3: RESULTADOS that surrounds the enzyme, due to its effect on the thermodynamic of the reaction. Alkaline esterases and lipases such as those from sporosarcina sp. (Takehara et al. 2012), Macrophomina phaseolina (Schinke and Germani 2012), Streptomyces sp. (Mander et al. 2011), Penicillum cyclopium and Sparassis crispa (Chandrasekaran et al. 2011) present interesting properties for detergent industry due to their capacity to catalyze reactions under alkaline pH, while lipases with activity at low pH were used as digestive enzyme replacement therapy (Aloulou et al. 2007).
12
10
pH
8
6
4
2 0
20
40
60
80
100
120
Residual activity (%) Figure 3 pH-dependent activity of recombinant CpEst. 2.5 mL 20% triglyceride emulsion, 1mL 50 mM Tris-HCl pH 8.5 buffer, 35°C
3.4 EFFECT OF TEMPERATURE AND THERMOSTABILITY. One of the key parameters of thermodynamic arguments in enzymatic reactions is the selection of the appropriate reaction temperature. Optimal temperature and thermostability of lipases/esterases are important to the thermodynamics of the reaction since the reaction initial rate increases with temperature until denaturation of the enzyme. Moreover, the cost of the enzymatic process will be hardly influenced by
177
CAPITULO 3: RESULTADOS this temperature reaction. A compromise should indeed be found between energy, material and time expenditures. As shown in figure 4a, CpEst presents an optimal temperature of 35°C. After 45ºC 80% of the initial activity is lost.
Thermostability of recombinant CpEst was evaluated at 50°C and 70°C (figure 5b). In terms of thermal stability, CpEst activity decreases to 50% of the initial activity in fifteen minutes at both 50°C and 70°C (figure 5b). However, along the entire assay (1 hour), the activity then remained almost constant (40 to 50%). In contrast, lipases recombinant lipase from Rhizopus oryzae that was completely inactivated at 55°C after 30 minutes (Takahashi et al. 1999), In the case of latex in hydrolysis of short chain triglycerides the lipolytic activity is almost completely inactivated at 50°C after 1 hour incubation (Rivera et al. 2014).
Figure 4 Effect of the temperature on recombinant CpEst. a) Optimal temperature b) Thermostability at 50 °C and 70 °C. 2.5 mL 20% triglyceride emulsion, 1mL 50 mM Tris-HCl pH 8.5 buffer
178
CAPITULO 3: RESULTADOS 3.5 SOLVENT EFFECT Solvent engineering is an important strategy to improve synthesis reactions; this approach consists in the selection of the proper solvent to be used in function of the lipase/esterase and substrate used, as in the case of CalB in aminolysis reactions (Priego et al. 2009). This approach is based on the fact that the physicochemical properties of the solvent used in the enzymatic reaction usually controls molecular interactions between the enzyme, substrates and the reaction media.
As shown in figure 5 CpEst is less stable in primary alcohols in contrast to secondary and tertiary alcohols such as tertbuthanol, nevertheless presents similar resistance to ethanol and methanol that the esterase from Geobacillus sp. HBB-4 that retained almost 50% of the initial activity (Metin et al. 2006). Isooctane is the solvent that most inhibits the enzyme, which retains only 40% of its activity. In solvents like acetone, acetonitrile and hexane, CpEst retained 50% to 60% of its initial activity which is similar other lipases such as those from Pseudomonas aeruginosa CS-2, Pseudomonas aeruginosa san-ai and Streptomyces CS 326 after 9 hours incubation (Mander et al. 2012).
179
CAPITULO 3: RESULTADOS
Isooctane Tertbuthanol Hexane Tetra hidrofurane Acetone Ethanol Acetonitrile Control
0
20
40
60
80
100
120
% Residual activity
Figure 5 Solvent resistance for recombinant CpEst. 2.5 mL 20% triglyceride emulsion, 1mL 50 mM Tris-HCl pH 8.5 buffer, 35°C
3.6 IMMOBILIZATION AND RESVERATROL ACETYLATION One useful strategy to stabilize and improve bioavailability and bioactivity of a phenolic compound is esterification. Resveratrol acetylation has been performed either chemically (Nico et al. 2002) or enzymatically (Teng et al. 2005; Torres et al. 2010), to obtain mono-, di- or tri-acetylated derivatives. We compare here performances of immobilized CpEst with previously described commercial lipases in resveratrol acetylation.
Immobilization is a requirement to effectively stabilize enzymes especially in organic media. Therefore, CpEst was further immobilized onto lewatit: an activity of 50 U/g was measured towards tributyrin hydrolysis. Interestingly, immobilized recombinant CpEst was shown to conduct preferentially the synthesis of 3, 5, 4´-tri-O-acetyl resveratrol (figure 6).
180
CAPITULO 3: RESULTADOS
Figure 6 Resveratrol reaction catalyzed by immobilized CpEst and commercial enzyme QLG. a)
Cromatograms example. 1) resveratrol, 2) 4´-mono-O-acetyl resveratrol 3) 3-mono-O-acetyl resveratrol, 4) 3,4´-di-O-acetyl resveratrol 5) 3,5,4´-tri-O-acetyl resveratrol B) Conversion after 260 hours.
As shown in figure 6, after 260h of reaction CpEst achieved 73% total conversion with 40% of 3,5,4´-tri-O-acetyl resveratrol as the major product, whereas QLG achieved 96% of total conversion in only 160 hours with a percentage of
3,5,4´-tri-O-acetyl
resveratrol of only 30% (Torres et al. 2010).
This constitutes a mayor difference with other commercial enzymes tested for this reaction, such as QLG from Alcaligenes sp. that catalyzed preferentially the mono acetylated 3-O-acetyl-resveratrol (Torres et al. 2010). Indeed, triacetylated resveratrol showed antitumoral activity (Huang and Zhou 2011) and to prepare it chemically, toxic reagents such as pyridine are needed (Nicolosy et al. 2002).
181
CAPITULO 3: RESULTADOS 4. CONCLUSIONS CpEst recombinant protein was successfully cloned and produced using Yarrowia lipolytica as an expression system. This is one of the first cases of a lipolytic enzyme from C. papaya that could be functionally produced and the first recombinant papaya lipase used in a synthesis reaction. This step forward enabled the accurate determination of CpEst optimal reaction conditions: CpEst showed an optimal pH of 8.5 and an optimal temperature of 35°C. CpEst extract was still active at extreme pH and retained 40% activity after 1 hour at 70°C.
Additionally, CpEst was found slightly sensitive to acetone and terbuthanol as solvent, which makes it a potentially relevant enzyme for biotechnological purposes, such as resveratrol acetylation.
5. REFERENCES Abdelkafi S, Abousalham A, Fendri I, Ogata H, Barouh N, Fouquet B, Scheirlinckx F, Villeneuve P, Carriere F. 2012. Identification of a new phospholipase D in Carica papaya latex. Gene 499(2):243-249. Abdelkafi S, Ogata H, Barouh N, Fouquet B, Lebrun R, Pina M, Scheirlinckx F, Villeneuve P, Carriere F. 2009. Identification and biochemical characterization of a GDSL-motif carboxylester hydrolase from Carica papaya latex. Biochimica Et Biophysica ActaMolecular and Cell Biology of Lipids 1791(11):1048-1056. Akoh CC, Lee GC, Liaw YC, Huang TH, Shaw JF. 2004. GDSL family of serine esterases/lipases. Progress in Lipid Research 43(6):534-552.
182
CAPITULO 3: RESULTADOS Aloulou A, Rodriguez JA, Puccinelli D, Mouz N, Leclaire J, Leblond Y, Carrière F. 2007. Purification and biochemical characterization of the LIP2 lipase from Yarrowia lipolytica. Biochim Biophys Acta 1771(2):228-37. Casas-Godoy L, Duquesne S, Bordes F, Sandoval G, Marty A. 2012. Lipases: an overview. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 861:3-30. Chandrasekaran G, Kim G-J, Shin H-J. 2011. Purification and characterization of an alkaliphilic esterase from a culinary medicinal mushroom, Sparassis crispa. Food Chemistry 124(4):1376-1381. Emond S, Montanier C, Nicaud J-M, Marty A, Monsan P, Andre I, Remaud-Simeon M. 2010. New Efficient Recombinant Expression System To Engineer Candida antarctica Lipase B. Applied and Environmental Microbiology 76(8):2684-2687. Huang X, Zhu HL. 2011. Resveratrol and its analogues: promising antitumor agents. Anticancer Agents Med Chem 11(5):479-90. Madzak C, Gaillardin C, Beckerich JM. 2004. Heterologous protein expression and secretion in the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica: a review. Journal of Biotechnology 109(1-2):63-81. Mander P, Cho SS, Simkhada JR, Choi YH, Park DJ, Ha JW, Yoo JC. 2011. An organic solvent-tolerant alkaline lipase from Streptomyces sp CS268 and its application in biodiesel production. Biotechnology and Bioprocess Engineering 17(1):67-75. Muller S, Sandal T, Kamp-Hansen P, Dalboge H. 1998. Comparison of expression systems in the yeasts Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Klyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe and Yarrowia lipolytica. Cloning of two novel promoters from Yarrowia lipolytica. Yeast 14(14):1267-1283.
183
CAPITULO 3: RESULTADOS Ng IS, Tsai SW. 2005. Hydrolytic resolution of (R,S)-naproxen 2,2,2-trifluoroethyl thioester by Carica papaya lipase in water-saturated organic solvents. Biotechnology and Bioengineering 89(1):88-95. Piamtongkam R, Duquesne S, Bordes F, Barbe S, Andre I, Marty A, Chulalaksananukul W. 2011. Enantioselectivity of Candida rugosa Lipases (Lip1, Lip3, and Lip4) Towards 2Bromo Phenylacetic Acid Octyl Esters Controlled by a Single Amino Acid. Biotechnology and Bioengineering 108(8):1749-1756. Priego J, Ortiz-Nava C, Carrillo-Morales M, Lopez-Munguia A, Escalante J, Castillo E. 2009. Solvent engineering: an effective tool to direct chemoselectivity in a lipasecatalyzed Michael addition. Tetrahedron 65(2):536-539. Rivera I, Mateos-Diaz JC, Sandoval G. 2012. Plant Lipases: Partial Purification of Carica papaya Lipase. In: Sandoval G, editor. Methods in molecular biology, Lipases and phospholipases: Springerlink. p 115-22. Ivanna Rivera, Georgina Sandoval.2014. Caracterización de diversas fracciones del látex Carica papaya como biocatalizadores en la hidrólisis de triglicéridos. Grasas y Aceites. El DOI 10.3989/gya.049313. Sandoval G, Rivera I, Barrera-Rivera K, Martinez-Richa A. 2010. Biopolymer Synthesis Catalyzed by Tailored Lipases. Macromolecular Symposia 289(1):135-139. Schinke C, Germani JC. 2012. Screening Brazilian Macrophomina phaseolina isolates for alkaline lipases and other extracellular hydrolases. International Microbiology 15(1):17.
184
CAPITULO 3: RESULTADOS S. Takahashi S, Ueda M, Tanaka A. 1999. Independent production of two molecular forms of a recombinant Rhizopus oryzae lipase by KEX2-engineered strains of Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology 52(4):534-540. Takehara M, Kinoshita K, Miyamoto M, Hirohara H. 2012. A Novel Alkaline Esterase from Sporosarcina spnov Strain eSP04 Catalyzing the Hydrolysis of a Wide Variety of Aryl-carboxylic Acid Esters. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 76(9):17211727. Tecelao C, Rivera I, Sandoval G, Ferreira-Dias S. 2012. Carica papaya latex: A low-cost biocatalyst for human milk fat substitutes production. European Journal of Lipid Science and Technology 114(3):266-276. Torres P, Poveda A, Jimenez-Barbero J, Ballesteros A, Plou, FJ. 2010. Regioselective Lipase-Catalyzed Synthesis of 3-O-Acyl Derivatives of Resveratrol and Study of Their Antioxidant Properties. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58(2) .807-813. Villeneuve P, Muderhwa JM, Graille J, Haas MJ. 2000. Customizing lipases for biocatalysis: a survey of chemical, physical and molecular biological approaches. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic 9(4-6):113-148. Yuzbashev TV, Yuzbasheva EY, Vibornaya TV, Sobolevskaya TI, Laptev IA, Gavrikov AV, Sineoky SP. 2012. Production of recombinant Rhizopus oryzae lipase by the yeast Yarrowia lipolytica results in increased enzymatic thermostability. Protein Expression and Purification 82(1):83-89.
185
CAPITULO 3: RESULTADOS 3.3.3 PUBLICACIÓN
8:
FUNCTIONAL
EXPRESSION,
EXTRACELLULAR PRODUCTION, PURIFICATION, BIOCHEMICAL CHARACTERIZATION AND STRUCTURE MODEL OF Carica papaya LIPASE 1
A pesar de los diversos esfuerzos realizados para lograr aislar la actividad lipolítica del látex Carica papaya hasta la fecha sólo se han identificado tres proteínas responsables de parte de la actividad lipolítica presente en el látex de Carica papaya.
Una de ellas fue identificada mediante proteómica; esta triacilglicerol lipasa; sin embargo hasta la fecha no se había logrado expresar de forma funcional, ni extraer de forma directa del látex; por lo que sus propiedades bioquímicas y capacidad de catalizar diversas reacciones de síntesis permanecían sin ser elucidadas.
Por otro lado; Pichia pastoris es una levadura metálotrofica que ha sido ampliamente empleado como sistema de expresión en el caso de triacilglicerol lipasas debido a su alta densidad celular y disponibilidad de una amplia gama de vectores.
En el presente trabajo titulado Functional expression, extracellular production, purification, biochemical characterization and structure model of Carica papaya lipase 1; la proteína CpLip1 fue expresada de forma funcional por primera vez empleando el plásmido pGAPZαB. Además la proteína recombinante se púrifico y se determinaron algunas de sus propiedades bioquímicas en hidrólisis de triglicéridos. Este trabajo fue sometido a la revista de arbitraje internacional FEBS.
186
CAPITULO 3: RESULTADOS FUNCTIONAL EXPRESSION, EXTRACELLULAR PRODUCTION, PURIFICATION, BIOCHEMICAL CHARACTERIZATION AND STRUCTURE MODEL OF Carica papaya LIPASE 1
Ivanna Rivera, Marcela Robles, Juan Carlos Mateos-Díaz, Abel Gutierrez-Ortega, Georgina Sandoval.
Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ). Av. Normalistas # 800 Colinas de la Normal. 44270. Guadalajara Jalisco. México
Abstract
Carica papaya latex lipolytic activity has been widely reported since 1925. However, up to now only one member of the class 3 family of lipase was identified in latex; nevertheless the efforts to isolate this protein from the latex polymeric matrix have been unsuccessful. In order to overcome this problem, heterologous expression is an interesting alternative and allowed the biochemical characterization of this recombinant protein for the first time.
In this work, Carica papaya lipase 1 (CpLip1) has been successfully cloned into pGAPZαB plasmid and for the first time functionally expressed using Pichia pastoris as an extracellular expression system. The highest production of CpLip1 was obtained between 48 and 72 hours of cell grow with a highest activity of crude extract of 3.7 U/mL. Purification of the recombinant enzyme was carried out by affinity
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CAPITULO 3: RESULTADOS chromatography reaching a 30-fold purification factor. The characterization of the purified enzyme shows that Lip1 hydrolyzed preferentially long chain triglycerides, has an optimal pH of 8.5 and an optimal temperature of 35°C; enzyme half-lifes at 50°C and 70°C were of 12.5 and 7.5 minutes, respectively. Finally, the enzyme stability evaluated in the presence of different organic solvents, showed that the lipase activity is most affected in polar solvents such as acetone. This contribution opens the possibility of studying in future works, the catalytic performance of pure CpLip1 in different synthesis reactions.
Key
words:
Carica
papaya,
lipase,
Pichia
pastoris,
recombinant
protein,
characterization. Introduction Lipases are defined as triacylglycerol acylhydrolases capable of hydrolyze carboxyl esters of long chain acylglycerols into fatty acids [1]. In addition to their natural ability to catalyze hydrolysis reactions, these enzymes are capable to catalyze synthesis reactions such as esterification, transesterification and aminolysis [2].
Lipases can be obtain from diverse sources going from microorganisms to plants and mammals, however due to their characteristics such as easy manipulation and fast growing microbial lipases are the most study type of lipases. Nevertheless one of the most interesting plant lipases corresponds to the lipolytic activity present in Carica
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CAPITULO 3: RESULTADOS papaya latex; this activity has been widely reported and evaluated as an interesting biocatalyst for synthesis of biopolymers [3], human milk fat substitutes [4], lipid modification [5], enantiomeric resolution of octyl ester of the acid 2-bromophenylacetique [6] and long chain diesters of 2-oxoglutaric acid [7].
Additionally, different efforts have been made in order to isolate this activity with the outcome of the identification of three of the lipolytic proteins present in latex [8- 10]. Nevertheless, the protein responsible for the majority of the lipolytic activity present in the latex insoluble fraction has not been isolated [10].
However, by molecular proteomics approach one lipase present in C. papaya latex was recently identified, this lipase, named CpLip1, was cloned in E. coli but without activity. [10]. Given the wide applications of papaya latex as biocatalyst and the identification of this new lipase, its functional expression could help to elucidate which enzymes are actually responsible of the lipolytic activity observed in papaya latex.
As an expression system, Pichia pastoris presents several advantages in comparison with bacterial system such as ability of growing on minimal medium at high cell densities and extracellular secretion of the heterologous protein simplifying the enzyme recovery. In addition, the methylotrophic yeast P. pastoris, performs many of the post-translational modifications of higher eukaryotic such as disulfide bond
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CAPITULO 3: RESULTADOS formation and glycosylation necessaries frequently necessaries for correct folding and function of the protein [11-12].
Furthermore, P. pastoris has already been successfully used for the heterologous expression of different microbial lipases such as Yarrowia lipolytica Lip2, Candida antarctica, Candida rugosa Lip2 and Rhizopus oryzae [13-16].
The first aim of this work was to functionally express CpLip1 lipase in P. pastoris, second, to perform the extracellular production and purification of the enzyme in order to characterize the recombinant protein. Some of the biochemical properties of the recombinant CpLip1 including thermal and solvent stability as well as the substrate selectivity on triglyceride hydrolysis, optimal temperature and pH were determined. Finally, a model of the structure of CpLip1 was constructed using a homology modeling approach.
These results open an opportunity for future works to test CpLip1 as biocatalyst in different reactions as well as to understand the role of lipases in C. papaya.
Results and discussion Sequence analysis and structural modeling of CpLip1 CpLip1 is a member of the triacylglycerol lipase family PF01764 (Pfam Protein family data base, http://pfam.sanger.ac.uk), the homology of this protein with other members of the triacylglycerol lipase family in plants had been previously reported by Abdelkafi et al. [10]; who determinate that this protein possess homology (51%) to the
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CAPITULO 3: RESULTADOS castor bean acid lipase (AAR15173.1). As well, CpLip1 presents 60% homology with Jatropha curcas lipase (ABN45748.1).
Interestingly, CpLip1 is a triacylglycerol lipase from plant that also presents homology with microbial lipases Lip1 shows 42% homology and 22% identity with Thermomyces lanuginosus lipase; 39.5% homology and 19.1% identity with Rhizopus oryzae lipase and 39.0% homology and 30% identity with Rhizomucor miehei lipase and 30% identity and 56% homology with YLL2 from Yarrowia lipolytica determined by the Basic Local Alignment Search Tool from the National Center for Biotechnology Information. The results of the alignment of these proteins with CpLip1 are shown in Fig. 1.
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CAPITULO 3: RESULTADOS
Fig.1. Alignment of CpLip1 lipase with different lipases. In squares the amino acid residues of the typical catalytic triad and the amino acids involved in the putative oxyanion hole are indicated by a dashed box. These analyses where carried out in the CLC sequence viewer 6 software.
Abdelkafi et al. [10] had determinate that CpLip1 cDNA corresponds to a 478 amino acid residues protein with a predicted mass of 55 kDa and a theoretical isoelectric point of 6.91. In this report, the critical amino acid residues for enzyme activity as the
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CAPITULO 3: RESULTADOS active side and oxyanion hole, were assign by comparison with Lipase 2 from Yarrowia lipolytica (YLL2) (Fig. 1). The presence of five possible glycosylation sites was predicted by NetNGlyc 1.0 Server, these characteristics are summarized in table 1.
Table 1 Catalytic residues and glycosylation sites in CpLip1 protein Characteristic
Residues
Catalytic triad
Ser289, Asp352 and His446
Oxyanion hole
Ser207, Gly290
Glycosylation sites*
35 (Asn, Lys, Ser, Phe), 89 (Asn, Arg, Tyr, Pro), 153 (Asn, Pro, Ser, Phe), 181 ( Asn, Lys, Ser, Asn), 453 (Asn, Ser, Thr, Leu)
*N-glycosylation sites predicted by the NetNGlyc 1.0 Server
In order to obtain structural insights of CpLip1, a 3D structural model was generated using the server Homology/analogy Recognition Engine V 2.0 (phyre2 Protein) and lipase YLL2 structure (PDB c3O0dF, [15]) as a template. The structural model of CpLip1 consists of three α helices and five parallel β strands and three antiparallel β strands. The predicted structured is shown in fig. 2; t is also observed that the only the hydroxyl group of the catalytic serine is expose and the presence of one lid in front of the active site.
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CAPITULO 3: RESULTADOS
Fig. 2. Tridimensional structure of CpLip1 predicted by Homology/analogy Recognition Engine V 2.0 2 (phyre Protein program [17]) based on YLL2 PDB c3O0dF [18].
Extracellular production of CpLip1 Fig. 3 shows the rate of CpLip1 lipase production during the cell growth. The enzyme production pattern indicated that lipase production is associated or partially associated to cell grow. The maximal lipolytic activity of CpLip1 (3.7 ± 0.26 U/mL using olive oil as substrate) was reached between 48h and 72h of growth.
Fig.3. Production of recombinant CpLip1.Time course of cell growth and production of CpLip1 Growth was carried out at 30°C in 1L flask with 250 mL of YPG medium. Activity measured by hydrolysis of triglycerides (2.5 mL 20% olive oil emulsion, 1mL 50 mM Tris-HCl pH 8.5, buffer 35°C. Data represent the mean ± SD of two independent experiments.
194
CAPITULO 3: RESULTADOS The culture obtained after growth was centrifuged and filtered to remove the yeast cells and the supernatant containing the extracellular lipase was used for purification.
Purification of recombinant CpLip1 The recombinant CpLip1 lipase produced was purified by affinity chromatography, using imidazole gradient were a peak of lipase activity was observed at the beginning. At this purification stage, the lipase exhibited a specific activity of 250 U/mg using olive oil as substrate, as shown in table 2 which summarizes the data on the purification.
Table 2 Purification of recombinant CpLip1 Activity Total U/mL activitya (U) Crude extract HisTrap FF a
Total protein b (mg/mL)
3.7
87
10
11
55
0.22
Specific activity (U/mg protein) 8.7 50
Purification Recovery (fold) (%)
1
100
6
70
Activity measured by triolein hydrolysis. Protein measure by Bradford method
b
Fractions with activity were recovered at the begging of the gradient (fractions A6A10); fractions A8-10 were keep for further analysis. Chromatogram for the purification is shown in fig. 4.
195
CAPITULO 3: RESULTADOS
Fig 4. Chromatogram for purification of recombinant CpLip1.buffer A (20 mM Tris-HCl, pH 8, 0.1 M NaCl). The column was washed with 50 ml of the buffer A, and the recombinant enzyme was eluted with a linear imidazole gradient (0–0.5 M) in buffer A at a flow rate of 1.0 ml/ min.
Substrate specificity CpLip1 reaches the highest activity of 11 ± 0.26 U/mL when olive oil was employed as a substrate as is shown in fig. 5. In the case of short and medium chain triglycerides as substrates 40 and 50% of the lipase activity was respectively conserved.
120
% residual activiry
100
80
60
40
20
0
Tributiryn Trioctanoin
Olive oil
Fig. 5 Substrate specificity of recombinant CpLip1 extract. Activity measured by hydrolysis of triglycerides (2.5 mL 20% olive oil emulsion, 1mL 50 mM Tris-HCl pH 8.5, buffer 35°C. Data represent the mean ± SD of two independent experiments.
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CAPITULO 3: RESULTADOS Remarkably, these results are different from does from previously reported partially purified Carica papaya latex which present preference to hydrolyze short chain triglycerides [19]. In terms of activity recombinant CpLip1 presents approximately 100 times lower activity that partially purify fraction without proteases and esterases obtained from latex, however probably this fraction does not correspond to a single protein and it is naturally immobilized in the latex.
Interestingly, lipases from yeast and fungus (Yarrowia lipolytica, Rhizopus oryzae, and Fusarium heterosporium) present also the same preference that CpLip1 to hydrolyze medium to long chain triglycerides [20-22], which make this enzymes attractive to be tested lipid modification and purification[2,4], as well as in detergent industry [19].
Effect of pH on enzyme activity In enzymology, interactions between the substrate and the lipase active site in interfacial catalysis are highly dependent on classical kinetic parameters such as pH [23].
CpLip1 exhibited activity in a pH range of 3 to 11 with a maximal activity achieved a between pH 8 and pH 9 and an optimum at pH 8.5 as is shown in fig. 6. At pH greater than 9, the activity dropped of remaining only the 20% of the activity at pH 10. Interestingly, the results obtained for the pH profile of the recombinant CpLip1 are similar to does obtained for Carica papaya latex and two partially purified fractions previously reported by Rivera et al. [19] when olive oil and tributyrin were used as substrate, 197
CAPITULO 3: RESULTADOS
Fig. 6. pH effects on lipolytic activity of recombinant CpLip1 extract. Activity determined by hydrolysis of olive oil (2.5 mL 20% olive oil emulsion, 1mL 50 mM Tris-HCl pH 8.5 buffer, 35°C. Data represent the mean ± SD of two independent experiments.
In general, a large number of widely study microbial lipases such as those from R. oryzae, Aspergillus niger and Lip 2 from Yarrowia lipolytica lipases [19, 24-25] present acidic optimal pH. This constitutes a difference with most plant lipases including Carica pentagona, Jatropha curcas and Coconut lipases [26], which present alkaline optimal pH and makes them attractive for applications in detergent industry.
Effect of temperature and thermostability Temperature is a key factor in industrial bioprocess, since the reaction rates typically increases with temperature, until the point of enzyme denaturation [27]. Taking in count that knowledge, thermostable enzymes have been of special interest.
Lipase activity of CpLip1 was tested in a temperature range from 30°C to 70 °C using olive oil as a substrate. The optimum temperature was obtained at 35°C as is shown in fig. 7a, when the activity increased sharply between 30°C and 35°C from 50% to 100% of residual activity. An Arrhenius plot of the data shows the activation energy of 264
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CAPITULO 3: RESULTADOS kJ/mol. Remarkably this result is 2 and 8 times higher than activation energy of Est30 and Est55 from Geobacillus stearothermophilus, respectively [28].
The thermal stability of CpLip1 was determinate at two different temperatures 50°C and 70°C; under these conditions 35% and 33% was kept after 120 minutes incubation in each case. Lipases like those from Candida rugosa, Penicillium expansum and Geotrichum candidum were completely inactivated at 50°C [29-31]; in this condition CpLip1 is stable until 60 minutes, retaining 40% of the initial activity as is shown in fig. 7b.
Fig. 7. Effect of the temperature on recombinant CpLip1 extract. A) Effect of temperature of CpLip1 lipolytic activity, B) Thermostability of CpLip1 at 50 and 70°C.2.5 mL 20% olive oil emulsion, 1mL 50 mM Tris-HCl pH 8.5, buffer 35°C. Data represent the mean ± SD of two independent experiments
Enzyme half-lifes at 50°C and 70°C were of 12.5 and 7.5 minutes, respectively which are relatively low in comparison to thermostable lipases such as Thermomyces lanuginosus lipase [32].
Solvent effects on lipolytic activity
199
CAPITULO 3: RESULTADOS It is well-known that the effect of organic solvents on enzyme activity differs from lipase between lipases [33-34]. Usually the use of solvents has the objective to increase the diverse reaction kinetics such a conversion and initial rate, however, lipolytic activity frequently is inhibited at solvent concentrations higher than 20%, especially when high polar solvents are employed. Taking in count all this knowledge is clear the importance of the determination of the solvent effect in the performance of the enzyme.
As is shown in table 3, CpLip1 presents a varying degree of stability under the presence of solvents after 1 hour incubation. Under the presence of solvents with low log P such as ethanol, CpLip1 retained only 28% of its initial activity. Ethanol is also a competitive inhibitor of lipases [35] which difficult some reactions as biodiesel production [36].
Table 3 Solvent stability of recombinant CpLip 1 2.5 mL 20% triglyceride emulsion, 1mL 50 mM Tris-HCl pH 8.5 buffer 35°C and 1hr incubation
Log P
% RESIDUAL ACTIVITY
DMSO
-2.03
54.6 ± 0.0
Ethanol
-0.32
27.7 ±0.0
Acetone
-0.24
36.4 ±0.0
Tert-buthanol
0.34
45.5 ± 0.0
Hexane Isooctane
3.23 4.5
54.6 ±0.0 27.3 ± 0.0
200
CAPITULO 3: RESULTADOS Under incubation with solvents of high log P values, CpLip1 retains between 54% and 40% of its original activity. Interestingly, in the case of CpLip1 DMSO shows higher resistance than several known lipases such as which make it attractive to be test in unconventional synthesis reactions such as resveratrol acylation. In general, CpLip1 show a low stability in the presence of solvents which is usually the case of recombinant proteins. To overcome this problem, immobilization of the enzyme results in a convenient strategy, since it leads to the stabilization of the enzyme [37].
Possible applications of CpLip1 The functional expression of CpLip1 from Carica papaya to be used as biocatalysts in the cases where Carica papaya latex previously succeed will certainly help to have a better understanding of lipase-catalyzed reactions such as human fat milk analogs [4], biopolymers [3], production of medium and long chain diesters of 2-oxoglutaric acid [6] and enantiomeric resolution [7,38].
Conclusions In this study, one CpLip1 lipase from Carica papaya was successfully cloned into pGAPZαB plasmid and functionally expressed for the first time using P. Pastoris as expression system. The crude extract from recombinant CpLip1 lipase presents an optimal pH of 8.5 which is interesting for its application in detergent industry due to it is capacity to catalyze reactions under basic conditions. Also, CpLip1 presents an optimal temperature of 35°C. Enzyme half-life at 50°C and 70°C were of 12.5 and 7.5
201
CAPITULO 3: RESULTADOS minutes, which are similar to those of Carica papaya latex which is of 15 min at 50°C [19].
CpLip1 preferentially hydrolyze triglycerides of long chain such as olive oil, which make it attractive to test it is catalytic properties in synthesis reactions such as biodiesel production, lipid modification and production of different kind of drugs such as prostaglandins and non- steroidal anti-inflammatories. Interestingly, the substrate preference of this protein is different than does of Carica papaya latex and its partially purified fractions that show preference to hydrolyze short chain triglycerides [19].
The use of plasmid under the control of inducible promoters such as the case of pPICZαB plasmid is an alternative to increment the expression level of the enzyme CpLip1 in order to obtain highest amount of biocatalyst and facilitate further studies and the use of this enzyme at industrial level.
Materials and methods Gene synthetic design Nucleotide and protein sequences of CPLIP1 were obtained at the Genetic sequence database GenBank ID: CBW44734.1. The signal peptide of the protein-coding sequence of CpLip1 was predicted by the http://www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/signal software. Finally, the mature protein-coding sequence was optimized with the codon usage for P. pastoris and flanked by restriction sites Kpn I and XbaI and his 6 tags were added at the C-terminal position.
202
CAPITULO 3: RESULTADOS Construction of the recombinant expression plasmid and P. pastoris transformation. The mature protein-encoding sequence without the signal peptide of CpLip1 was inserted between the KpnI and XbaI sites of the P. pastoris constitutive expression vector pGAPZαB (Invitrogen) to generate pGAPZαB-CpLip1 arranged in frame with an N-terminal secretory signal (the Saccharomyces cerevisiae α-factor), and a C-terminal extension including a (His) 6 tag. The plasmid construction was confirmed by sequencing.
Recombinant protein was produced by heterologous expression in P. pastoris. The plasmid was BglII linearized and transformed into P. pastorisX-33 electrocompetent cells. High resistance to Zeocin (100 mg/ml) was employed as a selection market for the transformants, among the transformants previously obtained; the clone with the highest activity was selected for further experiments.
Enzyme production The transformed strains resistant to high concentration of Zeocin were incubated in 25 mL YPG broth (10 g/L yeast extract, 20 g/L peptone, 20 g/L glucose) for 24 hours. Then 250 mL YPG broth in 1000 mL flasks where inoculated with 25mL of preculture and shaken at 250 rpm and 30 °C. After the cultivation was carried out for several days, the culture broth was centrifuged at 11,000 × g for 30 min at 4 °C and finally the supernatant obtained was tested for lipase activity.
203
CAPITULO 3: RESULTADOS Purification of recombinant CpLip1 The supernatant containing the recombinant protein CpLip1 was applied onto a HisTrap FF HP 5 ml column (GE Healthcare) equilibrated with buffer A (20 mM Tris-HCl, pH 8, 0.1 M NaCl). The column was washed with 50 ml of the buffer A, and the recombinant enzyme was eluted with a linear imidazole gradient (0–0.5 M) in buffer A at a flow rate of 1.0 ml/ min.
Lipase activity by hydrolysis of olive oil Lipase activity was measured by titration of the acid grass obtained during the hydrolysis of olive oil. Hydrolysis reactions were performed in a thermostated and mechanically stirred Envirogenie Scientific Industries (USA) at 35°C containing 2.5 mL 20% triglyceride emulsion, 1mL 50 mM Tris-HCl pH 8.5 buffer with the corresponding amount of enzyme. Lipase activity was expressed as 1U= 1µmol free fatty acid (FFA) released per minute.
Substrate specificity Substrate specificity was evaluated by measuring the activity towards triglycerides of different chain length under the same conditions that does to evaluate activity in olive oil hydrolysis.
Effect of temperature and thermostability The temperature effect on lipase activity was studied by carrying out the assays at different temperatures in the range of 30°C to 75°C and pH 8.5 using 50 mM Tris-HCl buffer.
204
CAPITULO 3: RESULTADOS Thermostability was evaluated by preincubating the enzyme at different temperatures, taking samples at diverse time intervals and measuring the activity.
Effect of pH pH optimal was evaluated by measuring the activity using different buffers at 50 mM concentration. The corresponding buffers were used as described as bellow acetate buffer (pH 3-6), Tris- HCl (pH 7- 9), Carbonate buffer (pH 10-11).
Effect of solvents Solvents effects on lipase activity was determined by measuring the residual activity after incubation of the enzyme in the presence of 20% v/v solvent and 50mM Tris-HCl buffer pH 8.5 during one hour. After solvent treatment the activity was measured at standard conditions.
References 1. Casas-Godoy L, Duquesne S, Bordes F, Sandoval G, Marty A. (2012) Lipases: an overview,
Methods in molecular biology, Lipases and phospholipases, G.
Sandoval Editor Springerlink 3-30. 2. Villeneuve P, Muderhwa JM, Graille J, Haas MJ. (2000) Customizing lipases for biocatalysis: a survey of chemical, physical and molecular biological approaches. J Mol Catal B-Enzym. 9 (6):113-148. 3. Sandoval G, Rivera I, Barrera-Rivera KA, Martinez-Richa A. (2010) Biopolymer Synthesis Catalyzed by Tailored Lipases. Macromol Sym. 289: 135-139.
205
CAPITULO 3: RESULTADOS 4. Tecelao C, Rivera I, Sandoval G, Ferreira-Dias S. (2012) Carica papaya latex: A low-cost biocatalyst for human milk fat substitutes production. Eur J Lipid Sci and Tech. 114(3): 266-276. 5. Mukherjee KD and Kiewitt I (1996) Specificity of Carica papaya latex as biocatalyst in the esterification of fatty acids with 1-butanol.J Agr Food Chem. 44 (7): 1948-1952. 6. Rivera I, Mateos JC, Marty A, Sandoval G, Duquense S (2013) Lipase from Carica papaya latex presents high enantioselectivity towards the resolution of prodrug of
2-bromo-phenylacetic
acid
octyl
ester.
Tetrahedrom
Lett.
doi.
10.1016/j.lelet.2013.07.151 7. Quintana PG, Sandoval G, Baldessari A (2011) Lipase-catalyzed synthesis of medium- and long-chain diesters of 2-oxoglutaric acid. Biocatal and Biotrans.29(5):186-191 8. Abdelkafi S, Ogata H, Barouh N, Fouquet B, Lebrun R, Pina M, Scheirlinckx F, Villeneuve P, Carriere F. (2009) Identification and biochemical characterization of a GDSL-motif carboxylester hydrolase from Carica papaya latex. BBA- Mol Cell BiolL 1791(11): 1048-1056. 9. Abdelkafi S, Abousalham A, Fendri I, Ogata H, Barouh N, Fouquet B, Scheirlinckx F, Villeneuve P, Carriere F. (2012) Identification of a new phospholipase D in Carica papaya latex. Gene. 499(2): 243-249. 10. Dhouib R, Laroche-Traineau J, Shaha R, Lapaillerie D, Solier E, Ruales J, Pina M, Villeneuve P, Carriere F, Bonneu M. (2011)
Identification of a putative
206
CAPITULO 3: RESULTADOS triacylglycerol lipase from papaya latex by functional proteomics. FEBS Journal .278(1): 97-110. 11. Valero F (2012) Factorias celulares de producción de productos recombinantes. Obtención enzimática de compuestos bioactivos a partir de recursos naturales iberoamericanos. 231-258. 12. Valero F. (2012) Heterologous expression systems for lipases: a review. Methods in molecular biology. Lipases and phospholipases, G. Sandoval Editor. Springerlink 861:161-78. 13. Wang X, Sun Y, Ke F, Zhao H, Liu T, Xu L, Liu Y, Yan Y. (2012) Constitutive Expression of Yarrowia lipolytica Lipase LIP2 in Pichia pastoris Using GAP as Promoter. Appl Biochem Biotech. 166(5): 1355-1367. 14. Yang C, Wang F, Lan D, Whiteley C, Yang B, Wang Y. (2012) Effects of organic solvents on activity and conformation of recombinant Candida antarctica lipase A produced by Pichia pastoris. Process Biochem. 47(3): 533-537. 15. Ferrer P, Alarcon M, Ramon R, Benaiges M, Valero F. (2009) Recombinant Candida rugosa LIP2 expression in Pichiapastoris under the control of the AOX1 promoter Biochem Eng J. 46(3): 271-277. 16. Arnau C, Casas C, Valero F. (2011) The effect of glycerol mixed substrate on the heterologous production of a Rhizopus oryzae Lipase in Pichia pastoris system. Biochem Eng J. 57: 30-37. 17. http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html.
207
CAPITULO 3: RESULTADOS 18. Bordes F, Barbe S, Escalier P, Mourey L, Andre I, Marty A, Tranier S. (2010) Exploring the conformational states and rearrangements of Yarrowia lipolytica Lipase.Biophys.J. 99:2225-2234. 19. Rivera I, Sandoval G. (2013) Characterization of different lipolytic fractions in Carica papaya. GyA. Accepted. 20. Yu M, Lange S, Richter S, Tan T, Schmid RD. (2007) High-level expression of extracellular lipase Lip2 from Yarrowia lipolytica in Pichia pastoris and its purification and characterization Protein Expres Purif. 53 (2):255-263. 21. Salah, R.B., Mosbah H, Fendri A, Gargouri A, Gargouri Y, Mejdoub H. (2006) Biochemical and molecular characterization of a lipase produced by Rhizopus oryzae. FEMS microbio letters. 260(2): 241-8. 22. Shimada, Y, Chigusa Koga, Akio Sugihara, Toshihiro Nagao, Nobuo Takada, Susumu Tsunasawa, Yoshio Tominaga. (1993) Purification and characterization of a novel solvent-tolerant lipase from Fusarium-heterosporum. J Ferment Bioeng. 75(5): 349-352. 23. Chahinian H, Snabe T, Attias C, Fojan P, Petersen SB, Carrière F. (2006) How gastric lipase, an interfacial enzyme with a Ser-His-Asp catalytic triad, acts optimally at acidic pH. Biochem-US. 45(3): 993-1001. 24. Song, X., Xiaoyu Qi, Bin Hao, YinboQu. (2008) Studies of substrate specificities of lipases from different sources. Eur J Lipid Sci Tech. 110(12): 1095-1101. 25. Yu M, S Qin, Tan T. (2007) Purification and characterization of the extracellular lipase Lip2 from Yarrowia lipolytica. Process Biochem. 42(3): 384-391.
208
CAPITULO 3: RESULTADOS 26. Rivera I, Mateos-Diaz JC, Sandoval G. (2012) Plant Lipases: Partial Purification of Carica papaya Lipase. Sandoval G (ed) Methods in molecular biology, Lipases and phospholipases, 1: 547 pp 115-122, Springer ISBN: 1940-6029 27. Peterson ME, Roy MD, Danson MJ, Eisenthal R. (2007) The dependence of enzyme activity on temperature: determination and validation of parameters. Biochem J 402: 331-337. 28. Ewis HE, Abdelal AT, Lu CH. (2004) Molecular cloning and characterization of two thermoestable carboxyl esterase from Geobacillus stearothermophilus. Gene. 329: 187-195. 29. Catoni E, Schmidt-Dannert C, Brocca S, Schmid RD. (1997) Overexpression of lipase A and B of Geotrichum candidum in Pichia pastoris: High-level production and some properties of functional expressed lipase B. Biotechnol Tech. 11(9): 689-695. 30. Brocca S, Schmidt-Dannert C, Lotti M, Alberghina L, Schmid RD. (1998) Design, total synthesis, and functional overexpression of the Candida rugosa lip1 gene coding for a major industrial lipase. Protein Sci.7(6): 1415-1422. 31. Bian CB, Yuan C, Lin L, Lin J, Shi X, Ye X, Huang Z, Huang M. (2005) Purification and preliminary crystallographic analysis of a Penicillium expansum lipase .BBAProteins and Proteomics 1752(1): 99-102. 32. Zheng YY, Guo XH, Song NN, Li DC. (2011) Thermophilic lipase from Thermomyces lanuginosus: Gene cloning, expression and characterization. J Mol Catal B: Enzym. 69(34): 127-132.
209
CAPITULO 3: RESULTADOS 33. Yang, C.F., Fanghua Wang, , Dongming Lanb, Chris Whiteleyc, Bo Yangd, Yonghua Wang. (2012) Effects of organic solvents on activity and conformation of recombinant Candida antarctica lipase A produced by Pichia pastoris.Process Biochem.47(3): 533-537. 34. Chakravorty, D, Parameswaran S, Dubey VK, Patra S. (2012) Unraveling the Rationale Behind Organic Solvent Stability of Lipases. Appl Biochem Biotechnol. 167(3): 439-461. 35. Sandoval G, Condoret JS, Marty A. (2001) Thermodynamic Activity Based Enzyme Kinetics: an efficient tool for nonaqueous enzymology. AIChE J. 47: 718-726. 36. Rivera I, Villanueva G, Sandoval G. (2009) Biodiesel production from animal grease wastes by enzymatic catalysis. GyA. 60(5): 468-474. 37. Guillén M, Begaiges MD, Valero F. (2011) Immobilization and stability of a Rhizopus oryzae lipase expressed in Pichia pastoris: Comparison between native and recombinant variants. 27: 1232-1241. 38. Ng, IS, Tsai SW (2005) "Hydrolytic resolution of (R,S)-naproxen 2,2,2trifluoroethyl thioester by Carica papaya lipase in water-saturated organic solvents." Biotechnol Bioeng 89(1): 88-95.
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CAPITULO 3: RESULTADOS 3.3.4 PUBLICACIÓN
9:
IDENTIFICATION,
CLONING
AND
EXPRESSION OF A NEW GDSL LIPASE FROM Carica papaya
En el genoma de Carica papaya se han identificado una gran cantidad de proteínas con actividad lipolítica de las cuales sólo se han identificado tres mediante diversas metodologías, además todos los estudios realizados hasta la fecha se han llevado a cabo sólo en la fracción del latéx de Carica papaya.
El presente estudio esta dedicado al análisis de la expresión de 10 diferentes genes que codifican para triacilglicerol lipasas en hoja Carica papaya empleando ácido jasmónico (compuesto involucrado en la respuesta de la planta ante un estrés biótico como la presencia de insectos o cambios clímaticos) como inductor.
A partir de este análisis fue posible identificar y aislar por primera vez el gen codificante de la proteína con actividad lipolítica CpLip2. De igual forma esta proteína fue expresada de forma funcional empleando dos variedades de Nicotiana (Nicotiana tabaccum y Nicotiana bentamiana) como sistemas de expresión. Este trabajo fue sometido a la revista de arbitraje internacional BioMed Research International.
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CAPITULO 3: RESULTADOS
4. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
.
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CAPITULO 4: CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS Las triacilglicerol lipasas son enzimas muy versátiles con una gran variedad de aplicaciones en la industria, por lo que han sido objeto de un gran número de estudios. Una de las triacilglicerol lipasas particularmente interesante es la conocida como la lipasa de Carica papaya.
En la primera etapa del presente trabajo de tesis concerniente a la purificación parcial y caracterización de diversos biocatalizadores de látex de Carica papaya (CPLtx) fue posible identificar la presencia de al menos dos proteínas con actividad lipolítica en CPLtx. Estos biocatalizadores presentan una temperatura óptima de 40°C en hidrólisis de triglicéridos de longitud de cadena corta, mientras que sobre triglicéridos de cadena larga es de 50°C. Presentan un pH óptimo de 8.5 en hidrólisis de triglicéridos de cadena corta y un pH óptimo de 9 en hidrólisis de triglicéridos de cadena larga.
Así mismo, fue posible obtener dos fracciones parcialmente purificadas a partir de CPLtx. La primera corresponde a la fracción denominada CPL-p en la cual fueron eliminadas las proteínas solubles en agua (principalmente proteasas) y se ve enriquecida la actividad lipolítica sobre triglicéridos de cadena mediana comparada con CPLtx.
En la segunda fracción parcialmente purificada, denominada como CPL-e, fue extraída parte de la actividad lipolitica sobre triglicéridos de cadena corta y la cual se ve enriquecida la actividad lipolítica sobre triglicéridos de cadena larga en comparación con CPLtx.
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CAPITULO 4: CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
Una alternativa para la obtención de proteínas en gran cantidad, así como para su caracterización, es la producción de proteínas recombinantes. La tercera etapa de este trabajo estuvo dedicada a la expresión heteróloga de proteínas lipolíticas de Carica papaya.
A este respecto, la esterasa CpEst reportada en la literatura como presente en el látex de Carica papaya se logró expresar por primera vez de forma funcional empleando la levadura Yarrowia lipolytica como sistema de expresión. El extracto que contiene la proteína recombinante CpEst presenta preferencia por hidrolizar triglicéridos de cadena corta, al igual que la proteína nativa.
La CpLip1 es una proteína lipolítica identificada mediante proteómica como una de las proteínas responsables de la actividad lipolítica presente en presente en la fracción insoluble en agua del látex de Carica papaya. En este trabajo CpLip1 se logró expresar por primera vez de forma funcional empleando la levadura Pichia pastoris como sistema de expresión. De igual forma esta proteína fue purificada y caracterizada empleando la reacción de hidrólisis de trioleina.
Por otro lado, gracias a que el genoma de Carica papaya se encuentra completamente secuenciado, fue posible la identificación de diversas proteínas lipolíticas mediante una búsqueda por pfam (Protein family data base). Fueron identificadas 55 secuencias de tipo lipasa clase 3, 16 secuencias de tipo GDSL lipasa y 6 secuencias de tipo α-β
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CAPITULO 4: CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS hidrolasa, lo que a su vez permitió el análisis bioinformático de estas secuencias y la selección de las secuencias con mayor hidrofobicidad. De las 10 seleccionadas por su alta hidrofobicidad se realizó por primera vez un análisis “in vivo” de la expresión de estas secuencias.
Mediante los ensayos de inducción con ácido jasmónico se logró identificar y aislar a la proteína CpLip2; esta proteína fue expresada de forma funcional empleando dos variedades de Nicotiana (Nicotiana tabaccum y Nicotiana benthamiana) como vector de expresión.
La expresión del gen CpLip2 posterior a la inducción supone la participación de esta proteína en el mecanismo de defensa de la planta, sin embargo aún es necesario realizar más estudios pa ra cuantificar la cantidad ADN. Además de estudiar otros inductores tales como BTH y ácido salicílico; con la finalidad de encontrar la mayor cantidad de secuencias correspondientes a enzimas lipolíticas que pueden ser expresadas en la hoja de Carica papaya, así como en otras fracciones.
Por otro lado, es necesario evaluar el nivel de expresión de una mayor cantidad de secuencias proteicas con el objetivo de determinar cuáles pueden ser inducidos bajo factores de estrés biótico o abiótico. Este tipo de estudios permitirán un mayor conocimiento de la expresión de cada una de estas proteínas, así como de los mecanismos de defensa y/o metabolismo en el que se encuentran involucradas dentro
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CAPITULO 4: CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS de Carica papaya. Además su clonación en forma funcional permitirá la determinación de sus propiedades bioquímicas.
De forma general la optimización de las condiciones de producción y purificación de las tres proteínas recombinantes obtenidas en este trabajo CpEst, CpLip1 y CpLip2, así como evaluar el empleo de otros plásmidos y sistemas de expresión, permitirá la obtención de una mayor cantidad de la proteína deseada.
En la segunda etapa de este trabajo se evaluó la capacidad catalítica de las lipasas obtenidas en las etapas anteriores en la resolución de compuestos quirales. Los ésteres de ácidos carboxílicos 2-halogeno sustituidos son un grupo de importante de moléculas quirales que funcionan como precursores de diversos medicamentos, un modelo interesante para evaluar este tipo de compuestos es el éster octílico del ácido bromofenil ácetico. Las reacciones de hidrólisis de este compuesto catalizadas por CPLtx y sus dos fracciones parcialmente CPL-p y CPL-e fueron altamente selectivas con preferencia por el enantiómero S y resultados comparables con los de las lipasas microbianas Candida rugosa Lip1 y Yarrowia lipolytica Lip2.
De igual forma se evaluó la eficiencia del látex de papaya CPLtx en reacciones de polimerización y producción de derivados análogos a los lípidos de leche materna y en donde se encontró que la eficiencia de este catalizador es comparable o incluso superior que la de lipasas microbianas disponibles comercialmente.
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CAPITULO 4: CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS Además, la evaluación de las proteínas clonadas CpEst, CpLip1 y CpLip2 en reacciones de interés industrial tales como los precursores de antiinflamatorios no esteroidales, producción de biodiesel, sustitutos de leche materna y polímeros, permitirá identificar cuál de estas enzimas son eficientes en cada caso. Así mismo, aportará conocimiento sobre qué proteína lipolítica es responsable en cada una de las catálisis que el látex de Carica papaya es capaz de hacer o si es la mezcla de enzimas lo que favorece la síntesis.
Así mismo, la inmovilización (confinamiento en un lugar específico del espacio) de las tres proteínas recombinantes permitirá la obtención de biocatalizadores más estables y que pueden ser reutilizados en diversas ocasiones, lo que les provee mayor versatilidad.
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5. RESUMÉ
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Purification, caractérisation, expression hétérologue et applications des enzymes lipolytiques de Carica papaya Carica papaya est une plante arborescente à tige unique originaire de l'Amérique centrale. Elle croit sous un climat tropical et peut atteindre 3 et 8 m de hauteur.
C. papaya est cultivée dans des régions tropicales et subtropicales telles que Hawái, Afrique du Sud et de l'Est, Ceylán, Inde, Îles Canaries et Australie. Au niveau mondial, la culture de papayes atteint plus d’onze millions de tonnes; Le Mexique étant l'un des producteurs principaux (sixième producteur mondial avec 634,369 tonnes et premier exportateur de ce fruit), les recherches de valorisation de ce produit sont un défis majeur pour le Mexique.
La fonction principale de la culture de C. papaya est l'obtention du fruit pour sa consommation comme fruit frais, cependant ce fruit peut être utilisé pour de nombreuses autres applications.
En effet, C. papaya produit un liquide d'apparence laiteuse connu comme latex. Ce latex extrait des distinctes parties de la plante (principalement du fruit) est utilisé dans l'industrie alimentaire pour une viande ou clarifier la bière, ou encore comme vermicide ou pour la fabrication de chewing-gum.
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La composition exacte du latex de papaye n'a pas été décrite dans sa totalité; cependant, différentes études ont révélé qu'il contient à peu près 15% de solides et 85% d'eau.
Cette résine solide contient une grande diversité de métabolites
secondaires et de protéines impliqués dans la défense de la plante contre les agents externes. Le latex contient également une grande quantité d'enzymes incluant proteases, oxidases, lecitines, chitinases, glucosidases et phosphatases (plusieurs parmi elles restent à élucider).
Parmi toutes les activités catalytiques présentes dans le latex de C. papaya on trouve l'activité lipolytique (EC 3.1.1.X), reportée depuis 1935 mais dont l’activité n’a été caractérisée qu’en 1991.
Les enzymes lipolytiques peuvent catalyser des réactions d’hydrolyse sur divers substrats de nature lipidique ou autre, mais également dans des conditions thermodynamiques favorables, des réactions de synthèse. De plus, elles sont actives en présence de solvants organiques, ce qui fait de ce type d’enzymes des biocatalyseurs spécialement attractifs pour des applications industrielles.
Dans l'industrie alimentaire les applications de cette classe d’enzymes sont très variées : modification d'huiles et de graisses, production de lactés durant l'élaboration de fromages, de yaourts et de beurres, synthèse d'esters, lactones, méthyle kêtons et acides utilisés comme exhausteurs de goût, ou encore production de lipides structurés
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(substituant du lait maternel ou du beurre de cacao, huiles enrichies en acides polyinsaturés).
Dans l'industrie pharmaceutique, les enzymes lipolytiques sont également très utilisées pour la résolution de mélanges racémiques ou pour le développement de certains médicaments servant au traitement de l'obésité. Par ailleurs, le marché mondial des enzymes lipolytiques est en expansion, et la recherche de nouvelles activités et spécificités de ces enzymes est un enjeu pour la communauté scientifique et industrielle.
L’activité lypolitique contenue dans le latex, connue comme la lipase de C. papaya, est particulièrement intéressante par sa capacité à réaliser des réactions de synthèses avec des spécificités très particulières (régio-sélectivité de type sn-3 et énantiosélectivité pour résoudre de nombreux mélanges racémiques). Cette activité lipolytique est associée à la matrice insoluble du latex, et constitue donc une activité immobilisée qui possède.
Cependant et pour cette même raison, il n'a pas été possible jusqu'à présent d'élucider la ou les séquences protéiques dans le latex responsables de cette activité lipolytique.
Cette thèse est dédiée à l'étude de l'activité lipolytique du latex de C. papaya. 1) Purification partielle du latex de C. papaya et applications
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Dans une première étape le travail est dédié à la caractérisation et la purification partielle de l'activité lipolytique présente dans le latex. Pour cela, une partie de la recherche a été dédiée à l'élaboration d'un protocole de purification partielle de l'activité lipolytique du latex de C. papaya. À partir de ce protocole deux fractions partiellement purifiées ont été obtenues. La première correspond à la fraction dénotée CPL-p dans laquelle au moyen de l'emploi d'eau sont éliminées la majorité des enzymes protéolytiques solubles dans l’eau.
La deuxième fraction (CPL-e) est obtenue grâce à l'usage d'un détergent ionique, qui permet d'éliminer une partie de l'activité estérase présente dans le latex. Ce protocole a été publié comme chapitre du livre « Lipases et phospholipases » (Publication 1 dans le manuscrit, premier auteur).
Ensuite, les deux biocatalyseurs obtenus au moyen du processus de purification partielle ont été caractérisés pour la réaction d'hydrolyse de deux triglycérides modelés (tributyrine et huile d'olive) et comparés avec le latex de C. papaya non purifié (CPLtx). Différents paramètres ont pu ainsi être comparés, comme notamment la préférence de longueur de chaîne de triglycéride, le pH optimal, la température optimale et la stabilité thermique.
CPLtx présente une préférence pour des triglycérides de courte chaîne dans la réaction d'hydrolyse des triglycérides, tandis que CPL-p et CPL-e ont montré une plus grande
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activité dans l’hydrolyse des triglycérides de longueur de chaîne moyenne et longue respectivement.
La vitesse initiale d'hydrolyse d'une huile d'olive a été évaluée pour les trois biocatalyseurs: CPLtx 0.24 mg/s·g, CPL-p 0.34 mg/s·g et CPL-e 0.4 mg/s·g de biocatalyseur respectivement.
La température optimale des trois fractions dans hydrolyse des triglycérides avec des chaînes courtes de triglycérides est de 40°C, alors que sur des triglycérides à longue chaîne est de 50°C. D’après nos résultats, les trois fractions CPLtx, CPL-p et CPL-e présentent un pH optimal de 8.5 pour l’hydrolyse de la tributyrine et un pH optimal de 9.0 pour l´hydrolyse de l’huile d’olive; ceci rend ces fractions du latex de C. papaya particulièrement attractives pour des applications dans des détergents. L’ensemble de ces travaux a été publié dans la revue d'arbitrage international « Grasas y Aceites » (Publication 2 dans le manuscrit, premier auteur).
Finalement, les fractions partiellement purifiées ont été appliquées à la résolution de mélanges racémique d'octyl ester de l'acide 2-bromo-phenylacétique, la synthèse de biopolymères et de lipides structurés.
En effet, une des applications les plus intéressantes des enzymes lipolytiques est la résolution de mélanges racémiques contenant deux composés chiraux. Ces énantiomères, très difficiles à séparer par chimie classique sont d’intérêt très
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particulier dans l'industrie pharmaceutique pour la synthèse de nombreux médicaments. Parmi ces composés chiraux, les esters d’acides carboxylique 2halogénés sont des intermédiaires importants pour la synthèse de divers médicaments, tels que les prostacyclines et prostaglandines.
La résolution cinétique d'un mélange racémique d’octyl esters de l'acide 2-bromophenylacétique par la lipase de C. papaya, a été étudiée pour évaluer la capacité catalytique du latex brut de C. papaya et des deux fractions de latex partiellement purifiées dans ce type de réaction. Plusieurs paramètres, comme la concentration de substrat ou le solvant de réaction ont été étudiés. Les meilleurs résultats ont été obtenus en utilisant le décane comme solvant avec 50 mM de substrat et une quantité d'enzyme de 50 mg/ml.
Dans ces conditions, une haute valeur d’énantiosélectivité (E >200) a été obtenu avec le latex brut. Quand des fractions purifiées ont été utilisées, la vitesse initiale de réaction a pu être doublée, tout en conservant une énantiosélectivité supérieure à 200. Ce travail a été publié dans la revue d'arbitrage international « Tetrahedron Letters » (Publication 3 dans le manuscrit, premier auteur).
D'autre part, la capacité catalytique des enzymes lipolytiques de C. papaya, contenues dans le latex pur ou partiellement purifié, a été comparée pour la synthèse de polymères à celle de la seule enzyme jusque là décrite pour la synthèse de biopolymères (enzyme commerciale Novozyme 435, correspondant à la lipase de
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Candida antarctica B). Jusqu'à présent, aucune enzyme lipolytique végétale n’avait été décrite comme biocatalyseurs pour la synthèse de biopolymères de type polyesters. La production enzymatique de ce type de composés est hautement appréciée car les conditions de réaction enzymatique sont simples comparées à la catalyse chimique (haute sélectivité et contrôle de la structure polymérique) et compatible avec les concepts de chimie verte. De plus, les traces métalliques présentes lors de l’utilisation de catalyseurs chimiques sont évitées, ce qui rend les biopolymères applicables à des fins biomédicales. C’est notamment le cas pour le polycaprolactone (PCL).
Le PCL est un polyester aliphatique biodégradable utilisé comme additif dans la fabrication de polyuréthanes spéciaux et de résines. Son application principale est dans l'industrie biomédicale comme biomatériel implantable et comme dispositif pour la libération de médicament, de suture ou barrière d'adhésion. La cinétique de polymérisation et le poids moléculaire du PCL obtenu en utilisant CPLtx, (35 % conversion et 1100 Da respectivement) sont comparables avec ceux obtenus avec les lipases microbiennes. Ces résultats ont été publiés dans la revue d'arbitrage international « Macromolecular Symposia » (Publication 4 dans le manuscrit, deuxième auteur).
Finalement, une des applications les plus étudiées du latex de C. papaya est l’utilisation de ses activités lipolytiques comme catalyseur de la production de divers lipides structurés; Ces composés peuvent être commercialisés pour leurs bénéfices à la santé, ou encore pour des applications alimentaires particulières (matières grasses
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analogues à celle du lait maternel humain ou du beurre de cacao). Des travaux précédents sur la production des lipides structurés avaient mis en évidence les avantages du latex de C. papaya comme biocatalyseur ; cependant jusqu'à aujourd’hui, il n’y avait pas de travaux dans lesquels les meilleures conditions de réaction auraient été déterminées pour la production d’analogues des matières grasses du lait maternel en utilisant le latex du C. papaya partiellement purifié.
La fraction CPL-p a été évaluée comme biocatalyseurs dans des réactions d’acidolyse entre tripalmitine et acide oléique dans des milieux sans solvant. La méthode de surface de réponse a été utilisée pour simuler des conditions de réaction (relation molaire des substrats et température). La température est en effet une variable clé dans ce procédé puisqu'il est nécessaire d'assurer des valeurs plus hautes que 60°C pour empêcher la solidification du milieu.
Les meilleurs conditions expérimentales déterminées sont une température de 60°C, avec un rapport molaire acide oléique/tripalmitine de 6 :1. Ceci permet d’obtenir des niveaux d'incorporation en acide oléique d'environ 40 % mol en 48 heures de réaction. Les niveaux d'incorporation en acide oléique obtenus avec CPL-p sont semblables à ceux obtenus avec des lipases commerciales (lipases microbiennes immobilisées). Ce travail a été publié dans la revue d'arbitrage international « European Journal of Lipid Science and Technology » (Publication 5 dans le manuscrit, deuxième auteur).
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2) Analyse génomique de C. papaya pour l’identification et la production hétérologues d’activités lipolytiques
Du fait de la structure polymérique du latex de C. Papaya, la purification des enzymes présentes dans la fraction insoluble du latex, et notamment la majorité de l’activité lipolytique, peut s’avérer particulièrement complexe; Dans ce cas, l'identification par analyse génomique ou transcriptomique, combinées à la production recombinante des enzymes, sont des alternatives puissantes.
Le génome de C. papaya ayant été complètement séquencé, nous avons donc pu mettre à profils différents outils de bioinformatique pour l'étude in silico des gènes de C. papaya, augmentant ainsi la possibilité d'identification des enzymes lipolytiques potentiellement intéressantes. Pour cela, une recherche dans le génome de C. papaya a permis d’identifier les séquences codant des motifs conservés dans les protéines lipolytiques.
À partir de cette analyse, 55 séquences ont été identifiées codant pour des triacylglycérol lipases de la famille des GDSL lipases et 23 séquences codant pour des lipases de la famille des triacilglycérol lipases classe 3.
De plus, grâce à une analyse d'homologie entre ces séquences et diverses triacylglycérol lipases végétales de fonction connue, il a été possible de déterminer la fonction potentielle de ces protéines. De même, certaines des caractéristiques
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biochimiques comme hydrophobicité et point isoélectrique ont pu être évaluées. Ces résultats sont déjà rédigés pour une future publication (Publication 6 dans le manuscrit, premier auteur). Parmi les divers efforts qui ont été réalisés pour isoler l'activité lipolytique de C. Papaya, l'emploi de détergents comme de NLS (N-Lauroylsarcosine, un détergent anionique) et CHAPS (un détergent zwitterionique) a permis l'extraction d'une fraction de l'activité sur triglycérides de longueur de chaîne courte (esterase). Cette activité est attribuée à la protéine CpEst déjà partiellement caractérisée précédemment. La quantité de protéine ainsi obtenue est cependant trop faible pour la tester dans des réactions. Dans ce cas, l'expression hétérologue des protéines est une stratégie intéressante pour l'obtention de protéines en plus grande quantité et ainsi la caractérisation biochimique et enzymatique fine de ces protéines. Yarrowia lipolytica a été sélectionnée comme système d'expression de l’enzyme CpEst.
Y. lipolytica est une levure non conventionnelle qui présente des propriétés intéressantes comme système d'expression. En effet, elle est capable de réaliser les modifications post-traductionnelles des organismes supérieurs et présente une croissance rapide et un haut niveau d'excrétion des protéines produites dans le milieu.
Grace à ce système d’expression, nous avons réussi à exprimer pour la première fois CpEst sous une forme fonctionnelle et excrétée dans milieu de culture.
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D’après la caractérisation que nous avons réalisée, CpEst présente une préférence pour des triglycérides de longueur de chaîne courte, avec une activité de 3.0 ± 0.26 U/mL de milieu de culture sur tributyrine (C4), une température optimale de 35°C et un
pH optimal de 8.5.
Cette enzyme a été testée dans la réaction d’acétylation du resveratrol. Le resveratrol (trans-3,5,40-trihydroxystilbene) est un composé polyphénolique et phytochimique qui possède notamment des propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires, antitumorales, cardioprotectrices et neuroprotectrices, ainsi que des effets retardant le vieillissement de la peau.
Cependant, l'application du resveratrol est limitée par sa biodisponibilité. Pour surmonter ce problème, la synthèse de resveratrol modifié pour être plus biodisponible (estérifié) ou de dérivés avec une bioactivité comparable ou améliorée sont très utiles. Ainsi, des lipases capables de modifier le resveratrol sont d'intérêt particulier pour l’industrie pharmaceutique et cosmétique.
CpEst a alors été immobilisée et testée dans la réaction d’acétylation du resveratrol, où 73 % de conversion total a pu être obtenue après 260 heures de réaction. Ces résultats sont déjà rédigés pour une publication dans une revue d’arbitrage international (Publication 7 dans le manuscrit, premier auteur).
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Une deuxième protéine avec activité lipolytique (CpLip1) avait été identifiée précédemment dans la littérature par protéomique. Cependant jusqu'à présent, elle n’avait pu être exprimée sous forme fonctionnelle et donc ses propriétés biochimiques et sa capacité à catalyser diverses réactions de synthèse restaient inconnues.
Ici, Pichia pastoris a été sélectionné comme système d'expression de l’enzyme CpLip1. P. pastoris présente plusieurs avantages comme système d'expression : sa capacité de croissance sur un milieu de culture minimal à une haute densité cellulaire et la sécrétion extracellulaire de la protéine hétérologue. De plus, comme Y. lipolytica, cette levure est capable de réaliser des modifications post-traductionnelles.
Enfin, de
nombreux outils génétiques sont disponibles pour faciliter l’expression hétérologue puis la purification de protéines dans cet hôte.
Dans ce travail, CpLip1 a été a exprimée pour la première fois de manière fonctionnelle et extracellulaire en utilisant P. pastoris comme hôte d'expression. La production maximale de CpLip1 a été obtenue entre 48 et 72 heures de culture avec une activité dans le milieu de culture brut de 3.7 µmol/min/mL sur huile de l’olive. La purification de l'enzyme recombinante a été effectuée par chromatographie d'affinité et a permis d’obtenir un facteur de concentration de 30, avec une activité spécifique du 50 unités/mg de en protéine.
La caractérisation de l'enzyme purifiée montre que CpLip1 hydrolyse de manière préférentielle les triglycérides de chaîne longue, et qu’elle a un pH optimal de 8.5 et
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une température optimale de 35°C. Quant à la thermostabilité, les demi-vies de cette enzyme à 50°C et 70°C sont de 12.5 et 7.5 minutes respectivement. Finalement, la stabilité de l'enzyme évaluée en présence de différents solvants organiques a montré que l'activité lipase est plus affectée dans des solvants polaires comme l'acétone. Ce travail a été soumis dans la revue d'arbitrage international « FEBS » (Publication 8 dans le manuscrit, premier auteur).
Finalement, une étude par transciptomique a constituée la dernière approche pour identifier les enzymes lipolytiques de C. papaya. Pour cela, dix des séquences lipasiques identifiées lors de l’analyse du génome ont été sélectionnées. Une analyse de l'expression in vivo de ces 10 gènes dans les feuilles de C. papaya a été réalisée en employant comme inducteur l'acide jasmonique (un composé impliqué dans la réponse de la plante devant un stress biotique comme la présence d'insectes ou de changements climatiques). À partir de cette analyse, il a été possible d'identifier et d'isoler un gène codant pour une protéine avec activité lipolytique.
Ce gène, nommé CpLIP2 code pour une lipase de la famille des GDSL lipases, avec une longueur totale de 1790 pb et un cadre de lecture ouvert de 1125 pb. Il code pour une protéine de 375 acides aminés avec un peptide signal prédit de 32 acides aminés. Le cadre de lecture ouvert de CpLIP2 a été cloné dans un module provector viral pour l'expression transitoire dans Nicotiana benthamiana et Nicotiana tabacum. L'activité lipolytique a été détectée seulement dans des extraits de plantes transformées avec le
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vecteur d’expression du gène CpLIP2, mais pas dans ceux de plantes transformées avec un gène sans relation.
CpLip2 a donc été exprimée sous une forme fonctionnelle pour la première fois avec une activité de 3.2 µmol de tributyrine hydrolysée par min et par mL d’extrait. La caractérisation préliminaire a montré une préférence de CpLip2 pour les chaînes courtes (tributyrine); Cette même sélectivité avait été observée dans le latex brut de C. papaya CPLtx. Ce travail a été accepté dans la revue d'arbitrage international « BioMed Research International » (Publication 9 dans le manuscrit, premier auteur).
En conclusion, l’ensemble de ces travaux a largement contribué à l’identification, la production et la caractérisation des enzymes lipolytiques de C. papaya, ainsi qu’au développement de plusieurs procédés de synthèses biocatalysés par ces enzymes. Le rôle de ces enzymes dans la plante sera étudié par la suite.
Aussi, l'optimisation des conditions de production et de purification des trois protéines recombinantes obtenues CpEst, CpLip1 et CpLip2 permettra l'obtention d'une plus grande quantité de la protéine et par conséquence il sera possible de leur tester dans un major numéro des réactions d’intérêt industrielle.
De même, l'immobilisation (confinement de l’enzyme dans un lieu spécifique de l'espace), sera étudiée pour ces trois protéines recombinantes et permettra l'obtention de biocatalyseurs plus stables et qui peuvent être réutilisés dans de diverses occasions.
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D'un autre côté, il faut évaluer les niveaux et cinétiques d'expression in vivo d'une plus grande quantité des séquences protéiniques avec l'objectif de déterminer son rôle dans la plante. De plus, le clonage de ces nouvelles protéines du C. papaya dans une forme fonctionnelle permettra la détermination de ses propriétés biochimiques.
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